一種啟動子BgIosP524及其製備方法和用途的製作方法

2023-10-31 02:54:27 2

專利名稱：一種啟動子BgIosP524及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因調控領域。具體而言，本發明涉及一種啟動子，具體是水稻的啟動 子BgIosP524，以及所述啟動子的製備方法。本發明還涉及所述啟動子在調控單子葉植物或 雙子葉植物中目的基因表達的用途。
背景技術：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位於結構基因5』端上遊，是RNA聚合酶識別、 結合和開始轉錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶(holoenzyme)同模板正確結合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉錄，從而控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。在轉 基因植物中，啟動子是影響轉基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效 率表達外源基因的關鍵。根據啟動子的轉錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調控下，不同組織器官和發育 階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子，可以更有效 地在單子葉植物中驅動外源基因的轉錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應啟動子，用其代替CaMV 35S啟動子，在轉基因菸草中也 取得了很好的表達效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動子有山bi啟動子(Plant ubiquitin promoter)、 Actin 啟動子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動子(Maize alcohol dehydrogenase lpromoter)。Ubi啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩定等因素而倍受青睞。目 前，已經從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，包括玉米基因組中的WDi-I啟動子、水稻 泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素WdBI啟動子、菸草泛素Ubi. U4啟動子、 馬鈴薯泛素證丨7啟動子、番茄泛素W^il-I啟動子，大麥泛素Mubl啟動子。玉米泛素W^i-I 啟動子已經廣泛地應用於玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動子在水稻 和甘蔗中也有較多的應用。Actin啟動子1990年由康奈爾大學的McElroy等首次在水稻中發現，屬於強組成 型啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調控功 能卻十分不理想。因此，許多相關研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動子，並成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續發現。Actin啟動子由於對基因表達的強調控作用，在單子葉 植物優良性狀的轉基因中已經得到越來越廣泛的應用。Adh-I啟動子調控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對植物在缺氧環境下乙醇脫氫酶的表達至關重要。Adh-I啟動子對單子葉植物特別是穀類植物如水稻、燕麥 和大麥，和少部分雙子葉植物如菸草，基因的調控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子 提高10-50倍。Adh-I啟動子主要應用於單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基因表達的調 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農業作物。單子葉植物基因的強效啟動子，能夠調控植物高效率表達 具有特殊性狀的外源基因，對優良作物的分子育種研究意義重大。在強效啟動子相關研究領域，發現並驗證了許多單子葉植物的啟動子。此外，雙子 葉植物中的一些強效啟動子如CsVMV啟動子、番茄E8啟動子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動 子等高效啟動子，在單子葉植物中也有很強的基因調控作用。儘管已經有上述已知的單子葉植物的啟動子，本發明人通過對水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動子，所述啟動子能夠用於調控單子葉植物和雙子葉 植物中目的基因表達，同時為研究單子葉植物和雙子葉植物中目的基因表達提供了一種新 的工具和選擇。

發明內容
在第一方面中，本發明提供了一個具有啟動子活性的啟動子基因BgIosP524。所述 啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。TTAGCTGCTGTACTTGGTGTGGTTACATCAACTTGTTCTGACGGCAATTTGATAAACAAAACCTCGTTA GGTCATATACTTTGTAGCTTGACAGCGTATGCAAACATAATGGCCACTACTCCGTATTTAATTCATTGGAATGAATT AAAAATTAAGAGCAAGGTCCATCTTTAGAACTTTCCTGCGGTGCAGTCGAGACTAGATAGCCATTGGAACTAGAGTA GAAAAAGGTATATAAGCGGCCCTCTTCTATGAATCTGTTTTTAGACAACTTATTATAGGCGTCAACTGAGTACGATC CAAATTCTGATTTCAATATTGGAGACTTAAGTCCCAACTGGCTACCGAAAATAGAATAAAGTCGTCGAACGATGAGT TGAACTGGCTTCCCTCGCATAAACGAGAATAATTATCGCAAGATTCTCGATCAAGTCGGCGTTCCAACTAAAAAATG TTTGGAAGCAAAATGATACTTGATCTTGTACTCCTCCAGGTCCTGCACCGGCGCACGTCGCCACTCATCAGAAACGC CCGTTCGTATCATAATTGCCCATTGTTCATGGCGTTTTCAGCTTTCAGGTCCCTGTCGGGCTCGTTGCCGGATAAAC CAGATTATTCCAAAGCTGCTGTTTGTTCTACGTCCAACTTGTCGAAGCATCCATTTGATTTCGAGGCCGACGCGGCG CCGATTGTGACCGGCGCCGGCGCGATATGCAAAATTACCACTAGTGACCTACTATCGCTGCTGTCTCGTACAGTCGT ACTCGTACTCCCTCGGCCTTTCGTTTTTCACATTCCCGTCTATTATCCTGTTCGTTTGTGCCCGGAAGGAAAAGCTA AAGCTTCGATCGTGACGGGTTGATGCGCGACTACGTCATGCGAGTATGCGCTTGCCGTCCAGCGAATGGCGTACGTG GCGATGCACCACGGCCACTAGCCAATAGCCATATCGTAGCGCACGCGATTCCGGCATGTTCAGTTATTCACCGTTTC ACCTGTGTCATGGCGAGCGGAATCACGCCGGATCGTATTGGCGTGGCGTTACGTACCCCCACAAACGCGGAGCACGT CTCGCGTTGGCGTTGCACGTCGAATCGCCGAAAGGAAACGGGCTCACGAGGTCACGAGGAAGAGGGAGTCGCACGCA CCGCGCCGCACAGATGGGTGGTGGGGAGGCGGGGGCTGAGACGGAGGAAAACCGGGCGCAACCGCAACCGCGGCGCC TCCGAAACGGGAGCGTGCCGTGCCGTGCCAGGTATACGTCGCTCTCCTCGTGACGTTGCGGCGACCTACTCCAGGAA ACCGCTTGCGAACCGACGGATTCACGCTTCCCGGGCTCCCCGCCACGCCATCCGAGGCCGCCCCGCGCGAGGGGTGG ACGCGTGTGCCGTGGTGGGCGGGGGTGTGAGGTGGGGTCCCAGTCCAATACCGCGACGCGCGCCGCAGCGGCGCGGA GAGGGGCCGCGACGAGGAAAACCGCTCGCCCATGCGGAGGCGGCGCGCGTGTGACGGGTGGACTCCTCTGGGACCCG CGCGTCGGCGTGTGCTGCAGTGCTGGACAAACGACGACAGCCGCTTGGGGCGGGGCGTCGCATCGCGTCTGGTTTGGGTCATCCGGGGGTGGGTGGCACGGTTGGGTGAGGTGAGGTGCGGACGTGCGGTGAACCCGTGAGTGCAGTCGGGTTC GGGAGAGAACGGGAAGAGCTTTTCCGCATTCCCCCCGAGAATGTTAGGAAAATACTACTGCCCATTATAGCTGGTGT TTTCTGTAGTACTCCACATCATACGCTGGCTGGACGTCATTAACGTGACCCAGGAAGTTCTTACTAACCACTCATTA ACGTGATCACGCTTGTCTATCATTGTGTGGTTCAGAACTTCAGATCAAGTCAAGCATAAACACCTTTGAAGTGCATT GCATAATTGGATGACAGAACAATGCAAAAAAGCCAAACAAAGAATTGTAATTGTACAGAGTATACTACATATAGGAC TGCCCGGTACAAAGCGTGACGGAGAACAGCAGAATCAAGTACGTGACCGAATCCCCTGTGCGGGGCAAGGGTTTGCA CGGAAATACAGAGGAAACCAGGGGCCACACGAGTAGTAGGCGGCACATAGTTCTCGTGGGCTCTCGGCATCGGCACC CAGATCGCATCTCCTCTACTCTTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGCGTCCAAGACTGGACTCTCCTCTTTATAACC CGTCTCCCTTCTCATCTTTTTCTCCACAGTCGCCTCCTCCCCTGCCAAACCAGTCTCCCCCAAATCTCCTTTGCGTC CTCTCGATTCCTCAGCGA(SEQ ID NO :1)。在一個實施方案中，本發明涉及含有選自以下任意一組並具有啟動子功能的核苷 酸序列的啟動子a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個鹼基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；以及e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在第二方面中，本發明提供了一種核酸構建體，所述核酸構建體包含本發明的啟 動子以及與啟動子可操作連接的基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者 不同。在第三方面中，本發明提供了一種載體，所述載體包含本發明的啟動子或核酸構 建體。在一個實施方案中，所述質粒是PMD18-T質粒或p8質粒。在一個實施方案中，所述 啟動子或核酸構建體序列位於KpnI酶切位點和SbfI酶切位點之間。在第四方面中，本發明提供了一種包含本發明的啟動子、核酸構建體或載體的重 組細胞。在一個實施方案中，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。在另 一個實施方案中，所述菌株是根癌農桿菌EHA105-P524。在一個實施方案中，本發明提供了 一種包含本發明的啟動子、核酸構建體、載體或重組細胞的植物愈傷組織、植物外植體或植 物。在一個實施方案中，所述植物愈傷組織是水稻愈傷組織。在一個實施方案中，所述植物 是單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或 菸草NC89。在第五方面中，本發明提供了一種製備SEQ ID NO :1所示的啟動子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增。在一個實施方案中，所 述擴增引物根據SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對首尾進行設計。在另 一個實施方案中，所述擴增引物是SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3。在一個實施方案中，所述 擴增引物5』端還連接一段限制性酶切位點和/或保護鹼基。例如，所述擴增引物是SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO 4和SEQID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點 和SbfI酶切位點。在第六方面中，本發明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動子的用途。在一個實施方案中，所述用途是調控植物中目的基因表達的用途，所述目的基因優選是GUS。在 另一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻 或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。在第七方面中，本發明提供了一種調控基因表達方法，所述方法包括步驟將本發 明的啟動子、核酸構建體、載體或重組細胞轉化至植物，優選轉化至植物愈傷組織，使所述 啟動子位於所述基因的5』端。在一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。為實現上述調控基因表達的目的，本發明所述的啟動子可以以單拷貝和/或多拷 貝的形式應用，也可以與現有技術中已知的啟動子聯用。在第八方面中，本發明提供了一種製備轉基因植物的方法，包括在有效產生植物 的條件下培養本發明的重組細胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。在第九方面中，本發明提供了本發明的啟動子、核酸構建體、載體、重組細胞、植 物愈傷組織、植物外植體或植物用於調控植物目的基因表達和育種的用途，所述植物是單 子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草 NC89。保藏信息培養物名稱菸草NC89種子。保藏日期2010年11月12日。保藏單位湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養物保藏 中心(CCTCC)。保藏編號CCTCCNO :P201017。


圖1示出質粒pCAMBIA-1301的圖譜。圖2示出含有需要構建的多克隆位點及GUS序列的p8質粒的圖譜。圖3示出水稻愈傷組織gus染色的照片。以含有啟動子的P8+P5M重組載體的重 組根癌農桿菌介導轉化的水稻愈傷組織經染色後呈現藍色(右)。作為對照，經不含啟動子 的P8質粒重組根癌農桿菌介導轉化的水稻愈傷組織經GUS染色後顏色未發生變化(左)。圖4示出水稻轉基因苗的根gus染色的照片。以含有啟動子的p8+P5M重組載體 的重組根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的根經染色後呈現藍色(右)。作為對照，經不含啟動 子的P8質粒重組根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的根經GUS染色後顏色未發生變化(左)。圖5示出水稻轉基因苗葉gus染色照片。以含有啟動子的P8+P5M重組載體的重 組根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的葉經染色後呈現藍色(右)。作為對照，經不含啟動子的 P8質粒重組根癌農桿菌介導轉化的水稻苗的葉經GUS染色後顏色未發生變化(左)。圖6示出轉基因菸草的葉gus染色的顯微照片(光學顯微鏡，X 3)。以重組根癌 農桿菌EHA105-P5M轉化的菸草的葉經染色後呈現藍色(右)。對照菸草的葉經⑶S染色 後顏色未發生變化(左)。圖7示出轉基因菸草根gus染色的顯微照片(光學顯微，X 3)。以重組根癌農桿菌EHA105-P5M介導轉化的菸草的根經染色後呈現藍色(右)。對照菸草的根經⑶S染色 後顏色未發生變化(左)。
具體實施例方式在第一方面中，本發明提供了一個具有啟動子活性的啟動子基因BgIosP524。在一 個實施方案中，本發明涉及含有選自以下任意一組並具有啟動子功能的核苷酸序列的啟動 於a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個鹼基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本發明中，所述的啟動子來源於單子葉植物。具體而言，所述單子葉植物為水 稻，例如所述水稻為日本晴(Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare)。本發明的啟 動子可以調控基因在植物、特別是單子葉植物中的表達。在本發明的一個實施方案中，所述 單子葉植物為稻屬。在本發明的又一實施方案中，所述稻屬是水稻。在本發明的又一實施 方案中，所述為水稻日本晴。本發明的啟動子還可以控制基因在雙子葉植物，所述雙子葉植物有例如菸草，大 豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿蔔、花生等。菸草是典型的基因工程模式植物。在實施例中選擇菸草進 行轉基因研究，以驗證本發明的啟動子在雙子葉植物中的效果。實驗結果表明，該啟動子能 在轉基因菸草中起作用。本領域技術人員已知獲得一個核苷酸序列的互補序列的方法。而且，為了實現啟 動子對基因的調控，可以將所述基因的互補序列連接至所述啟動子的互補序列的5』形成核 酸構建體，然後獲得所述核酸構建體的互補序列，從而可以利用所述核酸構建體的互補序 列實現啟動子對一個基因的調控。利用核苷酸雜交進行核苷酸的鑑定和篩查是本領域技術人員公知的。典型地，「雜 交條件」根據測量雜交時所用條件的「嚴緊性」程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結 合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，「最大嚴緊性」典型地發生在約Tm-5°C (低 於探針Tm 5°C )；「高等嚴緊性」發生在Tm以下約5_10°C；「中等嚴緊性」發生在探針Tm以 下約10-20°C ；「低嚴緊性」發生在Tm以下約20-25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件 可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6XSSC =極 低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性；0. 5XSSC =高等嚴緊性。從 功能上說，可以採用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列； 而採用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對於要求高選擇性的應用，典型地期望採用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗 室手冊，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊 性在內的雜交條件。
為便於說明，用於檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨後用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 於雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。在本發明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的置換、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5』端和/或3』端，和 /或序列內部進行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超 過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續整數表示的鹼基的置 換、缺失、添加修飾。在本發明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個鹼基 的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動子活性。通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO=I的參考 核苷酸序列至少具95%的「同一性」是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個 核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些 核苷酸插入參考序列中，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5或3末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨散在於參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在於參考 序列中。在本發明中，用於確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。採用例如文獻中所述或者默認參數，BLAST 和BLAST 2.0可以用於確定本發明的核苷酸序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟體可 以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。在本發明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當採用本 文所述方法(例如採用標準參數的BLAST分析)時，與本發明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。在第二方面中，本發明提供了一種核酸構建體，所述核酸構建體包含本發明的啟動子以及與啟動子可操作連接的基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者 不同。在本文中，所述核酸構建體可以包含SEQ ID NO 1所示的啟動子序列或其互補序 列的核苷酸序列。所述核酸構建體可以通過將SEQ ID NO :1所示的啟動子序列或其互補序 列與所需的其他序列可操作地連接進行製備。或者，所述核酸構建體可以通過直接合成製備。在第三方面中，本發明提供了一種載體，所述載體包含本發明的啟動子或核酸構 建體。在一個實施方案中，所述質粒是PMD18-T質粒或p8質粒。在一個實施方案中，所述 啟動子或核酸構建體序列位於KpnI酶切位點和SbfI酶切位點之間。構建質粒的方法是本 領域中已知。例如，在本發明的實施例中構建了 PMD18-T質粒和p8質粒。適於構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限於，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T SimpleVecter 等。適於構建本發明所述的表達載體包括但不限於，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在第四方面中，本發明提供了一種包含本發明的啟動子、核酸構建體或載體的重 組細胞。在一個實施方案中，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。將質 粒導入細菌的方法是本領域中已知的。例如，所述重組細胞可以通過將含有本發明啟動子 的所述重組載體轉化至宿主細胞而得到。在本發明的實施例中，質粒被導入根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，具體是根癌農桿菌 EHA105-P524。適於構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限於，例如根癌農桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等在第五方面中，本發明提供了一種製備SEQ ID NO :1所示的啟動子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增。可以使用本發明中公知的方法製備SEQ ID NO 1所示的啟動子，例如化學合成法 直接從頭合成或者從基因組中擴增所述啟動子序列。在一個實施方案中，所述擴增引物根 據SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對首尾進行設計。本領域技術人員可 以根據待擴增的目的核苷酸序列按照鹼基互補原則設計相應的PCR擴增引物對。例如，本 發明的引物可以是 TTAGCTGCTGTACTTGGTGTG(SEQ IDNO 2)和 TCGCTGAGGAATCGAGAGGAC (SEQ ID NO :3)。在一個實施方案中，所述擴增引物5』端還連接一段限制性酶切位點和/或保護 鹼基。例如，在實施例中使用的擴增引物是SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點和SbfI酶切位點。在擴增引物5，端連 接一段限制性酶切位點和/或保護鹼基是基因擴增中常用的方法，本領域技術人員可以通 過常規的方法實現。在第六方面中，本發明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動子的用途。在一 個實施方案中，所述用途是調控植物中目的基因表達的用途，所述目的基因優選是GUS。在 另一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻 或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。在第七方面中，本發明提供了一種調控基因表達方法，所述方法包括步驟將本發 明的啟動子、核酸構建體、載體或重組細胞轉化至植物，優選轉化至植物愈傷組織，使所述 啟動子位於所述基因的5』端。在一個實施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。將核苷酸序列、構建核酸構建體、質粒或細菌導入植物可以使用本領域中常用的 方法。例如，可採用植物基因轉化技術將目的基因插入到植物基因組中，包括農桿菌介導轉 化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉化和電穿孔等。本領域周知，農桿菌介 導的基因轉化常被用於單子葉植物和雙子葉植物的基因轉化，但其它轉化技術也可用於本 發明所述單子葉植物的基因轉化。當然，適於本發明的轉化單子葉植物的另一種方法是粒 子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發。另外，還可以採用的 轉化單子葉植物的方法是原生質體轉化。基因轉化後，採用通用的方法來篩選和再生整合 有表達單元的植株。為實現上述調控目的基因表達的目的，本發明所述啟動子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應用，也可以與現有技術中已知的啟動子聯用。在第八方面中，本發明提供了一種製備轉基因植物的方法，包括在有效產生植物 的條件下培養本發明的重組細胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。在第九方面中，本發明提供了本發明的啟動子、核酸構建體、載體、重組細胞、植物 愈傷組織或植物用於調控植物目的基因表達和育種的用途。本發明的啟動子可成為一種新 的啟動子作為單子葉植物、尤其是水稻轉基因的工具啟動子，為開展低表達基因轉化苗篩 選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大的縮短優良品種的選育時間。本發 明的啟動子可廣泛用於培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。例如， 可使用本領域中常用的基因重組方法，將本發明的啟動子導入植物基因組中希望表達量增 加的目標基因5』端，實現目標基因的表達增加。在本發明中，術語「單子葉植物」，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻 屬植物例如水稻，包括但不限於，例如包括但不限於水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。在本發明中，術語「水稻」包括但不限於，日本晴，中花9、中花10、中花11、臺北 309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優 128,11優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農家福有限公 司)等。在本發明中，術語「雙子葉植物」，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙 草屬植物(菸草)，包括但不限於 K326、K346, K394、NC82、NC89、G140、G28, G80、中煙 90、 Coker 176, CV87 等等實施例下面將結合具體實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員 將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明 具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。 所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 :P524啟動子片段的PCR擴增和dMD18_T+P524重組載體的構津PCR擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號DP320-(^)提取水稻日本晴(已在申請號為200910238992.0、發明名稱為「一種啟動子 BgIosP587、其製備方法及用途」的發明申請中保藏，並於2010年9月22日公開，保藏編號 為CCTCC P200910)的基因組DNA，根據該啟動子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾 設計一對PCR特異性擴增引物(上遊引物F1，加限制性酶切位點KpnI和保護鹼基，下遊引 物R1，加限制性酶切位點SbfI和保護鹼基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使 用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表1所示。表1基因啟動子擴增的PCR體系
權利要求
1.一種啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組並具有啟動子功能的核苷酸序列a、SEQID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQID NO 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個鹼基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸 序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—種核酸構建體，包含權利要求1所述的啟動子，以及與啟動子可操作連接的基因 序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，含有權利要求1的啟動子或權利要求2的核酸構建體，例如含有權利要求 1的啟動子或權利要求2的核酸構建體的pMDIS-T質粒或p8質粒。
4.一種重組細胞，含有權利要求1的啟動子、權利要求2的核酸構建體或權利要求3的 載體，所述重組細胞例如為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。
5.一種含有權利要求1的啟動子、權利要求2的核酸構建體、權利要求3的載體或權利 要求4的重組細胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。
6.一組引物對，所述引物對用於擴增得到權利要求1所述的啟動子，其特徵在於所述 引物對的兩條引物分別含有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的序列，優選地，所述引物對 的兩條引物在5』端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護鹼基，更優選地，所述引物對 的兩條引物分別具有SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的序列。
7.製備SEQID NO :1所示的啟動子的方法，包括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使 用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據SEQ ID N0:1在水稻日本晴gDNA中的序列分 別針對首尾進行設計，優選是權利要求6所述的引物對。
8.一種調控基因表達方法，所述方法包括步驟將權利要求1的啟動子、權利要求2的核酸構建體、權利要求3的載體或權利要求4的 重組細胞轉化至植物(優選植物愈傷組織或植物外植體)，使所述核苷酸序列位於所述基 因的5』端，所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或煙 草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。
9.一種製備轉基因植物的方法，包括在有效產生植物的條件下培養權利要求4的重組 細胞或權利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物。所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。
10.權利要求1的啟動子、權利要求2的核酸構建體、權利要求3的載體、權利要求4的 重組細胞或者權利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物者用於調控植物目的基因表 達和植物育種的用途，所述植物可以為單子葉植物或雙子葉植物，優選稻屬或菸草屬，更優 選水稻或菸草，最優選水稻日本晴或菸草NC89。
全文摘要
本發明涉及一種啟動子BgIosP524及其製備方法和用途，所述啟動子含有選自以下任意一組並具有啟動子功能的核苷酸序列a、SED ID NO1所示的核苷酸序列；b、與SED ID NO1互補的核苷酸序列；c、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個鹼基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本發明還涉及所述啟動子在調控單子葉植物或雙子葉植物中目的基因表達以及育種的用途。
文檔編號C12N15/10GK102146408SQ20101062316
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者倪雪梅, 孫紅正, 李寧, 楊爽 申請人:深圳華大基因科技有限公司