適用於改變產油植物及酵母中多不飽和脂肪酸水平的△15脂肪酸去飽和酶的製作方法

2023-10-09 13:17:29 2

專利名稱：：適用於改變產油植物及酵母中多不飽和脂肪酸水平的△15脂肪酸去飽和酶的製作方法適用於改變產油植物及酵母中多不飽和脂肪酸水平的A15脂肪酸去飽和酶本申請要求於2003年11月12日申請的美國臨時申請No.60/519191的權益。發明領域本發明屬於生物工程範疇。更具體地，本發明屬於對編碼可用於破壞或增強植物與生物(包括通過含油酵母而為人所知的微生物在內)中多不飽和脂肪酸的產量的A15脂肪酸去飽和酶的核酸片段進行鑑定。發明背景長期以來一直認為某些多不飽和脂肪酸——或稱其為PllFAs,是健康細胞的重要生物組分。例如，認為這些PUFAs是*無法在哺乳動物體內從無到有合成出來的"必需"脂肪酸，作為替代，必須從飲食中獲得，或者來自亞油酸(LA)或a-亞麻酸(ALA)的進一步脫氫作用以及碳鏈增長；*細胞質膜的組分，在這裡可發現它們以磷脂或者三酯醯甘油的形式存在；*正常發育的必需品，在嬰兒大腦的發育以及組織的形成與修復中尤為重要；以及*包括環前列腺素、類二十烷酸、白三烯及前列腺素類在內的、哺乳動物體內幾種重要的生物活性類二十烷酸的前體。在1970年代，觀察到格陵蘭的愛斯基摩人中心臟病的低發病率與長鏈co-3PUFAs的高攝入量相關(Dyerberg，J.等，Jmer.C7/w/V"扒28:958-966(1975);Dyerberg,丄等，Lfl髒f2(8081):117-119(July15，178))。近來更多的研究已證實了(o-3PUFAs的心血管保護效果(Shimokawa，H.，^/VrfyV"frZ)/W，88:100-108(2001);vonSchacky，(.,andDyerberg,丄，&vAto胸，88:90-99(200")。此外，已發現一些病症會對使用co-3脂肪酸進行治療作出反應，譬如血管成形術後再狹窄的速率、發炎與風溼性關節炎的症狀、哮喘、牛皮癬及溼滲等。已表明y-亞麻酸(GLA，一種io-6PlIFA)可降低同壓力相關的血壓增高，並可提高算術檢測的表現。已表明GLA與二高-Y-亞麻酸(DGLA，另一種(o-6PUFA)可抑制血小板聚集、導致血管舒張、降低膽固醇水平並抑制血管壁平滑肌與纖維組織的增殖(Brenner等，Jrfv.Exp.Merf.B/"/.83:85-101(1976))。已表明單獨給藥GLA或者DGLA，或同二十碳五烯酸(EPA，一種to-3PUFA)聯合給藥，可減少或防止腸胃出血以及其它由非甾體類抗炎藥物導致的副作用(S.4，666，701)。此外，已表明GLA或者DGLA可防止或治療子宮內膜異位及經期綜合症(11.S.4，758，592)，並可治療肌痛性腦脊髓炎與病毒感染後的慢性疲勞(U.S.5,116，871)。其它證據表明PlTAs可以參與調節4丐的新陳代謝，說明它們可以用於治療或預防骨質疏鬆以及腎臟或者尿路結石。最後，PUFAs可以用於治療癌症及糖尿病(l).S.4，826，877;Horrobin等，』m.C7/仏、旨,57(Suppl.):732S-737S(1993>)。PfJFAs—般分為兩大類(由w-6及o>3脂肪酸組成)，它們分別來自必需脂肪酸LA及ALA的脫氫作用以及碳鏈增長。儘管多種商品化的PlfFAs原料來源於天然原料[舉例來說，月見草、琉璃苣及紅醋慄的種子；被孢黴菌(Mo/t/^^〃fl)、/\r/7/y;nV//"w(紅藻)、魚油及海洋浮遊生物(C^，c/"fe〃fl、/V/toC、C，^corf/m'w附)I，但它們的生產方法上卻有一些不利之處。首先，諸如魚以及植物這樣的天然原料容易含有很高的異源油脂(oil)組分。因此從這些原料獲取的油脂需要進行大量的純化以分離或富集一種或者多種所需的PUFAs。天然原料在實用性方面還有無法控制的波動(舉例來說，由於氣候、疾病或者在魚群中過度捕魚)；而且，生產PUFAs的農作物在經濟上同雜交作物相比通常不具有竟爭性。某些可天然產生Pl!FAs的生物(譬如，/^//7/o'nV//Mw、被孢菌)的大規模發酵還可能比較昂貴，和/或難以以商業化的規模來培養。由於上述的局限性，已針對下述方面進行了大量的工作l.)發展可易於進行商業化生產的Pl!FAs的重組原料；2.)修飾脂肪酸生物合成途徑使得可生產所需的PL!FAs。例如，在過去幾年中，對多種生物的脂肪酸去飽和酶及碳鏈增長酶的分離、克隆及操作方面均取得進展。對這些基因序列的了解為在天然狀態下不產生Pl'FAs的全新的宿主生物中生產所需的脂肪酸和/或脂肪酸組分提供了希望。文獻報導了8畔酒糖酵母(iVflcc/ifl/"omj'c^)中的大量例子，譬如Domergue，F..等丄腸c/謂.269:4105-4113(2002))，其中將來源於海洋珪藻/Vi"rfflc印/wm/Wco附m似附的兩個去飽和酶克隆至譁酒糖酵母中，從而生產出EPA;BeaudoinF,，等(屍亂淑/./Jcflrf.f./1.97(12>:6421-6(2000))，其中在啤酒糖酵母中使用來源於線蟲(Oj^wo/Vifl6d/"、e/egflw:s)的基因再造了(o-3和(o-6Pl)FAs的生物合成途徑；Dyer，丄M"等(/.￡>wv'.M，嵐，59:224-230(2002)),其中在哞酒糖酵母中表達了植物脂肪酸去飽和酶(FAD2和FAD3)，從而生產出ALA;以及，l.S.6,136，574(Knutzon等，AbbottLaboratories),其中將一個來源於Bnw^/cawa/Hfs的去飽和酶和兩個來源於真菌Mo///^^〃fl的去飽和酶克隆至啤酒糖酵母中，從而生產出LA、GLA、ALA及STA。不過對於在其中可表達這些類型的基因從而提供商業規模大量生產的一種或多種具有商業化品質的PUFAs適合的植物和/或微生物系統仍然存在需求。此外，對於在特定的PUFAs中富集油脂，特別是EPA和DHA,也存在需求。一類先前沒有作為PUFAs生產平臺來進行研究的微生物是含油酵母。這些生物能夠積累高達其幹細胞重量80%的油脂。在高油含量下培養含油酵母的技術已經獲得很好的發展(例如，參見EP0005277B1;Ratledge，C.，/m/.M/cty^/o/.16:119-206(1982))，同用於生產(o-3或to-6PUFAs的商品化微藻類發酵相比，其成本更具優勢。完整的酵母細胞也可當作封裝所富集的(0-3或co-6Pl)FAs的便利途徑，用於功能性食品及動物飼料添加劑。儘管具有上述的優勢，但絕大多數含油酵母在天然狀態下均缺少(o-6Pl'FAs——因為這些生物中天然產生的PUFAs通常為18:2的脂肪酸。因此，需要解決的問題是開發出一種可以積累富含w-3和/或(o-6脂肪酸的油脂的含油酵母。為了這個目的，不僅需要導入可在含油酵母中合成並積累(0-3和/或w-6脂肪酸所需的去飽和酶和碳鏈增長酶，而且還要增加18:3底物(即，用於w-3生產的ALA)的可用性。一般地，可通過能夠將LA轉化為ALA的A15去飽和酶的活性來控制該底物的可用性。在本發明完成時所公開的文獻中揭示了多種已知的A15去飽合酶，包括來自光合生物(譬如植物)及線蟲的酶。這些酶並不是因為可在含油酵母中有效改變脂肪酸組分才為人所知的，而且也沒有被優選用於含油酵母中。此夕卜，在非含油酵母5"flcc/iflrom,vcesc'erev/s/"e中異源表達這些去飽和酶，獲得了產量低於5%的ALA(Reed，D.等P/fl"f122:715-720(2000);Meesapyodsuk，D.等腸c/i亂39:11948-11954(2000);WO2003/099216)。因此，有必要去鑑定並分離在用來生產PUFAs的含油微生物(譬如，含油酵母)中能夠維持18:3(ALA)的高水平產量以及w-3對o-6脂肪酸為更高比例的編碼A"去飽合酶的基因。本發明具體涉及從真菌串珠鐮孢中分離的編碼A15去飽合酶的基因，它在含油酵母中表達後表現出令人驚訝的18:2(LA)對18:3(ALA)的轉化效率。在稻瘟病菌(MagWfl/WW/li)、禾穀鐮孢菌(FMS"〃'W〃！gm附/wefl/'/ti附)、構巢麴黴(/i5/^rg/〃ws;i/rfw/a/w)及粗糙鏈孢菌中也確定了該A15去飽合酶的直系同源基因。不過，對串珠鐮孢與稻瘟病菌的去飽和酶活性進行進一步的實驗分析，結果令人驚訝，表明兩種去飽和酶均具有A12去飽和酶活性(因此在本申請中將這些酶描述為具有雙功能的A12/A15去飽合酶活性)。除了對可用作PUFAs生產平臺的含油酵母外，還涉及對其它亦可選擇作為Pl)FAs生產平臺的植物。WO02/26946,於2002年4月4日公開了所分離到的可在LCPl)FA-產'生生物譬如，破嚢壺菌、/^V由'"附//T"M/flA*e、AW".Z/C一〃.W附及Oj/^""^"/w附中進行表達的編碼FAD4、FAD5、FAD5-2及FAD6脂肪酸去飽和酶家族成員的核酸片段。這表明為了生產能夠產生LCPUFAs的細胞，可將含有去飽和酶基因的構建體用於包括植物、動物及微生物在內的任何表達系統,，WO02/26946，於2002年4月4日公開了FAD4、FAD5、FAD5-2及FAD6脂肪酸去飽和酶家族成員以及其生產長鏈多不飽和脂肪酸的用途。WO98/55625，於1998年12月19日公開了在植物中通過表達類聚酮化合物合成基因來生產多不飽和脂肪酸。WO98/46764，於1998年10月22日乂^開了在植物、植物部分及植物細胞製備長鏈脂肪酸的組分及方法，該法利用了核酸序列以及編碼脂肪酸去飽和酶包括A5去飽和酶、A6去飽和酶及A12去飽和酶的構建體。美國專利No.6,075,183，由Knutzon等於2000年6月13日/>開了在植物中合成長鏈不飽和脂肪酸的方法及組分。美國專利No.6，459，018，由Knutzon等於2002年10月1日公開了在植物種子中利用含有編碼A6去飽和酶DNA序列的構建體來生產硬脂艾杜糖酸的方法。Spychalla等,ZVm.淑/.,，Vol.94,1142-1147(Feb.1997),描述了對來源於線蟲中某個cDNA，當在擬南齊中表達時，它編碼一個可催化在18-及20-碳脂肪酸中引入w-3雙鍵的脂肪酸去飽和酶的分離與鑑定。發明簡述本發明提供了一種新發現的真菌A15去飽合酶以及編碼該酶的核酸序列。這種酶，以及本申請中所鑑定的真菌直系同源基因，其獨特之處在於它們可同時進行A15與A12脫氫反應。此外，本發明提供了可表達該真菌A15去飽合酶的宿主細胞。因此本發明提供了分離的、編碼真菌A15去飽合酶的核酸片段，其選自(a)分離的、編碼在SEQIDNO:2中所示的胺基酸序列的核酸片段；(b)分離的、在下述雜交條件下可與(a)雜交的核酸片段所述雜交條件指O.lxSSC，0.1%SDS，65€，在2xSSC，0.1V-SDS之後用O.lxSS(:，(U'54SDS清洗；或者分離的、與(a)或(b)互補的核酸片段。作為選擇，本發明提供了分離的、包含編碼A15去飽合酶中至少402個胺基酸的第一段核酸序列在內的核酸片段當其同具有SEQ1DISO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的Clustal方法表明兩者具有至少86%的同一性；或者是包含第一段核酸序列互補序列的第二段核酸序列"此外，本發明提供了由本申請所述的核酸所編碼的多肽，以及基因嵌合體和包含它們的轉化宿主。在本發明應用中優選的宿主細胞包括，但並不局限於植物、藻類、細菌、酵母和真菌。在另一個實施例中，本發明提供了一種用於生產ot-亞麻酸的方法，包括a)提供宿主細胞，其含有(i)分離的、編碼具有A15去飽合酶活性的蛋白的核酸片段，當所迷蛋白同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的Clustal方法表明它們具有至少46.2%的同一性；及(U)亞油酸的來源；b)在編碼具有A15去飽合酶活性的蛋白的核酸片段可以被表達並且亞油酸可被轉化為a-亞麻酸的條件下，培養步驟(a)中的宿主細胞；以及c)選擇回收步驟(b)中的a-亞麻酸。類似地，本發明提供了一種用於生產a-亞麻酸的方法，包括a)提供宿主細胞，它含有(i)分離的、編碼具有A15去飽合酶活性的蛋白的核酸片段，當所述蛋白同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的Clustal方法表明它們具有至少4f).2。/。的同一性；及(H)油酸的來源；b)在編碼具有Al5去飽合酶活性的蛋白的核酸片段可以被表達並且油酸可被轉化為a-亞麻酸的條件下，培養步驟(a)中的宿主細胞；以及e)選擇回收步驟(b)中的a-亞麻酸。作為選擇，本發明提供了一種用於在宿主細胞中生產w-3脂肪酸的方法，包括a)提供宿主細胞，它含有(i)分離的、編碼具有A15去飽合酶活性的蛋白的核酸片段，當所述蛋白同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的Clustal方法表明它們具有至少46.2%的同一性；及編碼具有功能的w-3/o)-6脂肪酸生物合成途徑的基因；b)提供由油酸組成的去飽和酶底物來源；c)在產生co-3脂肪酸的條件下使用步驟(b)中的去飽和酶底物培養步驟(a)中的宿主細胞；及d)逸摔回收步驟(t')中的oK5脂肪酸。在一個可選擇的實施例中，本發明提供了一種在產生o>3脂肪酸及(o-6脂肪酸的宿主細胞中提高w-3脂肪酸對to-6脂肪酸比例的方法，包括a)提供可產生co-3脂肪酸及w-6脂肪酸的宿主細胞；b)向(a)中的宿主細胞導入分離的、編碼蛋白的核酸片段，當所述蛋白同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的Clustal方法表明它們具有至少46.2%的同一性，其中多肽可與作為酶底物的油酸及亞油酸結合，其中w-3脂肪酸對(0-6脂肪酸比例增加了。此外，本發明提供了通過本發明中的方法來生產微生物油。在另一個實施例中，發明涉及用於改變油籽植物的成熟種子中總脂肪酸語的重組構建體，以生產w-3:co-6比例大於0.4的油脂，所述含有分離的核酸片段的構建體從由下述幾項所組成的組中選擇(a)分離的、編碼SEQlDNO:2中所示的全部或部分胺基酸序列的核酸片段；(b)分離的、當使用O.lxSSC、0.1%SDS、65t:洗滌時可與(a)雜交的核酸片段；(c)分離的、編碼胺基酸序列的核酸片段，所述胺基酸序列基於序列比對的ClustalV方法，同SEQIDNOs:2、6、10、14、18所示的胺基酸序列具有至少46.2%的序列同一性；或者(d)分離的、同(a)(b)或(c)完全互補的核酸片段。其中所述的分離的核酸片段可通過操作連接到至少一種調控序列上在第二個實施例中，本發明涉及在其基因組中含有本發明中的重組構建體的油籽植物、植物細胞、植物組織或植物部分。在笫三個實施例中，本發明還涉及從這些植物中所獲得的種子、從這些種子中獲得的油脂、以及在油脂加工過程中獲得的副產品。在第四個實施例中，本發明涉及本發明中的油脂在食品、動物祠料或者工業應用中的用途，以及本發明中的副產品在食品或動物伺料中的應用。在第五個實施例中，本發明涉及在油籽植物中提高o>-3脂肪酸對w-6脂肪酸比例的方法，包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇同未轉化植物中co-3脂肪酸對o)-6脂肪酸的比例相比，to-3脂肪酸對to-6脂肪酸比例有所提高的那些轉化植物。在第六個實施例中，本發明涉及通過本方法製備的油籽植物、從這些植物中獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物飼料中的用途、在該油脂加工過程中獲得的副產品以及這些副產品在食品或動物祠料中的應用。在第七個實施例中，本發明涉及在油籽植物的種子中產生a-亞麻酸的方法，其中種子中a-亞麻酸的含量至少為種子油中總脂肪酸含量的25%，所述的方法包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇那些其中所含a-亞麻酸至少為種子油中總脂肪酸含量25%的轉化植物。在第八個實施例中，本發明涉及通過本方法製備的油籽植物、從這些植物獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物飼料中的用途、在該油脂加工過程中獲得的副產品以及這些副產品在食品或動物祠料中的應用。在接下來的另一個實施例中，本發明涉及用於改變油籽植物成熟種子中總脂肪酸譜的重組構建體，以生產0)-3對(o-6比例大於2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高於2%，所述的構建體含有從由下述各項所組成的組中所選擇的分離的核酸片段a)分離的、編碼SEQ1DNO:2中所示的全部或部分胺基酸序列的核酸片段；b)分離的、當使用O.lxSSC:、0.1%SDS、65i:洗滌時可與(a)雜交的核酸片段；c)分離的、編碼胺基酸序列的核酸片段，所述胺基酸序列基於序列比對的ClustalV方法，同SEQIDNOs:2、6、10、14、18所示的胺基酸序列具有至少46.2%的序列同一性；或者d)分離的、同(a)(b)或(c)完全互補的核酸片段。其中所述的分離的核酸片段可通過操作連接到至少一種調控序列上。在進一步的實施例中，本發明涉及在其基因組中含有本發明中的重組構建體的油籽植物、植物細胞、植物組織或植物部分。本發明還涉及從這些植物獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物飼料中的用途、在該油脂加工過程中獲得的副產品以及這些副產品在食品或動物飼料中的應用。此外，本發明提供了通過本發明中方法生產的微生物油。在另一個實施例中，本發明涉及在油籽植物種子中產生二十碳五烯酸的方法，以生產co-3對co-6比例大於2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高於種子油總脂肪酸含量的2%,所述方法包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇那些其中所含二十碳五烯酸至少為種子油中總脂肪酸含量2%的轉化植物。在進一步的實施例中，本發明涉及在其基因組中含有本發明中的重組構建體的油籽植物、植物細胞、植物組織或植物部分。本發明還涉及從這些植物獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物伺料中的用途、在該油脂加工過程中荻得的副產品以及這些副產品在食品或動物飼料中的應用。此外，本發明提供了通過本發明中的方法生產的微生物油。生物保藏下述質粒保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,並有下面所述的名稱、保藏號及保藏日期。tableseeoriginaldocumentpage16附圖的簡要描述及序列描述圖1所示的是在含油酵母中脂類積累的生化機制的示意圖。圖2所示的是w-3及w-6脂肪酸生物合成途徑。圖3所示的是可在hmw/fl/^o/^/oz中進行基因表達的質粒載體pY5的構建。圖4所示的是來自不同絲狀真菌(即，構巢麴黴、串珠鐮孢、禾穀鐮孢菌、稻瘟病菌和粗糙鏈孢菌)的、與Fflnwv/"A12去飽和酶具有同源性的蛋白的系統發育樹，使用MegalignDNASTAR軟體生成。圖5所示的是來自不同的絲狀真菌且與yflmw/"//^(y"c"A12去飽和酶具有同源性的蛋白之間的成對比較(％同一性)——使用的是ClustalW分析(DNASTAR軟體中的Megalign程序)。圖6為質粒pKR578的示意圖(參見實施例11)。圖7為質粒pKR585的示意圖(參見實施例13)。圖8為質粒pKR274的示意圖(參見實施例14)。圖9為質粒pKKE2的示意圖(參見實施例15)。通過下述詳細描述及作為本申請的一個組成部分的相關序列描述可以更完整地理解本發明。下述序列遵照37C.F.R.§1.821-1.825("含有核苷酸序列和/或胺基酸序列的專利申請的相關要求公告——序列規則")，並與世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO與PCT的序列列表要求(規則5.2與49.5(a-bhO，以及208節與附件C)相一致。用於核苷酸及胺基酸序列數據的符號與格式遵照37C.F.R.§1.822所示的規則《SEQIDNOs:l-20、54和55為如表1中所確定的編碼基因的ORFs或蛋白表1去飽和酶基因與蛋白序列號描述串珠鐮孢亞族1去飽和酶lA15/A12去飽和酶)串珠鐮孢亞族2去飽和酶構巢麴黴亞族1去飽和酶(A15去飽合酶)構巢麴黴亞族2去飽和酶稻瘋病菌亞族1去飽和酶(A15去飽合酶)稻瘋病菌亞族2去飽和酶粗糙鏈孢菌亞族1去飽和酶(A15去飽合酶)___________________粗糙鏈孢菌亞族2去飽和酶tableseeoriginaldocumentpage17SEQIDNOs:21和22分別為引物TEF5'與TEF3'，用於分離TEF啟動子。SEQIDNOs:23和24分別為引物XPR5'與XPR3',用於分離XPR2轉錄終止子。SEQIDNOs:25-36分別對應於引物YL5、YL6、YL9、YL10、YL7、YL8、YL3、YL4、YL1、YL2、YL61和YL62，用於質粒構建。SEQ1DNO:37對應於命名為"GPDPro"的971bp的片段，在y"/rmW"/^o&"cfl中被鑑定為推斷的甘油醛-3-鱗酸去飽和酶啟動子。SEQlDNOs:38和39分別為引物YL211與YL212，用於擴增包括///w(y""/甘油醛-3-磷酸去飽和酶(GPD)啟動子在內的DNA片段。SEQ1DNOs:40和41分別為GPDsense和GPDantisense引物，用於再次擴增GPD啟動子。SEQlDNOs:42和44分別是鑑定為P73與P76的變性引物，用於分離FflA7Y7W/fl/^70/》'"Cfl的A12去飽和酶基因。SEQIDNOs:43和45分別是與變性引物P73與P76相對應的胺基酸一致序列。SEQlDNOs:46-49分別對應於引物P99、P100、P101和P102，用於定點破壞天然的KA12去飽和酶基因。SEQIDNOs:50-53分別對應於引物P119、P120、P121和P122，用於篩選所破壞的K///w/》'"o/A12去飽和酶基因的定點整合。SEQIDNOs:56和57分別為引物P192和P193，用於擴增串珠鐮孢A15去飽合酶("Fmi")的編碼區。SEQIDNO:58對應於在hmw/fl中用於基因最佳表達的密碼子優化的翻譯起始位點。SEQIDNOs:59-64分別為引物P186、P187、P188、P189、P190和P191，用於擴增潛症病麥A15去飽合酶("Mgl")。SEQIDNOs:65-72分別為引物PFglUPl、PFglLPl、PFglUP2、PFglLP2、PFg證3、PFglLP3、PFg證4和PFglLP4，用於擴增禾穀鐮孢菌M5去飽合酶("Fgl")。SEQ1DNO:73為實施例6中所述的在Kti啟動子上遊引入的多限制性內切酶位點序列。SEQIDNO:74列出了實施例6中所述的大豆白蛋白轉錄終止子及限制性內切酶位點的序列。SEQ1DNO:75為用於擴增白蛋白轉錄終止子的引物oSalb-12。SEQ1DNO:76為用於擴增白蛋白轉錄終止子的引物oSalb-13。SEQ1DNO:77為實施例6中所述的在P-伴大豆球蛋白啟動子前面引入的多限制性內切酶位點序列。SEQIDNO:78為實施例11與圖5中所描述的質粒pKR578的全序列。SEQID1NO:79列出了用於擴增大豆膜聯蛋白啟動子的寡核苷酸引物GSP1。SEQIDNO:80列出了用於擴增大豆膜聯蛋白啟動子的寡核苷酸引物GSP2。SEQIDNO:81列出了膜聯蛋白啟動子的序列。SEQIDNO:82列出了用於擴增大豆BD30啟動子的寡核苷酸引物GSP3。SEQIDNO:83列出了用於擴增大豆BD30啟動子的寡核苷酸引物GSP4。SEQIDNO:84列出了大豆BD30啟動子的序列。SEQIDNO:85列出了大豆|5-伴大豆球蛋白P-亞基啟動子的序列。SEQIDNO:86列出了用於擴增大豆P-伴大豆球蛋白[5-亞基啟動子的寡核苷酸引物p-conoligoBam。SEQIDNO:87列出了用於擴增大豆p-伴大豆球蛋白(5-亞基啟動子的寡核苷酸引物P-conoligoNot。SEQlDNO:88列出了大豆中大豆球蛋白Gly-l啟動子的序列。SEQIDNO:89列出了用於擴增Gly-l啟動子的寡核苷酸引物glyoligoBam。SEQIDNO:90列出了用於擴增Gly-l啟動子的寡核苷酸引物glyoligoINot。SEQ1DNO:91為用於擴增Kti/Notl/Kti3'盒的引物oKTi5。SEQ1DNO:92為用於擴增Kti/Notl/Kti3'盒的引物oKTi6。SEQ1DN:93為用於擴增大豆BD303'轉錄終止子的引物oSBD30-l'SEQIDN:94為用於擴增大豆BD303'轉錄終止子的引物oSBD30-2。SEQ1DNO:95為實施例13與圖6中所描述的質粒pKR585的全序列SEQIDNO:96為用於擴增高山被孢黴菌A6去飽和酶的引物o(GR5-1。SEQIDNO:97為用於擴增高山被孢黴菌A6去飽和酶的引物o(GR5誦2。SEQIDNO:98為用於擴增大豆球蛋白Gyl啟動子的引物oSGly-1。SEQ1DNO:99為用於擴增大豆球蛋白Gyl啟動子的引物oSGly-2.SEQIDNO:100為用於擴增legA2啟動子序列的引物LegPro5'。SEQIDNO:lOl為用於擴增legA2啟動子序列的引物LegPro3'。SEQIDNO:102為用於擴增leg2A轉錄終止子的引物LegTerm5'。SEQIDNO:103為用於擴增leg2A轉錄終止子的引物LegTerm3'。SEQ1DMO:104為用於擴增高山被孢黴菌去飽和酶的引物CGR4forward。SEQ1DNO:105為用於擴增高山被孢黴菌去飽和酶的引物(、GR4re、'erse。SEQ1DNO:106為用於擴增高山被孢黴菌(MoW/^^〃"a/p/mz)碳鏈增長酶的正向引物——RPB2forward。SEQIDNO:17為用於擴增高山被孢黴菌碳鏈增長酶的反向引物---RPB2re、'erse。SEQIDNO:108為用於形成Asclliker的引物Asc5。SEQIDNO:109為用於形成Asclliker的引物Asc3。發明的詳細描述所有引用的專利、專利申請及出版物均以參考的形式將其內容整合在本申請中。本發明涉及編碼A15去飽合酶的串珠鐮孢基因及;^症^#基因的分離以及其同一性的確定，並在其它真菌中鑑定它們的直系同源基因。此外，還提供了可修飾植物，特別是油籽植物與產油生物，包括含油酵母(譬如yrtA7Wv/"//jfw(v〃cfl)和植物(譬如，大豆、玉米及向曰葵)中長鏈多不飽和脂肪酸(P11FA)含量及組分的方法與組成。本發明中的A15去飽合酶還可通過它們可以作用於兩種酶底物油酸和亞油酸的能力來識別。發明涉及新穎的A15去飽合酶以及編碼該酶的基因，可以用這種酶來控制生成有益於健康的Pl]FAs的生化途徑。因此，本發明具有很多應用。才艮據本申請中所公開的方法，PUFAs或其衍生物可用作那些利用靜脈營養、或者預防或治療營養不良的病人的飲食代用品或者添加劑，特別是嬰兒配方食品。或者，純化的PDFAs(或其衍生物)可以加入到菜油、脂肪或配製的人造黃油中，在正常使用中可以使接受者獲得足夠量的飲食補充。PUFAs還可以加入嬰兒配方食品、營養添加劑或其它食物產品中，並可以發現它可作為抗炎或降低膽固醇的試劑使用。此外，組分可用於藥學用途(人類的或獸醫的)。在此案例中，PLFAs通常通過口服給藥，但也可以通過可成功吸收PDFAs的其它任意途徑，譬如腸道外(例如皮下、肌內或靜脈內)、直腸、陰道或者局部(譬如，作為皮膚軟膏或洗劑)給藥。對人或動物補充通過重組方式生產的PUFAs可以提高所加入的Pl)FAs及其代謝衍生物的水平。例如，使用花生四烯酸(ARA)治療不僅可以提高ARA的水平，還可提高諸如前列腺素類這樣的ARA下遊產物的水平。複雜的調控機制讓人期望聯合使用多種PUFAs、或者添加不同的PDFAs的結合物，以預防、控制或克服這樣的機制，在某個個體達到特定Pl;FAs的期望水平。在本公開資料範圍內將使用大量的術語。"開放閱讀框"縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應"縮寫為PCR。"美國典型培養物保藏中心"縮寫為ATCC。"多不飽和脂肪酸"縮寫為PUFA(s)。術語"串珠鐮孢(Fwfl,'/Mm附o附7(/i^me)，，與Fws"n.Mmve"/"7/wW"含義相同。"食品類似物"是人造的、類似其食品副本的象食品一樣的產品，無論是肉、乾酪、牛奶還是其它類似物，它特意具有其副本的外觀、味道和質地。因此，本申請中所用的術語"食品"也包含食品類似物。"水產祠料"指在涉及淡水或海水中水生生物、動物和/或植物的繁殖、培養或飼養的水產養殖場中使用的飼料。本申請中所用的術語"動物伺料"也包含水產飼料。術語"脂肪酸"指的是不同鏈長的長鏈脂肪族酸(烷酸)，其長度從約C,2至c22(儘管已知有更長及更短鏈長的酸)。多數鏈長在c16和(:22之間。脂肪酸的結構可以通過一個簡單的符號體系"X:Y，，來表示，其中X是特定脂肪酸中C原子的總數，Y是雙鍵的數目。一般地，脂肪酸可分為飽和的或不飽和的。術語"飽和脂肪酸"指在碳主鏈上沒有"雙鍵"的那些脂肪酸。相反，"不飽和脂肪酸"在碳主鏈上有"雙鍵"(它們通常多為順式構型)。"單不飽和脂肪酸"在碳主鏈上僅有一個"雙鍵"(譬如，對於棕櫚油酸(16:1)及油酸(18:1)而言通常位於第9和第10個碳原子之間)，而"多不飽和脂肪酸"(或"PlJFAs，，)在碳主鏈上至少有個雙鍵(譬如，對於亞油酸(18:2)而言位於第與第10、及第12與第13個碳原子之間；對於a-亞麻酸(18:3)而言位於第9與第10、第12與第13、及第15與第16個碳原子之間)。"PUFAs"可以分為兩個主要的家族(根據離脂肪酸碳鏈曱基末端最近的第一個雙鍵的位置)。因此，"(o-6脂肪酸"(co-6或者"-6)在距分子的co(曱基)末端6個碳原子處有其第一個不飽和雙鍵，並且共有兩個或更多雙鍵，後續不飽和鍵在向著分子羧基末端每再隔3個碳原子處形成。作為對比，"w-3脂肪酸"(co-3或者"-3)在距分子的o)末端3個碳原子處有其第一個不飽和雙鍵，並且共有三個或更多雙鍵，後續不飽和鍵在向著分子羧基末端每再隔3個碳原子處形成。對本發明來說，將使用to-參照系統來指明碳原子數目、雙鍵的數目以及距離co碳最近的雙鍵的位置，從co碳開始計數(在這個用法中它編號為1)。該命名法如下面的表2中標題為"縮略符號"的列中所示。表中其餘部分總結了(o-3與w4脂肪酸的常用名、在說明書全文中將使用的縮寫、及每種化合物的化學名。多不飽和脂肪酸的命名法tableseeoriginaldocumentpage23特別地，據此將(o-3脂肪酸定義為來自下面列表中的脂肪酸——其中括號內的數字表明雙鍵距脂肪酸羧基末端的位置a亞麻酸IALA;18:3(9,12,15)1、硬脂艾杜糖酸!STA;18:4(6，9，12，15)|、二十碳四烯酸IETA;20:4(8，11，14，17)|、二十碳五烯酸EPA;20:5(5，8，"，14，17>|、二十二碳五烯酸IDPA;22:5(7，10，13，16，19)|及二十二碳六烯酸|DHA;22:6(4,7,10，13,16，19)|。類似地，據此將co-6脂肪酸定義為來自下面列表中的脂肪酸——其中括號內的數字表明雙鍵距脂肪酸羧基末端的位置亞油酸ILA;18:2(9,12)、"亞油酸GLA;18:3(6，9，12)、二高-，亞油酸IHGLA或DGLA;20:3(8，11，14)|、花生四烯酸IARA;20:4(5，8，11，14)|及二十二碳四烯酸IDTA;22:4(7，10，13，16)j。牽涉到任一種脂肪酸濃度的術語"濃度"，在本申請中指的是樣品中個別脂肪酸的量除以所有脂肪酸的總量。o-3脂肪酸的濃度被定義為樣品中所有toJ脂肪酸(定義如上)的量除以所有脂肪酸的總量。w-6脂肪酸的濃度被定義為樣品中所有w-6脂肪酸(定義如上)的量除以所有脂肪酸的總量。典型地，脂肪酸濃度可以表示為重量百分比(wt.%-個別脂肪酸的質量除以所有脂肪酸的質量再乘以100%)或摩爾百分比(mol"/"-個別脂肪酸的摩爾數除以所有脂肪酸的總摩爾數再乘以100%)。術語"o)-3對co-6脂肪酸的比例"或"o-3對co-6的比例"(n-3/")在本申請中定義為g)-3脂肪酸的濃度除以(0-6脂肪酸的濃度(wt.%co-3/wt.%co-6或者mol%o)-3/mol%w-6)。術語"必需脂肪酸"指一類特別的PUFA——個體必須攝取才能存活，卻無法從無到有合成出必需脂肪酸來。亞油酸(18:2，toA)和亞麻酸(18:3，co-3)兩種脂肪酸是"必需脂肪酸"，因為人無法合成它們，必須從食物中獲取》術語"脂肪"指在TC為固體的脂類物質，通常是飽和的。術語"油脂(oil)"指在25i:為液體的脂類物質，通常是多聚不飽和的。在某些藻類、含油酵母和絲狀真菌的油脂中發現PUFAs。"微生物油"或"單細胞油脂"是那些由微生物在其生命期間天然產生的油脂。這些油脂可含有長鏈Pl'FAs。術語"PDFA生物合成途徑的酶"指下述同PUFA生物合成相關的酶中的任意一個(以及編碼所述酶的基因)，包括A4去飽和酶、A5去飽和酶、A6去飽和酶、A12去飽和酶、A15去飽合酶、A17去飽和酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶和/或碳鏈增長酶。術語"co-3/w-6脂肪酸生物合成途徑"指的是一系列基因，當它們在適當條件下表達時，所編碼的酶可催化co-3及(o-6脂肪酸的產生。典型地，同w-3/co-6脂肪酸生物合成途徑相關的基因編碼下列酶中的一部分或全部A12去飽和酶、A6去飽和酶、碳鏈增長酶、去飽和酶、A17去飽和酶、A15去飽合酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶及A4去飽和酶。一個具有代表性的途徑如圖2所示，用來提供油酸通過多種中間體到DHA的轉化方式，該圖展示了(o-3及co-6脂肪酸是如何從普通原料中生成的。途逕自然分成兩部分，一部分生成w-3脂肪酸，另一部分只有W-6脂肪酸。僅生成CO-3脂肪酸的部分在本申請中將指代O)-3脂肪酸生物合成途徑，而僅生成co-6脂肪酸的部分在本申請中將指代co-6脂肪酸生物合成途徑。在人體內，有證據表明0)-3脂肪酸具有降低血液中三酯醜甘油水平的效果。其它證據支持它具有保護作用可防止致命性心臟病發作。亞油酸和a-亞麻酸均是合成來源於其長鏈代謝產物的類花生酸(eicosonoids)的前體。在合成過程中，這些代謝產物會竟爭相同的酶。那些來源於a-亞麻酸(w-3)的代謝產物同來源於亞油酸((0-6)的相比，具有更低的炎症及免疫性效應。a-亞麻酸還可以產生二十二碳六烯酸(DHA)----種人腦和視網膜的主要成分。tt-亞麻酸最豐富的來源是某些種子油，譬如亞麻籽油、油菜籽油、大豆油及某些堅果，尤其是核桃。具有很長鏈的、可在體內從a-亞麻酸製備的co-3脂肪酸DHA及二十碳五烯酸(EPA),可在魚油和富含油脂的鮮魚肉(不是罐頭金槍魚)中獲取。來自亞麻的諸如亞麻籽油這樣富含a-亞麻酸的油脂，還具有工業用途，可作為"千性油，，用於清漆及油漆中,，本申請中所用的同o-3/o)-6脂肪酸生物合成途徑相關的術語"功能性的"指在途徑中部分(或者所有)基因表達具有活性的酶。可以這樣理解"ca-3/o)-6脂肪酸生物合成途徑"或者"功能性w-3Ao-6脂肪酸生物合成途徑"並不是表明上面段落中所示的基因都是必需的，因為很多脂肪酸產物僅需要該途徑中部分基因表達即可。術語"去飽和酶"指可以在一種或多種脂肪酸中可降低飽和度即，引入雙鍵從而生成所需的單或多不飽和脂肪酸或前體的多肽。儘管在本說明全文中對於特定的脂肪酸使用了a)-參照系統，但使用A-系統通過從底物的羧基末端開始計數的方式來表明去飽和酶的活性更為便利,，本申請中特別關注的是A15去飽合酶，它在從分子的羧基末端數起第十五個與第十六個碳原子之間處降低脂肪酸的飽和度，並催化LA轉化為ALA。同本發明相關的其它去飽和酶包括催化油酸轉化為LA的A12去飽和酶；催化DGLA轉化為ETA和/或ARA轉化為EPA的"7去飽和酶；催化LA轉化為GLA和/或ALA轉化為STA的A6去飽和酶；催化DGLA轉化為ARA和/或ETA轉化為EPA的A5去飽和酶；催化DPA轉化為DHA的A4去飽和酶；催化EDA轉化為DGLA和/或ETrA轉化為ETA的A8去飽和酶；以及催化軟脂酸轉化為棕櫚頁油酸和/或硬脂酸轉化為油酸(18:1)的A9去飽和酶。在本領域中，A15及AH去飽和酶有時也稱為"omega-3去飽和酶"、"w-3去飽和酶"、和/或"o)d去飽和酶"。某些去飽和酶對兩種或多種底物均有活性(譬如，異絲水黴(A'a/m/"w/"力W/w")A17去飽和酶的底物包括ARA和DGLA，線蟲co-3去飽和酶的底物包括LA和GLA，本申請中描述的串珠鐮孢A15去飽合酶的底物包括LA、GLA和DGLA)。術語"雙功能"在涉及本發明中A15去飽合酶時指的是具有同時以油酸及亞油酸作為酶底物的能力的多肽。關於"酶底物"，指的是多肽在活性位點上結合的、並以催化方式與其作用的底物。術語"與FflATOH7'fl///70/》力'"/A12去飽和酶同源的蛋白"指的是本申請中SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18與20所確定的、與本申請中SEQIDNO:55(在共同待決美國專利申請10/840325中確定，其內容通過參考的方式整合在本申請中)所確定的K/^0/》'"Cfl去飽和酶具有同源性的蛋白。系統發育分析表明這些蛋白(即，SEQID、Os:2、4、6、8、10、12、，4、16、18和20)歸於兩個不同的亞族中，在本申請中為"亞族l"及"亞族2"。特別地，亞族1中的蛋白(即，SEQ"》Ns:2、6、10、14和18)~~如本申請所鑑定，編碼A15去飽合酶。相反，亞族2中的蛋白編碼具有A12去飽和酶活性的蛋白(即，SEQ11)Ns:4、8、12、16和20;參見共同待決美國專利申請60/570679，其內容通過參考的方式整合在本申請中)。術語"轉化率"及"底物轉化百分比"指的是特定的酶(譬如，去飽和酶或者碳鏈增長酶)將底物轉化為產物的效率。轉化率根據下面的公式來計算(|產物|/|底物+產物1)x100，其中"產物"包括中間產物以及途徑中由它衍生的所有產物。在本申請中，期望能夠鑑定那些在諸如含油酵母宿主這樣的真核生物中表達時具有高底物轉化百分比((|18:3|/|18:2+18:3|)xiO)的A15去飽合酶;這樣，例如，至少約為50%的ALA轉化率是可用的，至少約為80%的ALA轉化率是優選的，而至少約為90%的ALA轉化率是特別優選的，至少約為95%的ALA轉化率是最優選的。術語"碳鏈增長酶"指的是能夠增加脂肪酸的碳鏈並生成比碳鏈增長酶所作用的脂肪酸底物長兩個碳的酸的多肽。碳鏈增長過程是一個同脂肪酸合成酶相關的多步機制，在這裡CoA是醯基栽體(Lassner等，77w屍/fl,"C>〃8:281-292(19%))。簡單說，丙二醯-CoA同長鏈醯基-(:oA縮合，生成C2及P-酮脂醯-CoA(其中醯基部分增長了兩個碳原子)》隨後的反應包括還原成p-幾醯-CoA、脫水生成烯醯-CoA、及再次還原生成已增長的醯基-(:oA。碳鏈增長酶所催化的反應的實施例有GLA轉化為DGLA、STA轉化為ETA及EPA轉化為DPA。因此，碳鏈增長酶可以具有不同的特異性。例如，。6/18碳鏈增長酶優先使用CH>底物，('18/2(,碳鏈增長酶優先使用C,8底物，o/i.Af/c/7>/>/o/.57:419-25(1991))。含油微生物累積了超過其細胞乾重約25%的油脂的情況並不常見。含油酵母的實施例包括，但不局限於下列屬y"nwW"、假絲酵母屬(C"wrf/rffl)、紅酵母屬(//^rf^w"/fl)、紅冬孢酵母屬(/^"rf"Aywr/rf/M"0、隱球酵母屬、絲孢酵母屬及油脂酵母屬。術語"可發酵的碳底物"是指微生物可以代謝並產生能量的碳源。本發明中典型的碳源包括，但不局限於單糖、寡糖、多糖、烴類、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、二氧化碳、曱醇、甲醛、曱酸酯及含碳的胺》術語"密碼子優化"當其涉及用於轉化多種宿主的基因或核酸片段的編碼區時，所指的是在不改變DNA所編碼的多肽的前提下，改變基因或核酸片段的編碼區的密碼子使其與宿主中典型的密碼子使用情況相符。在本申請用法中，"分離的核酸片段"是一段單鏈或者雙鏈的RNA或DN'A多聚體，可含有合成的、非天然的或者改造的核苷酸鹼基。DNA多聚體形式的分離的核酸片段可以是由一個或多個cDNA、基因組DNA或合成的DNA片段所組成的。術語"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸序列"及"核酸片段"/"分離的核酸片段"在本申請中可替換使用。這些術語包含核苷酸序列及其它類似名稱。多核苷酸可以是單鏈或者雙鏈的RNA或DNA多聚體，可含有合成的、非天然的或者改造的核苷酸鹼基。DNA多聚體形式的多核苷酸可以是由一個或多個cDNA、基因組DNA、合成的DNA片段或其混合物所組成的。核苷酸(通常以其—磷酸的形式存在)通常使用單個字母來指代，如下所示"A"為腺苷酸或者脫氧腺苷酸(分別對應RNA或DNA)，"(:"為胞苷酸或者脫氧胞苷酸，"G"為鳥苷酸或者脫氧鳥苷酸，"ll"為尿苷酸，"T"為脫氧胸苷酸，"R"為嘌呤(A或(；)，"Y"為嘧啶(C或T),"K"為G或T，"H"為，V或C或T，"r，為次黃嘌呤，"N"為任意核苷酸。術語"功能上等價的亞片段"及"功能等價亞片段"在本申請中可替換使用。這些術語指的是某個分離的核酸片段的一部分或亞序列，其中無論該片段或者亞片段是否編碼具有活性的酶，依然保存著改變基因表達或者產生某種表型的能力。例如，片段或亞片段可用於在轉化植株中產生所需表型的嵌合基因的設計中。可通過連接相對於植物啟方式來設計用於抑制作用中的嵌合基因。當核酸片段的單鏈形式可同其它核酸片段在適當的溫度及溶液離子強度條件下退火時，核酸片段同另一個核酸片段，譬如，cDNA、基因組DMA或RNA分子是"可以雜交"的。雜交及洗滌條件是眾所周知的，並在Sambrook,丄，Fritsch,E.F.andManiatis，T.MolecularCloning:ALahoratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory:(oldSpringHarbor,NY(")89)中、尤其是11章與其中的表11.1(通過參考的方式完全整合在本申請中)中有例證。溫度和離子強度的條件決定了雜交的"嚴謹性"。可以調整嚴謹條件，用於篩選中度相似片段(諸如來自遠源生物的同源序列)至高度相似片段(諸如來自關係密切的生物中功能相同的酶的基因)。雜交後洗滌決定了嚴謹條件。一套優選的條件應用一系列的洗滌，室溫下6xSSC、0.5%SDS洗15min，然後是451、2xSS(:、0.5%SDS洗30min、接著50X:、0.2xSSC、0.5%SDS、30min洗2次。一套更優選的嚴謹條件應用了更高的溫度，其中洗塗條件與上面的相同，只是最後兩次0.2xSSC、0.5%SDS、30min洗滌的溫度增高到60TC。另一套優選的高嚴謹條件在最後應用兩次65t:,o.ixssc、(u"/"sDS的洗滌。還有一套嚴謹條件，包括在65x:、(UxSS('、0.1%SDS條件下雜交，並在譬如，O.lxSSC、0.1%SDS之後，j吏用2xSSC、(UYoSDS洗滌。雜交要求兩個核酸含有互補序列，儘管依賴於雜交條件的嚴謹性，但鹼基間的錯配也是可以的。對於雜交的核酸而言，適當的嚴謹性依賴於核酸的長度及互補程度這些本領域中所周知的變量。兩個核苷酸序列之間相似性或同源性的程度越高，具有這些序列的核酸雜交時的Tm值就越大。核酸雜交的相對穩定性(同較高的Tm相對應)按下列順序遞減RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對於長度大於1U個核苷酸的雜交，已經有公式用於計算Tm(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對於較短的核酸序列，即寡核苷酸的雜交，錯配的位置變得更為重要，寡核苷酸的長度決定了它的特異性(參見Sambn)ok等，同上，11.7-11.8)。在一個實施例中，可雜交的核酸長度至少為約10個核普酸。優選地，可雜交核酸的的最小長度為至少約15個核苷酸；更優選地為至少約20個核苷酸；最優選地長度為至少約30個核苷酸。因子來調節溫度及洗滌溶液鹽濃度。胺基酸或核苷酸序列的"實質部分"指的是包含了多肽中足夠的胺基酸序列或者基因中足夠的核苷酸序列的組分，根據本領域中熟練的工作人員對序列的手工估算，或通過使用諸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.，等，丄Mo/.所o/.215:403-410(1993))這樣的算法用計算機自動對序列進行對比和鑑定，利用這些組分即可推測並鑑定多肽或基因。一般而言，為了推測鑑定多肽或核酸序列與已知蛋白或基因的同源性，需要已知IO個或以上連續胺基酸或30個或以上核普酸的序列。此外，對於核苷酸序列，包含20-30個連續核苷酸的基因特異的寡核苷酸探針可用於序列依賴的基因鑑定(例如Southern雜交)和分離(例如細菌克隆或噬菌體斑的原位雜交)。另外，12-15個鹼基的短寡核苷酸可用作PCR擴增引物，以獲得包含引物在內的特定核酸片段。因此，核酸序列的"實質部分"含有足以特異性鑑定和/或分離含該序列的核酸片段的序列。本說明書中介紹了編碼特定真菌蛋白的完整的核苷酸序列和胺基酸序列。由於本申請報導了這些序列的益處，熟練的技術人員現在可以使用本發明所公開的序列的全部或實質部分用於本領域的技術人員已知的用途。因此，本發明包含序列列表中報導的全序列，以及這些序列如上定義的實質部分。術語"互補的"用於描述可相互雜交的核苷酸鹼基間的關係。例如，關於DNA，腺嘌呤同胸腺嘧啶互補，胞嘧啶同鳥噤呤互補。因此，本發明也包括可以序列列表中報導的全序列互補的分離的核酸片段，以及那些足夠相似的核酸序列。術語"同一性百分比"，如本領域中所周知的那樣，指的是兩個或多個多肽序列或者兩個或多個多聚核苷酸序列之間的關係，通過比較這些序列來確定。在本領域中，"同一性"也指多肽或多聚核苷酸序列之間序列相關的程度，例如，可以是由這些序列的字串之間的匹配程度來確定。"同一性"和"相似性"可以通過已知方法容易算出，包括但不局限於下面著作中所述的方法1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，\.M.，Ed.)OxfordUniversity:NY(1988);2.)Biocomputing:InformaticsandGenomeProiects(Smith,D.W"Ed.)Academic:"NY(1993);3.)ComputerAnalysisofSequenceData.PartI(Griffin,A.M"andGriffin,H,G,,Eds.)Humania:N,J(1994);4.)SequenceAnalysisin!MolecularBiology(vonHeinje，G,Ed.)Academic(1987);及5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.andDevereux，，J.，Eds.)Stockton:NY(1991)。用於確定同一性的優選的方法其本意應該是能夠在所檢驗的序列中給出最佳匹配。用於確定同一性和相似性的方法已編程用於很多公開的電腦程式中。序列比對及同一性百分比的計算可以使用LASERGENE生物信息學計算系列(DNASTARlnc.，Madison,\VI)中的Megalign程序來執行。如未有其它說明，序列的多重比對使用比對的C，ustal方法(HigginsandSharp,C^/OS.5:15"153(1989))利用預設參數(GAPPEINALTY=10，GAPLENGTHPENALTY-10)來執行。使用Clustal方法進行成對比對的預設參數為KTL了PLE1，GAPPENALTY=3，WINDOW=5及DIAGONALSSAVED=5。合適的核酸片段(本發明中的分離的多聚核苷酸)編碼同本申請中所報導的胺基酸序列有至少約70%的同一性、優選地為至少約75%的同一性、最優選地為至少約80%的同一性的多肽。優選的核酸片段編碼同本申請中所報導的胺基酸序列有約85%同一性的胺基酸序列。更優選的核酸片段編碼同本申請中所報導的胺基酸序列有至少約90%同一性的胺基酸序列。最更優選的是編碼同本申請中所報導的胺基酸序列有至少約95%同一性的胺基酸序列的核酸片段。合適的核酸片段不僅具有上述的同源性，而且一般都編碼至少含50個胺基酸的多肽，優選地為至少100個胺基酸，更優選地為至少150個胺基酸，更加優選地為至少200個胺基酸，最優選地為至少250個胺基酸。術語"同源性"、"同源的"、"基本上類似"及"基本上相當於"在本申請中可替換使用。它們指的是其中一個或多個核苷酸鹼基的改變並不影響該核酸片段進行基因表達或者產生特定表型的能力的核酸片段,，這些術語也指本發明中核酸片段的修飾，譬如相對於初始的、未修飾的片段，在基本上並未改變該核酸片段功能特性的一個或者多個核苷酸的刪除或插入。因此可以明白，正如本領域的技術人員所意識到的，本發明包含了比明確示範的序列還要多的序列。術語"直系同源"或"直系同源序列"在本申請中指的是物種形成後序列趨異的關係(即，在不同物種中來自於物種形成時共同祖先基因的同源序列)。相反，術語"並系同源"指的是由於基因重複所形成的單個物種中的同源序列。本領域的技術人員熟悉鑑別同源、直系同源及並系同源序列的所需技術。此外，熟練的技術人員公認本發明中所包含的基本上類似的核酸序列，也可以通過在適當嚴謹條件下(例如，0.5xSSC，0.1%SDS，601C)與本申請所示範的序列、或在功能上等價於本申請中公開的任一核酸序列的本申請所公開的核酸序列的任一部分進行雜交的能力來定義。可以調整嚴謹條件，用於篩選中度相似片段，諸如來自遠源生物的同源序列，至高度相似片段，諸如來自關係密切的生物中功能相同的酶的基因。雜交後洗滌也決定了嚴謹條件。一套優選的條件應用一系列的洗滌，室溫下6xSSC、0.5%SDS洗15min，然後是451C、2xSSC、0.5"/i,SDS洗30min、接著50€、0.2xSSC、0.5%SDS、30min洗2次。一套更優選的嚴謹條件應用了更高的溫度，其中洗滌條件與上面的相同，只是最後兩次0.2xSSC、0.5%SDS、30min洗滌的溫度增高到60"C。另一套優選的高嚴謹條件在最後應用兩次65r、0.1*SSC,0.1%SDS洗滌。"密碼於簡併性"指的是在不改變所編碼多肽的胺基酸序列的情況下、遺傳密碼允許核酸序列中存在變異的性質。熟練的技術人員很注意由於特定宿主細胞對某個特定的胺基酸在核苷酸密碼使用上所表現出的"密碼子偏愛"。因此，當合成用於在宿主細胞中增加表達的基因時，期望能夠對該基因進行設計，使得其中密碼子使用的頻率接近宿主細胞中優選的密碼子使用頻率。"化學合成"同dna序列相關時，指的是作為組成的核苷酸是在體外組合的。dna人工化學合成可以使用已制定好的步驟來完成；或者使用某種已大量商品化的機器來進行自動化學合成。"人造基因"可以使用本領域的技術人員熟知的程序從化學合成的寡核苷酸構件中來組合。連接並退火這些構件以形成此後酶學上可組裝的基因片段，從而構建完整基因。因此，基於可反映宿主細胞中密碼子偏愛性的最優的核苦酸序列，可對基因進行剪裁以實現最佳的基因表達。熟練的技術人員懂得倘若密碼子的使用與宿主偏愛的密碼子有偏差，成功進行基因表達的可能性會是怎樣。基於對來源於宿主細胞中的、其中序列信息是可用的基因的調查，可以確定優選的密碼子。"基因"指的是可以表達特定蛋白的核酸片段，也可以單獨指編碼區，或者也可包括編碼區前面(5'非編碼序列)及後面(3'非編碼序列)的調控序列。"天然基因"指的是在天然狀態發現的帶有自己調控序列的基因。"嵌合基因"指的是非天然基因的基因，所包含的調控與編碼序列在天然狀態下不在一起。因此，嵌合基因可以含有不同來源的調控序列與編碼序列，或者調控序列與編碼序列雖然來源相同，但以天然狀態下不存在的方式排列。"內源基因"指的是天然基因位於生物基因組中天然的位置上。"外源"基因指的是通過轉基因導入宿主生物中的基因。外源基因可以包含轉入非天然生物中的天然基因、轉入其天然宿主中新的位點上的天然基因、或者嵌合基因。"轉基因"是通過轉化程序導入基因組中的基因。"密碼子優化的基因"是指其密碼子使用頻率設計成與宿主細胞中優選的密碼子使用頻率相似的基因。"等位基因"是佔據染色體上給定座位的基因的幾種可選形式中的一種。當位於染色體上給定座位的所有等位基因均相同時，植物在這個座位上為純合子。如果位於染色體上給定座位的等位基因有差別，植物在這個座位上為雜合子。"編碼序列"指的是編碼特定胺基酸序列的DNA序列。"合適的調控序列"指的是位於編碼區上遊(5'非編碼序列)、中間、或下遊(3'非編碼序列)，並且影響轉錄、RNA加工或穩定、或者相關編碼序列的翻譯的核苷酸序列。調控序列可以包括啟動子、翻譯引導序列、內含子、多聚腺苷酸識別序列、RINA加工位點、效應物結合位點及莖環結構。"啟動子"指的是能夠控制編碼序列或功能RNA表達的DNA序列。一般而言，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子序列由近端及更遠的上遊元件組成，後者經常用來指增強子。因此，"增強子"是能夠刺激啟動子活性的DNA序列，也可以是啟動子的固有元件，或者是插入的用來增強啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以整個都來源於天然基因，或者由來源於天然狀態的不同啟動子的不同元件所組成，甚至還可含有合成的DNA片段。本領域的技術人員知道，不同的啟動子可以在不同的組織或細胞類型中、或在發育的不同階段、或對不同的環境條件作出的應答中指導基因表達。進一步可意識到，由於在絕大多數情況下，調控序列盒的精確邊界並未完全確定，因此某些變異體的DMA片段可以有相同的啟動子活性。在絕大多數時刻、絕大多數細胞類型中均導致基因表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。持續發現了可用於植物細胞中的多種類型的新啟動子；可在Okamuro,J.K.，andGoldberg,R.B.(1989)B/oc/ie附"'町15:1-82編輯的文中發現大量的實施例。"翻譯引導序列"指的是位於基因的啟動子序列與編碼序列之間的多聚核苷酸序列。翻譯引導序列位於完全加工後的mRNA中翻譯起始序列的上遊。翻譯引導序列可以影響初級轉錄物加工為mRNA、mRNA的穩定性或者翻譯效率。翻譯引導序列的實施例已有描述((Turner,R.andFoster,G.D.(1995)A/"/.所o化c/mo/.3:225-236)術語"3'非編碼序列"及"轉錄終止子"指的是位於編碼序列下遊的DNA序列。它包括多聚腺苷酸識別序列以及編碼可影響mRNA加工或基因表達的調控信號的其它序列。多聚腺苷酸信號通常表現出影響多聚腺苷酸添加到mRNA前體3'末端的特徵。3'區可影響轉錄、RNA加工或穩定、或者相關編碼序列的翻譯。"RNA轉錄物"指的是一段DNA序列經RNA聚合酶催化轉錄生成的產物。當RNA轉錄物是DNA序列完全互補的拷貝時，稱其為初級轉錄物，若是來源於初級轉錄物經轉錄後加工的RNA序列，則稱之為成熟的RNA。"信使RlNA"或"mRNA"指的是沒有內含子、可以被細胞翻譯成蛋白的RNA。"cDNA"指的是來源於mRNA並與之互補的雙鏈DNA。"正義"RNA指的是包括mRNA的RNA轉錄物，可被細胞翻譯為蛋白"反義RNA"指的是同全部或部分目標初始轉錄物或者mRNA互補的RNA轉錄物，可以阻斷靶基因的表達(l;.S.5,107,065;WO"/28508)。同反義RNA互補的可以是特定基因轉錄物的任一部分，即,5'非編碼序列、3'非編碼序列或者編碼序列。"功能RNA"指的是反義RNA、核酶RNA或者其它並不翻譯但仍對細胞活動有影響的其它RNA。術語"可通過操作連接"指的是單個核酸片段上核酸序列的聯繫，某個序列的功能會受其它序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時(即，編碼序列處於啟動子的轉錄控制下)，它與編碼序列即為可通過操作連接。編碼序列可與調控序列以正義或反義方向進行可通過操作連接。在另一個實施例中，互補的RNA區域可以直接或間接地、在5'端或3'端可通過操作連接到靶mRNA上，或者是位於把mRINA內部，或者是第一個互補區域位於靶mRNA的5'端，它同靶mRNA的3'端互補。本申請中所用的術語"表達"，指的是生成了有功能的終產物譬如，mRNA或蛋白(前體或成熟的)。本申請中所用的術語"表達盒"，指的是可以向其中移入核酸序列或片段的、由各分散部分所組成的核酸片段。"成熟"蛋白指的是經翻譯後加工的多肽；即，初級翻譯產物中任一前肽或前體肽均被除去的多肽。"前體"蛋白指的是mRNA翻譯後的初級產物；即，依然存在前肽和前體肽。前肽和前體肽可以是、但並不局限於細胞內定位信號c"轉化"指的是將核酸片段轉入宿主生物中，並導致遺傳學上穩定的遺傳。核酸片段可以是質粒，譬如，它可自主複製；或者，它可整合到宿主生物的基因組中。含有轉化核酸片段的宿主生物稱為"轉基因"或"重組"或"轉化"生物，"穩定轉化"指的是將核酸片段轉入宿主生物基因組，包括核基因組和細胞器基因組中，並導致遺傳學上穩定的遺傳。相反，"瞬時轉化"指的是在不整合或者無穩定遺傳的前提下，將核酸片段轉入宿主生物的細胞核或含DNA的細胞器中，並導致基因表達。含有轉化核酸片段的宿主生物稱為"轉基因"生物。"反義抑制"指的是生成了可抑制靶蛋白表達的反義RNA轉錄物。"共抑制"指的是生成了可抑制相同的或基本上相似的外源或者內源基因的正義RNA轉錄物(美國專利No.5，231，020)。先前已通過以正義方向過量表達與內源mRNA具有同源序列的核酸序列的方法，來設計植物中的共抑制構建體，這樣可以減少所有與過量表達的序列具有同源性的RNA(參見Vauche，et等(1998)屍/a"f/.16:651-659;及Gura(2000),Vfl,Mre404:804-808)。該現象的總體效率較低，所減少的RNA的範圍變化很大。近來的工作描述了以互補方向整合到所有或部分mRNA編碼序列中的"髮夾"結構的應用，它可使所表達的RNA具有潛在的"莖環"結構(於1999年10月21日發布的PCTPublicationWO9(》/53050，以及更近的、於2002年1月3日發布的國際發布號為WO02/00904的申請者代理人的PCTApplication)。這在所獲得的轉基因植物中可增加共抑制的頻率。另一個不同的文獻描述了直接使用植物病毒序列來抑制或者"沉默"鄰近的mRNA編碼序列(於1998年8月20曰發布的P(TPublicationWO98/36083)儘管已有用來闡述這種複雜情形的遺傳學證據，但這兩種共抑制現象仍未徹底從原理上得到闡明(Elmayan等(1998)P/婦(>〃10:1747-1757)。用來進行抑制的多聚核苷酸序列並不需要與被抑制的基因中的多聚核苷酸序列具有100%的互補性。例如，對於大豆種子貯存蛋白(3-伴大豆球蛋白的所有亞基，可以通過使用來源於該基因編碼a-亞基部分的多聚核苷酸來對它們進行抑制(美國專利No.6,362,399)。p-伴大豆球蛋白是一種鑑定為由a、(x'及(3三個富含負電的亞基的不同組合所組成的異源糖蛋白。編碼a與a'亞基的多聚核苷酸序列之間具有85%的同一性，而編碼P亞基的多聚核苷酸序列與編碼a與a'亞基的相比有75-85%的同一性。因此，與所要抑制的靶多聚核苷酸某個區域具有至少75%同一性的多聚核苷酸可以對期望的靶分子表現出有效抑制。多聚核苷酸應該有至少80%的同一性，優選地為至少90%的同一性，最優選地為至少95%的同一性，或者多聚核苷酸可以與期望的靶分子具有100%的同一性。術語"質粒"、"載體"及"盒"指的是通常攜帶那些不屬於細胞重要代謝部分的基因的額外的染色體元件，常見的形式為環狀雙鏈DNA片段。這類元件可以是自主複製的序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性的或環狀的、單鏈或者雙鏈的DNA或RNA，其來源不限，其中將很多核酸序列結合或重組成獨特的構建體，它可以將譬如，用於選擇基因產物的啟動子片段和DNA序列與合適的3'非翻譯序列一起導入細胞中。"轉化盒"指的是含有外源基因、並具有除外源基因之外用於促進特定宿主細胞進行轉化的元件的特定載體。"表達盒"指的是含有外源基因、並具有除外源基因之外用於增強該基因宿主細胞中進行表達的元件的特定載體。術語"重組"指的是通過譬如，化學合成或者使用基因工程技術對分離的核酸區段進行處理，使得序列中兩個不同的分離的區段人為地結合在一起。術語"重組構建體"、"表達構建體"、"嵌合構建體"、"構建體"及"重組DNA構建體"在本申請中可替換使用。重組構建體含有人工結合在一起的核酸片段即，在天然狀態下並不是在一起的調控盒編碼序列。例如，嵌合構建體可以含有來自不同來源的調控序列及編碼序列，或者是調控序列盒編碼序列來自同一來源，但其排列方式與天然狀態下的並不同。這類構建體可以單獨使用，或者同栽體聯合起來使用。如果使用了栽體，那麼栽體的選擇依賴於轉化宿主細胞時所用的方法一--這對本領域的技術人員是已知的。例如，可以^吏用質粒載體。熟練的技術人員會非常注意載體上必須存在的遺傳元件，以成功進行轉化，選擇並增殖含有本發明中任一分離的核酸片段的宿主細胞。熟練的技術人員也公認,不同的、獨立的轉化過程所導致的表達水平及模式也不同(Jones等，(1985)EAZ/0丄4:2411-2418;DeAlmeida等，(i989)編.(7飢218:78-86)，因此應對多個過程進行篩選，以獲得表現出期望表達水平與模式的路線。這類篩選可以通過DNA的Southern分才斤、mRNA表達的Northern分才斤、蛋白表達的免疫印跡分析、或者尤其是表型分析來完成。術語"同源重組"指的是兩個DNA分子之間DNA片段的交換(在交換期)。交換的片段是兩個DISA分於具有相同核酸序列的位點(即，"同源區，，)側翼的片段。術語"同源區"指的是在參與同源重組的核酸片段上彼此之間具有同源性的核酸序列範圍。在這些同源區的長度為至少約10bp、優選地長度為至少約50bp，可發生有效的同源重組。典型地，易於重組的片段至少含有兩個同源區，在那裡可期望靶基因斷裂或置換。"PCR"或者"聚合酶鏈反應"是一種用來合成大量特定DNA區段的技術，由一系列重複的循環所組成(PerkinElmerCetusInstruments，Norwalk，CT)。典型地，雙鏈DNA被熱變性，兩個與把區段3'邊界相互補的引物在低溫下退火，然後在中間溫度下進行延伸。一整套這三個連續的步驟被稱為一個循環。術語"序列分析軟體"指的是可用於核酸或胺基酸序列分析的任何計算機算法或軟體程序。"序列分析軟體"可以是已商業化的或者獨立開發的。典型的序列分析軟體包括、但並不局限於l.)GCG程序系歹'l(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wl);2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，丄/W"/.Z/"/.215:403-410(1990));3.)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,\V1)-'4.)Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI);以及5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,C(W2/7wf.G^wo附e/es.，|Proc.Int.Symp.l(1994)，MeetingDate1992,111-20.Editor(s):Suhai，Sandor.Plenum:NewYork,NY)。在本申請的全文中，可以認為在使用序列分析軟體進行分析的地方，如未有特別說明，分析結果均基於所引用程序的"預設值"。在本申請用法中，"預設值"指的是當軟體第一次啟動運行時其最初載入的那一套值或參數。本申請中所用的標準重組DNA及分子克隆技術，在本領域中是眾所周知的，並在Sambrook,,J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T..Molecular(loning:ALaboratoryManual.2nded"(oldSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(在下文中為"Maniatis")、Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.andEnquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions.ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984)、以及A謂bel，F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology.GreenePublishingAssoc.與Wiley-lnterscience出版(1987)中均有描述。脂肪酸的微生物生物合成一般而言，含油微生物體內的脂類累積是為了適應生長培養基中總的碳氮比例而觸發的(圖1)。當細胞耗盡了可用的氮源供應時(譬如，當碳氮比高於約40時)，細胞內一磷酸腺苷(AMP)的耗竭會導致線粒體中AMP依賴的異檸檬酸去飽和酶活性的終止並累積檸檬酸鹽，檸檬酸被輸送到細胞液中，隨後由ATP-檸檬酸裂解酶剪切檸檬酸從而產生乙醯-CoA。乙醯-CoA是從頭合成脂肪酸的主要構建材料。雖然任何可在代謝後有效產生乙醯-CoA的化合物均可作為脂肪酸的前體，但葡萄糖是這類反應中的主要原料(圖1)。葡萄糖經過糖酵解可轉化為丙酮酸，然後丙酮酸可以被輸送到線粒體中，在那裡通過丙酮酸去飽和酶("PD")轉化為乙醯-CoA。由於乙醯-CoA不能跨過線粒體膜直接輸送到細胞質中，因此乙醯-CoA上的兩個碳與草醯乙酸縮合生成檸檬酸(由檸檬酸合成酶催化)。檸檬酸可直接輸送到細胞質中，在那裡它被ATP-檸檬酸裂解酶剪切，重新生成乙醯-CoA和草醯乙酸。草醯乙酸通過轉化為蘋果酸再進入三羧酸循環。丙二醯-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一個所需步驟，在細胞質中進行。丙二醯-CoA通過乙醯-CoA羧化酶("AC(:")對乙醯-CoA的羧化而產生。脂肪酸合成由多酶脂肪酸合成酶複合物("FAS")催化，其過程是通過8個二碳片段(乙醯-CoA中的乙醯基團)的縮合來形成一個16個碳的飽和脂肪酸——軟脂酸。更具體地，FAS催化一系列的7個反應，包括下面步驟(Smith,S.F/^EJ5J，8(15):1248-59(1994)):1.乙醯-CoA和丙二醯-CoA被傳遞到FAS的醯基載體蛋白(ACP)上。然後醯基基團被轉移到丙二醯基團上，形成p-酮丁醯-ACP並釋放co2。2.p-鯛丁醯-ACP經還原(通過p-酮脂醯還原酶)及脫水(通過P-羥醯脫水酶)形成反-單不飽和脂醯基基團。3.由NADPH還原雙鍵，產生比初始物長兩個碳的飽和脂醯基基團。然後丁醯基團可與新的丙二醯基團縮合併重複碳鏈增長過程的能力再次恢復。4.當脂醯基基團有16個碳長時，硫酯酶活性將其水解，釋放出遊離的軟脂酸。軟脂酸(16:0)是由位於內質網膜上的碳鏈增長酶和去飽和酶的作用所形成的、具有更長碳鏈的飽和及不飽和脂肪酸(譬如，硬脂酸(18:0)、棕櫚油酸(16:1)與油酸(18:1))的前體。軟脂酸和硬脂酸(視為CoA和/或ACP酯)可通過A9去飽和酶作用，分別轉化為其不飽和的衍生物——棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)。三酯醯甘油(脂肪酸主要的貯存單位)是通過兩個分子的脂醯-CoA與甘油-3-磷酸的酯化作用以生成1，2-二酯醯甘油磷酸(通常視為磷脂酸)的方式來形成的(圖1)。然後磷酸可由磷脂酸磷酸酯酶除去，生成l，2-二酯醯甘油。通過添加第三個脂肪酸，例如通過二酯醯甘油醯基轉移酶的作用來形成三酯醯甘油。Q)-脂肪酸的生物合成簡單來說，將LA轉化為GLA、DGLA及ARA(to-6途徑)以及將ALA轉化為STA、ETA、EPA、DPA及DHA(w-3途徑)的代謝過程包括通過添加二碳單元的碳鏈增長與在分子中引入雙鍵的脫氫作用(圖2)。這需要位於內質網膜上的一系列具有特定脫氫作用及碳鏈增長的酶的參與。co-6脂肪酸油酸在A12去飽和酶的作用下轉化為LA(18:2)最初的o>-6脂肪酸。後續的co-6脂肪酸按下述步驟生成1.)LA在A6去飽和酶的作用下轉化為GLA;2.)GLA在碳鏈增長酶的作用下轉化為DGLA;以及3.)DGLA在A5去飽和酶的作用下轉化為ARA。co-3脂肪酸亞油酸(LA)在A15去飽合酶的作用下轉化為ALA，即最初的w-3脂肪酸。後續的(0-3脂肪酸按一系列(0-6脂肪酸中相似的步驟生成。具體地1.)ALA在A6去飽和酶的作用下轉化為STA;2.)STA在碳鏈增長酶的作用下轉化為ETA;以及3.)ETA在A5去飽和酶的作用下轉化為EPA。或者，ETA和EPA可以在A17去飽和酶的作用下分別由DGLA和ARA生產。EPA在碳鏈增長酶及A4去飽和酶的作用下還可以進一步轉化為I)HA。在另一實施例中，A4碳鏈增長酶能夠分別催化LA及ALA轉化為EDA及ETrA。然後A8去飽和酶將這些產物分別轉化為DGLA及ETA。與生成co脂肪酸相關的基因很多微生物——包括藻類、細菌、黴菌及酵母，均可在細胞代謝的正常過程中合成PUFAs及(o脂肪酸。已經特別進行了充分研究的是包括iSc/".zoc^vm.m附ttggregttf附、破囊壺菌屬中的多個種及Mo"e〃W/flfl/p/mz在內的真菌。此外，很多腰鞭毛目(Dinophyceaae)的生物也天然產生高濃度的Pl〗FAs。同樣地，已通過遺傳學方法鑑定了多種同油脂生成相關的基因，其中某些這類基因的DNA序列已是公開可用的(非限制性的實施例如下面表3所示)表3tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41tableseeoriginaldocumentpage42國一0683(剛—068392,NM一070713,NM一068746,NM—064685線蟲脂肪酸碳鏈增長(elo-6)、(elo-5)(elo-3)和(elo-9)的mRNA(elo-2)此外，專利文獻提供了很多其它的參與油脂生成的基因的DNA序列(和/或涉及上述某幾個基因的詳細資料以及它們的分離方法)。參見，例如l;.S.5，968，89(A6去飽和酶)；U.S.5,972,664與li.S.6,075,183(A5去飽和酶)VVO91/13972與U.S.5，057，419(A9去飽和酶);l.S.2003/0196217Al(A17去飽和酶);W02/090493(A4去飽和酶)；WO94/11516、S.5,443,974與美國專利申請No.10/840325(A12去飽和酶);WO00/12720與U.S.2002/0139974A1(碳鏈增長酶)。這些專利及申請的每一個均以參考的方式將其內容整合在本申請中。本申請中特別關心的是A15去飽合酶，更具體地，可以在含油酵母(譬如，yfln^w/"///wfy""/)中用來進行異源表達的A15去飽合酶。在本領域中編碼A15去飽合酶的基因是已知的。例如，它們先前已經從植物(譬如擬南芥、fi/Y"'"c""flp"s、G/)，"V^mo:v(WO93/11245))、藍細菌及線蟲中被克隆。此外，在本申請所描述的申請人的發明之後，在WO03/099216(於2003年12月4日公開)中還揭示了來自粗糙鏈孢菌、Z^《v&c/w^^"及構巢麴黴的真菌A15去飽合酶。很多因素影響對特定的具有A15去飽合酶活性的多肽進行選擇，它會在宿主細胞中表達產生Pl)FAs(可與其它去飽和酶及碳鏈增長酶一起作用)。根據宿主細胞、底物的可用性及所期望的終產物，有幾個多肽值得關注不過，在選擇特定的具有去飽和酶活性的多肽時需要考慮的情況包括多肽的底物特異性、是否多肽或其組分是限速酶、是否該去飽和酶對合成期望的Pl)FA而言是必需的、和/或多肽所需的輔助因子,.優選地，所表達的多肽與其在宿主細胞中所處的生化環境具有相一致的參數，例如，多肽可以與宿主細胞中的其它酶竟爭底物。因此對多肽的KM及特異活性的分析可用來確定在給定的宿主細胞中，所給定的多肽用於調節Pl!FA產物的適合程度。用於特定宿主細胞中的多肽，它可以在該宿主細胞的生化條件下具有功能，然而在其它方面它可以是具有能夠修飾期望脂肪酸(即，LA)的A15去飽合酶活性的任何多肽。因此，序列可來自任何來源，譬如，從天然來源(來自細菌、藻類、真菌、植物、動物等)中分離，通過半合成途徑或從頭合成來產生,.為了在本申請中實現本發明的目標，當在期望的真核宿主細胞中進行表達時，使用轉化率(即，(|18:3]/|18:2+18:3|)xl00)為至少約50%的具有A15去飽合酶活性的多肽是有益的，其中至少約80%的轉化率是更佳的，更優選至少約90%的轉化率，最優選至少約95%的轉化率。新穎的真菌A15去飽合酶的鑑定已知幾種真菌，包括絲狀真菌稻瘟病菌、粗糙鏈孢菌(7V^/r^pom(Trtssfl)、構巢麴黴、禾穀鐮孢菌和串珠鐮孢(FM^n't/mm0附7(/l9m^)可以產生18:3(WO03/099216;WO03/099216)。考慮到本申請中所公開的指導和發現，這些真菌中的每一個均可期望具有A15去飽合酶活性。這些序列特別用於在含油酵母(譬如，J^rraw/fl///r(v""i)中的基因表達。通過使用J^/7wv/fl//p"(^/cflM2去飽和酶蛋白序列(SEQIDNO:55)作為查詢序列進行序列比較，在串珠鐮孢中鑑定了一種新穎的A15去飽合酶。具體地，這個h/vwWfl查詢序列被用於在DuPont所有的串珠鐮孢M-8114株的表達序列標籤(EST)庫(E丄duPontdeNemoursandCo.,Inc.,Wilmington,DE)中查找推定的編碼蛋白序列。其結果是鑑定了分別由核苷酸序列SEQIDNOs:1和3編碼的兩個同源序列Frnl(SEQIDNO:2)和Fm2(SEQIDNO:4)。F紅raWflA12去飽和酶序列也可用作公共資料庫中幾個絲狀真菌的查詢序列；特別地，在中^關齡莩(SEQIDNOs:6和8)、萄症^麥(SEQIDNOs:10和12)、粗糙鏈孢菌(SEQIDNOs:14和16)以及禾穀鐮孢菌(SEQIDNOs:18和20)中鑑定了同源蛋白序列。隨後，基於使用ClustalW(慢、精確、Gonnet選項；Thompson等ZV"ctoV*他22:4673-4680(1994))方法對這些序列(即,SEQIDNOs:2,4、6、8、10、12、14、16、18和20)的比較而進行的系統發育及同源分析，表明與A12去飽和酶具有同源性的蛋白分為兩個不同的"亞族"。具體地，"亞族l"中的所有蛋白(SEQIDNOs:2、6、1、14和18)彼此之間具有至少46.2%的同一性，而與"亞族2"(SEQIDNOs:4、8、12、16和20)中的蛋白的同一'汰低於39.6%(圖4和5;序列比對的Clusta，方法(同上))。亞族2中的蛋白彼此之間具有至少56.3%的同一性。由於Kanwv/fl僅能合成18:2(但沒有18:3)而上述的每種絲狀真菌均可產生18:2與ALA，並且由於yflf7Y7>v/fl只有單一的A12去飽和酶而每種絲狀真菌均具有兩種與A12去飽和酶同源的酶，因此，申請人假定這些生物中某個亞族的去飽和酶代表A12去飽和酶，另一個代表A15去飽合酶。使用表達分析通過對兩個亞族每個中具有代表性的蛋白的活性進行測定來檢驗該假設。具體地，在y"A7wWfl///w/j"c"中表達Fm2，發現它編碼A12去飽和酶(參共同待決的美國臨時申請60/570679)，而如本申請所述在K//力o(v"'"/中表達Fml與Mgl,表現出A15去飽合酶活性(此外具有部分A12去飽和酶活性)。使用序列比對的Blastp2.2.5程序、以下列參數期望值為10、BLOSl;M62矩陣以及低複雜性過濾(Altschul等，7V'Mc/e/c/lcW/M,25(17):3389-3402(1997>)，對串珠鐮孢A15去飽合酶核苷酸及推斷的胺基酸序列(即，分別為SEQIDNOs:1和2)與公共資料庫中的序列進行比較。這樣，串珠鐮孢A15去飽合酶核普酸與以GenBank序列號XM—388066.1提供的G/6&'/^〃flPH-1序列最為相似(在573bp的長度上由86%的同一性)GenBank序列號XM—388066.1對應於GenBank序歹'j號為XP—388066.1的("》&m〃"PH-1蛋白以及本申請中的SEQIDNO:17(即，串珠鐮孢A15去飽合酶ORF)。直接比較表明串珠鐮孢(F.Mo肌7〖/bm^)與禾穀鐮孢菌ZU5去飽合酶ORFs在1211bp的長度上具有87.4%的同一性。對串珠鐮孢A15去飽合酶推斷的胺基酸序列與公共資料庫的數據進行比較，表明基於同一性百分比關係最近的是GenBank序列號為XM—388066.1的序列(在193個胺基酸長度上有89%—致)。這是同本申請中SEQID1NO:18——編碼全長的串珠鐮孢A15去飽合酶——相對應的部分胺基酸序列，在403個胺基酸的全長上有88.8%的同一性。更優選的胺基酸片段是與本申請中的序列具有至少約70%-80%的同一性，其中有85%-90%同一性的序列是特別合適的，那些約95%同一性的序列是最優選的。類似地，優選的對應於本ORF的A15去飽合酶編碼核苷酸序列是那些編碼具有活性蛋白的序列，與本申請中所報導的編碼串珠鐮孢A15去飽合酶的核苷酸序列具有至少約70%-80%同一性，其中有85%-90%同一性的序列是特別合適的，那些約95%同一性的序列是最優選的。在本發明中具有用處的同一性百分比包括，但並不局限於45.4%、46.2%、47%、50%、55%、60%、65"/o、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。相信在46%與100%之間的任何整數百分比均是可用的。同系物的鑑定與分離本發明中A15去飽合酶核酸片段可以用於鑑定及分離來自相同或其它細菌、藻類、真菌或植物物種中的編碼同源蛋白的基因。鑑定抹術例如，通過本領域的技術人員對序列的手動評估、或者使用諸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul，S.F"等，層.B,V,/.215:403-410(1993))及ClustalW(DNASTA軟體中的Megalign程序)這樣的算法所進行的計算機自動序列比較與鑑定，可將本發明所述的串珠鐮孢A15去飽合酶胺基酸或核苷酸序列的實質部分用於相關多肽或基因的推斷鑑定中。如上所述，使用F"mw/a///wfy"cflA12去飽和酶(SEQIDNO:55)可以鑑定一系列真菌去飽和酶——在上面分析中，它們聚成了兩個不同的蛋白亞族(即，亞族1和亞族2)。亞族1包括上面所述的串珠鐮孢A15去飽合酶，以及其編碼DNA序列在下述各項中發現的蛋白*種關必#基因組計劃(由基因組研究中心((::GR)，Cambridge,MA贊助)中的重疊群1.122(scaffold9)(SEQIDNO:6t;*;0症4芽基因組計劃(由CGR與國際稻瘟病基因組協會贊助)中重疊群2.1597的基因座MG08474.1(SEQIDNO:;*GenBank序列號AABX01000577(粗糙鏈孢菌)(SEQIDNO:14);及*禾穀鐮孢菌基因組計劃(由CGR與國際G/M^"〃fl基因組協會(IGGR)贊助)中的重疊群1.320;BAA33772.1(SEQIDNO:18)假定上述每個蛋白均可編碼M5去飽合酶。在WO03/099216中對構巢麴黴及粗糙鏈孢菌確認了該假設，本申請中對稻瘟病菌也確認了該假設。根據序列比對的Clustal方法(同上)對上述蛋白進行的分析表明，這些蛋白與串珠鐮孢A15去飽合酶(SEQIDNO:2)具有最少為46.2%—致的序列(圖5)。此外，本發明亞族1中的A15去飽合酶也同其它已知的A15去飽合酶蛋白進行了比較；不過，同其它已知的A15去飽合酶相比較，本申請亞族1中的A15去飽合酶與亞族2中的蛋白具有更高的同源性(39.6%的同一性)。本領域的技術人員能夠利用相似方法去鑑定其它也與亞族1歸於一起的直系同源蛋白(本申請中鑑定為A15去飽合酶)。或者，本申請中任一去飽和酶序列(即，SEQIDNOs:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18)均可用作鑑定同源性的雜交反應物。核酸雜交檢驗的基本組分包括探針、猜測含有感興趣的基因或基因片段的樣品以及明確的雜交方法。本發明中的探針是可與要檢測的核酸序列互補的典型的單鏈核酸序列。探針與要檢測的序列是"可雜交的"。探針的長度可在5個鹼基至上萬個鹼基之間變化，這依賴於所要完成的具體的檢驗。典型地，長度為約15個鹼基至30個鹼基的探針是合適的。只要求探針分子的部分片段與所檢測的核酸序列是互補的。此外，探針與靶序列之間不必完全互補。在沒有完全互補的分子間所進的合適的互補鹼基。已詳細說明了雜交方法。典型地，探針和樣品必須在允許核酸雜交的條件下混和。這涉及在存在合適濃度的無機或有機鹽以及適當溫度的條件下，使探針和樣品接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時間，這樣探針與樣品核酸之間任何可能的雜交均可發生。混合物中探針或靶的濃度將決定使雜交發生所需的時間。探針或靶的濃度越高，所需的雜交溫育時間就越短。有時候可加入離液劑。離液劑可通過抑制核酸酶活性來穩定核酸。此外，離液劑還使得短寡核苷酸探針的敏感且嚴謹的雜交可在室溫下進行(VanNessandChen,Awd.J"V/aWes.19:5143-5151(1991))。合適的離液劑包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀以及尤其是三氟乙酸銫。典型地，離液劑的終濃度為約3M。如杲需要，還可以向雜交混合物中加入甲醯胺，通常為30-50%(v/v)。可以使用多種雜交液。典型地，它們含有佔體積約20至60%、優選地為30%的極性有機試劑。常見的雜交液採用約30-50%v/v曱醯胺、約0.15至1M的氯化鈉、約0.05至0.1M緩衝液(譬如，檸檬酸鈉、Tris畫HCI、PIPES或HEPES(pH範圍約6-9))、約0.05至0.2%的去汙劑(譬如，十二烷基磺酸鈉)、或者0.5-20mM之間的EDTA、F1COLL(PharmaciaInc。)(約300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500kdal)、以及血清白蛋白。在典型的雜交液中還包括未標記的載體核酸——它們取自約0.1至5mg/mL、斷裂核酸DNA(譬如，小牛胸腺或鮭魚精DNA、或者酵母RNA)，也可來自含約0.5至2%wt/Vol甘氨酸的溶液。還可以包含其它添加物，諸如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑(譬如，聚乙二醇)、陰離子聚合物(譬如，聚丙烯酸酯或聚曱基丙稀酸甲酯)及陰離子糖聚合物(譬如，硫酸葡聚糖)在內的體積排阻試劑。核酸雜交可修改為多種試驗形式。其中最適合的是夾心法形式。夾心法特別適用於非變性條件下的雜交。夾心法這類試驗的主要組分是固相支持物。固相支持物可吸附或共價耦聯固定的、未標記的核酸探針，並與其部分序列互補。分離方法本發明中的串珠鐮孢A15去飽合酶核酸片段(或本申請中所確定的任何A15去飽合酶ISEQlDNOs:5、6、9、10、13、14、17和18p可用於分離來自相同物種或者來自其它細菌、藻類、真菌或植物物種的編碼同源蛋白的基因。在本領域中，使用序列依賴的方案來分離同源基因是眾所周知的。序列依賴的方案的實施例包括，但並不局限於l.)核酸雜交法；2.)DNA及RNA擴增法，已通過多種核酸擴增技術的應用來示例l譬如，聚合酶鏈反應(PCR)，Mu川s等，美國專利4,683，202;連接酶鏈反應(L(:R)，Tabor，S.等，/lc"rf.i/^482:1074(1985);或者鏈置換擴增(SDA)，Walker，等，/Voc./VW/.爿Cfl叢AW,L.乂,4.，89:392(1992)|;以及構建文庫並通過互補作用來篩選的方法。例如，對於編碼類似本申請中所述去飽和酶的蛋白或者多肽的基因，本領域的技術人員可利用眾所周知的方法，通過使用全部或部分該核酸片段作為D1NA雜交探針、對來自任何感興趣的酵母或真菌的文庫進行篩選的方式來直接分離(其中，可產生ALAI或者ALA-衍生物1的那些酵母或者真菌是優選的)。基於該核酸序列，可以根據本領域中已知的方法來設計併合成特異性的寡核苷酸探針(Maniatis，同上)。而且，根據熟練技術人員已知的方法(譬如，隨機引物DNA標記、切口平移或末端標記技術)，整個序列可直接用於合成DNA探針，或者使用有效的體外轉錄系統合成RNA探針。此外，可設計特異引物用來擴增部分(或全長)該序列。所獲得的擴增產物可以在擴增反應期間直接標記，或者在擴增反應後標記，在適當的嚴謹條件下用作分離全長DNA片段的探針。典型地，在PCR-類擴增技術中，引物序列不同且彼此間不互補。根據所需的試驗條件，引物應設計為可有效並可靠地複製靶核酸。PCR引物的設計方法在本領域中是常見的，眾所周知(TheinandWallace,"TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",in//wmflwG^we".('/)/a'"ww/4屍ra"/oz//l/7/w"c/i，K.E.DavisEd.,(1986)pp33-50，IRL:Herndon,VA;及Rychlik，W"InMethodsinMolecularBiology.White,B.A.Ed.,(1993)Vol.15，pp31-39，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.Humania:Totowa，)。通常，在聚合酶鏈反應方案中，對於來自DNA或RNA的同源基因，可使用該序列的兩個短片段來擴增更長的編碼該基因核酸片段。對於克隆核酸片段的文庫也可以進行聚合酶鏈反應，其中一個引物序列來源於該核酸片段，另一個引物的序列則利用編碼微生物基因的mRNA其前體中3'末端存在多聚腺苷酸。或者，第二個引物序列可以基於來源於克隆載體的序列。例如，熟練的技術人員可以通過使用PCR來擴增轉錄物中某點與3'或5'末端之間的區域的拷貝數的方式，遵照RACE方案(Frohman等，/W/^85:8998(1988))來生成cDNAs。根據該序列可以設計3'及5'方向的引物。使用商業化的3'RA(:E或者5'RACE體系(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可分離特異的3'或5'DNA片段(Ohara等，P/V^LS，(75/186:5673(1989);Loh等，.S，c,e"ce243:217(1989))。該核苷酸及所推斷的胺基酸序列的可用性促進了DNA表達文庫的免疫篩選。可以合成表示部分該胺基酸序列的人造肽段。這些肽可用來免疫動物，產生特異性針對該肽或者含有該胺基酸序列的蛋白的多克隆或者單克隆抗體。然後可以使用這些抗體去篩選DNA表達文庫，從而分離感興趣的全長DNA克隆(Lerner，R.A.,楊./附腦wo/.36:1(1984);Maniatis，同上)為了提高異源表達進行的基因優化可使用多種技術在其它宿主中提高某種感興趣的特定A15去飽合酶的表達。有兩種此類技術，包括密碼子優化和基因誘變。密碼子優化例如，對於某些實施例，期望修飾編碼具有A15去飽合酶活性的密碼子的某部分，以便在其它宿主(即，含油酵母)中增強編碼這些多肽的基因的表達一般而言，在特定宿主物種中，通過檢查蛋白(優選地，這些蛋白大量表達)中密碼子使用情況以及判斷哪個密碼子使用頻率最高的方式，可確定宿主偏愛的密碼子。然後，可使用在宿主物種中所偏愛的密碼子，全部或者部分合成感興趣的、具有去飽和酶活性的多肽的編碼序列。也可合成全部(或者部分)DNA，以除去降低穩定性的序列或者在轉錄後的mRNA中形成二級結構的區域。也可合成全部(:或者部分)DNA，將鹼基組分改變為期望的宿主細胞中最優選的。在本發明的優選實施例中，來自——譬如串珠鐮孢、構巢麴黴、稻痘病菌、粗糙鏈孢菌和禾穀鐮孢菌的A15去飽合酶，於它們在諸如}r/wv/fl//^(W/"i這樣的異源含油酵母宿主進行表達之前已進行了密碼子優化,，誘變在文獻中已充分建立了合成序列及將序列組合的方法。例如，可使用體外誘變及選擇、定點突變、易錯PCR(Melnikov等，/Vwcto'cJ"V/a'/^廳我27(化1056-1062(1999年2月15日))、"基因混排"(I).S.5，605，793;l.S.5,811,238;l.S.5,830,721及IJ.S.5,837,458)或其它方法，來獲得天然去飽和酶基因，例如本申請所述的A15去飽合酶的突變這樣會生成在體內具有去飽和酶活性的多肽——它在宿主細胞中發揮功能時具有更合意的物理及動力學參數(譬如，更長的半衰期或者更高的生成期望P11FA的速率)。如果有必要，可以通過常規誘變、表達所獲得的突變多肽及判斷其活性的方式，來確定去飽和酶多肽中對酶活至關重要的區域。突變可以包括缺失、插入和點突變，或其組合。典型的功能分析由缺失誘變開始，以判斷蛋白功能所必需的N-及C-末端界限，然後進行內部缺失、插入或點突變，以進一步確定功能所必需的區域。也可使用諸如盒式誘變或者全合成這樣的其它技術。例如，通過使用核酸外切酶連續除去5'或3'編碼區的方式可完成缺失誘變。對這類技術已有可用的試劑盒。缺失之後，通過將含有起始或終止密碼子的寡核苷酸分別連接到經5'或3'缺失後的有缺失的編碼區，使編碼區恢復完整。或者，通過包括定點誘變、誘變P(:R在內的多種技術、或通過在已存在的限制性內切酶位點上連接上消化的DNA的方式，將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入到編碼區。內部缺失可通過多種方法，包括使用DNA上存在的限制性內切酶位點、使用經定點誘變後的誘變引物或者誘變P《'R，按相似的方式進行，插入可通過諸如接頭置換誘變、定點誘變或者誘變PCR這樣的方法來進行.點突變可通過諸如定點誘變或者誘變PCR這樣的技術來進行。化學誘變也可用來確定對去飽和酶多肽的活性至關重要的區域。表達突變構建體，檢測所獲得的已經改變的蛋白作為去飽和酶的能力。這樣的結構-功能分析可以確定哪個區域可以刪除、哪個區域可以有插入、以及哪個點突變仍可使突變蛋白基本上按原有方式發揮天然去飽和酶的功能。所有這些來源於本申請所述的去飽和酶基因的突變蛋白及核苷酸序列，均在本發明的範疇之內。因此，本發明包括序列列表中所報導的A15去飽合酶的全序列、這些全序列的互補序列、這些序列的實質部分、由此衍生的密碼子優化的去飽和酶、以及那些基本上與其同源的序列。利用微生物生產co-3和/或co-6脂肪酸c)-3和/或w-6脂肪酸的微生物合成相對於從諸如魚或植物這樣的天然來源中進行純化有幾個優勢。例如1.)已知同高等生物相比，許多微生物具有更單一的油脂組分，使得純化所需組分更為容易；2.)微生物的產量不易發生由諸如氣候及食品供應這樣的外界因素所導致的波動；3.)微生物產生的油脂基本上不含環境汙染的汙染物；4.)微生物可以提高特殊形式的PUFAs——它們可具有特殊用途；及5.)可通過控制培養條件，特別是提供微生物表達的酶所需的特殊底物、或加入基因工程方法的混和物來抑制非期望的生化途徑的方式來控制微生物油生成,，除了這些優勢外，通過在宿主中提供新的生物合成途徑或者通過抑制非期望的生化途徑、從而增加期望的PUFAs(或其共軛形式)的水平並降低非期望PUFAs的水平(參見共同待決的美國專利申請10/840579，通過參考的方式將其內容整合在本申請中)的方法，在重組微生物中進行的co-3和/或(o-6脂肪酸生產可提供改變天然形成的微生物脂肪酸構型的能力.生產多種(0-3和/或o-6脂肪酸的方法可以預料，轉入在合適啟動子控制下的本申請所述的編碼A15去飽合酶的嵌合基因，會在轉化的宿主生物中增加ALA的產量。因而，本發明包含直接生成PlIFAs的方法，它包括使脂肪酸底物(即，LA)受到本申請所述的Pl)FA酶(譬如，串珠鐮孢A15去飽合酶)的作用，從而將底物轉化為期望的脂肪酸產物(即，ALA)。更具體地，本發明的一個目標是提供在微生物(譬如，含油酵母)中生產ALA的方法，其中提供給微生物(a)分離的、編碼具有A15去飽合酶活性的真菌蛋白的核酸片段，當同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的C1ustal方法表明至少有46.2%的同一性；及(b)由LA組成的去飽和酶底物來源；其中酵母在可表達嵌合的去飽和酶基因以及LA可轉化為ALA的條件下生長，並且其中ALA可以選擇回收。因此，本發明最低程度上包括下述A15去飽合酶如本申請所述，SEQIDNOs:2、6、10、14和18的應用。或者，本申請所述的每種PUFA基因及其對應的酶產物均可直接用於w-3Pl)FAs的生產。w-3Pl;FAs的間接生產在脂肪酸底物通過中間步驟或者中間途徑的方式間接轉化為所需脂肪酸產物時發生。因此，可預期本申請所述的A15去飽合酶可以與一個或多個編碼其它酶的基因聯合表達，從而在經歷一系列反應後生成所需產物。在一個優選實施例中，例如，可使用含有編碼PUFA生物合成途徑中其它酶基因的載體來共轉化宿主生物以獲得更高水平的co-3脂肪酸產物(譬如，ALA、STA、ETA、EPA、DPA和DHA)。具體地，例如，可以在宿主細胞中過表達任意一種本申請所述的A15去飽合酶，該宿主細胞還表達L)編碼用於產生過量ALA的A12去飽和酶的基因(其中產物相對於單獨表達A15去飽合酶而言是增加的)；2.)編碼用於產生過量S1A的A6去飽和酶(也可以是A12去飽和酶)的基因；3.)編碼用於產生過量ETA的A6去飽和酶及高親和性碳鏈增長酶(也可以是A12去飽和酶)的基因；以及4.)編碼用於產生過量EPA的A6去飽和酶、高親和性碳鏈增長酶及、5去飽和酶(也可以是A12去飽和酶)的基因。如同本領域的技術人員所熟知的那樣，下述酶活的多種其它組合有助於在同本申請中去飽和酶有關聯的宿主細胞中的表達A4去飽和酶、A5去飽和酶、A6去飽和酶、A12去飽和酶、A17去飽和酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶和/或碳鏈增長酶(參見圖2)。位於特定表達盒中的特定基因，依賴於宿主細胞(以及其PUFA諳和/或去飽和酶諳)、底物的有效性以及所期望的終產物。在另一個實施例中，基於本申請所述的全序列、這些全序列的互補序列、這些序列的實質部分、由此衍生的密碼子優化的去飽和酶以及與其基本上同源的那些序列，有助於對宿主生物中天然的A15去飽合酶進行敲除。例如，以宿主生物中的A15去飽合酶為目標進行敲除，可生成不能合成ALA的突變株。這種突變林可用於產生"純"o6脂肪酸(沒有一起合成的a)j脂肪酸)。表達系統、盒及載體具有本申請中所述序列的基因與基因產物可以在異源微生物宿主細胞中，特別是在含油酵母(譬如，Ffl/7yw/fl/^w/W/m)中進4亍表達，在重組微生物宿主進行表達，有助於多種PUFA途徑中間產物、或宿主中已存在的PUFA途徑調節物合成此前使用宿主無法合成的新產物。對於本領域的技術人員而言，微生物表達系統與含有可指導外源蛋白高水平表達的調控序列的表達栽體均是眾所周知的。所有這些均可用來構建嵌合基因，用來生產本申請中任一序列的基因產物。然後這些嵌合基因可通過轉化導入合適的微生物中，以高水平表達所編碼的酶。在本領域中，用於轉化合適宿主細胞的載體或DNA盒是眾所周知的。對構建體中序列的特殊選取依賴於期望的表達產物(同上)、宿主細胞的性質以及計劃用來分離轉化細胞與非轉化細胞的方法。不過典型地，載體或盒均含有指導有關基因轉錄盒翻譯的序列、選擇標記以及容許自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包括控制轉錄起始的基因5'區以及控制轉錄終止的DNA片段的3'區。當控制區是來自被轉化的宿主細胞的基因時是最優選的，雖然明白這類控制區不必一定來源於作為生產宿主的特定物種自身的基因。對本領域的技術人員而言，有眾多熟悉的用於促使本申請ORFs在期望宿主細胞中進行表達的起始控制區或啟動子。事實上任何能夠指導這些基因在所選宿主細胞中進行表達的啟動子均適用於本發明。宿主細胞中的表達可以瞬時或穩定方式來完成。可通過在感興趣的基因上連接具有調控能力的啟動子、並誘導該啟動子活性的方式來實現瞬時表達。通過使用連接至感興趣的基因上的、組成型的啟動子可獲得穩定表達。作為一個實施例，當宿主細胞為酵母時，提供了在酵母細胞中具有功能的，尤其是來自宿主物種的轉錄及翻譯區。例如，轉錄起始調控區可以從l.)諸如乙醇去飽和酶、甘油醛-3-磷酸去飽和酶(參見美國專利申請No,10/869630)、磷酸甘油酸變位酶(參見美國專利申請No.10/869630)、果糖二磷酸醛縮酶(參見美國專利申請No,60/519971)、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸--醯基轉移酶(參見美國專利申請No.60/610060)等這樣的糖酵解途徑的基因；或者2.)諸如酸性磷酸酶、乳糖酶、金屬硫蛋白、葡萄糖澱粉酶、翻譯延伸因子EFl-a(TEF)蛋白(U.S.6，265，185)、核糖體蛋白S7(U.S.6,265,185)等這樣的具有調控能力的基因中獲得。若千調控序列中的任何一個均可使用，這依賴於所要進行的是組成型還是誘導型轉錄、啟動子表達感興趣的ORF的效率、構建體的難易程度以及其它類似因素。已發現翻譯起始密碼子ATG周圍的核苷酸序列可影響酵母細胞中的表達。若本申請中某種A15去飽合酶在酵母中低表達，可修飾外源基因的核苷酸序列使其包括有效的酵母翻譯起始序列，以荻得理想的基因表達效果。對於酵母中的表達，可通過將定點誘變的低效表達基因與內源酵母基因，優選地應為高效表達基因按閱讀框融合的方式來實現這點。或者，任何人均可確定宿主中一致的翻譯起始序列，然後將在外源基因上設計出該序列從而使其可在感興趣的宿主中實現最佳表達(參見，譬如，美國專利申請INo.10/840478用於l'"rra>Wfl的應用)終止區可以來源於從其中獲得起始區的基因的3'區，或者來自不同的基因。大量的終止區現已是已知的，在多種宿主中的功能也令人滿意(當用於與其來源相同的及不同的屬或種時都如此)。選擇終止區通常是出於方便起見，而不是由於特殊性質。優選地，終止區來源於酵母基因，特另'J是S"cc/zflw附jT"、AV/w'z仍fl(X^fln附jTes、假絲酵母屬、y"/'raH7'"或/iC/M》'》'cw。還知道編碼y-幹擾素及a-幹擾素的哺乳動物基因的3'-區在酵母中也具有功能。終止控制區也可來源於優選的宿主其自身的多種基因。有時候可以不用終止位點；不過，如果將其包括在內是最優選的。正如本領域的技術人員所意識到的那樣，僅僅將基因插入到克隆載體中並不能保證它會以所需要的水平進行成功表達。為了適應高表達速度的需要，已經通過使用大量不同的控制轉錄、翻譯、蛋白的穩定性、氧氣限制以及從宿主細胞分泌遺傳元件構建了許多專門的表達載體。更具體地，某些被用來控制基因表達的分子特徵包括l.)相關的轉錄啟動子及終止子序列的性質；2.)所克隆基因的拷貝數以及該基因是位於質粒上的還是整合到宿主細胞基因組中；3.)所合成外源蛋白的最終細胞定位；4.)在宿主生物中翻譯的效率；5.)所克隆基因的蛋白在宿主細胞中內在的穩定性；及6.)克隆基因中的密碼子使用率，其頻率接近宿主細胞偏愛的密碼子使用率。這些修飾類型中的每一種均包含在本發明中，作為進一步優化本申請所述的A15去飽合酶表達的手段。轉化微生物宿主一旦獲得編碼適合於在合適的微生物宿主中表達的多肽的DNA，可將其置於能夠在宿主細胞中自主複製的質粒載體上，或者將其直接整合到宿主細胞的基因組中。表達盒的整合可在宿主基因組中隨機發生，或者通過使用含有與宿主基因組具有同源區的構建體，它可與宿主的基因座重組來有針對性地發生。若構建體作用於內源基因座，全部或者部分轉錄及翻譯調控區可由該內源基因座提供。當從不同的複製栽體上表達兩個或更多基因時，期望每個載體均有不同的選擇方式，而且與其它構建體之間沒有同源性以保持穩定表達、防止構建體中的元件發生重排。可通過實驗來對所導入的構建體的調控區、選擇方式及增殖方法作出明智的選擇，使所有導入的基因可在所需水平上表達，從而提供所期望產物的合成。可通過任何標準技術將含有感興趣基因的構建體導入宿主細胞中。這些技術包括轉化(譬如，醋酸鋰轉化IMW/ioA/wE"^Am/0^，194:186-187(1991)|)、原生質體融合、基因槍衝擊、電穿孔、微注射或者其它將感興趣的基因轉入宿主細胞的方法。可應用於含油酵母(即，y"nwv/fl///w/j;"'('fl)的更具體的技術包括美國專利Nos.4，880，741與5,071,764,以及Chen,D.(.等M，編肌血'/婦/.48(2):232-235(1997))為了方便起見，通過任何方法的操作吸納了一段DNA序列(譬如，表達盒)的宿主細胞在本申請中稱作"轉化子"或者"重組子"。轉化的宿主含有至少一個拷貝的表達構建體，也可以含有兩個或更多，這依賴於基因是否整合至基因組中、是否擴增或者是否位於染色體之外的具有多個拷貝數的元件上。轉化的宿主細胞可以通過所導入構建體上的選擇標記來鑑定。或者，某個獨立的標記構建體可以與期望的構建體共轉化，因為很多轉化技術可將許多DNA分子導入宿主細胞中。典型地，轉化的宿主可根據它們在選擇培養基上的生長能力來進行選擇。選擇培養基可以加入抗生素或者缺乏未轉化的宿主所生長必需的因子，諸如營養物或者生長因子。所導入的標記基因可以提供抗生素抗性、或者編碼某種必需的生長因子或酶，因此可使得表達它們的轉化宿主能夠在選擇培養基上生長。當所表達的標記蛋白可以被直接或間接檢測時，也可進行轉化宿主的選擇。標記蛋白可單獨表達，或者同其它蛋白融合表達。標記蛋白可通過下述方法檢測l.)其針對有色產物的酶活(譬如，j3-半乳糖苷酶可以將底物X-gall5-溴-4-氯-3-p引哚-P-l)-半乳糖苷l轉化為有色產物；螢光素酶可以將螢光素轉化為發光產物)；或2.)其發光或4務飾特性(譬如，J^MO^"W"w/"的綠色螢光蛋白在受到藍光照射時會發出螢光)。或者，抗體可用來檢測標記蛋白或位於，譬如感興趣的蛋白上的分子標籤。表達標記蛋白或者標籤的細胞可通過例如，直接觀察、或者通過諸如FACS或4吏用抗體淘篩這樣的技術來進行選擇。任何在酵母中起作用的標記均可用於酵母轉化子的選擇。理想地，針對卡那黴素、潮黴素及氨基糖苷G418的抗性，以及具有在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培養基上的生長能力均是可以考慮的'轉化後，適於本申請A15去飽合酶(以及，在宿主細胞中共表達的其它任意PUFA酶)的底物可由宿主天然產生或通過轉基因來生成，或者可通過外源來提供。微生物中(o-3和/或(o-6脂肪酸生物合成的代謝工程與本申請A15去飽合酶序列相關的知識有助於操縱含油酵母中，特別地，在FflHYw/fl中co-3和/或(0-6脂肪酸的生物合成。這需要直接針對PL1FA生物合成途徑的代謝工程，或者對PUFA生物合成途徑中提供碳的途徑進行額外操作。對於本領域的技術人員而言，用於操縱生化途徑的方法是眾所周知的。上調所期望的生物合成途徑的技術額外拷貝的去飽和酶(以及任意碳鏈增長酶)基因，典型地，可通過多拷貝質粒導入宿主中，從而增加co-3和/或co-6脂肪酸生物合成的產量。通過使用導致表達增加的強啟動子(可以是調控型或組成型)、通過除去/刪除mRlNA或所編碼蛋白中的不穩定序列、或通過向mRNA上添加穩定序列，也可在轉錄水平上增加去飽和酶及碳鏈增長酶基因的表達(U.S.4，910，141)u還有一個增加異源去飽和酶或碳鏈增長酶基因表達的方法，就是在所選的宿主微生物中通過使用用於優化基因表達的密碼子來替代天然基因的密碼子，從而提高所編碼的mRNAs的翻譯效率。下調非期望的生物合成途徑的技術相反，同co-3和/或to-6脂肪酸生物合成途徑竟爭能量或碳的生化途徑，或者幹擾特定PUFA終產物生成的宿主自身PUFA生物合成途徑中的酶，應通過基因敲除或其它手段(譬如，反義mRNA)進行下調的方式來排除。對於基因敲除，將一段外源DNA片段(典型地，是可作為選擇標記的基因)插入到要敲除的結構基因中，破壞後者的編碼序列，從而從功能上使改基因失活。將敲除盒轉化入宿主細胞中，會導致有功能的宿主自身基因通過與沒有功能的敲除基因之間的同源重組發生替代(參見，譬如Hamilton等丄Bflo^/W.171:4617-4622(1989);Balbas等G證136:211-213(1993);Gueldener等泡c/e/cJ"V/s24:2519-2524(1996);以及Smith等A/o/.Ce〃.5:270-277(1996))。當已知靶基因序列時，反義技術是另一種下調基因表達的方法。為了實現該目的，克隆一個來自期望基因中的核酸片段並連接上一個啟動子，這樣可以轉錄出反義的RNA鏈。然後將該構建體轉入宿主細胞中，產生反義的RNA鏈。反義RNA通過阻止編碼感興趣蛋白的RNA累積的方式來抑制基因表達。本領域的技術人員了解與降低特定基因表達的反義技術應用相關的特別注意事項。例如，反義基因在適當的水平上進行表達，需要使用不同的嵌合基因，這些基因使用了熟練人員已知的不同調控元件。儘管靶基因敲除與反義技術可提供有效的下調那些序列已知的基因手段，還發展了其它特異性較低的、可以不必基於序列的方法。例如，細胞可暴露在UV射線下，然後篩選期望的表型。對於產生突變而言，化學試劑誘變也很有效，通常使用影響非複製的DNA的化學物質(譬如，HN02及NH20H)以及影響正在複製的DNA的試劑(譬如，因為可導致移碼突變而聞名的吖啶染料)來誘發突變。使用放射性或者化學試劑來產生突變的專門方法在本領域中有詳細的文獻記載。參見，例如ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology.2nded.(1989)SinauerAssociates:Sunderland,MA;或者Deshpande,MukundV.，/I/;/;/.i,》c/^m.i/^c/mo/.，36:227(1992)。另一種非特異性的基因敲除方法是使用轉座因子或者轉座子。轉座子是可以隨機插入至DNA中的遺傳元件，隨後可以根據新序列來判斷插入在哪裡發生。體內和體外轉座的方法均是已知的。兩種方法均涉及使用同轉座酶相關的轉座因子。當轉座因子或者轉座子在存在轉座酶的情況下同核酸片段進行接觸時，轉座因子將隨機插入到核酸片段中。該技術對隨機誘變以及基因分離是有用的，因為可以根據轉座因子的序列來鑑定被敲除的基因。用於體外轉座的試劑盒已商品化l參見n例如1.)ThePrimerIslandTranspositionKit,產自PerkinElmerAppliedBiosystems，Branchburg，NJ，基於酵母Tyl元件；2,)TheGenomePrimingSystem,產自NewEnglandBiolabs，Beverly,MA，基於細菌轉座子Tn7;以及3.)EZ::TNTransposonInsertionSystems,產自EpicentreTechnologies,Madison,Wl，基於Tn5細菌轉座因子|。在本發明全文中，通過上述任何一種方法來調節脂肪酸生物合成途徑的表達都是可用的。例如，本發明提供了編碼(o-3和/或w-6脂肪酸合成途徑中關鍵酶的基因(即，A15去飽合酶)。在18:3脂肪酸產量不足的含油酵母中表達這些基因、並利用用於宿主生物代謝工程的多種方法來調節該脂肪酸及其它PUFA生物合成基因的表達，在使優選的PUFA產物的產量達到最大上是特別有用的。同樣，為了利用這些基因使得PUFA產量達到最大，必需破壞同PL)FA生物合成直接竟爭總碳量的那些途徑。在另一個實施例中，期望通過敲除本申請中的Ai5去飽合酶，在抑制co-3脂肪酸共合成的同時提高(0-6脂肪酸的合成。在另外一個實施例中，可以通過將任一本發明中的A15去飽合酶基因置於誘導型或調控型啟動子的控制之下的方式，來調節(0-3和/或w-6脂肪酸的產量。用於A15去飽合酶重組表達的優選宿主用於表達本申請中基因及核酸片段的宿主細胞可以包括生長在廣泛的溫度及pH值範圍內含有簡單或複雜的碳水化合物、無機酸與醇類、和/或烴類的多種原料上的微生物宿主。儘管已分離到本發明中所述的基因並用於在含油酵母中，尤其是在y"/7wW"/^0/j，"c"中進行表達，但可以預料到，由於轉錄、翻譯以及蛋白合成器官的高度保守性，任何細菌、酵母、藻類和/或絲狀真菌均是用於表達本發明中核酸片段的合適的宿主。優選的宿主是諸如含油酵母這樣的產油生物。這些產油生物天然具有油脂合成及累積的能力，其中油脂含量可超過約25%的細胞乾重，更優選地超過30%的細胞乾重，最優選地超過40%的細胞乾重。典型地被鑑定為含油酵母的屬包括，但並不局限於FflnwWfl、假絲酵母屬、紅酵母屬(//i油f麵/fl)、紅冬孢酵母屬(//油，〃7//謹)、隱球酵母屬(O^p^^ccms)、絲孢酵母屬與油脂酵母屬。更具體地，作為例證的油脂合成酵母包括//^rfos/wr/rf/Mmtora/o/fifey、斯達氏油月旨##(Zj》omyce^WflM:《v//)、產;^由^由月旨一^:(L.Zj》6|/infS)、4^，夫氏假絲酵母(Gm力V/fl^vA:^//)、鐵紅假絲酵母(C/^/c/w/r/附fl)、熱帶假絲酵母((:.rra/;,'a^")、產朊假絲酵母(c.r"/")、7V/c/^5/70nW/M〃fl浴、r.CWflWeW附、股粘紅酵母(//lorf"^M/ag/w"m^)、禾木科紅酵母(/.Gram/m.s)及"Xv".cfl(先前被分類為解脂假絲酵母(Cflwrf/rffl//^W/c"))。最優選的是含油酵母yanwv/flZ/^o/j;"a)f;並且，在進一步的實施例中，最優選的是命名為ATCC#76982、ATC(:#20362、ATCC:#8862、ATCC#18944和/或LGAMS(7)1的y"/7Y;H7Vz〃/w/》'"cfl菌林(PapanikolaouS.，andAggelisG.，B/or^sowr.7Vc/iwo/.82(1):43-9(2002))。其它優選的微生物宿主包括產油細菌、藻類和其它真菌；並且，在這組微生物宿主中，特別令人感興趣的是合成諸如GLA和ARA這樣的(0-6脂肪酸的微生物。因此，例如，使用本申請中任一A15去飽合酶基因在誘導型或調控型啟動子的控制下轉化高山被孢菌(該菌已用於ARA的商業化生產)，均可產生能夠合成EPA的轉化生物。此外，轉化這些其自身A12去飽和酶中具有敲除或突變的菌林(譬如，使用本領域中眾所周知的方法，通過將本發明中任一A15去飽合酶轉入其自身的A12基因座位中)，這種基因工程生物可以提高w-3對co-6脂肪酸的比率。用於PUFA生產的發酵過程轉化的微生物宿主細胞在脂肪酸合成基因達到最優活性、並可產出最大量且最具經濟效益的脂肪酸(譬如，ALA，它又增加了多種co-3脂肪酸的產量)的生產條件下進行生長。通常，可優化的培養基條件包括碳源的類型及數量、氮源的類型及數量、碳-氮比、氧氣含量、生長穩定、pH、生物量產生期的長度、油脂累積期的長度以及細胞採集的時間。諸如含油酵母這樣令人感興趣的微生物在複合培養基(譬如，酵母提取物-蛋白腖-葡萄糖肉湯(YPD))或者缺少某種生長必需組分從而迫使對期望表達盒進行選擇的限定的基本培養基(譬如，YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI))上進行生長。本發明中的發酵培養基必須含有合適的碳源。合適的碳源可以包括，但並不局限於單糖(譬如，葡萄糖，果糖)、二糖(譬如，乳糖或蔗糖)、寡糖、多糖(譬如，澱粉、纖維素或其混合物)、糖醇(譬如，甘油)或者來自可更新原料的混合物(譬如，乳清、玉米漿、甜菜糖蜜、大麥芽)。此外，碳源可以包括烴類、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂以及包括植物油(譬如，豆油)及動物油在內的多種商業來源的脂肪酸。而且，碳源可以包括一碳底物(譬如，二氧化碳或者甲醇)，已經證明它們可代謝轉化為關鍵的生化中間產物。因此，可以預料，可應用於本發明中的碳源包括非常廣泛的含碳底物，並且僅受宿主生物的選擇限制。雖然認為上述所有的碳底物及其混合物均適用於本發明之中，優選的碳底物是糖和/或脂肪酸。最優選的是葡萄糖和/或含有10-22個碳的脂肪酸。氮可以從無機(譬如，(NH4>2S04)或者有機來源(譬如，尿素或穀氨酸)獲得供給。除了要有合適的碳源及氮源外，發酵培養基中還必須包含適當的礦物質、鹽、輔因子、緩衝液、維生素以及其它本領域的技術人員所已知的、適於微生物生長以及促進Pl)FA生產所必須的酶途徑的組分。值得特別關注的是幾種促進脂肪及PL)FAs合成的金屬離子(譬如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara,T.等/m/.S/wg/e0〃0//s，I).丄KyleandR.Colin,eds.pp61-97(1992))a本發明中優選的生長培養基是那些普通的、已進行商業化製備的培養基，譬如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)。也可使用其它限定的或者合成的生長培養基，微生物學或發酵科學領域的熟練人員也了解適於特定微生物生長的培養基。發酵時典型的pH範圍在約pH4.0至pH8.0之間，其中pH5.5至pH7.0是優選的適於起始生長條件的範圍。發酵可在有氧或無氧條件下進行，其中微氧條件是優選的。典型地，在含油酵母細胞中累積高水平的PUFAs需要兩階段的過程，因為生長和合成/儲存脂肪之間的代謝狀態必須"平衡"。因此，最優選地，兩階段的發酵過程在含油酵母中PUFAs的生產中是必需的。按這種方式，發酵的第一階段是專門用來產生並積累細胞量，其特徵是快速的細胞生長以及細胞分裂。發酵的第二個階段，優選的在培養基中建立一個缺乏氮的條件，以促進高水平的脂類累積。這種缺乏氮的效果是減小細胞中AMP的有效濃度，從而降低線粒體中NAD依賴的異檸檬酸去飽和酶的活性。當發生這種情況時，會累積檸檬酸，這樣在細胞質中形成豐富的乙醯-CoA池，並引發脂肪酸合成。這樣，這個時期的特徵是細胞分裂的停止、隨後脂肪酸的合成及油脂的累積。雖然典型地，細胞在約^"C時生長，但某些研究已表明在更低的溫度時會增加不飽和脂肪酸的合成(YongmanitchaiandWard,￡，m'/w".yV//cw^W.57:419-25(1991))。基於經濟角度的處理方法，最適於在兩階段發酵中的笫一階段之後、大部分生物體已生成時進行這種溫度轉變。可以預期有多種發酵過程方案可以使用，其中所期望的是使用本申請中A15去飽合酶基因的商業化co脂肪酸生產。例如，可通過分批、補料或持續發酵過程來從重組微生物宿主中生產商品化的PL!FAs產口P分批發酵過程是一個封閉體系，其中培養基組分在起始過程設定，在發酵過程中除了維持pH及氧水平所必需的組分外，不進一步添加其它組分。因此，在培養過程起始時，用期望的生物接種培養基，在無需向培養基中添加額外底物(即，碳源及氮源)的情況下即可進行生長或具有代謝活性。在分批過程中，體系的代謝物與生物量組成持續改變，直至培養過程結束。在典型的分批過程中，細胞經歷了靜態延遲期至高速生長對數期並最後到達生長速率逐漸減少或停止的穩定期。不予處理的話，穩定期的細胞最終將會死亡。標準分批過程的一個變型是補料過程，其中在整個發酵過程中底物是持續添加到發酵罐中的。補料過程也適用於本發明。當新陳代謝的副產品可能會抑制細胞的代謝時，或者期望在任何時間培養基中都有有限量的底物時，會使用補料過程.在補料體系中測量底物的濃度是困難的，因此基於可測定的因子，譬如pH、溶解氧及部分廢氣的壓力(譬如，C02)的變化來進行估算。在本領域中，分批與補料培養方法是常見的、眾所周知的，並且其實施例可以在ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiologv.2nded"(1989)SinauerAssociates:Sunderland,MA;或者Deshpande，MukundV,i5/oc/w附,fi/"&c/mo/.，36:22"7(W92)中找到，這裡通過參考的方式整合在本申請中。也可以通過連續發酵過程來獲得使用了本申請中A15去飽合酶的to脂肪酸的商業化產品，其中向生物反應器中持續加入給定量的培養基，同時取出等體積的培養物用於產物回收。連續培養一般可在恆定的細胞密度下使細胞處於對數生長期。連續或半連續培養方法允許對某個或者任意多個影響細胞生長或終產物濃度的因於進行調整。例如，一個方法是限定碳源，利用所有其它參數來調節新陳代謝。在其它體系中，當由通過培養基濁度所測定的細胞濃度保持恆定時，影響生長的許多因子可是是不斷變化的。連續體系試圖維持穩定的生長狀胞損失相平衡。在工業;生二領域中，口為^進行連續培養過程而調整養分和生長因子的方法、以及用於使產物形成達到最大速率的技術，均是眾所周知的，在前文Brock的著作中對多種方法均有詳述,.PUFAs的純化PllFAs可以在宿主微生物中以游離脂肪酸或者諸如醯基甘油、磷脂、硫脂或糖脂這樣的酯化形式存在，並可以通過本領域中多種眾所周知的方法來從宿主細胞中進行提取。關於酵母油脂的提取技術、質量分析及可接受標準的一篇綜述是Z.Jacobs(OZ"'c"//^v/eiw/wB/Wa/wo/ow12(5/6):463-491(1992))。A.SinghandO.Ward(/Jrfv.J/7/;/.M/cro^W.45:271-312(1997))還提供了一篇關於下遊加工的簡要綜述。通常，純化PUFAs的方法包括使用有機溶劑抽提、超聲處理、超臨界流體萃取(譬如，使用二氧化碳)、急化以及諸如擠壓這樣的物理方法，或者它們的組合,，其中特別感興趣的是在存在水的情況下使用甲醇和氯仿進行抽提(E.G.Bligh&W.J.Dyer，C頭.所od^附.屍/!",》.3*7:911力n(19S9))可以期望，其中水層被酸化，從而對帶有負電荷的部分給予質子，因此增加了所期望的產物向有機層中的分配抽提後，通過在氮氣流中進行蒸發來除去有機溶劑。當以共軛形式來分離時，可使用酶學或化學方法來剪切產物，從而釋放出遊離的脂肪酸，或者釋放出所感興趣的、複雜程度更低的結合物，然後通過進一步的操作來生成所期望的終產物。理想地，可使用氫氧化鉀來剪切共軛形式的脂肪酸。若需要進一步純化，可以使用標準方法。這類方法包括抽提、使用尿素處理、分步結晶、HPLC、分餾、矽膠層析、高速離心或蒸餾、或者這些技術聯合使用。可以通過已知技術(譬如，烷基化或碘化作用)在任一步驟完成對諸如酸或烯基基團這樣的反應基團的保護。所使用的方法包括對脂肪酸進行曱基化以生成甲基酯。類似地，保護基團可以在任一步驟除去。理想地，通過使用尿素和/或分餾處理可實現對含有GLA、STA、ARA、DHA及EPA的組分的純化。在植物中生產co-3和/或(o-6脂肪酸本發明的編碼區可以在植物、尤其是產油植物中表達。這通過以下步驟完成l.)構建嵌合基因(包含在諸如啟動子及3'轉錄終止子這樣的合適的調控序列控制下的本發明中的Al5去飽合酶)；2.)將嵌合基因轉化入合適的植物宿主中；以及3.)表達上述嵌合基因以生成PlFAs。因此，本發明涉及用於改變產油植物成熟種子中總脂肪酸譜以生產w-3:o>6比例大於0.4的油脂的重組構建體，該構建體含有從下組中選擇的分離的核酸片段(a)分離的、編碼SEQIDNO:2中所示的全部或部分胺基酸序列的核酸片段；(b)分離的、當使用O.lxSSC、0.1%SDS、65。C洗滌時可與(a)雜交的核酸片段；(c)分離的、編碼胺基酸序列的核酸片段，其中所述胺基酸序列基於序列比對的ClustalV方法，同SEQIDNOs:2、6、10、14、18所示的胺基酸序列具有至少46.2%的序列同一性；或者(d)分離的、同(a)(b)或(c)完全互補的核酸片段。其中所述的分離的核酸片段可通過操作連接到至少一種調控序列上co-3對to-6的比例可以在約2:5到至少約45:l的範圍內。可用的比例包括，但並不局限於w-3為約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、23、24、27、29、31、36、42及4S，對大約為l的co-6。其它可用的co-3對co-6比例包括，但並不局限於2:5、3:5、4:5、1:1及2:1。可以確信，從至少約2:5到至少約45:1中的任何co-3對w-6的整數比均是可用的。本申請所述的從串珠鐮孢中分離到的分離的核酸片段可用於本發明實踐中。本發明還涉及產油植物、植物細胞、植物組織和/或在其基因組中包含本發明中的重組構建體的植物部分。在更一步的方面中，本發明還涉及從這些轉化的油籽植物中獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、從油脂加工過程中獲得的產品、該油脂在食品、動物飼料或工業應用中的用途、副產品在食品或動物伺料中的應用。本發明提供多種用於轉化本申請所述的A15去飽合酶的植物宿主。所轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，優選地，它們與被鑑定為含油的植物(譬如，油籽植物)是同一類中。優選的油籽植物宿主的實施例包括，但並不局限於大豆(Gfyc/we與s/7.)、穀物(ZW{歸,s)、亞麻(L/m,平)、油菜軒(B屍騰/oz平)、櫻草花、芥花籽、玉米、紅花(CflW/mmM"p.)及向日葵(〃CVmWw"/7.)。通常，可通過過量表達本申請中A15去飽合酶來生產本發明中的改良植物。這可以通過首先構建嵌合基因的方式來完成，其中A15去飽合酶編碼區通過操作連接在能夠指導該基因在期望的組織中、在期望的發育時期進行表達的調控序列上。這些控制序列包括啟動子、增強子、沉默子、內含子序列、3'UTR和/或5'UTR區、以及蛋白和/或RNA穩定元件。這些元件在其強度和特異性方面可差別很大。出於便利的原因，嵌合基因包括來自相同基因的啟動子序列和翻譯引導序列。還必須提供編碼轉錄終止信號的3'非編碼序列。優選地，嵌合基因通過載體來導入，並且載有A15去飽合酶序列的載體還包含一個或多個選擇標記基因，用來區分使用嵌合基因轉化了的細胞與未轉化的細胞。本發明使用了多種植物啟動子來驅使本申請所述的A15去飽合酶基因或其功能片段進行表達。任何在植物中具有功能的啟動子均是適合的，包括(但並不局限於)組成型植物啟動子、植物組織特異性啟動子、植物發育階段特異性啟動子、誘導型植物啟動子、病毒啟動子、雄性生殖系特異性啟動子、雌性生殖系特異性啟動子、花特異性啟動子及營養體苗端分生組織特異性啟動子。如上文所提到的，啟動子是指導植物細胞器件從啟動子下遊(3')所毗鄰編碼序列開始生成RNA的一段DNA序列。啟動子區影響在該區域進行基因RNA轉錄的速率、發育階段以及細胞類型。進行RNA轉錄可生成信使RNA(mRNA)，它作為將RNA序列翻譯成所編碼多肽的胺基酸序列的模板。5'非翻譯引導序列是mRNA中蛋白編碼區上遊的一個區域，在起始及翻譯mRNA中發揮作用。3'轉錄終止子/多聚腺苷酸信號是蛋白編碼區下遊的一個非翻譯區域，在植物細胞中的功能是造成RNA轉錄的終止並在RNA的3'末端添加多聚腺苷酸核苷酸。所選擇的用來驅使編碼序列表達的啟動子的來源並不重要，只要它具有足夠的轉錄活性，可通過在期望的宿主組織中、在正確的時間能將期望的核酸片段表達為可翻譯的mRNA從而完成本發明即可。異源的或非異源的(即，內源的)啟動子均可用於實現本發明。可用於實現本發明的合適的啟動子包括，但並不局限於p-伴大豆球蛋白的a主亞基啟動子、Kunitz型胰蛋白酶抑制劑3啟動子、膜聯蛋白啟動子、Glyl啟動子、p-伴大豆球蛋白的P亞基啟動子、P34/GlyBdm30K啟動子、白蛋白啟動子、LegAl啟動子及LegA2啟動子。膜聯蛋白或P34啟動子在活性水平上比得上許多已知的強啟動子，譬如C:aMV35S啟動子(Atanassova等，(1998)屍/"WMo/.fi/。/.37:275-285;BattrawandHall,(1990)/VawL4fo/.fi/o/.15:527-538;Holtorf等，(1995)/Vflw,M。/.所o/.29:637-646;Jefferson等，(1987)￡7V/B6>丄6:3901-3907;Wilmink等，(1995)P/a"fMo/.28:949-955)、:y由ww啟動子(Plant等，(1994)P/flW編.fi/o/.25:193-2(5.，Li，(1997)TexasA&MUniversityPh,D,dissertation,pp,107-128)、擬南芥泛素延伸蛋白啟動子(Callis等，1990)、番茄泛素基因啟動子(Rollfinke等，1998),大豆熱休克蛋白啟動子(Schoffl等，1989)及玉米組蛋白基因啟動子(Atanassova等，1998)。當所需的是對目標異源核酸片段進行種子特異性表達時，在絕大多數植物細胞中使用作為2004年8月26日公開的W2004/071178的主題膜聯蛋白或P34啟動子進行嵌合基因的表達尤為有用。膜聯蛋白啟動子的另一個有用特徵是其在發育種子中的表達譜。本發明中的膜聯蛋白啟動子在種子發育的早期(傳粉後10天之前)最具活性，而在後期很大程度上是靜止的。膜聯蛋白啟動子的表達譜不同於很多種子特異性啟動子的表達譜，譬如種子儲存蛋白啟動子，它通常在發育後期提供最高活性(Chen等，(1989)Z)ev.10:112-122;Ellerst隱等，(1996)P/fl"fMo/.32:1019-1027;Keddie等，(1994)A/o/.層.24:327-340;Plant等，(1994)/Vfl"fMo/.所o/.25:193-205;Li，(1997)TexasA&MUniversityPh.D.dissertation,pp.107-128)。P34啟動子具有更便利的表達謙，但與其它已知種子特異性啟動子仍有區別。因此，當期望在胚早期發育階段進行基因過表達或抑制時，膜聯蛋白或PM啟動子是非常有吸引力的候選者。例如，可以期望過表達一個調節早期胚發育的基因或者涉及種子成熟之前代謝的基因。然後，使用本領域的技術人員所眾所周知的便利方法將啟動子通過操作以正向進行連接。一旦獲得重組構建體，隨後可通過本領域中普通熟練人員周知的方法包括，例如，上述的轉染、轉化及電穿孔，將其轉化入所選的油籽植物細胞中。然後在允許Pl)FA表達的適合條件下培養並重建轉化的植物細胞，之後可對其進行回收純化。本發明的所有重組構建體可以導入一個植物細胞中，或者，每個構建體導入不同的植物細胞中。在植物細胞中的表達可以按上述的瞬時或穩定方式來完成。所期望的PUFAs可以在種子中表達。在本發明範疇內，也可以是從這些轉化植物獲取的種子或植物部分。植物部分包括分化的及未分化的組織，包括但並不局限於根、莖、苗、葉、花粉、種子、瘤組織、以及諸如單種細胞、原生質體、胚與愈傷組織這樣的多種細胞及培養物形式。植物組織可是位於植物體內，或者位於器官、組織或細胞培養物內。主要通過1吏用/4gn^tt"(屍/"附似附e/flc/e"s轉4匕雙子葉植物並獲得轉基因植物的方法已公開，其中，可用於棉花(美國專利No.5，004，863，美國專利No.5,159,135),大豆(美國專利No.5，569，834，美國專利No.5,416,011)、芸苔(美國專利No.5,463,174)、花生(Cheng等(1996)/Vfl^(>〃15:653-657，McKently等(1995)jP/fl"f0〃14:699-703)、番木瓜(Ling，K.等(1991)9:752-758)以及豌豆(Grant等(1995)P/"/^Ce〃15:254-258)。其它植物轉化常用方法的綜述可參見Newell,(:.A.(2000)編.16:53-65。這些轉化方法中的一種是使用了々raZm"e/7f/附r/".zogeww(Tepfler，M.and(:asse-Delbart，F.(1987)AW.4:24-28)。已經報導了通過使用PEG融合(PCTpublicationWO92/17598)、電穿孔(Cho群ira，G.M.等(1995)服胸ec/mo/.3:17-23;Christou，P,等(1987)/Vw./Vfl,/.4c"AX'人f.iA84:3962-3966)、顯微注射、或粒子轟擊(McCabe，D.E.et.al.(1988)腸/7V由o/，6:923;Christou等(1988)/^W/Vr.vsi》/.87:671-674)的方式將DNA直接輸入大豆中進行轉化。有多種方法用於對從植物組織中獲得的植林進行重建。重建的特定方法依賴於起始的植物組織以及要重建的具體植物物種。在本領域中從單個植物原生質體轉化子或從多種轉化的外植體進行植物重建、發育及培養是眾所周知的(WeissbachandWeissbach，(1988)In.:MethodsforPlantMolecularBiology,(Eds.)，AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA)。典型地，這種重建及生長過程包括選擇轉化細胞、通過胚發育，經歷有根的胚芽階段的正常階段來培養這些具有特性的細胞的步驟。轉基因的胚和種子的重建相似。所獲得的轉基因的有根幼芽隨後種植在諸如土壤這樣的合適的植物生長培養基中。優選地，重建植物是自花授粉的，以提供純合的轉基因植物。否則，從重建植物中獲得的花粉會與那些由種子生長出來的農藝學上重要譜系的植物發生雜交。相反，來自這些重要譜系的花粉可以用於對重建植物進行授粉。可使用本領域熟練人員所周知的方法對本發明中含有期望多肽的轉基因植物進行培養.除了上面討論過的步驟外，專業人員還熟悉那些描述大分子(譬如，DNA分子、質粒等)構建、操作及分離、重組DNA片段及重組表達構建體的生成、以及篩選並分離克隆的具體條件和過程的標準資料(參見，例如，Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress;Maliga等(1995)MethodsinP通antMolecularBiology,ColdSpringHarborPress;Birren等(1998)GenomeAnalysis:DetectingGenes,1，ColdSpringHarbor,NewYork;Birren等(1998)GenomeAnalysis:AnalyzingDNA，2,ColdSpringHarbor,NewYork;PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,eds.Clark,Springer,NewYork(1997))。在另一方面，本發明涉及在油籽植物中提高(0-3脂肪酸對co-6脂肪酸比例的方法，它包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇同未轉化植物中(o-3脂肪酸對o-6脂肪酸的比例相比，O)-3脂肪酸對W-6脂肪酸比例有所提高的那些轉化植物。在更進一步的方面，本發明涉及在油籽植物的種子中產生a-亞麻酸的方法，其中種子中a-亞麻酸的含量至少為種子油中總脂肪酸含量的25%，所述的方法包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇那些其中所含a-亞麻酸至少為種子油中總脂肪酸含量25%的轉化植物。在這類種子中油脂中a-亞麻酸的含量範圍為至少25%到約89%,或者是25%與89%之間的任意整數百分比，譬如，26%、27%等。的重組構建:的油;i物、植物細胞:植物組織和/或植物部分。在更進一步的方面，本發明還涉及從這些轉化的油籽植物中獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、在油脂加工過程中獲得的產品、該油脂在食品、動物銅料或工業應用中的用途、副產品在食品或動物飼料中的應用。在本領域中分離種子油的方法是眾所周知的(Youngetal，ProcessingofFatsandOils,in"TheLipidHandbook"(Gunstoneetaleds.)Chapter5pp253-257;London,Chapman&Hall,1994)。隨後可向改造的種子油中添加諸如營養添加劑、食品、嬰兒配方食品、動物飼料、寵物食品及其它類似的營養組分。同其它植物油相比，從物理學角度看，可以確信本發明中的油脂在功能上與食品應用中的其它油脂類似。諸如豆油這樣部分氫化的油脂》可廣泛用作塗抹奶油、人造黃油以及燒烤及油炸起酥油的成分。其中加入了本發明中的改造種子油或改造種子的食品或食品類似物的實施例包括諸如肉類加工產品這樣肉製品、穀類食品、快餐食品、燒烤食品、油炸食品、健康食品、嬰兒配方食品、飲料、營養添加劑、乳製品、寵物食品、動物飼料或水產品。可使用本領域的技術人員所周知的加工過程來製備食品類似物。美國專利Nos.6,355,2%Bl及6，187，367Bl描述了乳化的肉類似物以及乳化的肉增量劑。美國專利No.5，206，050Bl描述了可用於烹飪食品類似物的大豆蛋白凝乳(也可作為生成凝乳，可用於製備食品類似物的工藝)。Hwa的美國專利NcK4,284，656描述了一種用於食品類似物的大豆蛋白凝乳。Hibbert等的美國專利No.3,988,485描述了一種由交織的植物蛋白纖維形成的類似肉類的蛋白食品。Puski等的美國專利No.3,950,564描述了一種製備基於大豆的肉類替代品的過程，Reinhart等的美國專利No.3,925,566描述了一種仿肉製品。例如，經過加工處理成具有一定結構的、塊狀或纖維狀的、用作食品配料的大豆蛋白稱為"大豆組織蛋白(TSP)"。常常將TSP製備成在含水時具有類似肉類、海產品或禽肉的結構及外觀。值得一提的還有肉類似物、乾酪類似物、牛奶類似物及其它相似物品從大豆中製備的肉類似物含有大豆蛋白或者豆腐以及其它混和在一起的成分，可以模擬成多種肉類。這些肉類替代品以冷凍、罐裝或乾燥食品的方式出售。通常，它們按與其所替代的食品相同的方式來使用。來自大豆的肉類替代品是蛋白質、鐵及維生素B的優質來源。肉類似物的實施例包括，但並不局限於火腿類似物、香腸類似物、燻肉類似物以及其它類似物。食品類似物根據其功能和組分特性可歸為仿製品或替代品。例如，仿製乾酪僅僅需要與它所要替代的乾酪相類似。不過，若是產品的營養與其所替代的乾酪等價、達到了該乾酪的最低組分要求，則通常稱之為替代乾酪。因此，替代乾酪通常比仿製乾酪具有更高的蛋白水平，並且維生素和礦物質也進行了加強。牛奶類似物或不含奶的食品包括，但並不局限於仿製牛奶、諸如從大豆和/或大豆蛋白產品製備的非乳製冰凍甜點。肉製品包括種類眾多的產品。在美國，"肉類"包括產自牛、豬及羊的"紅肉"。除了紅肉之外，還有包括雞、火雞、鵝、珍珠雞、鴨的家禽選項，以及魚類和貝類。對於有時效的及加工的肉製品有一個涵蓋很廣的分類新鮮的、醃製並油炸的、以及醃製並煮熟的。香腸和熱狗是加工過的肉製品的實施例。因此，本申請中的術語"肉製品"包括，但並不局限於加工過的肉製品。穀類食品是加工穀物所獲得的食品。穀物包括來自草本家族能產生可食用穀粒(種子)的所有植物。最普通的穀物是大麥、玉米、小米、燕麥、昆諾阿藜、稻米、黑麥、高粱、黑小麥、小麥及野生稻。穀類食品的實施例包括，但並不局限於整粒穀物、碾碎的穀物、粗麵粉、麵粉、麥麩、胚芽、早餐類穀物、膨化食品、義大利麵、以及其它類似物。燒烤食品包括上述任一種穀物食品，它是經歷過燒烤或者用與燒烤相當的方式即，通過加熱來乾燥或硬化進行過加工。燒烤食品的實施例包括，但並不局限於麵包、蛋糕、油炸團餅、麵包心、燒烤小吃、小點心、小脆餅、小甜餅、以及小鹹餅乾。如上所述，本發明中的油脂可以用作配料。一般地，通過一系列與從含油種子中提取並純化食用油相關的步驟來生產豆油。可使用下圖所示的一般性步驟來生產豆油和大豆副產過程大豆油脂抽提—脫膠—鹼或物理提煉水洗—漂白(氫化)(凍凝)—丄除臭—除去雜質/'獲得副產口口P穀物粗粉卵磷脂膠、游離脂肪酸、色素皂染料、皂、金屬硬脂酸FFA、生育酴、固醇、揮發物油脂產品將大豆種子進^f亍清洗、軟化、去皮、並剝成片，這會提供油脂提取的效率。通常使用溶劑(己烷)抽提的方法來進行油脂提取，不過也可通過物理壓迫和/或溶劑抽提相結合的方法還做到這點。獲得的油脂稱為粗油。粗油可以通過與可促進其與未水合的甘油三酯部分(豆油)分離的磷脂以及其它極性與中心脂類複合物水合的方式進行脫膠。獲得的卵磷脂膠可以進一步加工，製成在多種食品及工業產品中均具有重要商業價值的、可用作乳化劑及脫模(抗粘)劑的卵磷脂產品。同商業應用相比，在用於化學及生化時，術語卵礴脂本身具有不同含義。在化學上，卵磷脂是磷脂醯膽鹼。商業上，它指的是中性及極性脂類的天然混合物。極性脂磷脂醯膽鹼在已商品化的卵磷脂中其濃度為20-90%。含有磷脂醯膽鹼的卵磷脂可從植物、動物及微生物原料中生產，但主要來自植物原料。大豆、向日葵和油菜籽是商品化卵磷脂的主要植物來源。大豆是最常見的來源。植物卵磷脂被認為是符合GRAS(公認安全)的。脫膠油脂可進一步提煉除去雜質；主要是游離的脂肪酸、色素和殘留的膠。可通過向粗油中加入可與游離脂肪酸反應形成皂的腐蝕性試劑、以及水合磷脂及蛋白來完成精煉。使用水洗去精煉過程中形成的痕量皂。皂料副產物可直接用於動物伺料。或者酸化後回復成游離脂肪酸。通過漂白土的吸收來除去染料可除去絕大多數葉綠素11及類胡蘿蔔素混合物。精煉油脂可以氫化，形成具有多種融解特性及結構的脂肪。可使用凝析(分級分離)通過在精心控制的冷卻條件下進行結晶的方式，從氫化油脂中除去硬脂酸。除臭，主要是在真空中的蒸氣蒸餾是最後一步，用來除去給油脂造成臭味或氣味的化合物。其它有價值的副產品，諸如生育酚和固醇可以在除臭過程中分離出去。含有這些副產品的除臭蒸餾物可以作為天然的維生素E產品以及其它高價值的藥學產品來出售。精煉的、漂白的、(氫化的、分餾的)並除臭的油脂和脂肪，可包裝後直接出售，或者進一步加工成更專門的產品。關於大豆種子加工、豆油生產及副產品應用的更為詳盡的文獻，可以在Erickson，1995，PracticalHandbookofSoybeanProcessingandUtilization,TheAmericanOilChemists'Societyandl)nitedSoybeanBoard—書中找到。同其它油脂，諸如椰子、棕櫚、棕櫚仁及可可油相比，豆油中飽和脂肪酸的含量相對較低，因此它在室溫下是液體。很多加工過的脂肪，包括塗抹奶油、糖果用油脂、硬質脂肪、人造奶油、燒烤起酥油等，在室溫下需要具有多種程度不同的固體狀態，只能從豆油中通過改變其物理特性的方式來進行生產。實現該目標最常見的方式是催化加氫。氫化是一個化學反應，其中在諸如鎳這樣的催化劑的協助下，將氫加到不飽和脂肪酸雙鍵上。高油酸豆油含有不飽和的油酸、亞油酸及亞麻酸，其中每種均可氫化。氫化作用有兩個主要效果。首選，由於減少了不飽和脂肪酸的含量，增加了油脂的氧化穩定性。其次，由於對脂肪酸的修飾提高了熔點，使得油脂的物理性質發生變化，可在室溫下保持半固體或半液體狀態。有很多影響氫化反應的變量，它又改變了終產物的組成。包括壓力、穩定、催化劑種類和濃度、攪拌及反應器設計在內的操作條件是可以控制的比較重要的參數。選擇氫化條件，可以在較低不飽和脂肪酸之前優先氫化更不飽和的脂肪酸。經常使用非常輕微或小規模的氫化來增加液體油脂的穩定性。進一步的氬化會將液體油脂轉化為物理上為固體的脂肪。氫化的程度依賴於針對特定終產物所設計的期望操作以及融解特性。用於製造燒烤產品的液體起酥油、用於商業油炸與焙燒操作的固體脂肪和起酥油、以及用於人造奶油生產的基本原料就是通過氫化作用獲得的無數種可能的油脂與脂肪產品種的幾個。關於氫化作用和氫化產品的更為詳盡的描述，可以在Patterson,H.B.W.,1994,HydrogenationofFatsandOils:TheoryandPractice.TheAmericanOilChemists'Society中找到。由於存在氫化過程中形成的反式脂肪酸異構體，因此對氫化油脂也存在爭論。攝入大量的反式異構體同有害的健康效應包括增高血漿中低密度對高密度脂蛋白的比例從而增加了冠心病的危險相關聯。快餐食品可包括上述或下述食品中的任何一種。油炸食品可包括上述或下述經油炸製備的食品中的任何一種。健康食品是對健康有好處的任何食品。許多來源於油籽的食品可淨皮視為健康食品。飲料可以是液體或者乾粉形式。例如，可以是非碳酸類飲料；新鮮的、冷凍的、罐裝的或濃縮的杲汁；添加香料或正常的牛奶飲品等。在本領域中，成年人和兒童營養配方均是眾所周知的，而且已商品化(譬如，來自RossProductsDivision,AbbottLaboratories的Similac⑧、Ensure、Jevity⑧、以及Alimentum)。要兒配方食品是用來哺育嬰兒及年幼兒童的液體或可重新構成液體的粉末。它們用作人乳的替代品。嬰兒配方食品在嬰兒飲食方面具有特別作用，因為它們通常是嬰兒營養的唯一來源。儘管對嬰兒而言乳房餵養仍然是最具營養的，但嬰兒配方食品仍是寶寶不僅要生存下來還更要茁壯成長的最佳第二選擇。乳製品是來源於乳液的產品。牛奶類似物或者非乳製品來自乳液之外的原料，例如，上文討論過的豆奶。這些產品包括，但並不局限於全脂奶、脫脂奶、諸如乳酪或者酸奶這樣的發酵乳製品、奶油、黃油、煉乳、幹奶片、咖啡伴倡、咖啡奶精、冰淇淋、乾酪等。寵物食品是專門用來餵養諸如狗、貓、鳥、爬行動物、魚、齧齒動物以及其它類似動物的產品。這些產品可以包括上述的穀物與健康產品，以及肉與食用臟器、大豆蛋白產品、草和乾草產品包括但並不局限於苜蓿、貓尾草、燕麥草或雀麥草、蔬菜以及其它類似物。動物伺料是專門用來餵養諸如火雞、雞、牛與豬以及其它類似動物的產品。同上述寵物食品一樣，這些產品可包括穀物與健康產品、大豆蛋白產品、肉與食用臟器、以及上面所列的草和乾草產品。水產培養飼料是專門用於水產養殖場的產品，它涉及在淡水或鹹水中對水生生物、動物和/或植物進行繁殖、培養或飼養。在另一個實施例中，本發明包括從這類植物種子中獲得的油脂。在另外一方面，本發明涉及用於改變油籽植物成熟種子中總脂肪酸譜從而生成to-3對co-6比例大於2的油脂的重組構建體，其中所述的油脂中二十碳五烯酸含量高於2%，所述的含有分離核酸片段的構建體選自含有以下條件的組中(a)分離的、編碼SEQlDNO:2中所示的全部或部分胺基酸序列的核酸片段；(b)分離的、當使用O.lxSSC、0.1%SDS、651C洗滌時可與(a)雜交的核酸片段；(c)分離的、編碼胺基酸序列的核酸片段，所述胺基酸序列基於序列比對的ClustalV方法，同SEQIDNOs:2、6、10、14、18所示的胺基酸序列具有至少46.2%的序列同一性；或者(d)分離的、同(a)(b)或(c)完全互補的核酸片段。其中所述的分離的核酸片段可通過操作連接到至少一種調控序列上。另外，本發明涉及在其基因組中含有本發明中的重組構建體的油籽植物、植物細胞、植物組織或植物部分。本發明還涉及從這些植物獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物飼料中的用途、在該油脂加工過程中獲得的副產品以及這些副產品在食品或動物飼料中的應用。此外，本發明提供了通過本發明中的方法生產的微生物油。在另一個方面，本發明涉及在油籽植物種子中產生二十碳五烯酸的方法，以生產w-3對w-6比例大於2的油脂，其中所述的油脂中二十碳五烯酸的含量高於種子油總脂肪酸含量的2%，所述方法包括a)使用本發明中的重組構建體轉化油籽植物細胞；b)通過步驟(a)中的轉化植物細胞重建油籽植物；c)選擇那些其中所含二十碳五烯酸至少為種子油中總脂肪酸含量2%的轉化植物。另外，本發明涉及在其基因組中含有本發明中的重組構建體的油籽植物、植物細胞、植物組織或植物部分。本發明還涉及從這些植物獲得的種子、從這些種子中獲取的油脂、該油脂在食品或動物飼料中的用途、在該油脂加工過程中獲得的副產品以及這些副產品在食品或動物飼料中的應用。此外，本發明提供了通過本發明中的方法生產的微生物油。然後使用本領域的技術人員所周知的方法，參見，例如，Sambrook等，MokcwlarCloning;ALaboratoryM錯wal，2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,N、'，1989(在下文為"Maniatus");以及由GreenePublishingAssoc.及Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBio，ogy中所述的技術，可構建包含嵌合A15去飽合酶基因的多種質粒和載體。質粒栽體的選擇依賴於轉化宿主植物時所用的方法。熟練的技術人員非常清楚質粒上必須存在的遺傳元件，以成功轉化、選擇並增殖含有嵌合基因的宿主細胞。例如，所使用的終止信號通常來自胭脂鹼合成酶啟動子或CAMV35S啟動子,，經常使用的植物翻譯增強子是菸草花葉病毒(TM\)w序列；此外，已表明含有內含子(例如，來自玉米Shrunken基因的Intron-l)可提高表達水平達100倍之多(Mait,7削,"/c6:143-156(1997);Ni，/離聰/7:661-676(1995))。其它的調控元件可包括轉錄(以及翻譯)增強子。除了上述用於優選的表達載體的調控元件外，對於栽體而言，含有可作為選擇和/或記分的標記也是有用的。優選地，標記基因是某種抗生素抗性基因，因此可使用合適的抗生素從未轉化的細胞中將轉化細胞篩選出來。對本領域的技術人員而言，可用於篩選轉化的植物細胞、植物組織和植物的選擇標記基因是眾所周知的。實施例包括，但並不局限性提供針對theaminoglycosides、新黴素、卡那黴素和巴龍黴素(paromycin)抗性的w/;/;提供針對潮黴素抗性的/zjgra;允許細胞使用吲哚來替代色氨酸的w/^;允許細胞使用histinol來替代組氨酸的/"、Z)(Hartman,P麼.飾".iAR485:8047(1988));允許細胞使用甘露糖的甘露糖-6-磷酸異構酶(WO94/20627);提供針對鳥氨酸脫羧酶抑制劑、2-二氟曱基-DL-鳥氨酸(或為"DFMO")抗性的ODC(鳥氛酸脫叛酶)(McCon，ogue,In:Cw/rewfG附mMm'a/〃》ws/w;術/ecw/fl/'fi,》/o"',ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1987));以及提供針對殺稻瘟菌素S抗性的來自■/^/7erg〃/"s"at^ms的脫氛酵(Tamura，醜/osc/.B/o&c/zwo/.醜/oc/^m.592336-2338(1995))。對於本領域的技術人員而言，可用的記分標記也是眾所周知的，並且已商品化，譬如編碼螢光素酶(Giacomin,/>/.116:59-72(1996);Scikantha，丄Ba".178:121(1996))、綠色焚光蛋白(Gerdes,FERSLe",389:44-47(1996))或者R-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson,6:3901-3907(1987))的基因。這類實施例對於簡單並快速篩選含有包含A15去飽合酶的載體的細胞、組織和生物體非常有用。對某些應用而言，指導A15去飽合酶進入不同的細胞區室是有益的。因此可以想像，上述嵌合基因可通過向其編碼區添加適合的細胞76內導向序列(和/或將已經存在的導向序列刪除)的方式來使其進一步被修飾。這些附加的導向序列包括葉綠體轉運肽(Keegstra等，Ce〃56:247-253(1989))、指導蛋白進入內質網的信號序列(Chrispeels等，屍/aW屍/,)'s.P/"mMo/.42:21-53(1991))、以及核定位信號(Raikhel等，P/a/^屍/^'s.100:1627-1632(1992))。雖然所引用的參考文獻給出了上述每一個的實施例，但這個列表並沒有完結，在將來會發現更多可應用的導向信號，它們也可用於本發明中。對於本領域的技術人員而言，有多種已知的、可用的能夠將構建體導入植物細胞宿主的4支術。這些4支術包括4吏用/Ign^flc"n'mwf"me/fl"'^s或AW"'w^w"作為轉化劑用DNA進4亍轉化。特別優選的是使用了/^ra^/c^n'MW中Ti及Ri質粒的雙元栽體。來源於Ti的載體可轉化很多種高等植物，包括諸如大豆、棉花、油菜、菸草和稻這樣的單子葉植物及雙子葉植物(Pacciotti等，B/o/7>c/mo/^3，3:241(湧5);Byrne等，(>〃，77a層am/Of，C"&mm8:3(1987);Sukhapinda等，P/"wMo/.8:209-216(1987);Lorz等，M"/.Gew.C/VwW.199:178(1985);Potrykus，Mo/.GdC^wW.199:183(1985);Park等，丄P/fl"fB/"/.38(4):365-71(1995);Hiei等，P/rt"f丄6:271-282(1994))。對使用T-DNA轉化植物細胞的用法已經進行了廣泛的研究，並做了詳盡的描述(EP120516;Hoekema.In:TheBinaryPlantVectorSystem.Offset-drukkeri、jKantersB.V.;Alblasserdam(1985),ChapterV;Knauf等，(7t^e,/c,4脂/戸's"/Z/oW/fl"w/fA77/"w/0M6.，'々/7>/>Wcmw，In:MolecularGeneticsoftheBacteria-PlantInteraction.Puhler，A.Ed.;Springer-Veriag:NewYork,1983，p245;以及An等，EWZOX4:277-284(1985))。本發明中的嵌合基因可以插入實施例所述的雙元載體中以便轉入植物中。對於本領域的技術人員而言，其它轉化方法也是可用的，諸如1.)直接吸取外源DNA構建體(參見EP295959);2.)電穿孔技術(參見Fromm等，/Vflf"re(London)319:791(1986));3.)使用包被核酸構建體的金屬粒子進行高速彈道轟擊(參見Kline等，/V"mz^(London)327:70(1987)及美國專利No.4,945,050);或者4.)顯微注射(參見GeneTransferToPlants.PotrykusandSpangenberg，Eds.，SpringerVerlag:Berlin,N\(1995))。關於植物轉化通常所用方法的綜述可以參見Newell,(:,A.(Mo/.腸fec/i即/.16:53-65(2000))。使用上述的方法可以轉化絕大多數雙子葉植物；不過，還發展了其它轉化技術用於成功轉化單子葉植物。這些方法包括原生質體轉化以及通過使用」g/Y^"c'^n'M附似附e/"c/^w的植物5舌體方'法進4亍轉4匕。這種植物5舌體方法(BechtoldandPelletier，C.R.Acad.Sci.Paris,316:1194(1993);orCloughS.丄，BentA.F.;PlantJournal16(6):735-43(1998))涉及在發育中花蕾外面4吏用.1.f"m《/"c/e/"然後將雙元載體DNA導入正在發育的小孢子和/或大孢子和/或形成中的種子之中，以在不使用外源細胞分裂素和/或赤黴素的情況下產生轉化種子。本領域的技術人員知道所選取的用於這樣一個過程的組織可以有很多種；不過，通常優選地，使用在合子形成階段的植物原料用於植物活體轉化過程。一旦被轉化，有多種方法用於從植物組織中重建植株。重建的特定方法依賴於起始的植物組織以及要重建的具體植物物種。在本領域發育及培養是眾所周知的(MethodsforPlantMolecularBiology;WeissbachandWeissbach，Eds.，Academic:SanDiego,CA(1988.>)。其中特別相關的是將外源基因轉入商業上重要的油籽作物——諸如油菜籽(參見DeBlock等，P/fl,"91:694-701(1989);美國專利No.5,463,174)、向日葵(Everett等，B/。/7>c/mo/，5:1201(1987))、大豆(Mc(:abe等，B,V/7>c/mo/。g>'6:923(1988);Hinchee等，Bi"/7>c/mo/"w6:915(1988);(:hee等，P/flW屍/1,w/0/.91:1212-1218(1989);(:hristou等，/Voc./lc"A〃^486:7500-7504(1989);EP301749;美國專利No.5,569,834;美國專利No.5,416,011)及穀物(Gordon-Kamm等，P/","(>〃2:603-618(1990);F薩m等，B/W"/"w/ogv8:833-839(1990))中的方法。典型地，將轉基因植物細胞置於合適的選擇培養基上用於篩選隨後會長成愈傷組織的轉基因細胞。幼苗從愈傷組織中長出，通過在生根培養基上生長會從苗中生成小植株。通常會在多種構建體中加入標記用來對植物細胞進行篩選。為了便利，標記會對某種生物殺滅劑(尤其是諸如卡那黴素、G418、博來黴素、潮黴素、氯黴素、除草劑或其它類似物這樣的抗生素)具有抗性。使用的特定標記可以通過與缺少導入DNA的細胞進行比較來選擇轉化細胞。本領域的技術人員知道，在植物中轉基因的表達水平和調節會因譜系不同而差別顯著。因此，可以檢測數個譜系，得到具有期望表達水平及調節的譜系。熟練的技術人員還知道不同的、獨立進行的轉化會導致不同的表達水平和模式(Jones等，4:2411-2418(1985);DeAlmeida等，層.Ge".G匿to218:78-86(1989))，因此一定要對多次轉化進行篩選以獲得表現出期望表達水平和模式的譜系。這種篩選可通過DNA印跡的Southern分析(Southern,/./V^/.98:503(1975))、mRNA表達的Northern分析(Kroczek，J.C7wo附","gr.fi/》附^/./1p//.，618(1-2):133-145(1993))、蛋白表達的Western分析或表型分析來完成。一個用來測定蛋白表達量以及檢測不同植物組織中重複性的特別有用的方法是使用報告基因(譬如，GUS)。一旦荻得轉基因植物，它們可生長產生具有期望表型的植物組織或局部。可採集植物組織或植物部分，並/或收集種子。種子可用作長成額外的、其組織或局部具有期望特徵的植物的來源。如上文所討論的那樣，分離種子油的方法在本領域中是眾所周知的(Young等，7力e丄—V///aw^卯A:;Gunstone等，Eds.;Chapman&Hall:London,1994;pp253-257)。然後改造的種子油可用於多種營養組分中(譬如，營養添加劑、食品、嬰兒配方食品、動物伺料、寵物食品等)。本申請所述工作的最終目標是累積了富含co-3PUFAs油脂的生物體的發育，其中優選的宿主是產油植物或者含油酵母。為了這個目標，必須鑑定出在這些宿主中具有合成並高度累積優選的PUFAs的功能的去飽和酶。對有效的A15和(0-3去飽和酶進行鑑定對於控制宿主細胞中o-3對co-6PUFAs的比例也是必要的。在先前的工作中，分離到天然y"/7Yw/a//》0(V"CflA12去飽和酶，並過表達該蛋白，結果相對於野生型細胞，油酸轉化為LA增加了(美國專利申請10/840325，通過參考的方式完全整合在本申請中；也可參見本申請實施例2以及SEQIDNOs:54和55)。儘管在這些宿主細胞中LA的可用性增加了，但期望獲得適於在K/^w/^/cfl轉化細胞中可高水平生產多種PUFAs(譬如，EPA)的更大的底物池。這樣，以改造生物體的途徑來表達具有高水平A15去飽合酶活性的異源蛋白從而具有優勢。由於不指望先前在植物原料中分離的，115去飽合酶能在含油酵母中有效發揮作用，因此本發明的目標是分離真菌A15去飽合酶。可以預料，該真菌去飽和酶的過表達會增加含油酵母宿主中ALA的底物池，從而使得在這些宿主中合成並高度累積優選的co-3PUFAs(譬如，STA、ETA、EPA、DPA及DHA)。增高的A15去飽合酶活性也能夠改變o)-3對o>6PUFAs的比例。為了實現這些目標，在本發明中，申請人分離並克隆了來自串珠鐮孢的DNA片段，它編碼A15去飽合酶("Fml";SEQIDNOs:1和2》。使用含有串珠鐮孢Fml去飽和酶的嵌合基因轉化後在野生型的y"/roH^">w/v'"Va細胞中生成了ALA，基於這點，確認了該基因作為A，5去飽合酶的活性(實施例5，其中底物轉化百分比按(|18:3|/|18:2+18:3|*100)計算為82.5%)。不過令人驚訝的是，同先前已知的A15去飽合酶相比，串珠鐮孢A15去飽合酶還具有幾個獨特的性質。具體地，除了串珠鐮孢A15去飽合酶具有全新的序列之外，它還以具有顯著的A12去飽和酶活性(即，具有使用油酸作為酶底物的能力)、。/。ALA產物累積以及廣泛的底物特異性而聞名。*顯著的A12去飽和酶活性如實施例中所示，本申請所公開的串珠鐮孢A15去飽合酶具有顯著的A12去飽和酶活性(參見表9、實施例5)，其中使用編碼SEQIDNO:2的嵌合基因轉化A12去飽和酶已被敲除的Fflmw/"//^/^/c"菌林，它能將24%的油酸轉化為LA(底物轉化百分比按(|18:2+18:3|/|18:1+18:2+18:3|)*100)計算，此外還將96%的LA轉化為ALA(底物轉化百分比按(|18:3|/|18:2+18:3|)*100)計算))。這種雙功能同其它所有已知的A15去飽合酶形成鮮明對照。並且，儘管知道存在可對超過一種底物具有特異性的去飽和酶，但仍可將雙功能的串珠鐮孢去飽和酶(其中蛋白同時具有:V12和A15去飽合酶活性)和迄今為止所鑑定的任何已知的Al2或A15去飽合酶區分開來。攀ALA產物累積百分比在yflf7Ym7'fl///w(v"c'fl表達本申請所公開的串珠鐮孢A15去飽合酶時，相對於已描述的其它異源表達的A15去飽合酶(譬如，蠕蟲和植物)，它可進行極高的ALA合成。具體地，F"m/7'w附酶非常有活性(即，使用編碼SEQIDNO:2的嵌合基因所轉化的Ffl/7wWfl///w(v"cfl能夠表現出相對於轉化宿主細胞中總脂肪酸為31％的％ALA產物累積(參見表9、實施例5))。這代表ALA的轉化效率超過83%(按|18:31/jl8:2+18:3"100計算)。在使用編碼SEQIDNO:2的嵌合基因轉化的A12去飽和酶已被敲除的l'flmw/fl///w/^/cfl菌抹中，表明ALA的轉化率為％%。相反，在非含油酵母釀酒糖酵母中表達線蟲A15去飽合酶時，％ALA產物累積僅為4.1%(Meesapyodsuk等肌w/i^fi.39:11948-11954(2000));並且，當在譁酒糖酵母中表達仗A15去飽合酶時，％ALA產物累積僅為1.3%(Reed.，D.W.等，戶/"WP/^s/o/.122:715-720(2000))。串珠鐮孢A15去飽合酶的高效性，尤其是在A12去飽和酶被敲除的F.菌林中，是該蛋白具有雙功能的A12及A15去飽合酶活性的結果，由此A12去飽和的產物可用作A15去飽合酶的底物。本領域的技術人員知道，通過在幾乎沒有或完全沒有合成18:2能力的宿主生物(譬如，含油酵母的無A12去飽和酶譜系或者擬南芥/"rf2突變體)中表達本申請所公開的酶，18:3/18:2比例可最大化。參廣泛的底物特異性最後，串珠鐮孢A15去飽合酶對於18:2的下遊w-6衍生物具有相對廣泛的底物特異性；具體地，本申請所述的A15去飽合酶能夠催化GLA到STA、DGLA到ETA、及ARA到EPA的轉化。不過，相對於在釀酒糖酵母中線蟲(C.e/gflw"和仗廂/""15去飽合酶的異源表達(Meesapyodsuk等，見上；Reed等，見上)，本申請申請人的數據表明在F^r"w/rt中進4亍表達時，串珠鐮孢A15去飽合酶可更有效地將0)-6底物轉化為其(o-3對應物，即，具有更高的％底物轉化(表4)。81表4來自蠕蟲、植物與真菌的A15去飽合酶底物選擇的定性比較tableseeoriginaldocumentpage82注除了K///w(Wcfl中的18:2外，所有例子均加入了w-6底物；Nd=未檢測因此，本發明中真菌A15去飽合酶的異源表達通過增強ALA生物合成的方式增加了細胞內的碳流入(o-3脂肪酸生物合成途徑。結果，當其它P11FA生物合成酶與本申請的A15去飽合酶共同表達時，可提高w-3/(o-6脂肪酸的比例，並生成更多下遊co-3脂肪酸(譬如，STA、ETA和EPA)。可以預料這樣的結果會出現在任何表達本發明中A15去飽合酶的微生物中。在另外的實施例中，本發明人通過在植物油籽宿主中過表達串珠鐮孢A15去飽合酶的方式揭示了類似的結果。因此，可以預料該串珠鐮孢A15去飽合酶在任何宿主細胞中的表達均會使宿主細胞產生水平高於約10%總脂肪酸的ALA，其中高於約30%是優選的，高於50%是最優選的。類似地，這類轉化子顯示了改變的ALA對LA比例，其中ALA:LA比例至少約4是典型的，比例至少為8是優選的，比例至少為12是最優選的。從這些轉化子中提取的微生物油含有高於約10%的ALA，其中高於約30%是同樣期待的，高於50%會是典型的。此外，本發明人還從構巢麴黴、粗糙鏈孢菌、稻瘟病菌和禾穀鐮孢菌中鑑定了一系列同所述串珠鐮孢蛋白直系同源的A15去飽合酶(即，分別是SEQ1DNOs:6、14、10和18)。也預期這些真菌蛋白可用於在包括含油酵母(譬如，y"/rmW"/,》0(v"c")在內的不同宿主細胞中表達A15去飽合酶活性。這些蛋白(包括串珠鐮孢A12去飽和酶(SEQIDNO:2))歸於一個獨特的蛋白亞族(本申請中指的是"亞族1")中，它與歸於"亞族2"(即，SEQIDNOs:4、8、12、16和20，在共同待決美國臨時申請案6/570679中鑑定為A12去飽和酶)中的蛋白截然不同，雖然所有的蛋白均鑑定與K//^0/"/Cfl去飽和酶本申請中鑑定為SEQIDNO:55(其特徵見共同待決美國專利申請10/840325)同源。綜上，亞族1中的蛋白(本申請中鑑定為A15去飽合酶)代表其中彼此間具有至少46.2%同一性的一組蛋白(實施例3)，它們可根據序列同源性與先前所述的A15去飽合酶完全區分開來。在WO03/0"26中描述了構巢麴黴和粗糙鏈孢菌蛋白的功能特性，這確認了其作為A15去飽合酶的活性。本申請確認了推測的4^#病霧A15去飽合酶("Mgr，；SEQIDNOs:9and10)基因確實具有A15去飽合酶的活性，這是基於使用含有Mgl的嵌合基因轉化的野生型F"/roH^細胞產生了ALA(實施例6)。不過，這些A15去飽合酶的活性與上述串珠鐮孢A15去飽合酶活性的對比顯示，並非所有亞族1中的A15去飽合酶蛋白均具有雙功能的A12/A15去飽合酶活性。具體地，基於WO2003/099216中的結果，粗糙鏈孢菌與構巢麴黴蛋白並未表現出雙功能的A12/A15去飽合酶活性。相反，；0症病,蛋白的表現與串珠鐮孢蛋白類似，因此這兩個均歸為具有雙功能的A12/A15去飽合酶活性一類。推測禾穀鐮孢菌("Fgl";SEQIDNOs:17和18)也具有雙功能的A12/A15去飽合酶活性，因為Fgl與Fml關係最近(具有88.8%的同一性)，而雙功能的Fml與Mgl僅有60.9%的同一性。預計這個獨特的真菌A15去飽合酶類群作為改變脂肪酸組成的手段可用於含油酵母(譬如，J^/rmWfl/z》o(^/c")中的表達，這是基於對它們會高效發揮功能的期望(即，底物轉化百分比，其中LA到ALA的％底物轉化至少約50%是有用的，到ALA的轉化率至少約80%是優選的，到ALA的轉化率至少約90%是特別合適的，到ALA的轉化率至少約95%是最優選的)。因此，本發明的一個實施例是在含油酵母中改變脂肪酸譜的方法，其中亞族l中的A15去飽合酶蛋白單獨表達，或者同其它脂肪酸合成基因(譬如，A4去飽和酶、、5去飽和酶、A6去飽和酶、A12去飽和酶、A15去飽合酶、A17去飽和酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶和/或碳鏈增長酶)一起表達。另一個實施例是在植物中改變脂肪酸諳的方法，其中亞族l中的A15去飽合酶蛋白單獨表達，或者同其它脂肪酸合成基因一起表達，從而改變油脂中o>-3:w-6的比例和/或改變植物PUFAs的累積或組成。實施例本發明通過以下實施例進行進一步描述。用途。通過以上討論和這些實施例，本領域的熟練人員可了解本發明的本質特徵，在不偏離其主旨和範圍下，可對本發明進行各種改變和修改，以使其適於各種用途和條件。常規方法在實施例中所用的標準重組DNA和分子克隆技術在本領域中是眾所周知的，並在以下著作中進行了描述1.)Sambrook，,J.,Fritsch，E.F,andManiatis，T.A/o/eai/a/"CYtm/wg:爿Lfl6on^，iVffl/i鼎/;ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis).,2,)T,丄Silhavy，M.L.Ben,，andL.W'.Enquist，ExperimentswithGeneFusions;Co，dSpringHarborLaboratory:(oldSpringHarbor,NY(1984);及3.)Ausubel，F.M,等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingAssoc.andWiley-lnterscience出版(1987)。適於細菌培養物維持和生長的材料和方法在本領域中是眾所周知的。i舌幹以下實施例中的實膾枯太可表貝，ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhilUppGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.(:ostilow，EugeneVV.Nester，WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhilips,Eds),AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.(,(1994)>;或ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology.2nded.,SinauerAssociates:Sunderland,MA(1989)。若無特別說明，所有用於細菌細胞生長和維持的試劑、限制性內切酶和材料均從AldrichChemicals(Milwaukee,WI),D1FCOLaboratories(Detroit,MI)、GlBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或SigmaChemicalCompany(St.Luis，MO)獲得。Eo//TOP10細胞和Eco//ElectromaxDH10B細胞從lnvitrogen(Car皿sbad，CA)獲得。￡，.co//DH5a高效感受態細胞從GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)獲得。￡.o//(XL1-Blue)感受態細胞購自StratageneCompany(SanDiego，CA)。典型地,所有co//菌抹於37"在LuriaBertani(LB)培養皿上進行培養。根據標準方法進行常規的分子克隆(Sambrook等，同上)。寡具核苷酸由Sigma-Genosys(Spring,TX洽成。PCR產物克隆到Promega的pGEM-T國easy載體(Madison，WI)中。在ABI自動測序儀上通過dyeterminator技術(U.S.5,366,860;EP272,007)利用重組載體和插入子特異的引物來獲得DNA的序列。使用Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor，1VH)進行序歹'J編輯。所有序列均在兩個方向上覆蓋至少兩次。用DNASTAR軟體(DNASTARInc.,Madison,Wl)進行基因序列的比較。縮略語的含義如下"sec"表示秒，"min"表示分，"h"表示小時，"d"表示天，"nl"表示微升,"mL"表示毫升，"L，，表示升，"uM"表示微摩爾濃度，"mM"表示毫摩爾濃度，"M"表示摩爾濃度，"mmol"表示毫摩爾，"pmole"表示皮摩爾,"g"表示克，"ng"表示微克，"ng"表示納克，"l!"表示單位，"bp"表示鹼基對，"kB"表示千鹼基。yfl/rmWfl//po/y".q的培養F"mm^/(pofy"ca菌抹ATCC#76982和ATCC#90812購自美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)。K/Z^(^/c"菌林通常於28匸在YPD瓊脂(1%酵母提取物，2%蛋白腖，2%葡萄糖，2%瓊脂)上進行培養。對於轉化子的篩選，要使用基本培養基(0.n'!4無硫酸銨和胺基酸的酵母氮源(D1FCOLaboratories,Detroit,Ml)，2%葡萄糖,0.〗％脯氨酸，pH(U)並加入適量腺嘌呤、亮氨酸、賴氨酸和/或尿嘧啶至終濃度0.01%。Fflrnw,Vi的月旨肪酸分析為了進行脂肪酸分析，通過離心收集細胞，並根據Bligh，E.G.&Dyer,W.,J.(Cfl"../.所"c/^附./^卩,》.37:911-917(1959))所描述的方法提取脂肪。通過用曱醇鈉對抽提的脂類進行醯基轉移反應來製備脂肪酸曱基酉旨(Roughan，G.,andNishida.276(1):38-46(1990)),然後用已填充30畫mx0.25mmHP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC進行分析。烤箱溫度從1701C(維持25分鐘)，以丄5X:/min的速率升到185t:。對於直接的鹼基醯基轉移反應，收穫hmw/fl培養物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，然後在Speed-Vac中真空乾燥5-10分鐘。向樣品中加入甲醇鈉(1%，100，然後搖動並振蕩20min。在加入3滴lM的NaCI和400^U的己烷後，對樣品進行振蕩並離心。除去上層後，用上述GC進行分析。實施例1yfl/roiv/flt表達載體的構建本實施例描述了pY5-13(包含嵌合的TEF啟動子::XPR終止子基因)、pY5-13GPDN(包含嵌合的GPD啟動子:XPR終止子基因)和p\'5-20(包含嵌合的潮黴素耐藥基因)的構建。質粒pY5-13的構建構建的質粒pY5是質粒pINA532(由Dr.ClaudeGaillardin，InsitutNationalAgronomics,CentredebiotechnologieAgro國Industrielle，laboratoiredeGenetiqueMoleculaireetCelhilarieINRA-CNRS，F-78850Thiverval-Grignon，France惠贈，)的矛汴生物，用於Ffl/rmv/fl中異源基因的表達(圖3)。首先，將含有plNA532中ARS18序列和LEl]2基因的部分消化的3598bp長的片段亞克隆到pBluescript(Strategene，SanDiego，CA)的位點上，生成pY2。以TEF5'(SEQIDNO:21)和TEF3'(SEQIDNO:22)為引物，通過PCR從Yrt/rmv/fl/i/w/》，"c'fl基因組DNA中擴增獲得TEF啟動子(MuHerS.，等，^fl仏14:12671283(1998))。PCR擴增在50^總體積中進行，含有100ngh/TrnW"基因組DNA，含10mMKC'I、10mM(fsH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.75)、2mMMgS04、0.1%TritonX-100的PCR緩衝液，lOOjig/mLBSA(終濃度)，200nM每種脫氧核糖三砩酸核苷酸、lpmole每種引物和1piPfuTurboDINA聚合酶(Stratagene，SanDiego，)。擴增反應如下進4亍在95r起始變性3min，然後如下進4亍35個循環95"C1min，56T30sec,72T1min。最後進行一個10分鐘的72X:延伸循環，然後於4TC終止反應。將418bp的PCR產物連接到pCR-B，unt上，生成plP-tef。將plP-tef的Z"/w////E('o/a片段亞克隆到pY2的Bflw好/XS"附"/位點，生成pY4。以plNA532為模板，以XPR5，(SEQIDNO:23)和XPR3'(SEQIDNO:24)為引物，通過PCR擴增獲得XPR2轉錄終止子。PCR擴增在50nl總體積中進行，反應試劑和反應條件如上所述。將得到的179bp的PCR產物用Sflc〃消化，然後連接到pY4的Sflc〃位點，生成pY5。這樣pY5(如圖3所示)可作為yflmH7'fl-Eo/,'穿梭質粒，它包將，1.)Fa/7wv/fl自主複製序列(ARS18);2.)(:oHEl質粒複製起始位點；3.)氨千青黴素抗性基因(AmpR)，用於在E中進行篩選；4.)Fa/row/flLEIJ2基因，用於在Ffl/row/a中進行篩選；5.)翻譯延伸啟動子(TEFP)，用於在中異源編碼區的表達；及6.)胞外蛋白酶基因終止子(XPR2)，用於hwwW"中異源基因表達的轉錄終止。質粒pY5-13作為p\5的f汙生物而構建，以利於在yflmw/tf^0/.W/Cfl中的亞克隆和異源基因表達。特別地，pY5-13是以pY5為模板通過6輪定點突變而獲得的。用寡核苷酸YL5和YL6(SEQIDNOs:25和26)通過定點突變將Sa//和C7a/位點從pY5中刪除，從而生成pY5-5。用寡核苷酸YL9和YL10(SEQIDNOs:27和28)通過定點突變在pY5-5的Leu2基因和TEF啟動子之間引入一個A'fl//位點，從而生成pY5-6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQIDNOs:29和30)在pY5-6的LEU2基因和ARS18之間引入一個P"('/位點，從而生成pY5-8。用寡核苷酸YL3和YL4(SEQIDNOs:31和32)在pY5-8的TEF啟動子翻譯起始密碼子附近引入一個co/位點而生成pY5-，用寡核苷酸YL1和YL2(SEQIDNOs:33和34)刪除pY5-9的Leu2基因內部的/V"/位點，生成Y5-12。最後，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQIDNOs:35和36)在pY5-12的ColEl和XPR區之間引入Bw'『/位點，生成pY5-13。質粒Y5-13GPDN的構建以寡核苷酸YL211(SEQlDNO:38)和YL212(SEQIDNO:39)為引物，以Fflmw/fl基因組DNA為模板，擴增含甘油醛-3-磷酸-去飽和酶(GPD)啟動子區("GPDPro";參見共同待決的美國專利申請No.10/869630，此處通過參考將其內容整合在文中)的DNA片段。簡言之，該啟動子片段(SEQIDNO:37)包括GPD基因-968到+3之間的核苷酸區域，其中"ATG"翻譯起始密碼子中"A"的位置定義為+1。將擴增的GPDProDNA片段用^"//完全消化，然後用Wco/進行部分消化。含GPDPro的^///iVo/片段通過1%(w/v)瓊脂糖電泳進行純化，並連接到Sa////Vc0/消化的pY5-13栽體(其中/V"//S，fl//消化已將TEF啟動子從pY5-13載體骨架上除去)上，從而生成pY5-13GPD。因此，pY5-13GPD含有GPDPro::XPR終止子表達盒。將pY5-13GPD啟動子片段3，端的/Vco/位點轉變為/Vw/位點，從而生成pY5-13GPDN。為了實現該目的，將GPDPro通過PCR，用GPDsense(SEQIDNO:40)和具有AW/位點的GPDantisense(SEQIDNO:41)引物重新進行擴增。得到的啟動子片段用^//和/Vw/進行消化，並克隆到pY5-13的^////VW/位點(從而除去TEF啟動子)，生成pY5-13GPDN。質粒pY5-20的構建質粒pY5-20是pY5的衍生物。通過向pY5的vVW/位點插入含有嵌合的潮黴素抗性基因的W/片段來構建。嵌合基因具有在///w(F"c'"的TEF啟動子調控下的潮黴素抗性ORF。實施例2yflfrow/flL/p。/WoitA12去飽和酶的克隆及內源A12去飽和酶基因的破壞根據Fflmw/fl/i/w/^/c"(ATCC#76982)的脂肪酸組成表明該微生物可生成LA(18:2)，但不能生成ALA(18:3)，因此推測K//^/少'"'"/可能含有具A12去飽和酶活性、而不具有A15去飽合酶活性的基因。因此，本實施例描述了使用簡併PCR引物分離ym>W"/*o/^/cflA12去飽和酶的部分編碼序列，使用部分序列破壞yanwv/a/fXWoz中的天然基因，及隨後全長基因的亞克隆。用簡併PCR引物通過PCR對來源於Famn^//po/^c"的部分推測的A12去飽和酶序列進行克隆用DNeasy糹且織提取試劑盒(Qiagen，Catalog#69504)分離yVirran^V////wfy"('fl(ATCC#76982)中的基因組DNA，並以0.5ng/fi1的DNA濃度重懸在試劑盒的緩衝液AE中。以基因組DNA為模板，用根據不同A12去飽和酶中保守的胺基酸序列設計的幾組簡併引物進行PCR擴增。最好的結果是由一組上遊和下遊簡併引物P73和P76獲得的，如下表所示。表5用於擴增A12去飽和酶部分推測序列的簡併引物引物描述i簡併核苷酸序列對應的胺基酸序列P73(32)T5'-TGGGTCCTGGGCCA26-me「siYGARTG丫GGNCA-3'^(SEQIDNO:42)WVLGHECGH(SEQIDNO:43)P761~—""「5'-GGTGGCCTCCTCGG30，rs:CGTGRTARAANGG隨-3':(SEQIDNO:44)(SEQIDNIO:45)l注縮寫是標準的核苷酸和蛋白。所用的核酸的簡併代碼如下R=A/G;Y=C7T;及N=A/C/G/T|才艮據產品i兌明書在EppendorfMastercycler梯度熱循環4義上進4亍PCR。擴增反應如下進行在951C起始變性1min，然後進行30個循環95iC變性30sec，58"C退火lmin，72TC延伸1min。最後一個72r的延伸循環進行10min,然後在41C終止反應。預期大小的(約740bp)PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測、分離、純化，克隆到pTA載體(Invitrogen)中，並進行測序。根據BLAST程序分析(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.，等，./.A/W.B/W.215:403-410(1993))，得到的序列與已知的A12去飽和酶具有同源性。yfl/To>Wa//j^/W/c"A12去飽和酶基因的定點破壞Ffl/wn^///w/v"'ozATCC#76982A12去飽和酶基因的定點破壞是通過用與命名為pY23D12的定點表達盒對A12去飽和酶基因進行同源重組替代來進行的。pY23D12由質粒pY5-20(實施例1)衍生而來。特別地，通過在類似線性化的pY5-20中插入州m///片段可生成pY23D12。該642bp的片段包括(5'到3'方向)從(SEQIDNO:54的編碼序列(ORF))+718到+1031位的3'同源序列，Bg/〃限制性內切酶切位點及從(SEQIDNO:54的編碼序列(ORF))+403到+717位的5'同源序列。該片段分別用兩組PCR引物P99和P100(SEQ1DNOs:46和47)，及P101和P102(SEQIDNOs:48和49),對642bpPCR產物的3'和5'序列進行PCR擴增而獲得。通過Bg/〃限制性內切酶消化將pY23D12線性化，並根據Chen,D.C.等的方法(4PP/M,'cn^/o/份o^c/mo/.48(2):232-235(1997))通過醋酸鋰法來轉化對數中期的K//Xv"V"ATCC#76982細胞。簡言之，將K///^/.Wfl劃線接種到YPD培養皿上，於301C培養約18小時。將幾環細胞從培養皿上刮下，並重懸到1mL轉化緩衝液中，緩衝液含參2.25mL50y。平均分子量為3350的PEG;*0.125mL2M醋酸鋰，pH6.0;參(U25mL2MDTT;及參50jig剪切的鮭魚精DNA。將約500ng質粒DNA放在100nl重懸細胞中，於391C溫育1hr，並間隔15min振蕩混合一次。然後將細胞塗布在YPD潮黴素選擇培養皿上，於30TC培養2到3天。分離到4個潮黴素抗性的克隆，並通過PCR篩選定點破壞。將引物(P119ISEQIDNO:50和P120[SEQIDNO:51j)i殳計為可擴增同源重組後的特定拼接片段。另一組PCR引物(P121[SEQIDNO:521和P122[SEQIDNO:53|)被設計為可檢測天然基因。在4個潮黴素抗性克隆中，有3個是拼接片段陽性，而天然片段陰性的，因此確定發生了定點整合。在M2去飽和酶被破壞的菌株中測定脂肪酸諶通過對其中一抹命名為Q-dl2D的破壞菌抹中總脂類的GC分析，進一步了驗證天然M2去飽和酶基因已被破壞。野生型(ATCC#76982)和Q-dl2D的單克隆在3mL基本培養基(成分/L:20g葡萄糖，1.7g酵母氮源，lgL-脯氨酸，O.lgL-腺嘌呤，O.lgL-賴氨酸，pH6.1)中，於3010培養至006,,,)約為1.0。收穫細胞，用蒸餾水進行洗滌，真空乾燥，然後進行直接的醯基轉移反應和GC分析(如常規方法中所述)。野生型F"/7wWfl和含破壞的A12去飽和酶轉化Q-dl2D的脂肪酸譜如表6所示。脂肪酸定義為16:(軟脂酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)和18:2(LA)，每種酸的組成以總脂肪酸的a%表示e表6tableseeoriginaldocumentpage91nd-未檢測到結果表明在Q-dl2D菌株中天然A12去飽和酶基因是失活的。因此，在Fflmw/fl/,>。/j，"a/ATCC#76982中只有一個編碼有功能的A12去飽和酶的基因。Fanwv/fl///w(y"azzU2去飽和酶基因的質粒拯救由於是通過插入含有E07//氨節青黴素抗性基因和E//ori的完整pY23D12載體而破壞了A12去飽和酶基因，因此可在大腸桿菌中拯救其側翼序列。為此，用DNeasyTissue試劑盒提取Ffl/7wv/fl/&o/j"cfl菌抹Q-dl2D的基因組DNA。特別地，在200^1反應體積中用50^1限制性內切酶/t^/、/Jv/"〃、；V/w/和5"/;/i/消化10ng基因組DNA。消化的DNA用酚氯仿抽提，並重懸在40一去離子水中。消化的DNA(lOpl)在含3UT4DNA連接酶的200jil連接混合液中進行自連。連接反應於161C進行12小時。連接的DNA用酴氯仿抽提，並重懸在40jil去離子水中。最後，用1nl重懸的連接DNA通過電穿孔轉化E('"//，並塗布在含氨千青黴素(Ap)的LB培養皿上。分離具有Ap抗性的克隆，並通過小量製備分析質粒是否存在。在回收的或挽救的質粒中發現以下長度的插入片段(表7):表7根據限制性內切酶，所回收質粒中插入片段長度tableseeoriginaldocumentpage91用測序引物P99(SEQIDNO:46)和P102(SEQIDNO:49)來開始進行質粒的測序。才艮據測序結果，組裝了編碼yfl/rmv/fl/,力o(v"cfl的A12去飽和酶基因的全長基因(1936bp;SEQIDMO:54)。特別地，該序列編碼一個1257個鹼基的開放閱讀框(SEQIDNO:54中+283到+1539的核苦酸)，而推測的胺基酸序列長419殘基(SEQIDNO:55)。在"Yeastproject(^m/ww/^"的/^開的K〃/w(F"'ca蛋白資料庫中也發現了該基因，以YAL1-CDS3053.1公開(CenterforBioinf謹atics，LaBRI，TalenceCedex，France)(參見Dujon，B.等，/Vw"m430(6995):35-44(2004))。實施例3鑑定絲狀真菌中的A15去飽合酶本實施例描述了在多種絲狀真菌中A15去飽合酶的鑑定。這些序列是根據其與^r/YmvVzA12去飽和酵(實施例2)的同源性來鑑定的；而且根據系統發育分析，每個種的序列均位於兩個"亞族"中的某一個內。使用yy/wc/ioc/tv^A15去飽合酶進行同源性檢索首先用A15去飽合酶蛋白序列(rf^"基因，GenBank登錄號為D90913)作為查詢序列對絲狀真菌粗糙鏈孢菌和稻瘟病菌序列的公共資料庫進行BLAST檢索(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschu，，S.F.，等，丄Mo/.215:403-410(1993))。出人意料地，這些檢索沒有鑑定到任何同源序列。使用Fflnwv/fl///w(v"cflM2去飽和酶進行同源檢索然後申請人用YarrowialipolyticaA12去飽和酶蛋白序列(SEQIDNO:55)作為查詢序列對相同的資料庫進行BLAST檢索。這些檢索在每種生物中鑑定了兩個同源序列。然後，以SEQIDNO:55為查詢條件，在1.)^^必#和禾穀鐮孢菌的公共資料庫，及2.)串珠鐮孢菌林M誦8114的DuPontEST文庫(E.1.duPont(leNemoursandCo.，Inc.,Wilmington,DE)(串珠鐮孢菌林M-8114可從ResearchCenter,UniversityPark,PA獲得；亦可參見/Vfl,"Z)/se證81(2):2U-216(1997))中進行檢索。這些檢索也在每種生物中鑑定到兩個與h/nwv/fl/^ofy"o/A12去飽和酶蛋白同源的序列。下表總結了這些同源序列的詳細信息。表8與)^mH^//j^/^oA12去飽和酶具有同源性的ORFs的描述tableseeoriginaldocumentpage93*注奇數SEQIDNOs表示ORF核苷酸序列，而偶數SEQIDINOs表示推斷的胺基酸序列。所有這些同源序列或者未注釋，或者注釋為A12去飽和酶或脂肪酸去飽和酶。此外，來源於禾穀鐮孢菌的核苷酸序列是推測具有內含子序列的基因組序列；申請人通過與其它同源序列的胺基酸序列比對而對其推斷的胺基酸序列進行了嘗試性的組裝。用LASERGENE生物信息計算中心的Megalign程序(Windows32Megalign5.061993-2003;DNASTARInc"Madison，WI)對每個種的A12去飽和酶同源序列的系統樹分析意外地發現兩個亞族。如圖4所示，Ncl、Mgl、Fgl、Fml和Anl歸於"亞族l"中，其蛋白與F"nwv/""X^/cflA12去飽和酶有同源性，而Fg2、Fm2、Mg2、Nc2和An2歸於yfl/7YnWfl/,》0/j"cflA12去飽和酶蛋白同系物所在的"亞族2"中。然後用DNASTAR軟體的Megalign程序中的Clusta，W方法(慢，精確；Go隱t選項5Thompson等，iVwc7e/cJ"V/s紐.22:4673-4680(1994))對每個與Frtm^/fl///w(v"c'flA12去飽和酶具有同源性的蛋白進行比對。這個方法得到的同一性百分比用於檢測蛋白是否是直系同源基因(圖5)。具體地，該圖表示1.)歸於亞族1中蛋白的同一性百分比(左上角的三角形，以黑線表示)；2.)亞族1和亞族2之間蛋白的同一性百分比(右上角的盒子，以點線表示)；及3.)歸於亞族2中蛋白的同一性百分比(右下角的三角形)。因此，所有亞族1的蛋白(SEQlDNOs:2、6、10、14和18)至少互相具有46.2%的同一性，而與亞族2中蛋白(SEQIDNOs:4、8、12、16和20)的同一性同源性低於39.6%。此外，亞族2中蛋白間的同一性至少為56.3%。以上分析清楚地區分了兩個與Ffl/7YW/"A12去飽和酶(SEQ1DNO:55)具有同源性的蛋白亞族。此外，已知諸如K///w/》'"c"這樣的酵母只能合成18:2(不能合成18:3)，而這5種絲狀真菌中每種都能合成18:2和18:3另外，從yfl/7wv"中只分離到一個單獨的AI2去飽和酶，而其它所有真菌均具有兩個FaA7Wv/flA12去飽和酶的同系物。因此，本發明人推測在這些生物中其中一個亞族的去飽和酶代表A12去飽和酶(可將油酸轉化為LA(18:2)),而另一個代表Al5去飽合酶(可將LA轉化為ALA(18:3))。最後，使用Clusta，W比對算法(MegalignprogramofDNASTARsoftware,同上)單獨對串珠鐮孢A15去飽合酶蛋白序列與已知的大範圍物種的A15去飽合酶蛋白進行相似性分析。本申請報導的Fml胺基酸序列與C.ii7g(ms，GenBank登錄號為L41807的同一性為25.4%，與5yw^/^"W、rf&W(Gll653388)相似性為33.1%,與擬南芥/arf2基因的相似性為33.7%，與l.S.2003/0196217中異絲水黴去飽和酶的相似性為29.1%。含有亞族1(編碼推測的A15去飽合酶)中串珠鐮孢去飽和酶的表達質粒pY34(GPDPro::Fml::XPR)的構建本實施例描述了含實施例3所鑑定的亞族1中串珠鐮孢A15去飽合酶("Fml")的表達質粒的構建。具體地，構建一個嵌合基因，從而使推測的A15去飽合酶可在1Vwwv/"GPD啟動子("GPDPro")調控下進行表達。通過檢測所表達的ORF在野生型菌林和互補的A12去飽和酶被破壞的突變林(實施例2)中產生ALA的能力，從而可在I7"/7YH7'fl///70(V"Cfl中效!]定蛋白活性。以含有全長cDNA的cDNA克隆ffmlc.pK001.g23和ffmlc.pK013.n7為模板，以P192(SEQIDNO:56)和P193(SEQIDNO:57)為上下遊引物，通過PCR擴增編碼串珠鐮孢A15去飽合酶的ORF。根據廠商說明書，用聚合酶在EppendorfMastercycler梯度循環儀上進行PCR。擴增反應如下進行95TC起始變性1min，然後進行30個循環95X:變性30sec，58"C退火lmin，72。C延伸1min。最後一個72。C延伸循環進行10min，然後於4匸終止反應。從兩個模板中均獲得正確大小(約1240bp)的片段。使用QiagenDNA純化試劑盒(Valencia,CA)從瓊脂糖凝膠中純化來源於克隆ffmlc.pK001.g23的片段，使用用/Vw/消化，並克隆到質粒pY5-13GPDN(實施例1)上GPDPro和XPR終止子之間的/VW/位點。從而生成質粒pY34，它包含GPDPro::Fml::XPR嵌合基因。確定了所獲得的8878bp的質粒中具有FmlORF序列。質粒pY3d還包括E"/('複製起點、細菌氨苄青黴素抗性基因，Fflmiv/flLeu2基因和J^nYw/"自主複製序列(ARS)。實施例5含有亞族1(編碼推測的A15去飽合酶)中串珠鐮孢去飽和酶的質粒pY34(GPDPro::Fml::XPR)在Ffl/row/fl/^w(y"c"的表達本實施例描述質粒p、34(含有嵌合的GPDPro::Fml::XPR基因，來源於實施例4)在Fflrnw/"///w/^/o中的表達。具體地，檢測了所表達的串珠鐮孢ORF在野生型F.//^^"oz(確認了ORF的A1S去飽合酶活性)和互補的M2去飽和酶被破壞的突變株(來源於實施例2;確認了ORF的A15/A12去飽和酶雙功能活性)中轉化生產ALA的能力。使用實施例2中的轉化流程將質粒pY5(單獨的載體對照，來自實施例1)和pY34(GPDPro::Fml::XPR)分別轉入野生型(WT)和A12去飽和酶被破壞(Q-dl2D)的F"nwv/fl///w(y"cflATCC#76892菌抹中。在BiolOlDOB/CSM-Leu培養皿上篩選轉化細胞。將野生型和轉化細胞的單克隆於3mL基本培養基中培養，如實施例2及常規方法中所述進行收集、洗滌、乾燥和分析。野生型hnwWa和每個轉化子的脂肪酸譜如下面表9所示。脂肪酸定義為16:0(軟脂酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和18:3(ALA),每種酸的組成以總脂肪酸的a%表示。根據以下公式計算"dl2d%SC":([18:2+18:3j/|18:1+18:2+18:3J)*100,表示底物轉化為18:2的百分比。根據以下公式計算"(I15d%S('":([18:3|/[18:2+18:3|)"00,表示底物轉化為ALA的百分比。表9串珠鐮孢Fml作為雙功能A12/A15去飽合酶的鑑定tableseeoriginaldocumentpage96上述結果表明，本申請中以Fml表示的、並鑑定為與FflnwWfl//po/^/oiA12去飽和酶同源的亞族1中蛋白的串珠鐮孢ORF是A15去飽合酶。根據這個結果，本發明人預測所有亞族1中的其它成員(SEQIDNOs:6、10、14和18)也具有A15去飽合酶功能。對於Fml的A15去飽合酶活性，值得注意的是該蛋白在y"/7wv/fl(31%ALA累積)中的效率比以前在其它酵母中表達的A15去飽合酶更高。特另'J地，當在非含油酵母，釀酒糖酵母(S"cc/^omycesce"v"/M)中表達線蟲A15去飽合酶時，ALA的產物累積百分比僅為4.1%(Meesapyodsuk等，所oc/w附.39:11948-11954(2000)),而在啤酒糖酵母中表達B.w"/;"sA15去飽合酶時，ALA的產物累積百分比僅為1.3%(Reed"D.W.等，屍/fl加屍/rw."/.122:715-720(2000))。根據本申請提供的結果，可以預測串珠鐮孢A15去飽合酶與PUFA生物合成的其它基因(譬如，A6去飽和酶、碳鏈增長酶、A5去飽和酶、A17去飽和酶、A9去飽和酶、A8去飽和酶、A4去飽和酶、A12去飽和酶)將比任何先前鑑定的A15去飽合酶獲得更高產量的co-3PL!FAs。此外，結杲意外地表明串珠鐮孢A15去飽合酶(Fml)具有部分A12去飽和酶活性。具體地，Fml在M2去飽和酶被破壞的Fflnwv/fl//>w/v"ctt菌株(即，Q-tU2D+GPDPro::Fml::XPR)由於Fml的A12去飽和酶功能，可得到將油酸轉化為LA的24%的底物轉化率(參見"dl2d%SC")。由於Fml的A15去飽合酶進一步提高了LA到ALA的底物轉化率(96%,參見"dl5d%SC")。這種雙功能性與其它任何已知的A12或A15去飽合酶有顯著區別。對本領域的技術人員而言，很顯然，在具有低A12去飽和酶活性(或完全缺少這種活性)的宿主生物中表達串珠鐮孢A15去飽合酶可以獲得18:3/18:2的最大比率。因此預期當PUFA生物合成的其它基因(例如A6去飽和酶、碳鏈增長酶、A5去飽和酶、A17去飽和酶)在具有上述串珠鐮孢A15去飽合酶的這類宿主生物中進行表達時，可獲得增高的co-3對co-6脂肪酸的比例。實施例6亞族1(編碼推測的A15去飽合酶)中iV/flfl"""f^"ggn、g"去飽和酶在yamiWa/,如/v".ca中的表達本實施例描述了包含推測的;^症^^A15去飽合酶("Mgl")的表達質粒的構建及該質粒在h/7WV/fl/&0/>"'Cfl中的表達。通過檢測所表達的ORF在野生型Fflmw/"菌株中產生ALA的產量驗證Mgl是A15去飽合酶，通過檢測所表達的ORF在A12去飽和酶被破壞的1^/7wv/a//)^/y/c'fl突變抹(來自實施例2)中生成ALA的產量驗證其為雙功能的A12/A15去飽合酶。具體地，構建嵌合的TEF::Mgl基因，其中推測的A15去飽合酶在Fflnwv/flTEF啟動子調控下進行表達(MullerS"等，&flW,14:12671283(1998))。首先，用與實施例2中所述JV/mrnvVz//》"(v"'c""相似的方法分離;^症^^"的基因組DNA。然後，由於編碼推測的A15去飽合酶(SEQIDNO:9)的^^;虔^霧Mgl基因有兩個內含子，因此通過首先分別PCR擴增三個外顯子、然後用重疊的PCR引物進行PCR擴增，將這三個外顯子連接在一起而得到全長的ORF的方式，來除去這些內含子序列。因此，使用下面表10中的上遊和下遊引物，將基因組DNA用作3個單獨的PCR反應的模板。表10擴增編碼Mgl的稻痙病菌外顯子的引物擴增的外顯子上遊引物下遊引物Exon1P186(SEQIDNO:59)P187(SEQIDNO:60〉Exon2P188(SEQIDNO:61)P189(SEQIDNO:62)Exon3P190(SEQIDNO:63)P191(SEQIDNO:64)然後，用3個膠純化的PCR產物為模板，與上遊引物P186和下遊引物P191進4亍PCR擴增獲得全長ORF。引物P186和P191含/V^/位點，以利於克隆到表達栽體上。特別地，將正確大小的片段進行膠純化，用/Vo/和AW/進4亍消化，並克隆到用jVw/酶切的、在F"/T"WflTEF啟動子調控下的F"rnm^表達載體pY5-13(實施例1)中。獲得的克隆命名為pY31。將幾個pY31克隆進行測序。預期地，所有克隆由於上遊引物中的iV"/位點而在ORF的位置3處均有T到C替換，以利於克隆。這造成第二個胺基酸由Ser變為Ala。有3個質粒克隆(即，pY31質粒克隆#21、#24和#28)由SEQ1DNO:10(除了上述第二個胺基酸的變化)編碼；但沒有一個的核苷酸序列與SEQIDNO:9(即，它們均具有可能由PCR錯誤產生的、不改變推斷的胺基酸序列的額外的沉默核苷酸替換)相同。更特別地，質粒克隆#21、#24和#28有以下鹼基替換在309位的(到T替換，在390位的C的T替換，在549位的T到C替換及在567位的G到(替換。此外，克隆#24在位置645有T到A替換，克隆^21和弁28在669位均有C到T替換。根據實施例2中所述的方法將每個含TEF::Mgl嵌合基因的質粒(即，克隆#21、#24和#28)轉入y"/vwW"/^o/^/cfl(ATCC#76982)野生型(Q)和A12去飽和酶被破壞的菌林(Q-dl2D)中。按常規方法所述，從每個轉化中挑取3個克隆(在下表ll中薈定為"a"、"b"和"c")，並接種到3mLDOB/CSM培養基中，於30X:培養72小時。收集培養物(1.5mL)，並進4亍直接醯基轉換反應和GC分析(如實施例2和常規方法所述)。野生型yfl/7wv/fl和每個轉化子的脂肪酸譜如下表11所示。脂肪酸定義為16:0(軟脂酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和18:3(ALA),每種酸的組成以總脂肪酸(TFAs)的a0/o表示。根據以下公式計算"dl2d%SC，，U18:2+18:3|/118:1+18:2+18:3|)*100，表示底物轉化為18:2的百分比。根據以下公式計算"tU5d%S("':(|18:3|/1，8:2+18:3|)*100，表示底物轉化為ALA的百分比。表11稻瘟病菌Mgl作為雙功能A12/A15去飽合酶的鑑定tableseeoriginaldocumentpage99如上所示，在用TEF::Mgl嵌合基因轉化的/00(v"c"野生型(Q)和A12去飽和酶被破壞的菌抹(Q-dl2D)中均可產生ALA。因此，才艮據這些結果，可確定Mgl是具有雙功能A12/A15去飽合酶活性的去飽和酶。實施例7亞族1(編碼推測的A15去飽合酶)中禾穀鐮孢菌去飽和酶在y"mH7'fl///7</y//cfl中的表達本實施例描述含推測的Fmmh'm附gm附/歴A15去飽合酶("Fgl")的表達質粒的構建及該質粒在y"/rmv/fl/&o(^/cfl中的表達。通過檢測所表達的ORF在野生型y"mw/fl">/^/cfl菌林中產生ALA的能力驗證Fgl為A15去飽合酶，通過檢測所表達的ORF在Ffl/roH7'"///w(yf/"/A12去飽和酶被破壞的突變抹(來自實施例2)中產生ALA的能力驗證其為雙功能的A12/A15去飽合酶。特別地，合成嵌合的TEF::Fgl基因，其中推測的A15去飽合酶在n"7wWflTEF啟動子調控下進^亍表達。與實施例6中的方法類似，編碼推測的A15去飽合酶的禾穀鐮孢菌Fgl基因(SEQIDNO:17)中存在3的個內含子，在FglORF表達前通過PCR擴增除去。因此，用下面表12中所示的上遊和下遊引物，將禾穀鐮孢菌基因組DNA首先用作4個單獨PCR反應的模板。4il擴增編碼Fgl的F.f/rfl附/wgfl〃'"附夕卜顯子的引物擴增的外顯子上遊引物下遊引物tableseeoriginaldocumentpage100然後，用4個膠純化的PCR產物為模板，用上遊引物PFgllJPl和下遊引物PFglLP4進行PCR，擴增全長ORF。引物PFgU)Pl和PFglLP4含有iVW/位點，以利於克隆到表達栽體中,，將正確大小的片段進行膠純化、用/VW/消化、並克隆到7VW/酶切的FamH7'fl表達栽體中，如實施例6中Mgl編碼區所述。200480033502.9說明書第95/123頁用含有TEF::Fgl嵌合基因的質粒轉化Famw/fl/(/w(v"cfl(ATCC#76982)的野生型(Q)和A12去飽和酶被破壞的突變林(Q-dl2D)。在基本培養基中培養野生型和轉化細胞的羊克隆，然後收集細胞，並進行直接的醯基轉換反應和GC分析(如實施例2和常規方法所述)。在轉化TEF::Fgl嵌合基因的FflnwW"野生型和A12去飽和酶被破壞的突變抹中均預期地產生了ALA，從而證明Fgl是一種雙功能的A12/A15去飽合酶。該預測基於Fgl蛋白序列與Fml蛋白序列在a%同一性比較中非常相近實施例8用含亞族1中串珠鐮孢A15去飽合酶(Fml)的嵌合基因轉化Arabidopsis植抹本實施例描述用含Fw"n'"附A15去飽合酶編碼區的嵌合基因轉化擬南芥野生型和fad2-l突變菌林的方法。含Fml的擬南芥表達載體的構建將含FmlA15去飽合酶編碼區(實施例4)的pY34的/V'W/片段克隆到大豆表達載體pKR353的/VW/位點。如下面實施例18所述，pKR353在來自Kti3(kunitz胰蛋白酶抑制劑3)基因的種子特異的啟動子和Kti3轉錄終止子的旁測含有tVW/位點。分離嵌合的K"3啟動子::Fml::Kti3終止子基因，將其作為來自pKR353(A15)的Ast/片段，克隆到雙元載體pZBLll中唯一的/isc/位點上。pZBLll(/^c/)衍生於雙元載體pZBLll，通過在T-DNA邊界右邊和左邊間的屍fl('/和」s/77M位點之間加入」sc/連接元件而獲得。pZBLll(美國專利5,968,793;EP1003891和WO9859062)也在T-DNA邊界內包括提供了對磺醯脲除草劑具有抗性的35S:磺醯脲抗性的乳酸鹽合成酶(ALS)的轉基因，可用作植抹的篩選標記。pZBLl1還具有￡*.t'o//和々ra/mC'Mm似附e/flc/em，的複製起點及氨苄青黴素抗性基因。將獲得的雙元質粒pZBLI(A皿5)轉入^g"6fl"^7'"w菌株LBA4404。隨後通過/1gn7/^"en'w附浸染法，用轉染的/^w6""^7'm附轉化擬南芥野生型和fad2-l突變林(Okuley，J.等，P/aW(>〃6:147-158(1994))。在磺醯脲上篩選轉化子，並在種子中檢測ALA的產量。101用表達A15去飽合酶的嵌合基因所轉化的野生型擬南芥比未轉化的植林具有更高的ALA含量。用同樣的嵌合基因轉化的Fad2-1植林比未轉化的突變林具有更高的ALA含量；而且轉化的fad2-l植林中18:3/18:2的比例比未轉化的突變株和野生型轉化子的比例更高。實施例9用含亞族1中串珠鐮孢A15去飽合酶(Fml)的嵌合基因轉化大豆體細胞胚芽培養物本實施例描述用於培養大豆、然後用含FmlA15去飽合酶編碼區的嵌合基因對其進行轉化的方法。含Fml的大豆表達載體的構建質粒pKR353(A15)(在實施例8中構建)還含有兩個含潮黴素B磷酸轉移酶基因("hpt，，;Gritz，L,andJ.Davies，G緩25:179-188(1983))的表達盒(1)T7啟動子:hpt::T7終止子盒——該表達盒除了具有細菌複製起點(ori)外，還可在￡.co//中進行篩選和複製。(2)35S啟動子hpt::NOS3'轉錄終止子盒——該表達盒可在大豆中進行篩選(35S，參見Odell等，/Vfl似^313:810-812(1985));INS3',參見Depicker等，丄層.勿/.Genet.1:561:570(1982))。大豆體細胞胚芽培養物的轉化大豆胚芽懸浮培養物(cv.Jack)於35mL液體培養基SB196(見下文)中，在搖床上以150rpm、^TC培養，其中冷白螢光的光密度為60-85E/m2/s，日/夜光周期為16:8hr。SB196-FN低鹽液體增殖培養基(每升)MSFeEDTA100x儲液10mLMS硫酸鹽100x儲液10mLFN低鹽卣化物100x儲液10mLFN低鹽P，B，Mol00x儲液10mLB5維生素(1mL/L)1.0mL2，4-D(終濃度10mg/L)1.0mLKN032.83g(NH4)2S040.463g天冬氨酸1.0g蔗糖(1%)pH5.810gFN低鹽儲液1MSFeEDTA100x儲液Na2EDTA'FeS04-7H201000mL5003.724g1.862g2.784g1.392g首先加入，於深色瓶中攪拌溶解MS硫酸鹽lOOx儲液MgS04-7H2MnS04-H20ZnS04-7H20CuSOj-5H20則g1.69g0.86g0.0025g18.5g0.845g0細25g3FN低鹽卣化物lOOx儲液CaCl2-2H2030.0gKJ0.083g(0(:l2-6H2O0麓5g15.0g0.0715g0細25g44氐鹽P，B，Mol00x儲液KH2P04H3B03Na2Mo04-2H2018.5g0.62g0.025g9.25g0.31g0.0125g每隔7-14天將約35mg組織接種到35mL新鮮液體培養基SB1%中，進行亞培養(優選的亞培養間隔是每隔7天進行一次)。用pKR353(A15)(同上)通過粒子槍轟擊法(Klein等，/V"m^，327:70(1987))轉化大豆胚芽懸浮培養物。用DuPontBiolisticPDS1000/HE設備(heliumretrofit)進行所有轉化(E.I.duPontdeNemoursandCo.，Inc.,Wilmington,DE)。大豆胚芽懸浮培養的起始在每個月起始兩次大豆培養，每次起始之間隔5-7天。在種植後45-55天間，摘取可獲得的大豆植株上具有未成熟種子的豆莢，並從殼中除去種子，放入滅菌的品紅盒中。在以下溶液中將大豆種子振蕩15分鐘，進行滅菌95mL高壓滅菌蒸餾水加5mL次氯酸鈉及l滴肥皂。用2個有滅菌蒸餾水的1L瓶洗滌種子，將那些小於4mm的種子放在單獨的顯微鏡玻片上。切除種子的小末端，並將子葉壓到眾種皮外。將子葉(每板25-30)轉移到含SB1培養基的培養皿中。SB1固體培養基(每升)1包MS鹽(Gibco/BRL，Catalog#11117-066)1mLB5維生素儲液(見下文)31.5g蔗糖2mL2，4曙D(終濃度20mg/L;2，4-D儲液從Phytotech，Catalog#D295以1mg/mL預製)pH至5.78gTC瓊脂B5維生素儲液(每100mL):10g肌糖100mg煙酸100mg維生素B6HCI1g硫胺'注等分後儲存在-20t:;如果溶液不能快速溶解，則用熱傳播板進行低水平加熱。含子葉的培養皿用纖維帶包裝，並儲存8周。之後，切除次級胚，並在SB196液體培養基中放置7天。轟擊用的DNA的製備用完整的質粒或含感興趣的基因和選擇性標記基因的質粒片段進行轟擊。通過膠分離雙消化的質粒而獲得片段。在每種情況下，在0.5mL合適的酶混合物中消化100pg質粒DNA。得到的DNA片段通過1%SeaPlaqueGTG瓊月旨糖(BioWhittakerMolecularApplications,Rockland,ME)凝膠電泳進行分離，從瓊脂糖膠中切割含嵌合基因的DNA片段。根據廠商的說明書，用GELase消化斷Epicentre,Madison,WI)從瓊脂糖中純化DNA。將5(^1含3mg金顆粒(3mg金)的等份的滅菌蒸餾水加到5nllpg/plDNA溶液(如上述製備的完整質粒或DNA片段)、50^12.5MCaCl2和20jil0.1M亞精胺中。將混合物在旋渦振蕩器的3檔振蕩3min，然後在工作檯微型離心機中離心10sec。沉澱用400pl100%乙醇洗滌後，通過超聲重懸到40fil100%乙醇中。將5^1DNA懸浮液分散到BiolisticPDS1000/HE儀器碟的每個飛碟中。在每個轟擊(即每個碟)中，每5pl等份含約0.375mg金。組織製備及DNA轟擊將約150-200mg7天的胚芽懸浮培養物置於空的、滅菌的60x15mm培養皿中，並用塑料網覆蓋盤子。用設置在1100PS1的膜破裂壓力及抽真空至27-28英寸汞柱的槍膛對每個培養皿的組織進行1或2次轟擊。將組織放在距保留/停止屏約3.5英寸的地方。轉化胚芽的篩選用潮黴素(當潮黴素鱗酸轉移酶HPT的基因被用作選擇標記時)或氯磺隆(當乙醯乳酸合成酶ALS的基因被用作選擇標記時)篩選轉化的胚芽。在每種情況下，將組織置於新鮮的SB196培養基中，並在轟擊後如上所述進行培養。轟擊6天後，用新鮮的含選擇試劑30mg/L潮黴素或100ng/mL氯磺隆(氯磺隆儲液1mg/mL溶於0.01N氫氧化銨中)的SB196代替原來的SB196。選擇培養基每周進行更新。在選擇4到6周後，可觀察到綠色的轉化的組織從未轉化的壞死的胚芽簇中生長出來。將分離的、綠色的組織移出並接種到含SB196的多孔培養皿中，使其產生新的、克隆繁殖的、轉化的胚芽懸浮培養物。大豆體細胞胚芽到植抹的重建為了從胚芽懸浮培養物獲得整個植株，必須進行組織重建。胚芽的成熟:將胚芽在SB196中，於26X:、在冷白螢光(PhmipsCoolWhiteEco,att歸/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro;40watt)燈泡的光密度為90120fiE/m2/s、日/夜光周期為16:8hr的條件下培養4-6周。之後，將胚芽簇轉移到SB1"固體瓊脂培養基中培養1-2周。SB166固體培養基(每升)1包MS鹽(Gibco/BRL，Cat#11117-066)1mLB5維生素lOOOx儲液60g麥芽糖750mg六水合MgCl25g活性炭2g脫乙醯吉蘭糖膠然後將胚芽簇在SB103培養基(除了不包括活性炭外，培養基的製備與SB166相同)中亞培養3周。在該時期，可從胚芽簇中除去單個的胚芽，並篩選其脂肪酸組成的變化。應注意的是，任何由於感興趣的基因的表達而造成的可檢測的表型均可在該階段被檢出。這包括，但不限定於脂肪酸鐠、蛋白譜及含量、碳水化合物含量、生長速率、發育為正常大豆植抹的存活率或能力等變化。胚芽的乾燥和萌發:將成熟的單個胚芽放置在空的小培養皿(35x10mm)中約4_7天以進4亍乾燥。培養皿用纖維帶封口(以創造一個小的溼潤的小室)。將乾燥的胚芽種植在SB7卜4培養基中，使其在如上所述相同的培養條件下萌發。SB71-4固體培養基(每升)1瓶GamborgB5鹽w/蔗糖(Gibco/BRL，Catalog#21153-036)pH5.75gTC瓊脂將萌發的小植株從萌發培養基中移出，並用水充分漂洗，然後種植在24個單元的Redi-Earth包裝碟中，並用乾淨的塑料頂覆蓋。兩周後，除去塑料頂，再用一周使植株變硬。如果小植株看起來足夠硬，則將它們移植到10"Redi-Earth罐中，每罐最多放3棵苗。10-16周後，收穫成熟的種子，壓碎，分析其脂肪酸。實施例10含亞族1中串珠鐮孢A15去飽合酶(Fml)的大豆體細胞胚芽的分析本實施例描述在具有包含FmlA15去飽合酶編碼區的嵌合基因的轉化大豆中用於分析脂肪酸含量的方法。理論成熟的體細胞大豆胚芽是合子胚很好的模型。在液體培養基的球狀胚芽狀態時，體細胞大豆胚芽含很低量的、在大豆合子胚中卻典型的三醯基甘油或成熟的貯存蛋白質。在該發育階段，總三醯基甘油對總極性脂類(砩酸脂和甘油脂)的比例約為1:4,與典型的大豆合子胚在體細胞胚芽培養起始的發育階段一樣。在胚的球形期階段，主要的種子蛋白、j5-伴大豆球蛋白"-亞基、kunitz胰島素抑制物3及種子凝集素的mRNAs基本不存在。在轉移到無激素的培養基中使其分化為成熟的體細胞胚芽狀態時，三跣基甘油成為最多的脂類成分，而P-伴大豆球蛋白(x-亞基、kunitz胰島素抑制物3及種子凝集素的mR!NAs在總mRNA中的含量非常豐富。基於此，體細胞大豆胚芽系統與成熟的大豆合子胚在體內的行為非常相似，因此是分析脂肪酸生物合成途徑中基因表達改變對表型有何影響的很好的、而且快速的模型。最重要地，該模式系統也可預測來源於轉基因胚芽的植株種子中脂肪酸的組成，脂肪酸分析將對轉基因體細胞大豆胚芽進行分析。為此，通過醯基轉換反應從單個成熟的體細胞大豆胚芽中製備脂肪酸的甲基酯。將胚芽放在含50pL氫氧化三甲基巰(TMSH)和0.5mL己烷的小瓶中，室溫溫育30min，並進行振蕩。然後分離脂肪酸曱基酯(從己烷層抽取5jiL)，並用填充了Omegawax320融合矽毛細管柱(SupelcInc.，Bel皿efonte，PA;Catalog#24152)的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀進行定量。一部分體細胞胚芽比對照體細胞胚芽具有更高水平的ALA。從轉化的胚芽進行成熟植林的重建，並對重建植林產生的種子進行脂肪酸分析。然後將這些植林與其他表達w-3脂肪酸生物合成途徑基因的轉基因植林(其中EPA和DPA的組合水平經常高於總量的15%，甚至高達23,5%)進行雜交。優選的生產長鏈Pl)FAs(譬如，EPA)的代表性基因包括以下一個或多個EPA生物合成途徑的基因'基囚生物質粒名稱參考文獻△6desaturaseS.c/Zc/ZnapRSP1JWO02/081668△6desaturaseMa/p/'〃apCGR5US5鄰8,8Q9ElongaseM.a/p/'napRPB2WO00/12720Elongase7".au廣eumpRAT4-A7WO02/08401△5desaturaseM.a/p/napCGR4US6,075,1831A5desaturaseS.cfc/ZnapRSP3WO02/081668△4desaturaseS.aggregrafumpRSA1WO02/090493實施例11將FMMr/MWA15去飽合酶克隆到大豆表達載體(PKR578)中本實施例描述在大豆中構建可種子特異性高表達A"去飽合酶的載體pKR578。質粒pKS121(WO02/00904)在Kunitz大豆胰島素抑制劑(KTi)啟動子l,Jofuku等，(1989)(>〃1:1079-1093|和KTi3'終止子區側翼含有AW/位點，其分離在美國專利6，372，965(KTi/Notl/KTi3'盒)中有所描述。載體pKR457是pKSUl的衍生物，其中Kti/Notl/Kti3'盒上遊和下遊的限制性位點已通過多個亞克隆步驟進行了修改。載體pKR45也在Kti終止子下遊包含大豆白蛋白轉錄終止子，以延長並加強轉錄的終止。在pKR457中，除去了KS121中Kti啟動子上遊的fi"mH!位點，並引入一個含fis/Wl、Sa/1、和///mmi位點的新序列(SEQlDNO:73),使Bw"WI位點鄰近Kti啟動子的5，端。此外，除去了pKS121中Kti終止子下遊的^/I位點，並引入一個含A》"1(鄰近Kti終止子3，端)、Bfl附HI位點、大豆白蛋白轉錄終止子序列、^/WI位點及另外一個B,H1位點(K翻ot膽iSalb盒)的新序列(SEQIDNO:74)。白蛋白轉錄終止子是以前用在終止子3，端引入B"附Hl、X6fll和ZsAVI位點的引物oSalb-12(SEQIDNO:75)、和在終止子5，端引入Bfl附HI位點的的引物oSalb-13(SEQIDNO:76)從大豆基因組DN'A中擴增得到的。起始的質粒pKS123(WO02/08269，其內容通過參考整合在本申請中)含潮黴素B磷酸轉移酶基因(HPT)[Gritz，L.andDavies，丄(1983)GV/化25:179-188|,其側翼為T7啟動子和轉錄終止子(T7^rom/hpt/T"7term盒)，以及用來在諸如o//這樣的細菌中篩逸和複製的細菌複製起點(ori)。此外，pKS123也包括潮黴素B磷酸轉移酶基因，其側翼為35S啟動子IOdell等，(1985)胸匿313:810-812|和NS3'轉錄終止子IDepicker等，(1982)/編.G匿f.1:561:5"70j(35S/hpt/NOS3'盒)，用來在諸如大豆這樣的植物中進行篩選。pKS123還包含AWI限制性位點，其側翼為p-伴大豆球蛋白a-亞基的啟動子IBeachy等，(1985)4:3047-3053|和菜豆蛋白基因的3'轉錄終止區IDoyie，,，.J.等(1986)C7^附.261:9228-9238|,從而允許克隆到AW1位點的基因在大豆種子中進行很強的組織特異性表達載體pKR72是pKS123的衍生物，其中含P-伴大豆球蛋白//Wd/菜豆蛋白盒的///m/IU片段是反向的，而含S6/1、Fwl和限制酶切位點的序列(SEQIDNO:77)被引入到p-伴大豆球蛋白啟動子前面的mm/IU和BflwHI位點之間。用///mmi消化載體pKR72，除去(kon/7V》"/Phas3'盒，從而得到pKR325。通過克隆pKR457的^AV1片段而形成一個中間克隆載體，它含有插入pKR325中位點的Kti/iVWl/KtiSalb盒。然後將pY34(參見實施例4)中含F"sfln'MwzU5去飽合酶的/Vort片段克隆到該中間載體的/VW1位點，得到pKR578。質粒pKR578(SEQII)NO:78)如圖6所示。質粒pKR578已提交美國典型培養物保藏中心(ATC(:)，10801lniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，其ATCC保藏號為PTA-XXXX，保藏日為2004年11月4日。實施例12大豆種子特異的啟動子的分離大豆種子特異的啟動子的克隆已在WO04/(V71467中進行描述，並在此重新進行描述。使用UniversalGenomeWalker系統(Clontech)根據其使用手冊(PT30"-1)對大豆膜聯蛋白和BD^啟動子(在WO04/071178中描述，於2004年8月26日公開)進行分離。為了構建大豆基因組步行文庫，將大豆基因組DNA樣品用Dml、五coRV、屍vwll和A"I分別消化2小時。DNA純化後，將消化的基因組DNA與基因組步行接頭API和AP2連接。基於DuPontEST資料庫中膜聯蛋白cDNA5'編碼序列設計大豆膜聯蛋白基因的兩個基因特異引物(GSP1和GSP2)。GSP1和GSP2的序列在SEQIDNOS:79和80中列出。在第一輪PCR中使用API和GSP1引物及基因組步行系統手冊中定義的條件。循環條件為941C4分鐘；94"C2秒及72TC3分鐘，7個循環；941C2秒及671C3分鐘，32個循環；67TC4分鐘。將第一輪PCR的產物稀釋50倍。以l微升稀釋產物為模板，用AP2和GSP2為引物進行第二輪P(:R。循環條件是941C4分鐘；94。C2秒及72r3分鐘，5個循環；94t2秒及671C3分鐘，20個循環；671C3分鐘。從￡oRV消化的基因組步行文庫中擴增並分離出一個2.1kb的基因組片段。用B"mHl和A'"/1消化基因組片段，並克隆到BluescriptKS+載體上進行測序。該2012bp長的大豆膜聯蛋白啟動子片段的DNA序列在SEQIDNO:81中列出。基於NCBIGenBank中BD30cDNA的5'編碼序列(J05560)設計了大豆BD30的兩個基因特異引物(GSP3和GSP4)。GSP3和GSP4引物的寡核苷酸序列在SEQIDNOS:82和83中列出。以基因組步行系統手冊中闡述的相同條件，用API個GSP3引物進行第一輪PCR。在基因組步行實驗中，大豆膜聯蛋白啟動子的循環條件對大豆BD30啟動子來說並不好用。因此使用了修改後的降落PCR程序。循環條件是94TC4分鐘；94t:2秒，741C3分鐘，6個循環，其中退火溫度在每個循環中降低ir;941C2秒，69°C3分鐘，32個循環；69r4分鐘。將第一輪PCR產物稀釋50倍。以1微升稀釋的產物為模板，以AP2和GSP4為引物進行第二輪PCR。循環條件是94t:4分鐘；2秒，74TC3分鐘，6個循環，其中退火溫度在每個循環中降低11C;94r2秒，691C3分鐘，20個循環；69"C3分鐘，從ZVwII消化基因組步行文庫中擴增並分離到一個1.5kb的基因組片段。用B"mHl和AWl消化基因組片段，並克隆到BluescriptKS+載體中進行測序。DNA測序表明該基因組片段包含1408bp大豆BD30啟動子序列(SEQIDNO:84)。基於NCBI資料庫中大豆p-伴大豆球蛋白P-亞基啟動子序列(S44893)設計了兩個在5'端具有B"mHI或iVofl位點的寡核普酸，用來擴增大豆p-伴大豆球蛋白a-亞基啟動子(SEQ1DNO:85)。這兩個寡核普酸的序列在SEQ1DNOS:86和87中列出。基於NCBIGenBank資料庫中大豆球蛋白Gyl啟動子序列(X15121)設計了兩個在5，端具有BflwHI或7VWI位點的寡核苷酸，用來擴增大豆球蛋白Gyl啟動子(SEQIDNO:88)。這兩個寡核苷酸序列在SEQIDNOS:89和90中列出。實施例13將Ff^flr/MmA15去飽合酶克隆到大豆表達載體中，與A17去飽和酶共表達(pKR585)本實施例描述在大豆中，構建可種子特異性高表達F"^m'"wA15去飽合酶和異絲水黴A17去飽和酶的載體pKR585。含有大豆膜聯蛋白啟動子調控下的異絲水黴An去飽和酶Pereira等(2004)Biochem.J.378，665-671]的中間克隆載體(pKR271)的構建在WO04/071467已有描述，並在此重新進行描述。KTi/7VWl/KTi3'盒是使用被設計為在該盒的兩端引入X6"I和仏AVI位點的引物oKTi5(SEQIDNO:91)和oKTi6(SEQIDNO:92)、從pKS121中通過PCR擴增獲得的。將得到的PCR片段亞克隆到克隆載體pllC19的X6fll位點上，得到質粒pKR124,這樣，在Kti轉錄終止子的3，端引入了PWI和X6/1位點。將含大豆BD30啟動子(WO01/68887)的pJS93的5Vz/1片段與pl!C19的Sfl/I片段連接在一起，得到pKR227，從而在BD30啟動子的5，端引入了屍WI和位點。使用被設計為在終止子5，端引入7VWI位點的引物oSBD30-l(SEQIDNO:93)和被設計為在終止子3，端引入^AVI位點的引物oSBD30-2(SEQIDNO:94)從大豆基因組DNA中進行PCR,擴增BD303'轉錄終止子。根據廠商說明書，將得到的PCR片段亞克隆到中間克隆載體p(:R-ScriptAMPSK(+)(Stratagene)中，獲得質粒pKR251r。將含BD303'轉錄終止子的pKJR251r的五"RI/7VWl片段克隆到中間克隆載體pKR227的E"RI/A^rt位點上，得到pKR256。通過B"wHI檢消化獲得來自pJS92的膜聯蛋白啟動子(SEQ1DNO:81)，並將其末端補齊。將得到的片段連接到補齊的來自pKR124載體骨架的^AV1片段上，其方向是在膜聯蛋白啟動子5'端引入/^1和位點，從而得到pKR265。通過和AWI消化pKR265得到膜聯蛋白啟動子，並克隆到含有BD303'轉錄終止於、氨千青黴素抗性基因及細菌ori區的pKR256的A々/l/A^"片段中，從而得到pKR268。通過用Vwl部分消化pKS203|Pereira等(2004)份^/^附.《/.378，665-671|，獲得異絲水黴A17去飽和酶基因，將其克隆到pKR268的AWI位點，得到pKR271。然後用屍WI消化pKR271，將含異絲水黴A17去飽和酶的片段克隆到pKR578的5VI位點，得到pKR585。在這種情況下，F"^n7/wA15去飽合酶可與異絲水黴A17去飽和酶在強的，種子特異的啟動子下共表達。pKR585(SEQIDNO:95)的圖譜如圖7所示。質粒pKR585已提交美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801l!niversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，ATCC登錄號為PTA-XXXX，提交日期是2004年11月4日。實施例14組裝EPA生物合成途徑的基因，使其在大豆中表達(pKR274)本實施例描述pKR274的構建，該載體被設計為在大豆體細胞胚芽和大豆種子中可種子特異性高表達高山被孢黴菌A6去飽和酶(美國專利5,968,809)、高山被孢黴菌碳鏈增長酶(WO00/12720)和高山被孢黴菌A5去飽和酶(美國專利6，075，183)。該載體的構建以前在WO04/071467中有所描述，此處重新進行描述。將A6去飽和酶克隆在J3-伴大豆球蛋白a-亞基啟動子IBeachy等，(1985)￡7V/^>/.4:3047-3053的後面，之後為菜豆球蛋白基因|Doyle，丄丄等(1986)丄所oL261:9228-9238|3'轉錄終止區(Ikon/Mad6/Phas3'盒)。將去飽和酶克隆在Kunitz大豆胰島素抑制劑(KTi)啟動子IJofuku等，(1989)屍/fl"f0〃1:1079-10931的後面，之後為KTi3'終止區，其分離在美國專利6，372，965(KTi/Mad5/KTi3'盒)中有所描述。將碳鏈增長酶克隆在大豆球蛋白Gyl啟動子(SEQIDNO:88)後面，之後為豌豆球蛋白A23'終止區(Gyl/Maelo/legA2盒)。所有這些啟動子在大豆種子中均表現出很強的組織特異性表達活性。質粒pKR274還包括克隆在T7RNA聚合酶啟動子和T7終止子之間的潮黴素B磷酸轉移酶基因IGritz，L.andDavies，，J.(1983)G，25:179-188|(T7prom/HPT/T7term盒)，可在特定的￡，.菌林-例如INo、aBlue(DE3)(Novagen,Madison，WI)，該菌對於XDE3是溶原的(並攜帶在lacUV5調控下的T7RNA聚合酶基因)——中根據潮黴素B對質粒進行選擇。此外，質粒pKR274含有來自載體pSP72(Stratagene)的、在c'"//中具有功能的細菌複製起點(ori)。使用引物oCGR5陽l(SEQIDNO:96)和oCGR5-2(SEQIDNO:9")對pCGR5(美國專利5，968，809)進行PCR，擴增高山被孢黴菌A6去飽和酶基因，引物被設計為在A6去飽和酶兩端引入/VW1限制性內切酶位點，並在酶的閱讀框的起始密碼子處引入AW"位點。根據廠商說明書，將得到的PCR片段亞克隆到中間克隆載體p(R-ScriptAMPSK(+)(Stratagene)中，獲得pKR159。將包含高山被孢黴菌A6去飽和酶基因的pKR159的/VWI片段以正向克隆到pZBL117的7VWI位點，製備植物表達盒pZBL119。將包含T7prom/hpt/T7term盒和細菌ori的質粒pKS102(WO02/00904)的/b('l片段與包含(kon/AWI/Phas盒的質粒pKR72的片段連接在一起，構建載體pKR197。用7VWl消化質粒pKR159,得到高山被孢黴菌A6去飽和酶，然後將其克隆到大豆表達載體pKR197的iVWI位點，得到pKR269。使用被設計為在啟動子5'端引入S6/I/屍WI位點的引物oSGly-l(SEQIDNO:98)和被設計為在啟動子3'端引入/VWI位點的引物oSG，y-2(SEQIDNO:99)從pZBL119中擴增大豆球蛋白Gyl啟動子。根據廠商說明書，將得到的PCR片段亞克隆到中間克隆載體p(R-ScriptAMPSK(+)(Stratagene)中，獲得質粒pSGIyl2。使用被設計為在啟動子5'端引入X6fll和仏'/Wl位點的引物LegPro5'(SEQIDNO:lO)和被設計為在啟動子3'端引入/VWl位點的引物LegPro3'(SEQIDNO:l(H)從豌豆基因組DNA中擴增legA2啟動子。使用被設計為在終止子5'端引入位點的引物LegTerm5'(SEQII)NO:102)和被設計為在終止子3'端引入^AVI和X6fll位點的引物LegTerm3'(SEQIDNO:103)從豌豆基因組DNA中擴增legA2轉錄終止子。然後將得到的PCR片段用引物LegPro5'和LegTerm3'進行連接並重新擴增，從而形成legA2/7V^I/legA23'盒。根據廠商說明書，將legA2/ZVwl/legA23'盒PC:R片段亞克隆到中間克隆載體pCR-ScriptAMPSK(+)(Stratagene)上，得到質粒pKR140。質粒pKR142是通過將包含legA2/A^I/legA23'盒的pKR140的片段克隆到含細菌ori和氨節青黴素抗性基因的pKR124的&AVI位點上而構建的。然後將來自質粒pKR142的/^1//VWI片段與含大豆球蛋白Gyl啟動子的質粒pSG，yl2的/^1//VW1片段連接在一起，得到pKR263。使用被設計為在去飽和酶兩端引入/VWI限制性內切酶位點的引物CGR4foward(SEQIDNO:104)和CGR4reverse(SEQIDNO:105)從pCGR4(美國專利6,075,183)中擴增高山被孢黴菌A5去飽和酶基因將得到的PCR片段用7VWI消化，並克隆到載體pKR124的/Vwl位點上，得到pKR136。使用被設計為在碳鏈增長酶兩端引入yvwi限制性內切酶位點的引物RPB2foward(SEQIDNO:106)和RPB2reverse(SEQIDNO:107)從pRPB2(WO00/12720)中擴增高山被孢菌碳鏈增長酶基因。將得到PCR片段用/W"消化，並克隆到載體pKR263的/VWl位點，獲得pKR270。用和5^/1消化質粒pKR270，得到Gyl/Maelo/legA2盒，並將其克隆到含A6去飽和酶、T7prom/hpt/T7term盒和細菌ori區的質粒pKR269的^AVI/幼/1位點上。該質粒命名為質粒pKR272。然後將通過用BsAVI消化pKR136而得到的KTi/Mad5/KTi3'盒克隆到pKR272的位點上，得到pKR274(圖8)。實施例15組裝EPA生物合成途徑基因，使其在大豆中表達(pKKE2)本實施例描述pKKE2的構建，該質粒是一個被設計為在大豆體細胞胚芽和大豆種子中可種子特異性高表達異絲水黴A6去飽和酶(WO02/081668)、高山被孢黴菌碳鏈增長酶(WO00/12720)和高山被孢黴菌A5去飽和酶(美國專利6，075，183)的載體。除了用高山被孢黴菌A6去飽和酶代替異絲水黴A6去飽和酶外，該載體與pKR274相同。該載體的構建以前在WO04/071467中已有所描述，此處重新進行描述。通過用fcoRI和消化pRSPl(WO02/081668)而得到A、.rf/c//wflA6去飽和酶基因。將得到的DNA片段末端補齊，並將該片段克隆到補齊的pKS123的A^fl位點上，得到pKS208。通過///m/III消化質粒pKS208而得到(5con/Sdd6/Phas3'盒，並克隆到質粒pKR272的///wrflll位點上，獲得pKR301。然後將通過消化pKR136而得到的KTi/Mad5/KTi3'盒克隆到pKR301的BsAVI位點，獲得pKKE2(圖9)。實施例16大豆體細胞胚芽培養物的轉化培養條件大豆胚芽懸浮培養物(cv.Jack)於35ml液體培養基SB196(參見下文配方)中，在搖床上以150rpm、261C培養，其中冷白螢光的光密度為60-85E/m2/s，日/夜光周期為16:8hr。每隔7天或兩周，將約35mg組織接種到35ml新鮮液體SB196中對培養物進行亞培養(優選的亞培養間隔是每隔7天)。根據粒子槍轟擊法(Klein等1987;iVfl似M,327:70)，將大豆胚芽懸浮培養物用實施例18中所述的pKR353(A15)質粒進行轉化。在所有轉化實驗中均使用DuPontBiolisticPDS1000/HE儀器(heliumretrofit)。大豆胚芽懸浮培養的起始大豆培養每月起始兩次，每次起始間隔5-7天。在種植45-55天後，從可獲得的大豆植林上摘取具有未成熟種子的豆莢，從殼中除去種子，並置於滅菌的品紅盒中。將大豆種子在加入了1滴象牙皂的5%次氯酸鈉溶液(95ml高壓滅菌蒸餾水加入5ml次氯酸鈉和l滴肥皂)中，振蕩滅菌15分鐘。混勻。用2個裝滅菌蒸餾水的1升瓶子洗滌種子，將那些小於4mm的種子分別置於單獨的顯微鏡玻片上。切開種子的小末端，將子葉從種殼中擠壓出來。將子葉轉移到含SB1培養基的培養皿上(每培養皿25-30個子葉)。將培養皿用纖維帶包起來，儲存8周。之後，切除次級胚芽，並將其置於SB196液體培養基中放置7天。轟擊用DNA的製備用含感興趣的基因和選擇性標記基因的完整質粒或DNA質粒片段進行轟擊。通過雙消化質粒的膠分離獲得這些片段。在每種情況下，均在0.5ml合適的酶混合液中消化100pg質粒DNA。將得到的DNA片段通過1%SeaPlaqueGTG瓊脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)凝膠電泳進行分離，從瓊脂糖膠中切下含嵌合基因的DNA片段。根據廠商說明書，用GELase消化酶從瓊脂糖中純化DNA。將50nl含3mg金顆粒(3mg金)的等份的滅菌蒸餾水加到5pllpg/plDNA溶液(如上述製備的完整質粒或DNA片段)、50n皿2.5MCa(:h和20nl0.1M亞精胺中,，將混合物在旋渦振蕩器的3檔振蕩3min,然後在工作檯微型離心機中離心10sec。沉澱用400jU100%乙醇洗滌後，通過超聲重懸到4fil100%乙醇中。將5nlDNA懸浮液分散到BiolisticPDS1000/HE儀器碟的每個飛碟中。在每個轟擊(即每個碟)中，每5pl等份含約0.375mg金。組織製備及DNA轟擊將約150-200mg7天的胚芽懸浮培養物置於空的、滅菌的60xlSmm培養皿中，並用塑料網覆蓋盤子。用設置在UOOPSI的膜破裂壓力及抽真空至27-28英寸汞柱的槍膛對每個培養皿的組織進行1或2次轟擊。將組織放在距保留/停止屏約3.5英寸的地方。轉化胚芽的篩選用潮黴素(當潮黴素磷酸轉移酶——HPT的基因被用作選擇標記時)或氯磺隆(當乙醯乳酸合成酶——ALS的基因被用作選擇標記時)篩選轉化的胚芽。潮黴素(HPT)篩選轟擊後，將組織置於新鮮的SB196培養基中，並如上述進行培養。轟擊6天後，用新鮮的含選擇試劑30mg/L潮黴素的SB196代替原來的SB196。選擇培養基每周進行更新。在選擇4到6周後，可觀察到綠色的轉化的組織從未轉化的壞死的胚芽簇中生長出來。將分離的、綠色的組織移出並接種到含SB196的多孔培養皿中，使其產生新的、克隆繁殖的、轉化的胚芽懸浮培養物。氯磺隆(ALS)篩選轟擊後，將組織分到2個燒瓶中，並如上述進行培養。轟擊6到7天後，用新鮮的含選擇試劑0.1mg/L氯磺隆的SBl96代替原來的SB196。選擇培養基每周進行更新。在選擇4到6周後，可觀察到綠色的轉化的組織從未轉化的壞死的胚芽簇中生長出來。將分離的、綠色的組織移出並接種到含SB196的多孔培養皿中，使其產生新的、克隆繁殖的、轉化的胚芽懸浮培養物。大豆體細胞胚芽到植株的重建為了從胚芽懸浮培養物獲得整個植株，必須進行組織重建。胚芽的成熟將胚芽在SB196中，於26°C、在冷白萸光(PhillipsCoolWhiteEconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro;40watt)燈泡的光密度為90120nE/m2/s、日/夜光周期為16:8hr的條件下培養4-6周。之後，將胚芽簇轉移到SB166固體瓊脂培養基中培養l-2周。然後將胚芽簇在SB103培養基中亞培養3周。在該時期，可從胚芽簇中除去單個的胚芽，並篩選其脂肪酸組成的變化。應注意的是，任何由於感興趣的基因表達而造成的可檢測的表型均可在該階段被檢出。這包括但不限定於脂肪酸譜、蛋白譜及含量、碳水化合物含量、生長速率、發育為正常大豆植林的存活率或能力等變化。胚芽的乾燥和萌發將成熟的單個胚芽放置在空的小培養皿(35x10mm)中約4-7天以進行乾燥。培養皿用纖維帶封口(以創造一個小的溼潤的小室)。將乾燥的胚芽種植在SB71-4培養基中，使其在如上所述相同的培養條件下萌發。將萌發的小植株從萌發培養基中移出，並用水充分漂洗，然後種植在24個單元的Redi-Earth包裝碟中，並用乾淨的塑料頂覆蓋。兩周後，除去塑料頂，再用一周使植株變硬。如果小植株看起來足夠硬，則將它們移植到10"Redi-Earth罐中，每罐最多放3棵苗。"M6周後，收穫成熟的種子，壓碎，分析其脂肪酸。培養基配方SB196-FN低鹽液體增殖培養基(每升)-MSFeEDTA-100x儲液110m，MSSulfate-訓x儲液210mlFN低鹽Halides-100x儲液310mlFIN低鹽P,B，Mo-lOOx儲液410mlB5維生素(lml/L)1.0ml2，4國D(終濃度10mg/L)1.0mlKNO32.83gm(NH4)2S040.463gm天冬氨酸1.0gm蔗糖(1%)10gmpH5.8FN低鹽儲液儲液#1000mL500mL1MSFeEDTA100x儲液Na2EDTA'3.724g1.862gFeS04-7H202.784g1.392g'首先加入，於深色瓶中攪拌溶解MS硫酸鹽100x儲液MgS04-7H20MnS04-H20ZnS04-7H20CuS04-5H201.69g0.86g0.0025g18.5g0.845g0.43g0細25g3FN低鹽卣化物100x儲液CaCl2-2H20KlCoCI2-6H2030.0g15.0g0.083g0.0715g0麓5g0細25g4低鹽P，B，MolOOx儲液KH2P04H3B03Na2Mo04-2H2018.5g9.25g0.62g0.31g0.025g0.0125gSB1固體培養基(每升)-lpkg.MS鹽(Gibco/BRL,Catalog#11117-066)1mlB5維生素1000x儲液31.5g蔗糖2mL2，4-D(終濃度20mg/L)pH5.78gTC瓊月旨SB166固體培養基(每升)-lpkg.MS鹽(Gibco/BRL,Cat#11117-066)1mlB5維生素1000x儲液60g麥芽糖750mg六水合MgCl25g活性炭pH5.72g脫乙醯吉蘭糖膠SB103固體培養基(每升)-lpkg.MS鹽(Gibco/BRL,(:at#11117-066)1mlB5維生素1000x儲液60g麥芽糖750mg六水合MgChpH5.72g脫乙醯吉蘭糖膠SB71-4固體培養基(每升)-1瓶GamborgB5鹽w/蔗糖(Gibco/BRL,Catalog#21153-036)pH5.75gTC瓊月旨2.4-D儲液-由Phytotechcat#D295預製獲得，濃度為1mg/mlB5維生素儲液(每100mL)-等分後儲存在-20iC10g肌糖100mg煙酸100mg維生素B6HC11g碗胺如果溶液不能快速溶解，則用熱傳播板進行低水平加熱。氯磺隆儲液-以lmg/ml溶於0.01N氫氧化銨中實施例17含F^fl/7'f/wA15去飽合酶的大豆體細胞胚芽的分析成熟的體細胞大豆胚芽是合子胚很好的模型。在液體培養基的球狀胚芽狀態時，體細胞大豆胚芽含很低量的、在大豆合子胚中卻典型的三醯基甘油或成熟的貯存蛋白質。在該發育階段，總三醯基甘油對總極性脂類(磷酸脂和甘油脂)的比例約為1:4，與典型的大豆合子胚在體細胞胚芽培養起始的發育階段一樣。在胚的球形期階段，主要的種子蛋白、P-伴大豆球蛋白a-亞基、kunitz胰島素抑制物3及種子凝集素的mRINAs基本不存在。在轉移到無激素的培養基中使其分化為成熟的體細胞胚芽狀態時，三醯基甘油成為最多的脂類成分。而(3-伴大豆球蛋白a-亞基、kunitz胰島素抑制物3及種子凝集素的mRNAs在總mRNA中的含量非常豐富。基於此，體細胞大豆胚芽系統與成熟的大豆合子胚在體內的行為非常相似，因此是分析脂肪酸生物合成途徑(WO02/00904中實施例3)中基因表達改變對表型有何影響的很好的、而且快速的模型。最重要地，該模式系統也可預測來源於轉基因胚芽的植林種子中脂肪酸的組成。含上述構建體的轉基因大豆體細胞胚芽用類似方法進行分析。為此，通過醯基轉換反應從單個成熟的體細胞大豆胚芽中製備脂肪酸的甲基酯。將胚芽放在含50pL氫氧化三曱基巰(TMSH)和0.5mL己烷的小瓶中，室溫溫育30min，並進行振蕩。然後分離脂肪酸甲基酯(從己烷層抽取5fiL)，並用填充了Omegawax320融合矽毛細管柱(SupelcoInc.,Bellefonte，PA;Catalog#24152)的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀進行定量。烤箱溫度設置為在2201C持續2.7min，，然後以2TC/min增加到240"€，再持續2.3min。通過Whatman氫氣產生儀提供載氣。將保留時間與已商品化的標準甲基酯(Nu-ChekPrep,Inc.catalog#U-99-A)進4亍比較。含pKR578的最好的10個胚芽系和僅用篩選標記進行轉化的對照胚芽的結果如表14所示。雖然僅顯示最好的胚芽系，但其它胚芽系ALA水平的範圍為對照水平(22%)至最好水平(89%)間。類似地，也獲得了其它0>-3對0>6比例在0.4到45範圍內的胚芽系。最好的胚芽系中的胚芽的平均18:3含量為79%,其分析的最好的胚芽具有89%的18:3，相對而言，對照的平均18:3含量為19%，其最好的胚芽僅具有22%的18:3。這相當於與對照胚芽比，18:3平均提高了4倍。在pKR578轉化的胚芽系中，18:3含量為51-89%。該胚芽系to-3:0)-6脂肪酸(18:3/18:2)的平均比例為24:1，其中最好的胚芽的比例為42:1,相對而言，對照的18:3/18:2比例的平均值和最好值為0.4。這相當於w-3:w-6比例平均提高了66倍。在pKR578轉化的胚芽系中，w-3:w-6脂肪酸(18:3/18:2)比例的範圍為3:1-42:1。表14pKR578轉化的胚芽系中18:3(ALA)的累積tableseeoriginaldocumentpage122表14tableseeoriginaldocumentpage123含pKKE2和pKR585的最好胚芽系的結果如表15所示。最好的胚芽系中胚芽的平均w-3含量為63%，平均EPA含量為7。/。。所分析的最好的(0-3胚芽其(0-3含量為"72%。分析的最好的EPA胚芽其EPA為16%，0)-3含量為57%。這個胚芽系的平均o-3:co-6脂肪酸(18:3/18:2)比例為8:1，最好的胚芽的比例為16:1。最好的EPA胚芽中o-3:(o-6脂肪酸(18:3/18:2)比例為4:1。，tableseeoriginaldocumentpage124表15ptCKE2和pKR578轉化的胚芽系中oo-J脂肪酸的累積tableseeoriginaldocumentpage125表l3(.續)tableseeoriginaldocumentpage126實施例18擬南界植抹的轉化用Mm/1H消化載體pKR197以除去P-伴大豆球蛋白表達盒，將栽體骨架重新連接，得到pKR277用Ry/WI消化pKR124除去Kti/AWI/Kti3'盒，將末端補齊，然後將該片段克隆到補齊的pKR277上的"/"rfHI位點，得到pKR353。將含/^sfln'w附A15去飽合酶的pY34的AWl片段克隆到pKR353上的Ao"位點，得到pKR353(A15)。載體pHDl衍生於雙元載體pZBLll美國專利No.5,968,793;EP1003891和WO9859062|，通過在T-DNA邊界右邊和左邊間的和As/7718位點之間加入/^cI連接元件的方式。^4化1連接元件通過將寡核苷酸Asc5(SEQIDNO:108)與Asc3(SEQIDNO:109)退火形成。栽體pZBLl1I美國專利No.5，％8，793;EP1003891和WO9859062|在T-DNA邊界內包括提供了對磺醜脲除草劑具有抗性的35S:磺醯脲抗性的乳酸鹽合成酶(ALS)的轉基因，可用作植林的篩選標記。pZBLll還具有",〃和/^/Y^fl('w〃7/w！m附e/"c7ews的複製起點及細菌卡那黴素抗性基因。從pKR353(A15)中分離含嵌合基因Kti3啟動子:FmA15去飽合酶ORF:Kti3終止子的Ascl片段，並克隆到兩用載體pHDl中單一的敘l位點上，得到pZBLl(D15)。將質粒pZBLI(D15)轉入Jgra6fl"e/"/M/w菌林NTL4|Luoet.al.(2001)MPM114:98|中，該培養物通過土壤桿菌(Jgw6fl"er/Mw)浸染法轉4乜擬南芥的fad2-l突變林IOkuleyet.al.(1994)F/"m0〃6:147|。在磺醯脲上篩選出命名為NY的轉化子，培養植林，獲得T2種子。也用pHDl按同樣方法轉化作為對照。如下所述分析來自大批T2種子中的脂類(仍分為T-DNA和磺醯脲抗性)。用玻璃棒在5(HiLTMSH中破碎約25-50個T2種子。在室溫下溫育約15分鐘，並持續攪拌，然後向樣品中加入500jiL己烷，在攪拌下，室溫再溫育15分鐘。然後將己烷層轉移到單獨的GC瓶中，通過所述的GC分析(WO04/071467)進行脂肪酸甲基酯(FAME)分析。各胚芽系的結果如表16所示。在A15表達的胚芽系(FmDlS-NY)中的平均18:3水平比空載體對照(HD1對照)胚芽系約高1.5倍，而18:3/18:2比例比同樣的胚芽系高2倍。野生型擬南芥中n3/n6比例為0.61|Shahet.al.(1997)屍/flW/%淑W114:1533|。本領域的技術人員應理解，因為所分析的大批種子中含有隔離種子(包括野生型、雜合子和純合子)，因此ALA的水平是低估的,，本領域的技術人員也應理解，純合子系與雜合子系相比，含有二倍A15去飽合酶拷貝，因此預計ALA水平會更高(基因劑量效應)。表16tableseeoriginaldocumentpage128野生型擬南芥也可用表達A15去飽合酶的嵌合構建體以類似方法進行轉化，來自那些植林的種子將比未轉化的植林含有更高的ALA含量。因此，在植物油中o-3/w-6脂肪酸的比例可通過向野生型植林或具有降低的18:2的植林中轉化嵌合的A15去飽合酶基因而得到提高。後者是由於F"^〃'wmA15去飽合酶具有雙功能A12/A5去飽合酶的結果。因此，本領域的技術人員可向產量較少或無LA的突變植株中轉入雙功能A12/A15去飽合酶，或用雙功能A12/A15去飽合酶和設計成抑制宿主天然A12去飽和酶的DNA抑制構建體共轉化野生型菌抹。天然的A12去飽和酶基因包括編碼質粒外或質粒A12去飽和酶的基因。權利要求1.分離的、編碼真菌Δ15去飽合酶的核酸片段，其選自(a)分離的、編碼在SEQIDNO2中所示的胺基酸序列的核酸片段；(b)分離的、在下述雜交條件下可與(a)雜交的核酸片段，所述雜交條件指0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，並用2×SSC，0.1％SDS以及之後用0.1×SSC，0.1％SDS清洗；或者分離的、與(a)或(b)互補的核酸片段。2.權利要求1所述的分離的核酸片段，其如SEQIDNO:1所示。3.權利要求1所述的分離的核酸片段，其由串珠鐮孢(F"Sfln'M/wmom7fyimw)中分離。4.分離的、包含編碼A15去飽合酶中至少402個胺基酸的第一段核酸序列的核酸片段，當其與具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的C:lustal方法表明它們具有至少86%的同一性；或者是包含第一段核酸序列互補序列的第二段核酸序列,，5.由權利要求i-4任一項中的分離的核酸片段所編碼的多肽，它可與作為底物的油酸或亞麻酸結合。6.可操作地連接到合適的調控序列上的、包含權利要求1-4任一項中的分離的核酸片段的嵌合基因。7.包含權利要求1-5任一項中的分離的核酸片段的轉化宿主細胞。8.權利要求7中的轉化宿主細胞，其選自植物、藻類、細菌、酵母或真菌。9.權利要求8中的轉化宿主細胞，其中宿主細胞選自大豆、穀物、油菜籽、櫻草花、亞麻、芥花籽、玉米、紅花和向日葵的植物。10.權利要求8中的轉化宿主細胞，其中宿主細胞選自破嚢壺菌(r/ira^"c/，,/肪,^p.)、5V力/,/r,/Mm5/>.和被孢菌的真菌。11.權利要求8中的轉化宿主細胞，其中酵母是含油酵母。12.權利要求n中的轉化酵母，其中含油酵母選自y"/7wv/fl、假絲酵母屬(Om力V/fl)、紅酵母屬(//^^Mrw/fl)、紅冬孢酵母屬(//1油*戸涵附>、隱球酵母屬、絲孢酵母屬(:7>/c/ws"raw)和油月旨酵母屬(L—，ces)。13.權利要求12中的轉化酵母，其中含油酵母是Ffl"3脂肪酸。25.—種在產生(o-3脂肪酸及w-6脂肪酸的宿主細胞中提高w-3脂肪酸對w-6脂肪酸比例的方法，包括a)提供可產生w-3脂肪酸及o-6脂肪酸的宿主細胞；b向(a)中的宿主細胞導入分離的、編碼下述蛋白的核酸片段，當所述蛋白同具有SEQIDNO:2中所示的序列的多肽比較時，基於序列比對的C，ustal方法表明它們具有至少46.2%的同一性，其中多肽可與作為酶底物的油酸及亞油酸結合，且(o-3脂肪酸對(o-6脂肪酸比例增加了。26.權利要求25中的方法，其中產(o-3脂肪酸和co-6脂肪酸的宿主細胞缺少具有A12去飽和酶活性的多肽。27.權利要求24或25中的方法，其中分離的、編碼具有A15去飽合酶活性的蛋白的核酸片段編碼選自SEQIDNOs:2、6、10、14和18的胺基酸序列。28.權利要求24的方法，其中co-3脂肪酸選自a-亞麻酸、硬脂艾杜糖酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。29.權利要求24的方法，其中編碼co-3/co-6脂肪酸生物合成途徑的酶的基因是選自A6去飽和酶、碳鏈增長酶、A5去飽和酶、A4去飽和酶、A8去飽和酶、A9去飽和酶、A9碳鏈增長酶和A17去飽和酶的基因。30.權利要求15、16、24和25任一項的方法，其中宿主細胞選自植物、藻類、細菌、酵母和真菌。31.權利要求30中的方法，其中宿主細胞選自大豆、穀物、亞麻、油菜籽、櫻草花、芥花籽、玉米、紅花和向日葵。32.權利要求30中的方法，其中宿主細胞是從由破嚢壺菌、AV/〃',一n'wm5/7.和被孢黴■>33.權利要求30中的方法，其中酵母是含油酵母。34.權利要求33中的方法，其中含油酵母選自yflf7wWa、假絲酵母屬(Gmrf/rffl)、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬(7V/c如，raw)和油月旨酵母屬(Zj》0附ycey)。35.權利要求34中的方法，其中Famiv/fls/選自！^nwv/flATC(#20362、yfl/'raw/"/(po/^"'cflATC(#8862、y拼o油//p豐c'flAT(X#18944、l辨麵.fl一,flATCC#76982和F"fT畫.fl///7爭'('flLGAMS(7)1。36.—種由權利要求15、16、24和25任一項中的方法生產的微生物油。37.—種獲得編碼A15去飽合酶的核酸片段的方法，包括(a)用權利要求l所述的核酸片段檢測基因組文庫；(b)鑑定可與權利要求1所述的核酸片段雜交的DNA克隆；和(c)對包含步驟(b)中所鑑定的克隆的基因組片段進行測序，其中測序的基因組片段編碼A1S去飽合酶。38.—種獲得編碼A15去飽合酶的核酸片段的方法，包括(a)合成至少一個對應於SEQ1DNO:l中所示的序列的一部分的寡核苷酸引物；和(b)用步驟(a)中的寡核苷酸引物擴增存在於克隆栽體上的插入片段；其中所擴增的插入片段編碼A15去飽合酶的一部分的胺基酸序列。全文摘要本發明涉及可催化亞油酸(18:2，LA)轉化為α-亞麻酸(18:3，ALA)的真菌Δ15脂肪酸去飽和酶。描述了編碼該去飽和酶的核酸序列、可與此序列雜交的核酸序列、含有該去飽和酶基因的DNA構建體、以及在增強水平上表達該去飽和酶的重組宿主植物與微生物。本申請還描述了通過過量表達Δ15脂肪酸去飽和酶的方式來提高特定ω-3及ω-6脂肪酸產量的方法。文檔編號C12N15/82GK101128475SQ200480033502公開日2008年2月20日申請日期2004年11月10日優先權日2003年11月12日發明者N·S·亞達夫申請人:納幕爾杜邦公司