N[n－n－(4－哌啶－4－基)丁醯基)－n－乙基甘氨醯基]化合物的不吸溼的穩定結晶形式的製作方法

2023-10-26 08:50:02

專利名稱：N[n－n－(4－哌啶－4－基)丁醯基)－n－乙基甘氨醯基]化合物的不吸溼的穩定結晶形式的製作方法
背景技術：
1. 發明領域本發明涉及式I的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼的穩定結晶形式。該化合物具有抗血栓形成活性，
包括在哺乳動物中抑制血小板聚集和血栓的形成，可用於預防和治療與心肌梗塞、中風、外周動脈疾病和彌散性血管內凝血等疾病有關的血栓形成。
此外，本發明還涉及N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺結晶形式的製備方法，其藥物組合物及其中間體。
此外，本發明還涉及用於製備四氮雜環烷基鏈烷醯基肽或假肽化合物的中間體。
止血，血液凝集的生物化學過程，是一種極為複雜的現象，正常的全血和身體組織通過該過程自發地使受損的血管停止流血。有效的止血需要血管、血小板和血漿因子的聯合活性以及控制機制以防止過度凝固。其中任意一種成分的缺陷、不足或過量均會導致出血或血栓形成的後果。
血小板在細胞外基質上的粘附、擴散和凝集是血栓形成的重要事件。這些事件受一族粘著糖蛋白，即纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德(von willebrand)因子的調節。纖維蛋白原是血小板凝集的輔助因子，而纖連蛋白支持血小板的粘附和擴散反應，馮·維勒布蘭德因子對於血小板在內皮下基質上粘附和擴散是非常重要的。纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子的結合位點位於被稱為糖蛋白IIb/IIIa的血小板膜蛋白配合物上。
粘著糖蛋白如纖維蛋白原不與正常的靜息血小板結合。但是，當血小板被激動劑如凝血酶和二磷酸腺苷激活時，血小板的形狀發生改變，可能會使GP IIb/IIIa結合位點適於纖維蛋白原接近。本發明的化合物可以封閉纖維蛋白原受體，從而具有上述的抗血栓形成活性。
2. 已報導的進展已發現，Arg-Gly-Asp(RGD)的存在是纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子與細胞表面受體相互作用所必需的(RuoslahtiE.，Pierschbacher，細胞(Cell)1986，44，517-18)。另外兩種胺基酸序列似乎也參與了纖維蛋白原的血小板粘附功能，即Gly-Pro-Arg序列和十二肽His-His-Leu-Gly-Gly-ALa-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val序列。含有RGD或十二肽的小合成肽表現出可與血小板GPIIb/IIIa受體結合併競爭性地抑制纖維蛋白原、纖連蛋白和馮·維勒布蘭德因子的結合以及抑制被激活血小板的凝集(Plow等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1985，82，8057-61；Ruggeri等，美國國家科學院院報1986，5708-12；Ginsberg等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)1985，260，3931-36；和Gartner等，生物化學雜誌，1987，260，11，891-94)。
Tjoeng等在美國專利5037808和4879313中報導了含有胍基鏈烷醯基-和胍基鏈烯醯基-天冬氨醯部分的吲哚基化合物是血小板凝集的抑制劑。
1991年2月12日授權的美國專利4992463(Tjoeng等)公開了一系列具有血小板凝集抑制活性的芳基和芳烷基胍基烷基肽類似物，並具體公開了一系列單-和二甲氧基苯基肽類似物和二苯基烷基肽類似物。
1989年8月15日授權的美國專利(Adams等)公開了一系列具有血小板凝集抑制活性的含有末端芳烷基取代基的胍基烷基肽衍生物，並具體公開了一系列含有末端醯胺功能基的O-甲基酪氨酸、聯苯基和萘基衍生物。
Haverstick，D.M.等，在「血液」(Blood)66(4)，946-952(1985)中公開了多種合成肽，包括arg-gly-asp-ser和gly-arg-gly-asp-ser，可以抑制凝血酶誘導的血小板凝集。
Plow.E.F.等，在「美國國家科學院院報」79，3711-3715(1982)中公開了四肽甘氨醯-L-脯氨醯-L-精氨醯-L-脯氨酸可以抑制纖維蛋白原與人血小板結合。
1986年12月15日遞交的法國專利申請86/17507公開了含有-arg-gly-asp-序列的四肽、五肽和六肽可用作抗血栓形成劑。
1987年7月28日授權的美國專利4683291(Zimmerman等)公開了一系列含有-arg-gly-asp-序列的由6-40個胺基酸組成的肽是血小板結合抑制劑。
1989年6月7日公開的歐洲專利申請0319506公開了一系列含有-arg-gly-asp-序列的四肽、五肽和六肽是血小板凝集的抑制劑。
美國專利5023233報導了含有Gly-Asp部分的環狀肽類似物是纖維蛋白原受體的拮抗劑。
在分別於1991年3月28日、1990年6月7日和1990年1月4日遞交的未決美國專利申請07/677006、07/534385和07/460777，以及美國專利4952562和於1990年9月25日遞交的國際申請PCT/US90/05448中報導了含有氨基一、胍基-、咪唑基和/或脒基鏈烷醯基和鏈烯醯基部分的肽和假肽是抗血栓形成劑，以上這些專利申請均轉讓給了本發明的同一受讓人。
在1990年2月5日遞交的未決美國專利申請07/475043和1991年4月11日遞交的國際申請PCT/US91/02471(1992年10月29日公開，國際申請號為WO 92/13117)中報導了含有氨基-和胍基-烷基-和鏈烯基-苯甲醯基、苯基鏈烷醯基和苯基鏈烯醯基部分的肽和假肽是抗血栓形成劑，以上這些專利申請均轉讓給了本發明的同一受讓人。
在1989年12月1日遞交的美國專利5053392中報導了鏈烷醯基和取代的鏈烷醯基氮雜環烷基甲醯基天冬氨酸衍生物是血小板凝集抑制劑，該專利轉讓給了本發明的同一受讓人並且與本發明具有相同的發明人。
在1990年4月5日遞交的美國專利5064814中報導了N-取代的氮雜環烷基羰基環狀氨基醯基天冬氨酸衍生物是抗血栓形成劑，該專利的發明人和受讓人與本申請相同。與本申請的受讓人相同的、於1989年10月10日遞交的美國專利5051405中報導了氮雜環烷基甲醯基甘氨醯天冬氨酸衍生物是抗血栓形成劑。
1992年4月8日公開的歐洲專利申請0479481公開了用作纖維蛋白原受體拮抗劑的氮雜環烷基鏈烷醯基甘氨醯天冬氨醯胺基酸類化合物。
1992年4月1日公開的歐洲專利申請0478362公開了用作纖維蛋白原受體拮抗劑的氮雜環烷基鏈烷醯基肽基β-丙氨酸類化合物。
PCT專利申請公開號WO 95/10295公開了式II的氮雜環烷基鏈烷醯基肽和假肽，
特別是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺，其可以在哺乳動物中抑制血小板凝集和血栓形成，可用於預防和治療血栓形成。根據PCT專利申請公開號WO 95/10295所製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺是無定形的、吸溼的，並且由於吸溼其物理性質也不穩定。PCT專利申請公開號WO 95/10295並未公開N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼的、穩定的結晶形式。
PCT專利申請公開號WO 95/10295還公開了氮雜環烷基鏈烷醯基肽和假肽是通過常規的固相或液相肽合成方法，用原料和/或易於從化學品供應商如Aldrich或Sigma處獲得的中間體製得的(H.Paulsen，G.Merz，V.Weichart，「O-糖肽序列的固相合成」，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27(1988)；H.Mergler，R.Tanner，J.Gosteli和P.Grogg，「通過固相和液相方法聯合進行肽合成I一種新的用於固相合成完全保護的片段的對酸非常不穩定的錨基」，四面體通訊(Tetrahedron Letters)29，4005(1988)；Merrifield，R.B.，「25年後的固相肽合成高血糖素拮抗劑的設計與合成」，Markromol.Chem.Macromol.Symp.19，31(1988))。此外，PCT專利申請公開號WO 95/10295還公開了N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的無定形和吸溼的形式是通過順序合成從C-末端胺基酸製得的，參見反應路線I。反應路線I
PCT專利申請公開號WO 95/10295並未公開從中心的二(假肽或肽)形成四-氮雜環烷基鏈烷醯基肽和假肽，或者，具體地講，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺，由此使中心的二(假肽或肽)的N-和C-末端均與假胺基酸和/或胺基酸偶聯形成四-氮雜環烷基鏈烷醯基肽和假肽。
發明概述本發明涉及式I的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溫的、穩定的結晶形式。該化合物具有抗血栓形成活性，
包括在哺乳動物中抑制血小板聚集和血栓的形成，從而可用於預防和治療與心肌梗塞、中風、外周動脈疾病和彌散性血管內凝血等疾病有關的血栓形成。本發明還涉及N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溼的、穩定的結晶形式的藥物組合物及其中間體。
本發明還涉及製備式II的四-氮雜環烷基鏈烷醯基肽或假肽化合物的方法，
其中A是H；B是烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；Z是
E1是H；E2是天然α-胺基酸的-碳側鏈、H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜環基、取代的雜環基、雜環基烷基、取代的雜環基烷基，或E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個4-、5-、6-或7-元氮雜環烷烴環；G是OR1或NR1R2；R1和R2彼此獨立地是H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；R是H、烷基、芳基或芳烷基；m是1-5；n是0-6；p是1-4；特別是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溼的、穩定的結晶形式。
附圖概述

圖1表示實施例13，方法A中製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溼性結晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖2表示實施例13，方法B(a)中製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溼性結晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖3表示實施例13，方法B(b)中製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溫性結晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖4表示按照實施例14製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環已基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖5表示按照實施例14製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的非吸溼性結晶形式樣品的X-射線粉末衍射圖。
圖6表示按照實驗15的描述進行的三次不同實驗的輸出功率作為時間函數的等溫微量量熱圖。該實驗監測N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基}-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不同結晶形式與各種溶劑蒸氣接觸時的熱活性。圖6中的(A)線表明，當根據實施例5或11製得的吸溼性N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺於40℃下暴露在80％RH(飽和氯化鉀溶液)中30小時以上時，發生了強烈的放熱事件，在該暴露過程中，化合物的吸溼形式轉變成了化合物的非吸溼形式。圖6中的(B)線表明，當根據實施例5或11製得的吸溼性N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺於40℃下暴露在甲醇蒸氣(可溶解化合物的除水之外的溶劑)中時，未發生放熱轉化事件，因此，甲醇不會引起吸溼形式的晶體向非吸溼形式的轉變。圖6中的(C)線表明，當根據實施例13製得的非吸溼形式的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺暴露於40℃/80％RH時，未發生了放熱轉變事件，因此，該化合物的非吸溼形式在這些條件下不會經歷形式轉變，也就是說，是一種穩定的形式。
圖7表示按照實驗15的描述進行的三次不同實驗的輸出功率作為時間函數的等溫微量量熱圖。該實驗監測當於40℃、50℃和60℃暴露在80％RH下時，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式向其非吸溼性形式轉變的熱活性。該圖表明，在40℃時，轉變在約24小時發生，在50℃時，在6.5小時發生，在60℃時，在3小時發生。
圖8表示按照實驗15的描述進行的四次不同實驗的輸出功率作為時間函數的等溫微量量熱圖。該實驗監測當於60℃暴露在65％、75％、80％和100％RH下時，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式向其非吸溼性形式轉變的熱活性。圖8的顯著特點是，較高的相對溼度引起較快的轉變。另一個顯著特點是，在100％RH下於60℃向化合物的非吸溼形式轉變時，不會發生吸溼形式在室溫下出現的液化現象。基於這些結果，預期在60℃下向非吸溼形式的轉變速度遠高於吸溼形式的液化速度。
圖9表示按照實驗16的描述進行的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼(■)和非吸溼(●)形式在25℃下％重量增加對％RH作圖的比較。圖9表明，當RH增加時，吸溼形式比非吸溼形式吸收更多的水分，在相對溼度大於60％時更為明顯。此外，圖9還表明化合物的吸溼形式不會解吸至其最初的重量％，而化合物的吸溼形式會解吸至其最初的重量％。
發明詳述若無相反說明，在本申請整個說明書中所用的如下術語應理解為具有如下含義文中所用的縮寫包括BOC(叔丁氧羰基)、CBZ(苄氧羰基)、Gly(甘氨酸)、Asp(天冬氨酸)、0bzl(苄氧基)、TFA(三氟乙酸)、Cha(β-環己基丙氨酸)、EtOAc(乙酸乙酯)、DMF(二甲基甲醯胺)、DCC(二環己基碳二亞胺)、HOBT(羥基苯並三唑)、，TBTU((2-1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽)、DI(去離子水)、PNP(對硝基苯酚)、PFP(五氟苯酚)、DCU(二環己基脲)、NMM(N-甲基嗎啉)、MTBE(甲基叔丁基醚)、RH(相對溼度)、THF(四氫呋喃)、PipBu(4-哌啶丁酸)，PipBuen(4-(哌啶-4-叉)-丁酸)是下式化合物
「患者」包括人和其它哺乳動物。
「可藥用鹽」是指式I母體化合物的鹽形式，當該鹽在治療劑量下使用時對患者相對無害，從而式I母體化合物有益的藥物特性不會被鹽形式抗衡離子的副作用而受到影響。可藥用鹽也包括式I化合物的兩性離子或內鹽。
「烷基」指飽和的脂族烴基，該烴基可以是直鏈或支鏈的並且在鏈中含有約1-20個碳原子。支鏈是指有低級烷基如甲基、乙基或丙基連接在直鏈烷基鏈上。優選的直鏈或支鏈烷基是含有1-約10個碳原子的「低級烷基」。首選的低級烷基含有1-約6個碳原子。
「環烷基」指含有一個或多個環並且含有約3-約10個碳原子的飽和碳環基團。優選的環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和十氫萘。
「環烷基烷基」指被環烷基取代的烷基。優選的環烷基烷基包括環戊基甲基、環己基甲基、環己基乙基、十氫萘-1-基甲基和十氫萘-2-基甲基。
「烷基環烷基」指被烷基取代的環烷基。烷基環烷基的例子包括1-、2-、3-或4-甲基或乙基環己基。
「烷基環烷基烷基」指被烷基環烷基取代的烷基。烷基環烷基烷基的例子包括1-、2-、3-或4-甲基或乙基環己基甲基或1-、2-、3-或4-甲基或乙基環己基乙基。
「氮雜環烷烴」指含有氮原子的飽和脂族環。優選的氮雜環烷烴包括吡咯烷和哌啶。
「天然-胺基酸」指甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸、組胺酸、精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。
「天然α-胺基酸的α-碳側鏈」指取代天然-胺基酸的-碳的部分。天然-胺基酸的α-碳側鏈的例子包括纈氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的異丙基、甲基和羧甲基。
術語「氨基保護基」指本領域已知的易於脫除的基團，該基團用於防止氨基在合成過程中發生不利的反應並且可以被選擇性地脫除。氨基保護基的用途是本領域已知的，用於防止氨基在合成過程中發生不利的反應，許多所述的保護基是已知的，參見，例如T.H.Greene和P.G.M.Wuts，有機合成中的保護基，第2版，John Wiley Sons，New York(1991)，該文獻引入本文作為參考。優選的氨基保護基是醯基，包括甲醯基、乙醯基、氯乙醯基、三氯乙醯基、鄰-硝基苯乙醯基、鄰-硝基苯氧乙醯基、三氟乙醯基、乙醯乙醯基、4-氯丁醯基、異丁醯基、鄰-硝基肉桂醯基、吡啶甲醯基、醯基異硫氰酸酯、氨基己醯基、苯甲醯基等；和醯氧基，包括甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、2，2，2-三氟乙氧羰基、2-三甲基甲矽烷基乙氧羰基、乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基(BOC)、1，1-二甲基丙炔氧羰基、苄氧羰基(CBZ)、對硝基苄氧羰基、2，4-二氯苄氧羰基等。
術語「對酸不穩定的氨基保護基」指很容易通過用酸處理除去而對其它試劑相對穩定的以上所定義的氨基保護基。優選的對酸不穩定的氨基保護基是叔丁氧羰基(BOC)。
術語「對氫化不穩定的氨基保護基」指很容易通過氫化除去而對其它試劑相對穩定的以上所定義的氨基保護基。優選的對氫化不穩定的氨基保護基是苄氧羰基(CBZ)。
術語「酸保護基」指本領域已知的易於脫除的基團，該基團用於防止羧酸(-COOH)基團在合成過程中發生不利的反應並且可以被選擇性地脫除。羧酸保護基的用途是本領域熟知的，並且許多所述的保護基是已知的，參見，例如T.H.Greene和P.G.M.Wuts，有機合成中的保護基，第2版，John Wiley Sons，New York(1991)，該文獻引入本文作為參考。羧酸保護基的例子包括酯，例如甲氧甲基、甲硫基甲基、四氫吡喃基、苄氧基甲基、取代和未取代的苯甲醯甲基、2，2，2-三氯乙基、叔丁基、肉桂基、取代和未取代的苄基、三甲基甲矽烷基等，以及醯胺和醯肼，包括N，N-二甲基、7-硝基吲哚基、醯肼、N-苯基醯肼等。
術語「對氫化不穩定的酸保護基」指很容易通過氫化除去而對其它試劑相對穩定的以上所定義的酸保護基。優選的對氫化不穩定的氨基保護基是苄基。
「芳基」指苯基或萘基。
「取代的芳基」指被一個或多個芳基取代基取代的苯基或萘基，所述取代基可以相同或不同，其中的「芳基取代基」包括烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羥烷基、醯基、甲醯基、羧基、鏈烯醯基、芳醯基、滷素、硝基、三滷代甲基、氰基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、醯基氨基、芳醯基氨基、氨基甲醯基、烷基氨基甲醯基、二烷基氨基甲醯基、芳基氨基甲醯基、芳烷基氨基甲醯基、烷基磺醯基、烷基亞磺醯基、芳基磺醯基、芳基亞磺醯基、芳烷基磺醯基、芳烷基亞磺醯基或-NRaRb，其中Ra和Rb彼此獨立地是氫、烷基、芳基或芳烷基。
「芳烷基」指被芳基取代的烷基。優選的芳烷基包括苄基、萘-1-基甲基、萘-2-基甲基和苯乙基。
「取代的芳烷基」指在芳基部分被一個或多個芳基取代基取代的芳烷基。
「雜環」指約4-至約15-元的單環或多環系統，其中，環中的一個或多個原子是除碳以外的其它元素，例如氮、氧或硫。優選的雜環包括吡啶基、嘧啶基和吡咯烷基。
「取代的雜環」指被一個或多個芳基取代基取代的雜環基團。
「雜環基烷基」和「取代的雜環基烷基」分別指被雜環基團和取代的雜環基團取代的烷基。
「吸溼性」指吸著作用，是指足以影響物質的物理或化學性質的水的獲得量或狀態(Eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，製藥技術百科全書(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)，Vol.10，33頁)。優選的實施方案根據本發明製備的優選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜環基、取代的雜環基、雜環基烷基、取代的雜環基烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個4-、5-、6-或7-元氮雜環烷烴環，條件是雜環基烷基不是吲哚-3-基甲基。
根據本發明製備的更優選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個4-、5-、6-或7-元氮雜環烷烴環。
根據本發明製備的更優選的化合物是式II所述的化合物，其中E2是氫、烷基、羥甲基、1-羥基乙基、巰基甲基、2-甲硫基乙基、羧甲基、2-羧基乙基、4-氨基丁基、3-胍基丙基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基，或者，E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子合在一起形成一個4-、5-、6-或7-元氮雜環烷烴環。
根據本發明製備的更為優選的化合物是式II所述的化合物，其中B是烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基或烷基環烷基烷基。
根據本發明製備的一個具體的實施方案是式IIa所描述的化合物
其中B是烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；J是H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基；L是OR1或NR1R2；R1和R2彼此獨立地是H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基、烷基環烷基烷基、芳基、芳烷基、烷芳基或烷基芳烷基；m是1-5；n是2-6；p是1或2。
根據本發明製備的更優選的具體實施方案是式IIa所描述的化合物，其中B是烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基或烷基環烷基烷基；
J是H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基或烷基環烷基烷基；m是3；n是3或4。
根據本發明製備的進一步優選的具體實施方案是式IIa所描述的化合物，其中B是烷基；J是烷基、環烷基或、環烷基烷基；R1和R2彼此獨立地是H、烷基、環烷基、環烷基烷基、烷基環烷基或烷基環烷基烷基；m是3；n是3或4；p是1。
根據本發明製備的另一個進一步優選的具體實施方案是式IIa所描述的化合物，該化合物是N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺，本發明的另一個實施方案是形成N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的穩定的、不吸溼的結晶形式。根據本發明，化合物的這種形式可以製成化合物的穩定製劑。N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的穩定的、不吸溼的結晶形式還具有高的熔點，並且沒有吸水的傾向。在高於運輸、劑型生產或長期運輸或儲存過程中所遇到的正常溼度和溫度下，該穩定的形式還對溼度和溫度表現出獨特的、意想不到的良好穩定性。這些特性也有利於劑型的生產。向穩定形式的轉變還不會引起物質或其純度的損失，也不會對其顆粒性質產生不利影響。
應當理解，本發明包括文中所定義的優選化合物、優選實施方案和具體實施方案的所有組合。
本發明的化合物可以以游離鹼或酸的形式、其兩性離子鹽的形式或其可藥用鹽的形式使用。所有這些形式均包括在本發明的範圍內。
如果本發明的化合物被鹼性基團取代，則可以形成酸加成鹽，所述酸加成鹽是更便於使用的形式；在實踐中，鹽形式的應用相當於游離鹼形式的應用。可用於製備酸加成鹽的酸優選包括那些當與游離鹼混合時可形成可藥用鹽的酸，可藥用鹽是指，在鹽的藥物劑量下，其陰離子對患者無毒的鹽，從而游離鹼所具有的對血小板凝集和血栓形成的有利的抑制效果不會被陰離子的副反應所影響。儘管優選所述鹼性化合物的可藥用鹽，但所有酸加成鹽均可用作游離鹼形式的來源，即使某個具體的鹽本身僅適用於作為中間體產物，例如，當成鹽僅僅是為了純化和鑑定的目的時，或將其用作通過離子交換的方法製備可藥用鹽的中間體。本發明範圍內的可藥用鹽是從如下酸衍生的鹽無機酸如鹽酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸；以及有機酸如乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環己基氨基磺酸、奎尼酸等。相應的酸加成鹽包括氫滷酸鹽，例如鹽酸鹽和氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、亞甲基-雙-β-羥基萘酸鹽、龍膽酸鹽、甲磺酸鹽、羥乙基磺酸鹽和二對甲苯甲醯酒石酸甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環己基氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽等。
根據本發明的另一個特點，本發明化合物的酸加成鹽採用已知的方法，通過將游離鹼與適宜的酸反應製得。例如，本發明化合物的酸加成鹽的製備可以通過將游離鹼溶於含有適宜酸的水溶液或水-醇溶液或其它適宜的溶劑中並通過蒸發溶液分離鹽來進行，或通過將游離鹼和酸在有機溶劑中反應來進行，在該情況下，鹽可以直接分離出來或可以通過濃縮溶液得到。
本發明化合物的酸加成鹽可以通過已知的方法從鹽再生。例如，本發明的母體化合物可以通過用鹼例如碳酸氫鈉水溶液或氨水溶液處理從其酸加成鹽再生。
如果本發明的化合物被酸性基團取代，則可以形成鹼加成鹽，所述鹼加成鹽是更便於使用的形式；在實踐中，鹽形式的應用相當於游離酸形式的應用。可用於製備鹼加成鹽的鹼優選包括那些當與游離酸混合時可形成可藥用鹽的鹼，可藥用鹽是指，在鹽的藥物劑量下，其陽離子對動物體無毒的鹽，從而游離酸所具有的對血小板凝集和血栓形成的有利的抑制效果不會被陽離子的副反應所影響。可藥用鹽包括，例如鹼金屬鹽和鹼土金屬鹽，本發明範圍內的可藥用鹽是從如下鹼衍生的鹽氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅、氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽鹼、N，N，-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)-氨基甲烷、四甲基氫氧化銨等。
本發明化合物的金屬鹽可以通過將選定金屬的氫化物、氫氧化物、碳酸鹽或類似的活潑化合物在含水或有機溶劑中與化合物的游離酸形式接觸製得。所用的含水溶劑可以是水或是水與有機溶劑的混合物，優選醇如甲醇或乙醇、酮如丙酮、脂肪族醚如四氫呋喃或酯如乙酸乙酯。所述反應通常在室溫下進行，如需要，也可以在加熱下進行。
本發明化合物的銨鹽可以通過將胺在含水或有機溶劑中與化合物的游離酸形式接觸製得。適宜的含水溶劑包括水和水與醇如甲醇或乙醇、醚如四氫呋喃、腈如乙腈、或酮如丙酮的混合物。胺基酸鹽可按照類似的方法製得。
本發明化合物的鹼加成鹽可以通過已知的方法從鹽再生。例如，本發明的母體化合物可以通過用酸例如鹽酸處理從其鹼加成鹽再生。
本發明化合物的鹽除了本身可用作活性化合物外，還可用於純化化合物的目的，例如，通過利用鹽和母體化合物、副產物和/或原料之間溶解度的不同，通過本領域技術人員熟知的方法進行純化。
本發明的化合物可以含有不對稱中心。這些不對稱中心可以彼此獨立地是R或S構型。對本領域技術人員顯而易見的是，某些式I化合物可以具有幾何異構體。幾何異構體包括帶有烯基部分的本發明化合物的順式和反式形式。本發明包括單獨的幾何異構體和立體異構體以及它們的混合物。
所述異構體可以通過已知的方法，例如色譜法和重結晶技術從它們的混合物中分離出來，或可以從它們中問體的適宜異構體通過本文所述的方法分別製得。
美國專利申請08/138820和08/476750描述了無定形式II化合物、特別是無定形式I化合物的製備方法，以上專利申請在此引入本文作為參考。
反應路線II中所示的合成方法描述了用於製備式II化合物、特別是本發明的結晶狀式I化合物的本發明的新方法，其中B、E1、E2、G、R、m、n和p如上所定義，P1是對氫化不穩定的酸保護基如苄基，P2是對酸不穩定的氨基保護基如叔丁氧羰基(BOC)，P3是對氫化不穩定的氨基保護基如苄氧羰基(CBZ)。反應路線II
在製備式II化合物或其中間體的過程中，可能還需要防止天然或假胺基酸上存在的化學活潑取代基之間的交叉反應。這些取代基可以用常規的保護基進行保護，所述保護基隨後可以根據需要通過已知方法脫除或保留以生成所需的產物或中間體(參見，例如Greene，「有機合成中的保護基」，Wiley，New York，1981)。還需要進行選擇性地保護或脫保護以轉化或除去己存在的保護基，或以便進行隨後的反應以生成最終的所需產物。
以式II化合物的製備對反應路線II的方法進行舉例說明，但應當理解，式I化合物是用適宜的原料製得的。在根據反應路線II製備式I化合物時，B是乙基，E是H，F是環已基甲基，G是NH2，R是H，m是3，n是3，p是1，P1是苄基，P2是BOC，P3是CBZ。
根據本發明，製備式I化合物的另一種方法與反應路線II中的方法相似，所不同的是用式III化合物(其中的P3如上所定義)
代替式IV化合物，
其中R是H，m是3，n是3，p是1，P3是CBZ，以生成式V的中間體，
其中B是乙基，E1是H，E2是環己基甲基，G是NH2，p是1，P1是苄基，P3是CBZ 。
反應路線II說明了一種製備本發明化合物的五步方法，首先是形成本發明式VI的中心二肽中間體，
其中B、p、P2和P1如上所定義。在製備式I化合物的情況下，本發明的中心二肽中間體是BOC-N(Et)-Gly-(L)-Asp-(OBzl)-OH。製得的中心二肽中間體未對游離的羧基部分進行保護。
在反應路線II的第2步中，偶聯形成中心二肽的反應可以在二氯甲烷或乙酸乙酯(含或不含DMF作為助溶劑)和有機鹼如NMM的混合物中進行，反應溫度為室溫至約40℃。用於偶聯的下式胺基酸或假胺基酸的活化可以採用
不用分離的活潑酯的形式用對硝基苯酚、五氟苯酚和N-羥基-琥珀醯亞胺通過二環己基碳二亞胺的作用來完成。根據所要偶聯的胺基酸或假胺基酸、活化劑、溶劑和溫度，偶聯反應的時間為約1-20小時。步驟1的中心二肽產物無需分離。步驟1的反應混合物通常用水或稀的含水酸(例如鹽酸)洗滌，然後不經乾燥直接用於步驟2。當使用基於苯酚的活潑酯時，將中心二肽產物從反應混合物中萃取到鹼性水溶液中，然後再從酸化的水溶液中萃取到有機溶劑中，然後將該溶液直接進行步驟2的反應。
式VI的二肽中間體用於製備本發明式VII的三肽中間體，
其中B、E1、E2、G、p和P1如上所定義，P2』是P2或TFA·H-。當P2』是TFA·H-時，「·」符號表示TFA解離形成F3CCO2-和H+，其中H+質子化式VII化合物末端的胺，即形成式VIIa的TFA鹽。
在製備式I化合物時，本發明的三肽中間體是p2'-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2。
在步驟2中，胺基酸或假胺基酸與中心二肽的偶聯反應可以在二氯甲烷或乙酸乙酯和DMF或THF的混合物中進行，反應溫度為室溫是低於室溫。用於偶聯的下式中心二肽的活化
可以用五氟苯酚或N-羥基-琥珀醯亞胺通過二環己基碳二亞胺的作用形成不用分離的活潑酯來完成。活化反應還可以用氯甲酸異丙酯來進行。反應時間隨所要偶聯的胺基酸或假胺基酸、活化劑、溶劑和溫度而改變，為約1-20小時。三肽產物可以不用分離。當不分離三肽中間體時，將反應混合物用有機鹼的水溶液如N-甲基嗎啉水溶液和含水的酸如鹽酸洗滌，在用水洗滌後不經乾燥直接通過步驟3的方法進行反應。
在反應路線II的步驟3中，可以用三氟乙酸的二氯甲烷溶液，或用HBr在乙酸和乙酸乙酯中的混合物從步驟2的三肽產物上脫除保護基如BOG。反應可以在室溫下進行，反應分別需要約1小時(HBr法)和約2小時(TFA法)。通過過濾以結晶狀固體的形式從反應混合物中分離出三肽的酸加成鹽產物，該過程可以直接進行(HBr法)，也可以在蒸除部分溶劑並向殘餘物中加入非極性溶劑後進行。
本發明的另一個方法可描述為從BOC-N(Et)Gly-OH迅速、簡便地製備TFA·H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的單一連環方法，該方法是包括反應路線II的前兩步和用TFA處理的「一勺燴」反應。結果出人意料地得到TFA·H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，因其從連環反應溶液中直接結晶出來。該連環方法避免了反應路線II中相應的三步不連續的反應，建立了一種簡單、省時、經濟的合成方法，該方法可用於工業生產。
反應路線II表明了以相反的順序構建多肽，從N-保護的胺基酸開始，然後依次在羧基末端添加，該順序與常規的順序相反，在常規的順序中，多肽是通過在保護的C-末端胺基酸的氨末端依次醯胺化構建的。本發明的反向合成方法僅需對第一個胺基酸的氮進行保護，從此以後可以使用在胺或酸末端均未保護的胺基酸(側鏈功能基除外)。反向合成方法還可以以流水線生產式II化合物、特別是式I化合物，因為可以使用流動型生產技術而不是液相肽化學通常需要的批量型技術。這種新方法無需購買在胺末端保護的胺基酸，從而降低了生產成本。無需特殊的設備、試劑或分析方法。
本發明的另一個方法是通過新型的固態轉變方法從通過反應路線II和指出的替代反應步驟中所述方法製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶可重複地形成N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的穩定的、不吸溼的結晶。
N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式的物理性質不穩定，在接觸溼度和溫度的條件下轉變成高度穩定的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼的結晶形式。
根據本發明，用於從N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式向高度穩定的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-B-環己基丙氨醯胺的不吸溼性結晶形式轉變的一般條件在靜態和動態條件下完成。
本發明的靜態方法是指靜態轉變，因為該方法包括將置於不能移動的容器如小瓶或託盤內的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溫性結晶形式在控制的環境室內暴露於特定的溫度和溼度條件。該「靜態」轉變在約20℃-80℃、更優選約40℃-80℃的溫度下和約40％-100％RH、優選約65％-80％RH的相對溼度下進行。
本發明的動態方法是指動態轉變，因為該方法包括將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式暴露於與靜態模型相同的溼度和溫度條件下，並同時進行攪拌，包括將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式在旋轉蒸發儀中翻滾或在圓柱形容器中(在溼度烘箱中)用攪拌葉片攪拌。
以下實施例是用來說明本發明的，並不對其範圍構成限定。
若無相反說明，所報導的質譜分析數據是在VG 70SE上進行的低分辨快原子轟擊質譜，「計算」值為(M＋H)+。核磁共振(NMR)波譜數據用Brucker ACF 300在D2O中得到。快速色譜在矽膠上進行。高效液相色譜(HPLC)在粒度為8-15μ的C-18反相柱上進行。
若無相反說明，所報導的x-射線粉末衍射圖是用帶有Cu輻射源的Siemens D5000衍射儀(1.8kW，45kV，40mA)掃描粉末樣品得到的。在測定前，將樣品研磨以消除粒度對峰強度的影響。將約60mg樣品上樣到1.5×1cm樣品器內並以3-40°2θ的範圍進行掃描，步長為0.04°，每一步長共照射1秒。實施例1 BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-OH的製備(反應路線II的步驟1)向1升的三頸圓底燒瓶中加入51g(0.25mol)BOC-N(Et)Gly-OH、35g(0.25mol)PNP、400mL乙酸乙酯和100mLDMF。將該混合物攪拌形成溶液並冷卻至4-6℃。在10分鐘內滴加51.5g(0.25mol)DCC的125mL乙酸乙酯溶液，同時將溫度保持在約5℃-約8℃。將所有DCC加完後，移走冷卻浴，將混合物升溫至室溫(20-22℃)並攪拌1.5小時。在此期間內有DCU固體沉澱生成。通過分析型HPLC(BOC-N(Et)Gly-OH的消失)確定PNP酯的形成是否完全。將反應混合物過濾並將DCU殘餘物用2-50mL乙酸乙酯洗滌，將洗滌液加入到濾液中。棄除DCU。
向攪拌的濾液中加入67g(0.3mol)H2N-(L)-Asp-(OBzl)-OH在150mml(138g，1.36mol)NMM中的漿液。將混合物加熱至38-40℃並在該溫度下保持41小時，此刻的分析型HLPC表明BOC-N(Et)Gly-OPNP已完全消耗掉。將反應混合物冷卻至25℃並濾除未反應的H2N-(L)-Asp-(OBzl)-OH。將溶液冷卻並過濾，再次得到1.2g(回收21.7g，11.2g是加入的20％過量，10.5g(0.047mol)是未反應的物質)。
將濾液在2升Squibb漏鬥中用500mL去離子水萃取，然後用2×250mL萃取。將合併的水溶液用3×300mL 1∶1 MTBE/EtOAc萃取以除去殘餘的PNP(HPLC分析表明僅有痕量殘餘)，然後冷卻至5℃並滴加150mL濃鹽酸進行酸化，從pH8.9至pH1.79。將酸化的水溶液用2×200mL乙酸乙酯萃取。對水溶液的HPLC分析表明不含殘餘的所需產物。將乙酸乙酯萃取液合併，用硫酸鎂乾燥，過濾並通過旋轉蒸發儀在35℃濃縮。將得到的淡橙色油於35℃抽真空，以儘可能地除去殘餘的溶劑，得到85.68g油狀的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-OH(21.3mol，85.5％收率，未對殘餘的溶劑進行校正)。鑑定NMR(250MHz)7.3ppm(s)，5.1ppm(s)，3.3ppm(dq)，3.0ppm(dq)，1.4ppm(s)，1.1ppm(t)MSM=408；M+1觀測值=409HPLC90.79A％(3.87A％對硝基苯酚，未對e進行校正)元素分析C20H28N2O7H，N；C實測值57.54，C計算值58.81實施例2 BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的製備(反應路線II的步驟2)方法A氯甲酸異丙酯法將1當量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶於乙酸乙酯(6-8體積；1∶6.5重量體積)並將溫度保持在-15℃至0℃。加入NMM(1當量)並將溫度保持在約-15℃至約0℃。在約-15℃至0℃的溫度下向保護的二肽溶液中加入氯甲酸異丙酯(1-1.1當量)。將反應液在約-15℃至約0℃的溫度下保持2-5分鐘。向維持在約-15℃至約0℃的二肽溶液中加入H2N-(L)-Cha-NH2(1當量)的THF溶液(10體積，1∶10重量體積)。用在1 5分鐘、1小時和2小時得到的進程控制(HPLC)樣品監測反應，以評估反應是否完成。(當所觀察的二肽在HPLC分析中的面積小於10％時，表明反應完成)。
BOC-三肽產物直接從反應溶液中沉澱出來，從反應混合物中濾出沉澱，用乙酸乙酯洗滌(2次，1體積，重量∶體積)，然後真空乾燥。一般產率＞60％，純度＞90A％；通常觀察到＜1A％的天冬氨酸差向非對映異構體。
用乙酸乙酯形成漿液，由此可得到最終收率約為60％的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2並將純度提高到＞95A％，同時將非對映異構體降低至＜0.5％。
作為氯甲酸異丙酯的一個具體例子，當進行實施例A的一般方法並使用4.55g(8.1mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH時，則製得的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的量為3.26g(純度97.9A％，0.3A非對映異構體)，70％理論收率。方法B五氟苯酚-DCC複合物法將五氟苯酚(PFP，2.9當量)和DCC(1當量)於室溫下溶於乙酸乙酯(5體積；1∶5重量∶體積)並冷卻至-15℃至0℃。將1當量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶於乙酸乙酯(6體積，1∶6重量∶體積)並與事先溶於DMF(10體積，1∶10重量∶體積)的1當量H2N-(L)-Cha-NH2混合。將二肽/H2N-(L)-Cha-NH2溶液滴加到PFP和DCC的溶液中，保持溫度在-15℃至0℃。將反應液在15-22℃保持5-16小時，用在1、2、3、4和16小時得到的進程控制(HPLC)樣品評估反應是否完成。(當所觀察的二肽的量在HPLC分析中面積小於2％時，表明反應完成)。
將反應混合物過濾並將濾餅(DCU)用乙酸乙酯(2×0.5體積；重量∶體積)洗滌。將濾液用水(10體積；1∶10重量∶體積)處理並除去水層。將乙酸乙酯層用水(1次，5體積；1∶5重量∶體積)洗滌。將乙酸乙酯層冷卻至析出產物沉澱，濾出沉澱並用乙酸乙酯(2×0.4體積；1∶0.4重量∶體積)洗滌。分離的摩爾收率＞60％，一般純度＞90A％；含1-4A％的天冬氨酸差向非對映異構體。
用乙酸乙酯形成漿液，由此可得到最終收率約為60％的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2並將純度提高到＞99A％，同時將非對映異構體降低至＜0.5％。
作為五氟苯酚-DCC複合物法的一個具體例子，當進行實施例B的一般方法並使用10g(24.5mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH時，則製得的BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的量為8.15g(純度99A％，0.49A非對映異構體)，59％理論收率。方法C羥基苯並三唑(HOBT)/2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)法將1當量BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH溶於DMF(9-10體積，1∶10重量∶重量)並保持在室溫。向該溶液中加入H2N-(L)-Cha-NH2(1當量)和羥基苯並三唑(HOBT，1當量)。將得到的溶液冷卻至約0℃-10℃，然加入NMM(1-1.1當量)。將偶聯劑TBTU(1-1.1當量)溶於DMF(4-5體積，1∶5重量∶重量)並於0℃至約10℃下加入到保護的二肽溶液中。將該溶液於約10℃-25℃攪拌約3小時，直至HPLC分析表明反應完成(原料的面積小於2％)。將反應混合物加入到攪拌中的5％氯化鈉水溶液(約為反應液體積的4倍)和乙酸乙酯(約為反應液體積的2倍)的混合物中。分液，將水相用另外的乙酸乙酯(約為反應液體積的1.5倍)萃取。合併有機相，依次用0.5N檸檬酸水溶液(約為有機相體積的0.6-0.7倍)、10％碳酸氫鈉水溶液(兩次，每次均約為有機相體積的0.6-0.7倍)和25％氯化鈉水溶液(約為有機相體積的0.3-0.4倍)洗滌。將得到的有機相在約30-50℃下減壓濃縮至約1/4至1/2體積，然後向該溫熱的溶液中加入同體積的庚烷。將混合物攪拌並冷卻至約0℃至約20℃以析出所需三肽的沉澱。濾出固體，用乙酸乙酯和庚烷的混合物洗滌，乾燥。一般收率＞60％，一般純度＞95.7A％；天冬氨酸差向非對映異構體的含量＜2A％。
作為HOBT/TBTU法的一個具體例子，當按照該一般方法進行時，使用10g(24.5mmol)BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH，製得9.3gBOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(純度96.1A％，1.77A％Asp的非對映異構體)，67.7％理論收率。質譜M計算值560.7；M+1觀測值561mp 182.17(DSC)1H NMR(δ vs TMS，D6 DMSO)0.89 m(1H)；0.94，m(1H)；1.0，dt(2H)；1.15，m(2H)；1.06-1.3,m(4H)；1.36，d(9H)；1.4-1.74，m(6H)；2.65，m(1H)；2.85，m(1H)；3.18.m(2H)；3.75，d(2H)；4.2，s(1H)；4.66，d(1H)；5.08，s(2H)；7.02，s(1H)；7.18，d(1H)；7.36，s(5H)；7.88，dd(1H)；8.24，dd(1H)。實施例3 TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的製備(反應路線II的步驟3)將BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2溶於二氯甲烷(約1∶12w/w)，然後於室溫下向該溶液中加入TFA。將其攪拌至HPLC表明反應完成(3-5小時)。將溶液於40-45℃濃縮至約1/2體積。向該溫熱的溶液中加入MTBE(相對於BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2約1∶10w/w)，同時保持溫度＞40℃。將該混合物緩慢冷卻至約5℃並攪拌1小時以確保完全結晶。將生成的固體過濾，用冷的MTBE洗滌。將固體減壓乾燥並分析TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的含量(HPLC w/w分析)。收率通常接近定量，純度＞95A％。質譜M計算值460(游離鹼)；M+1觀測值461元素分析C26H37N4O7F3H，N，F，C 54.35，實測值53.821H NMR(δ vs TMS，D6DMSO)0.9，m(2H)；1.15，1(6H)；1.5，m(1H)；1.5-1.8，m(6H)；2.65 dd(1H)；2.9 m(3H)；3.7，s，(2H)；3.9，m(2H)；4.2，m(1H)；4.75，m(1H)；5.1，s(2H)；7.0，s(1H)；7.15，s(1H)；7.2，s(5H)；8.13，d(1H)；8.7-8.8，m(3H)。13C NMR(顯著信號，δvs TMS，D6 DMSO)10.76，25.49，25.68，25.96，31.66，33.07，33.36，36.25，38.59，41.88，47.02，49.40，50.47，65.71，127.81-128.34，135.82，165.10，169.34，173.79脫保護的具體例子如表A所示。
表A
實施例4 CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的製備(反應路線II的步驟4)製備約等摩爾量的TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2、CBZ-PipBu和TBTU在乙酸乙酯、DMF和水(100∶8∶4v/v；相對於TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2約11∶1總體積/重量)中的懸浮液。將該懸浮液冷卻至0-10℃並加入約3-4當量的NMM。將該混合物升溫至室溫並攪拌至HPLC表明反應完成(1-3小時，在此期間內形成溶液)。加入水(最初加入水量的2-3倍)並分液。保留水相，將有機相用水洗滌兩次。將合併的含水洗滌液用乙酸乙酯萃取，將合併的有機相用25％氯化鈉水溶液洗滌。將有機相減壓濃縮至約1/2體積，加入MTBE(相對於溶液體積，約1/2v/v)。使混合物結晶(數小時)，過濾收集固體，用冷的乙酸乙酯和MTBE的混合物衝洗。將固體減壓乾燥。通過HPLC w/w分析確定CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的含量。收率通常＞80％，純度＞95A％。
作為上述製備方法的具體實例，當按照該一般方法進行時，使用7.25g(24.5mmol)TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，製得7.9g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(純度＞99A％，0.08A％ Asp的非對映異構體)，84％理論收率。元素分析C41H57N5O8H，N，C，65.84，實測值，65.38質譜M計算值747；M＋1觀測值748mp 101.6(DSC)1H NMR(δvs TMS，CDCl3)0.88m(1H)；0.98，m(1H)；1.13(2H)；1.23，m(6H)；1.4，m(1H)；1.62-1.76，m(8H)；1.86，qd(1H)；2.35，t(1H)；2.74，dd(2H)；3.25，dd(1H)；3.47，q(2H)；3.7，d(1H)；3.84，d(1H)；4.15，ds(2H)；4.5，qd(1H)；4.68，dt(1H)；5.07，d(1H)；5.14 bd(2H)；5.16，d(1H)；7.28-7.39，m(10H)；7.57，dd(1H)13C NMR(相對於TMS的δ，CDCl3)[顯著峰]66.93(兩個苄基碳)，127.78-128.64(兩個苯環)，155.249，170.00，170.24，171.69，174.27，175.21(所有的羰基碳)。實施例5 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式的製備(反應路線II的步驟5)製備CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2、甲酸銨和10％Pd/C在20∶1醇/水(相對於CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2，10∶1體積/重量)中的混合物。將該混合物加熱至40-50℃，然後攪拌至HPLC表明反應完成(1-2小時)。將該混合物冷卻至室溫並濾除催化劑。將得到的溶液加熱至40-50℃並加入丙酮(約於濾液等體積)，使溶液冷卻至35-40℃。向混合物加入N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的晶種，在冷卻至室溫時結晶出N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式(數小時)。在氮氣氛下過濾收集固體，用丙酮衝洗。將固體減壓乾燥並分析N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶的含量(HPLC w/w分析)。收率通常＞85％，純度＞95A％。
作為上述製備方法的具體實例，當按照步驟5的一般方法進行時，使用5g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2製得了3.1g白色固體狀的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式(純度99.6A％)，化學計量收率的89.4％。
根據上述實施例1-5，使用適宜的原料製得了如下化合物N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]纈氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-D-纈氨酸，N-[N-[N-(3-(哌啶-4-基)丙醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]纈氨酸，N-[N-[N-(5-(哌啶-4-基)戊醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]纈氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-α-環己基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]正亮氨酸，
N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-α-(2，2-二甲基)丙-3-基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-β-十氫萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-α-(2-環己基乙基)甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]苯丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-β-萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-β-萘-2-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-β-環己基丙氨酸，乙酯N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-L-β-順-十氫萘-2-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-α-氨基環己烷甲酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環己基-D-丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-十氫萘-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環己基丙氨酸-N-乙基醯胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環辛基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環己基甲基丙氨醯胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-金剛烷-1-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-(1，2，3，4)-四氫萘-5-基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-(4-環己基)環己基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環庚基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環辛基丙氨醯胺，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]--環己基丙基甘氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環辛基甲基丙氨酸，N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環戊基丙氨酸，和N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]天冬氨醯]-β-環己基甲基丙氨酸乙酯。實施例6 4-N-CBZ-哌啶酮的製備將40Kg N-苄氧羰氧基琥珀醯亞胺和26Kg(175mol)4-哌啶酮·HCl·H2O在38.8Kg水和88Kg THF中的混合物在15℃±5℃下攪拌直至溶解(約15分鐘)。向攪拌的混合物中加入NMM(22.8Kg)(放熱)，同時將溫度保持在20℃或20℃以下。將其在20℃±5℃下攪拌2.5小時，此刻的HPLC表明反應完成。將混合物用115.2Kg MTBE和38.8Kg水稀釋並在20℃±5℃下攪拌5分鐘。停止攪拌，分層，分出水層(下層)並棄除。將有機層用2×129.6Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除水相[下層])。將有機層用5.2Kg氯化鈉的46.8Kg水溶液洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除水相[下層])。將有機層用11.5Kg硫酸鎂處理，攪拌1小時，然後將混合物過濾。將反應器用8Kg MTBE衝洗(過濾，與主濾液合併；總濾液水的含量0.52％)。於30℃下減壓蒸餾將混合物的體積減少-半。向真空中充入氮氣並將殘餘物冷卻至20℃(殘餘物中水的含量0.43％)。將殘餘物用57.6Kg MTBE稀釋，然後通過30℃下減壓蒸餾再次將混合物的體積減少一半。向真空中充入氮氣並將殘餘物冷卻至20℃(殘餘物中水的含量0.25％)。如此重複5次。將最終的殘餘物用28.8KgMTBE稀釋並攪拌5分鐘，然後分析水含量和4-N-CBZ-哌啶酮的含量(水0.05％，4-N-CBZ-哌啶酮w/w分析22.66重量％，35.36kg，155mol，88.6％化學計量收率)。實施例7 PipBu的製備在氮氣流下及攪拌下，製備53.5Kg 3-羧基丙基三苯基溴化鏻在230.1Kg 1，2-二甲氧基乙烷中的溶液。於35分鐘內加入叔丁醇鉀/THF(20重量％，141.8Kg溶液)，同時將溫度保持在24-28℃。將混合物於該溫度下攪拌0.5小時，此刻的HPLC表明反應完成。將攪拌下的混合物冷卻至10℃±2℃，然後於40分鐘內向該混合物中加入96.45Kg(滴定度1.15摩爾當量)4-CBZ-哌啶酮的MTBE溶液，將反應液的溫度保持在12℃±2℃。將混合物在該溫度下攪拌10分鐘，然後加熱至20℃±2℃並將該溫度下攪拌2小時。向攪拌的混合物中加入22.5Kg濃鹽酸在245.6Kg水中的溶液，同時將溫度保持在20℃±2℃；最終的pH為0.5。將混合物在攪拌下用214.0Kg甲基叔丁基醚萃取。停止攪拌，分液，棄除水層(下層)。將有機相用133.75Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除水[下]層)，然後用10.7Kg50％氫氧化鈉的126.8Kg水溶液洗滌(攪拌10分鐘，分液，分離並棄除有機[上]層)。將水層用2×123.05Kg乙酸乙酯萃取(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除有機[上]層)。向攪拌的水溶液加入13.1Kg濃鹽酸至pH 2.5-3.5(最終2.82)。然後將混合物用123.05Kg乙酸乙酯萃取(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除水[下]層)。將乙酸乙酯溶液用133.75Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，分離並棄除水[下]層)，然後分析(w/w)CBZ-PipBuen的含量(總重量194.86kg，17.05％CBZ-PipBuen[33.22kg，108mol]，87.9％化學計量收率)。
將PipBuen的乙酸乙酯溶液與6.6Kg 5％Pd/C(50％水，重量％)-起在攪拌下加入到不鏽鋼壓力箱內，然後將該混合物加熱至55℃±2℃。加入溶於66.4Kg水的甲酸鉀(38.2Kg)，同時將反應混合物的溫度保持在55℃±2℃(約30分鐘)。將該混合物在55℃±2℃攪拌2小時，此刻反應結束(HPLC)。向反應器中加入6.6Kg硅藻土和33.2Kg水，將混合物攪拌，然後過濾。將反應器用33.2Kg水衝洗(過濾，加入到主濾液中)。將濾液置於新的容器中，冷卻至20-25℃，分液，棄除有機層。將水層用52.1Kg濃鹽酸酸化至pH 2-3(最終2.82)，然後用4×129.5Kg二氯甲烷萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除有機[下]層)。攪拌下加入17.85Kg 50％氫氧化鈉水溶液將水相調至pH 6.1。將混合物過濾得到224Kg含有17.6Kg(103mol)4-(3』-羧基丙基)哌啶的溶液。實施例8 CBZ-PipBu的製備將4-(3』-羧基丙基)哌啶在氫氧化鈉水溶液中的224Kg溶液與55.3Kg THF混合，然後將該混合物於攪拌下冷卻至8℃±2℃。加入NMM(20.9Kg)，同時保持溫度＜10℃。加料結束後，將溫度調至8℃±2℃，然後在1小時內加入溶於49.8Kg THF的25.7Kg 1-(苄氧羰基)琥珀醯亞胺，同時將溫度保持在＜15℃。10-15℃下3小時後反應結束(分析HPLC)。加入濃鹽酸(29.9Kg)將pH調至2.5-3.5(最終3.3)，然後加入61.4Kg MTBE並將該混合物攪拌5分鐘。停止攪拌，分液，分出水(下)層(棄除)。將MTBE層用3×83.1Kg水洗滌(分別攪拌10分鐘、5分鐘和5分鐘)；每次均分出水層並棄除。在不攪拌的條件下，加入8.3Kg 50％氫氧化鈉在95.7Kg水中的溶液，加料結束後，將混合物攪拌約5分鐘。停止攪拌，分液，分出有機(上)層並棄除。將水層倒回反應器中，用2×38.4Kg甲基叔丁基醚萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除有機[上]層)。用18.5Kg甲基叔丁基醚重複該操作。將水層倒回反應器中，用9.9Kg濃鹽酸酸化至pH2.5-3.5(最終3.37)。將混合物用76.4Kg甲基叔丁基醚萃取(攪拌5分鐘，分液，棄除下[水]層)。將有機層用1.1Kg碳酸氫鈉在12.4Kg水中的溶液洗滌(攪拌5分鐘，分液，棄除水[下]層)，然後用41.5Kg水洗滌(攪拌5分鐘，分液，棄除水[下]層)。將反應器置於減壓條件下並於55℃蒸除揮發性溶劑直至不再有餾出液流出。加入甲苯(32.4Kg)，將混合物常壓下蒸餾直至不再有餾出液流出，此刻的浴溫升至90-95℃。然後將混合物冷卻至30-35℃，向反應器中加入庚烷(56.85Kg)(兩相)，將混合物加熱至90-95℃(一相)，然後再次冷卻至38-42℃。加入CBZ-PipBu晶種，產物在1小時內從混合物中析出結晶。過濾收集固體，依次用19.35Kg 1∶2甲苯/庚烷和33.4Kg庚烷洗滌。將濾餅於40℃下真空乾燥(乾燥分析中有0.13％的損失)得到22.4Kg(72.96mol，以4-哌啶酮計，42％化學計量收率)CBZ-PipBu。實施例9 CBZ-PipBuen的製備14℃下，向82g 3-羧基丙基三苯基溴化鏻的407mL 1，2-二乙氧基乙烷懸浮液中於25分鐘內加入220g 20％(重量)叔丁醇鉀的四氫呋喃溶液，同時保持反應混合物的溫度在24-28℃。將混合物攪拌1小時，冷卻至10℃，然後在冷卻下於30分鐘內加入52.5g 4-N-CBZ-哌啶酮的246mL甲基叔丁基醚溶液。加料結束後，將混合物於12℃攪拌10分鐘，然後升溫至20℃並攪拌30分鐘。將反應混合物用410mLlN鹽酸處理10分鐘，用328mL甲基叔丁基醚稀釋，然後分液。將有機相用205mL水洗滌，然後用210mL1N氫氧化鈉水溶液洗滌。分出含有產物的氫氧化鈉層，用3×189g乙酸乙酯洗滌，用濃鹽酸酸化至pH 3.48，然後用189mL乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯層，用211mL水洗滌，然後用10g硫酸鎂乾燥30分鐘，過濾，真空濃縮。將油狀殘餘物(50.7g)用甲苯/庚烷結晶得到29.46g CBZ-PipBuen(50.9％收率，約95A％純)。質譜M計算值303，M＋1觀測值3041H NMR(δvs TMS，CDCl3)2.2，t(2H)；2.25，t(2H)；2.35，m(4H)；3.45，m(4H)，5.15，s(2H)；5.2，m(1H)；7.33，2(5H)。13C NMR(δvs TMS，CDCl3)22.43，28.2，34.26，35.66，44.88，45.74，67.20，122.02，127.83，127.95，128.45，128.69，128.90，136.17，136.72，155.34，178.39實施例10 CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的製備(反應路線II的另一種步驟4)將CBZ-PipBuen(70g，0.23mol)和DMF(230mL)加入到1升帶夾套的燒瓶中，攪拌下冷卻至0℃，然後立即加入TBTU(74.9g，0.23mmol)。將溫度保持在0℃，開始加入DIPEA(61.9g，0.61mol)。45分鐘後，加入TFA·N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(138.7g，0.24mol)的DMF(230mL)溶液。加入DIPEA(45mL)將pH調至7-8並將混合物升溫至室溫。2小時後，反應結束(HPLC分析)。在水(2.5升)中終止反應並用乙酸乙酯(1升)萃取。將水相用乙酸乙酯(0.3升)萃取。合併有機層，依次用檸檬酸水溶液(5％w/w，2×1升)、碳酸氫鈉水溶液(5％w/w，2×1升)和水(2升)洗滌。將乙酸乙酯層轉移至2升燒瓶中，於攪拌下加入庚烷(500mL)以引發結晶。在Buchner漏鬥上抽濾收集固體，用乙酸乙酯/庚烷(2∶1 v/v，1升)洗滌並乾燥至恆重得到CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(143.2g，0.19mol，83％收率)。元素分析C41H55N5O7C計算值66.02實測值65.53，H，N。質譜M計算值745.91；M＋1觀測值7461H NMR(δvs TMS，CDCl3)0.86qd(1H)；0.98，qd(1H)；1.16，t(2H)，1.24，dt(6H)；1.37，m(1H)；1.64-1.78，m(4H)；1.86，qd(1H)；2.2bd(4H)；2.35，m(1H)；2.4，m(2H)；2.74，dd(1H)；3.07，m(4H)；3.52，d，(1H)；3.85，d(1H)；4.12，q(1H)；4.49，qd(1H)；4.68，dt(1H)；5.07，d(1H)；5.14，s(1H)；5.16，d(1H)；5.22，t(2H)；6.45，s(1H)；7.28，d(1H)；7.26，s(5H)；7.35，s(5H)；7.56，d(1H)13C NMR(δvs TMS，CDCl3)14.15，22.68，24.95，25.61，26.03，26.45，28.20，31.71，32.89，33.80，33.89，34.00，35.63，38.37，44.79，45.13，45.65，50.23，51.34，60.40，66.87，67.06，76.50，77.13，77.77，122.46，126.88，127.80-128.60，135.15，155.19，170.11，170.20，171.61，173.76，175.35.實施例11 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式的製備(反應路線II的另一種步驟5)將CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2(140g，0.19mol)、甲酸銨(61g，0.96mol)和10％Pd/C(含50％水，degussa型，28g)加入到5升帶夾套的燒瓶中。加入乙醇(200標準強度，1260mL)、異丙醇(70mL)和水(去離子水，70g)。將混合物加熱至40-50℃，攪拌至HPLC表明反應結束(5小時)。將混合物冷卻至升溫，濾除催化劑。將得到的溶液加熱至40-50℃並加入丙酮(約與濾液等體積)，將溶液冷卻至35-40℃。向混合物中加入N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的晶種，在冷卻至室溫的同時(數小時)，從其中析出N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼形式的結晶。在氮氣氛下，用Buchner漏鬥抽濾收集固體，將濾餅用丙酮洗滌並晾乾至恆重得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺(84.3g，0.16mol，84.8％收率，＞95A％)。實施例12 TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的連鎖製備(反應路線II的另一種步驟1-3)向裝有溫度計的500mL燒瓶中加入BOC-N(Et)Gly(20.3g，0.1mol)、N-羥基琥珀醯亞胺(11.5g，0.1mol)和二氯甲烷(200mL)。將混合物以適當的速度攪拌並向形成的溶液中一次性加入DCC(20.6g，0.1mol)固體。將該溶液攪拌1小時，在此期間內觀察到輕微的放熱(溫度從20℃升至28℃)和DCU沉澱。將形成的懸浮液用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏鬥真空過濾。將濾餅用二氯甲烷(2×25mL)洗滌。將濾液倒回最初的500mL燒瓶內，然後依次加入(L)Asp(OBzl)(22.3g，0.1mol)、NMM(33.8ml，0.3mol)和DMF(80g，1.01mol)。室溫攪拌2小時後，形成BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)的反應結束(HPLC監測)。將反應混合物倒入含有冰水(100mL)的萃取漏鬥中。將混合物用鹽酸(36％，25mL)酸化至pH 1.分層，將二氯甲烷層用冰水(100mL)洗滌並分液(水相pH 3-4)。將二氯甲烷層倒回最初的500mL燒瓶內，然後依次以固體形式一次性加入NH2-(L)-Cha-NH2(17g，0.1mol)、N-羥基琥珀醯亞胺(11.5g，0.1mol)和DCC(20.6g，0.1mol)。室溫攪拌2小時後，形成BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的反應結束(HPLC監測)，用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏鬥真空濾除DCU。將濾餅用二氯甲烷(2×25mL)洗滌。將濾液轉移到萃取漏鬥中並用含有N-甲基嗎啉(15mL，pH 8-9)的去離子水(200mL)洗滌。分液並將二氯甲烷層再次用水(去離子水，2×150mL)洗滌。將二氯甲烷層用150mLlN鹽酸洗滌(pH 1)洗滌。分液並將二氯甲烷層用去離子水洗滌(200mL，pH3)。將BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2的二氯甲烷溶液倒回乾淨的500mL燒瓶中，然後加入TFA(100mL)。室溫攪拌2小時後，形成TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2的反應結束(HPLC監測)。將反應混合物真空蒸餾除去二氯甲烷和大部分TFA，然後加入MTBE(500mL)和晶種以引發產物結晶。將混合物用裝有1號Whatman濾紙的Buchner漏鬥真空過濾。將濾餅用MTBE(2×25mL)洗滌並晾乾得到白色固體狀TFA·HN(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-(L)-Cha-NH2(46.8g，81.5％收率)(＞97A％純，＜0.2A％D-Asp非對映異構體)。實施例13 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的穩定的不吸溼結晶形式的製備方法A靜態轉變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式(7.45Kg)用錘式磨研磨。將得到的7.35Kg固體置於不鏽鋼乾燥器託盤內(90×28cm)並將該託盤用穿孔的鋁箔覆蓋。然後將託盤密封在溼度烘箱內(LUNAIRE Humidity Cabinet CEO 941W-3型)；除了取樣用於分析外，將烘箱在整個形式轉變過程中保持密封。將烘箱調至40％RH和60℃並在該水平保持1小時。然後將溼度烘箱調至80％RH/60℃並在該水平保持12小時。在80％RH/60℃下18小時後，取樣並通過X-射線粉末衍射分析進行檢測，以分析向N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式的轉變。將溼度烘箱再次密封並調至40％RH/60℃，保持2小時。將烘箱調至周圍環境條件，然後從烘箱中取出託盤得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式(7.2Kg，96.6％收率)。通過X-射線粉末衍射圖(圖1)證實轉變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內距離(d)、每秒計數(Cps)和相對峰強度(％)按衍射角(2θ)增加的順序製成表(表1)。表1-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.06517.4314 86.00 5.822 6.32313.9672 248.0016.783 7.51811.7489 221.0014.954 8.16310.8222 496.0033.565 8.78010.0633 155.0010.496 10.383 8.5125218.0014.757 11.351 7.7886112.007.588 12.596 7.0218999.0067.599 13.858 6.3852316.0021.381015.191 5.82741338.00 90.531116.476 5.3759481.0032.541216.745 5.2901556.0037.621317.980 4.9294679.0045.951418.572 4.77351079.00 73.001518.799 4.71651230.00 83.221619.147 4.63151229.00 83.151719.619 4.52111380.00 93.371820.200 4.39241246.00 84.301920.466 4.33601478.00 100.002020.870 4.25281088.00 73.612121.625 4.1061584.0039.512222.088 4.0210891.0060.282322.840 3.8903613.0041.472423.947 3.7129597.0040.392524.569 3.6203680.0046.012625.608 3.4757506.0034.242727.015 3.29781100.00 74.422827.837 3.2022420.0028.422927.967 3.1877400.0027.063029.255 3.0502536.0036.273129.689 3.0066603.0040.803230.665 2.9130518.0035.053331.318 2.8538451.0030.513431.894 2.8036533.0036.063533.370 2.6829518.0035.053633.562 2.6679552.0037.353733.919 2.6407581.0039.313834.840 2.5730561.0037.963935.789 2.5069559.0037.824035.940 2.4967560.0037.894136.780 2.4416740.0050.074237.042 2.4249736.0049.804337.959 2.3684683.0046.214439.017 2.3066643.0043.50方法B動態轉變a.形式轉變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式(50g)置於位於環狀支架上的帶有機械攪拌器的400mL量筒內(高度6cm)。將該裝置置於溫度控制烘箱(LUNAIRE Humidity Cabinet CEO 941W-3型)內。將攪拌設置在275rpm，將溫度和RH在30分鐘內分別調至60℃和40％。將化合物在該條件下保持1小時，然後將條件在45分鐘內改變至80％RH/60℃。將化合物在該條件下保持16小時，然後將烘箱重新設置為40％RH/60℃並保持3.25小時。然後將化合物恢復至周圍環境條件(床高4cm)，從量筒內取出得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式(收率＞95％)。通過X-射線粉末衍射分析(圖2)證實轉變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內距離(d)、每秒計數(Cps)和相對峰強度(％)按衍射角(2θ)增加的順序製成表(表2)。表2-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---15.186 17.0268 196.008.4326.371 13.8615 722.0031.0737.570 11.6689 516.0022.2048.232 10.7323 1094.00 47.0758.817 10.0206 257.0011.06610.4288.4761365.0015.71711.3777.7714129.005.55811.6007.6223117.005.55912.6676.98281805.00 77.6710 13.9136.3599551.0023.7111 14.3986.1468178.007.6612 15.2265.844 2285.00 98.3213 16.5385.3557861.0037.0514 16.7735.2814929.0039.9715 18.0194.91901132.00 48.7116 18.6724.74831871.00 80.5117 18.8154.71252052.00 88.3018 19.2044.61782071.00 89.111919.6544.51322226.0095.782020.2374.38451939.0083.432120.5234.32402324.00100.002220.9344.24001656.0071.262321.6914.0938923.00 39.722422.1434.01121411.0060.712522.9103.8786994.00 42.772624.0073.7037964.00 41.482724.6423.6097991.00 42.642825.6423.6097991.00 42.642927.0703.29131687.0072.593(27.8553.2002688.00 29.603129.4973.0258843.00 36.273229.4973.0013878.00 37.783330.7512.9051809.00 34.813431.9162.8017821.00 35.333533.9822.6360882.00 37.953635.2002.5475865.00 37.223736.0012.4926841.00 36.193836.9272.43221106.0047.593938.3892.3429968.00 41.65b.形式轉變將N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式(370g)加入到2L旋轉蒸發儀燒瓶內。將該燒瓶置於旋轉蒸發儀(Heidolph UV2002)上並降至預先加熱(58℃)的水浴(Heidolph MR 2002)中。用真空泵(Divatrion DV1)將該裝置置於60毫巴的真空下，然後以控制的方式通入在另一個加熱的含水燒瓶內產生的潮溼空氣打破真空。通過溼度控制裝置(Vausalo Humiditique and TemperatureTraumettor)控制溫空氣的通入，以便在裝置內得到79％的RH(130-180毫巴的內壓)。然後將旋轉蒸發儀以145-160轉/分鐘旋轉5小時，同時將加熱浴保持在約60℃並將容器內的RH保持在71-79％。然後用氮氣打破真空，將容器及其內容物冷卻至室溫，取出產物得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式。將第2批317g N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環已基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式按照同樣方式進行處理得到N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式。通過X-射線粉末衍射分析(圖3)證實轉變。兩次共得到667g N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的不吸溼結晶形式(97％總收率)。通過X-射線粉末衍射分析(圖3)證實轉變。還將X-射線粉末衍射以用單位埃(A)表示的晶體平面內距離(d)、每秒計數(Cps)和相對峰強度(％)按衍射角(2θ)增加的順序製成表(表3)。表3-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.12417.2309 180.0010.172 6.32813.9565 408.0023.053 7.57411.6623 305.0017.234 8.19110.7851 556.0031.415 8.79710.0432 166.009.386 10.398 8.5004244.0013.797 12.628 7.00401198.00 67.688 13.871 6.3791353.0019.949 15.218 5.81721543.00 87.181015.723 5.6317187.0010.561116.538 5.3558589.0033.281216.751 5.2882621.0035.081318.024 4.9175869.0049.101418.640 4.75631156.00 65.311518.809 4.71411241.00 70.111619.191 4.62101521.00 85.931719.659 4.51201413.00 79.831820.865 4.40641303.00 73.621921.495 4.32991770.00 100.002020.865 4.25391120.00 63.282121.616 4.1077683.0038.592222.113 4.0166919.0051.922322.950 3.8719697.0039.382424.117 3.6871659.0037.232524.618 3.6132716.0040.452625.644 3.4709662.0037.402726.297 3.3862486.0027.462827.052 3.29341270.00 71.752927.960 3.1885518.0029.273029.640 3.0115705.100 39.383130.744 2.9058695.0039.273233.465 2.6755697.0039.383333.840 2.6467764.0043.163435.812 2.5053736.0041.583536.811 2.4396858.0048.473637.076 2.4228919.0051.923738.185 2.3549870 49.153839.622 2.2728882.0049.83實施例14 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶形式及其轉變的不吸溼結晶形式的樣品的X-射線粉末衍射圖取實施例5或11製得的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性結晶樣品，及其按照實施例13的方法轉變的相應不吸溼的結晶形式的樣品。吸溼性結晶形式和不吸溼結晶形式的X-射線粉末衍射圖分別如圖4和5所示。還將吸溼性結晶形式和不吸溼結晶形式的X-射線粉末衍射以對用單位埃(A)表示的晶體平面內距離(d)、每秒計數(Cps)和相對峰強度(％)按衍射角(2θ)增加的順序製成表(分別參見表4和表5)。表4-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.073 17.4037 1487.00 86.502 6.451 13.6905 447.0026.003 7.837 11.2712 411.0023.914 8.491 10.4049 602.0035.025 9.699 9.111993.00 5.416 10.4888.4278421.0024.497 11.5707.642392.00 5.358 12.5507.0474411.0023.919 13.5766.5168760.0044.211015.3275.7763606.0035.251115.7905.6080456.0026.531216.1795.4739346.0020.131316.7705.2824938.0054.571417.0855.1856685.0039.851517.7504.9927924.0053.751618.1514.8835741.0043.111718.5044.7909593.0034.501819.3234.5897930.0054.101919.7144.4996792.0046.072020.5454.31941719.00 100.002121.3884.1510897.0052.182222.3813.9691373.0021.702322.8703.8852258.0015.012423.6403.7604563.0032.752523.8413.7292680.0039.562624.0483.6976623.0036.242724.7463.5949338.0019.662825.2003.5311366.0021.292925.7923.4513590.0034.323026.2663.3901731.0042.523126.9593.3045555.0032.293227.4263.2494769.0044.743327.9673.1876528.0030.723429.0203.0744771.0044.853529.9222.9837491.0028.563630.9702.8851384.0022.343731.5522.8332510.0029.673833.3382.6854627.0036.473934.8382.5731520.0030.254035.8732.5012653.0037.994136.1072.4855639.0037.174237.1622.4174683.0039.734338.5092.3359775.0045.084439.7012.2684784.0045.61表5-N- 2θ ---d--- ---Cps--- ---％---1 5.152 17.1371 123.007.342 6.386 13.8287 483.0028.843 7.580 11.6540 389.0023.224 8.225 10.7410 752.0044.905 8.801 10.0390 180.0010.756 10.4088.4928276.0016.487 12.6606.98631399.00 83.528 13.9146.3594391.0023.349 15.2515.80471675.00 100.001016.5415.3548608.0036.301116.7715.2818652.0038.931218.0474.9112775.0046.271318.6764.74721078.00 64.361418.9024.69101099.00 65.611519.1824.62311151.00 68.721619.6974.50351164.00 69.491720.2404.38381049.00 62.631820.5684.31471403.00 83.761929.9334.24031024.00 61.1 32021.6844.0951569.0033.972122.1224.0150746.0044.542222.9703.8685564.0033.672324.0803.6927546.0032.602424.2183.6720556.0033.192524.6943.6023618.0036.902625.6803.4662510.0030.452726.4003.3732403.0024.062827.1053.28711093.00 65.252927.9293.1920450.0026.873029.3603.0395555.0033.133129.7243.0031595.0035.523230.3402.9435429.0025.613330.6932.9105552.0032.963431.3532.8507476.0028.423531.8222.8098531.0031.703632.0062.7940545.0032.543732.8852.7213485.0028.963833.5082.6722547.0032.663934.0402.6316606.0036.1 84034.8392.57305 80.00 34.634135.9982.4928596.0035.584236.6802.4480629.0037.554336.9482.4309727.0043.404437.1972.4152703.0041.974539.6022.2739697.0041.61實施例15 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性和不吸溼的結晶形式的等溫微量量熱實驗用ThermometricThermal Activity Monitor(TAM)對N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性和不吸溼的結晶形式進行等溫微量量熱實驗。通過將不同的結晶形式在不同溫度下暴露於不同的溼度或溶劑蒸氣中來研究所述結晶形式的固態轉變。使用如下鹽溶液來形成不同的溼度KCl(80％RH)，NaCl(75％RH)和NaBr(65％RH)。稱取約100mg各種結晶形式的化合物置於TAM玻璃安瓿內並將含有飽和鹽溶液(含有過量的固體)或有機溶劑的微恆溼器置於安瓿內。將安瓿密封，使其與環境溫度平衡，然後降至TAM的測量位置。將用洗滌過的海沙代替了待測試樣品的相同系統置於參考側。測定輸出功率(μW)隨時間的變化(圖6-8)。實施例16 N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性和不吸溼的結晶形式的吸溼等溫線在VTI MB300G溼度天平上測定N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯]-(L)-β-環己基丙氨醯胺的吸溼性和不吸溼的結晶形式的吸溼等溫線。實驗可按照兩種方式進行，一種是對約15mg的待測結晶形式進行增加和降低％RH的步驟並測定(在每一平衡步驟)重量增加隨％RH的變化(圖9)，另一種是將待測結晶形式置於恆定的溼度下並測定重量增加隨時間的變化。
式II化合物顯示出有價值的藥理活性，因此可摻入藥物組合物中並用於對患有特定疾病的患者進行治療。
本發明還涉及對患有可通過施用血小板凝集抑制劑通過抑制纖維蛋白原與激活的血小板和血小板凝集和血液凝固中涉及的其它粘著糖蛋白結合而得到緩解或預防之疾病的患者進行治療的方法。此外，本發明還涉及用於在人和其它哺乳動物中預防或治療與心肌梗塞、中風、外周動脈疾病和彌散性血管內凝血等疾病有關的血栓形成的方法。
本文所指的治療應理解為包括預防性治療以及對已確定的疾病進行治療。
本發明還包括含有藥物可接受量的至少一種式I化合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
實踐中，用於治療的本發明化合物或組合物可以通過任何適宜的方式，例如局部、吸入、胃腸外、直腸或口服給藥，但優選通過口服給藥。
式II化合物可以以允許通過最佳途徑進行給藥的形式提供，並且本發明還涉及適用於人或獸醫的含有至少一種本發明化合物的藥物合物。這些組合物可以根據常規方法，用一種或多種可藥用輔劑或賦形劑製得。所述輔劑包括，稀釋劑、無菌含水介質和各種無毒的有機溶劑。所述組合物可以呈片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、粉劑、水溶液或混懸液、可注射溶液、酏劑、糖漿等形式，並且可以含有一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑、穩定劑或防腐劑的試劑以得到可藥用的製劑。
對於載體以及載體中活性成分含量的選擇通常根據產物的溶解度和化學性質、具體的給藥方式和藥物實踐中需要注意的條件來決定。例如，可將賦形劑如乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鈣和崩解劑如澱粉、藻酸和某些複合矽膠及潤滑劑如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石用於製備片劑。為了製備膠囊，優選使用乳糖和高分子量的聚乙二醇。當使用含水混懸液時，其可含有乳化劑或有助於懸浮的試劑。還可使用稀釋劑如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或它們的組合。
為了進行胃腸外給藥，可以使用本發明化合物在植物油如蓖麻油、花生油或橄欖油或水-有機溶液如水和丙二醇、可注射有機酯如油酸乙酯以及可藥用鹽的無菌水溶液中的乳液、混懸液或溶液。還可用本發明產物的鹽溶液通過肌肉內或皮下注射進行給藥。水溶液，包括鹽在純淨蒸餾水中的溶液還可用於靜脈內給藥，條件是對其pH值進行了適當的調節、進行了正確地緩衝並用足夠量的葡萄糖或氯化鈉使其等滲，並且通過加熱、輻射和/或微孔過濾對其進行了滅菌。
局部給藥時，可以使用含有本發明化合物的凝膠(水或醇基質的)、霜劑或軟膏。還可將本發明化合物摻入凝膠或貼劑的基質中，從而可以透過皮膚屏障控釋化合物。
用於直腸給藥的固體組合物包括根據已知方法配製的含有至少一種式II化合物的栓劑。
本發明組合物中活性成分的百分含量可以改變，條件是其應構成適宜劑量的一定份額。顯然，可以在大概同一時間施用多個單位劑量形式。所採用的劑量可由醫生或有資格的醫務工作者確定，並取決於所需的治療效果、給藥途徑和治療的持續時間，以及患者的病情。完成本發明方法的劑量方案是，先是確保最大治療反應的劑量直至病情得到改善，然後用可以緩解病情的最低有效量。通常，口服劑量可以從約0.1mg/kg至約100mg/kg，優選從約0.1mg/kg至約20mg/kg，首選從約1mg/kg至約20mg/kg，靜脈內劑量為約0.1μg/kg至約100μg/kg，優選從約0.1mg/kg至約50mg/kg。對於各具體情況，劑量根據待治療患者的具體因素如年齡、體重、一般健康情況和可以影響本發明化合物效果的其它特點來確定。
此外，還可將式II化合物按照所需的頻率進行給藥以得到所需的治療效果。某些患者可能對較高或較低的劑量迅速反應，可能僅需非常小的維持劑量。對於其他患者，根據具體患者的生理需要，可能需要以1-4次口服劑量/天、優選每天1-2次進行長期治療。當然，對於其他患者，可能需要醫囑每天不超過一或兩次劑量。
當根據文獻中的記載進行試驗時，式II化合物顯示出顯著的藥理學活性，相信這些試驗結果與在人和其它哺乳動物中的藥理學活性相關聯。以下體外和體內藥理學試驗結果是式II化合物的特典型結果。
以下藥理學試驗評估式II化合物對於纖維蛋白原介導的血小板凝集、纖維蛋白原與凝血酶激活的血小板結合的抑制活性，以及對ADP誘導的離體血小板凝集的抑制作用，這些試驗的結果與式II化合物的體內抑制特性相關聯。
血小板凝集試驗是基於「血液」，66(4)，946-952(1985)中的描述。纖維蛋白原結合試驗是基於Ruggeri，Z.M.等，美國國家科學院院報，83，5708-5712(1986)和Plow，E.F等，美國國家科學院院報，82，8057-8061(1985)。對ADP-誘導的離體血小板凝集的抑制作用試驗是基於Zucker，「通過光電方法測定的血小板凝集」，酶學方法(Methods in Enzymology)，169，117-133(1989)。血小板凝集試驗製備固定的活化血小板用Magueie.G.A等，生物化學雜誌，254，5357-5363(1979)和Rggeri，Z.M.等，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)72，1-12(1983)所述的凝膠過濾技術，從人血小板濃縮物中分離血小板。將血小板以2×108細胞/mL的濃度懸浮在改性的無鈣Tyrode氏緩衝液中，該緩衝液含有127mM氯化鈉，2mM氯化鎂，0.42mM Na2HPO4，11.9mM NaHCO3，2.9mM KCl，5.5mM葡萄糖，pH為7.35的10mMHEPES，和0.35％人血清白蛋白(HSA)。通過加入終濃度為2單位/mL的人a-凝血酶，然後加入濃度為40μM的凝血酶抑制劑I-2581來激活這些洗滌過的血小板。向激活的血小板中加入低聚甲醛至終濃度為0.50％，然後將其在室溫保溫30分鐘。然後通過以650xg離心15分鐘來收集固定的活化血小板。用上述Tyrode氏-0.35％HSA緩衝液將血小板沉澱洗滌4次，然後用相同的緩衝液重懸至2×108細胞/mL的濃度。血小板凝集試驗將固定的活化血小板與所選劑量的待測化合物一起保溫，以檢測1分鐘的血小板凝集抑制作用以及加入終濃度為250μg/ml的人纖維蛋白原而引發的凝集作用。用血小板凝集繪圖儀PAP-4記錄血小板凝集作用。將凝集作用的抑制程度表示為不存在抑制劑的情況下所觀察到的凝集率的百分比。然後計算每種化合物的IC50，即將凝集率降低50％所需的抑制劑的量(參見例如Plow，E.F.等，美國國家科學院院報，82，8057-8061(1985))。纖維蛋白原結合試驗用Walsh，P.N.等，Br.J.Haematol.281-296(1977)所述的，Trapani-Lombardo，V.等改進的白蛋白密度梯度技術(臨床研究雜誌76，1950-1958(1985))，從血小板中洗去血漿組分。在每個實驗中，將改性的Tyrode氏緩衝液(Rggeri，Z.M.等，臨床研究雜誌，72，1-12(1983))中的血小板混合物用人a-凝血酶在22-25℃刺激10分鐘(3.125×1011血小板/升和凝血酶為0.1 NIH單位/mL)。然後將25倍過量(單位/單位)的水蛭素在加入125I-標記的纖維蛋白原和待測化合物前5分鐘加入。加入所有這些物質後，混合物中最終的血小板計數為1x1011/L。繼續在22-25℃保溫30分鐘後，通過將50μL混合物在300μL 20％蔗糖溶液中以12000xg離心4分鐘使結合的和游離的配體分離。然後將血小板沉積物與混合物的其餘部分分離以測定血小板結合的放射性。在含有過量未標記配體的混合物中測定非特異性結合。當通過Scatchard分析法對結合曲線進行分析時，利用電腦程式從結合等溫線中以擬合參數的形式得到非特異性結合(Musson.P.J.酶學方法(Methods Enzymol.)92，542-576(1983))。為了測定各化合物抑制50％纖維蛋白原與凝血酶激活的血小板結合所需的濃度(IC50)，對各化合物試驗6個或更多的濃度，125I-標記的纖維蛋白原保持在0.176μmol/L(60μg/mL)。將殘餘的纖維蛋白原結合對樣品化合物濃度的對數繪製曲線求得IC50。對ADP-誘導的離體血小板凝集的抑制實驗方法在向體重為10-20kg的雜種狗施用試驗化合物5-10分鐘之前取對照血液樣品。將化合物通過水飼管胃內給藥，或通過明膠膠囊口服給藥。給藥後，以30分鐘的間隔取血樣(5mL)3小時，然後在6、12和24小時取樣。通過靜脈穿刺頭部靜脈獲得各血液樣品並直接收集在含有3.8％檸檬酸三鈉的塑料注射器內，檸檬酸三鈉的量為每9份血液1份檸檬酸三鈉。離體犬血小板凝集將血液樣品以1000rpm離心10分鐘以得到血小板富集的血漿(PRP)。取出PRP後，將樣品以2000rpm繼續離心10分鐘得到血小板較少的血漿(PPP)。用Coulter計數器(Coulter Electronics，Hialeah，FL)對PRP中的血小板計數。如果PRP中血小板的濃度大於300000血小板/μL，則將PRP用PPP稀釋將血小板計數調整到300000血小板/μL。然後將PRP的等分液(250μL)置於石英玻璃比色杯(7.25×55mm，Bio/Data Corp.Horsham，PA)中。然後向PRP中加入腎上腺素(最終濃度為lμM)，將其於37℃保溫1分鐘。然後向PRP中以10μM的最終濃度加入血小板凝集刺激物，ADP。用光透射集合度計(Bio/Data Platelet Aggregation Profiler，PAP-4型，Bio/Data Corp.Horsham，PA)通過分光光度法監測血小板的凝集。為了測定化合物，一式兩份記錄透光率和最大透光率(最大凝集)的改變率(斜率)。以與從對照PRP得到的數據相比，斜率或最大凝集的減少百分比(平均值±SEM)報導血小板凝集數據，所述對照PRP是從在施用試驗化合物前得到的血液樣品製得的。
式II化合物在前述試驗中表現出顯著的活性，被認為可用於預防和治療與某些疾病有關的血栓形成。由離體犬血小板凝集試驗中的抗血栓形成活性可以預測到其在人中的活性(參見，例如Catalfamo，J.L.和Dodds，W.Jean，「從實驗室動物中分離血小板」，酶學方法，169，A部分，27(1989))。通過以上方法對式II化合物進行的試驗所得到的結果列於下表6中。在該表中還給出了4-4(哌啶基)丁醯基甘氨醯天冬氨醯色氨酸、即歐洲專利申請公開說明書0479481中公開的化合物的對比試驗結果。表6固定化血小板凝劑量ADP誘導的離體血小板凝集的抑制作用化合物 集的抑制作用(mg/kg)口服給藥後離體血小板凝集的％抑制作(IC50，μM) 用1h3h 6h 12h 24h實施例15 0.097 5100 100 100 9850EPA』481的化合物 0.047 553＜20本領域技術人員很容易理解，本發明可以很好地實現本發明的目的並達到所述的結果和優點。本文所述的化合物、組合物和方法是優選實施方案的代表，或是用於舉例說明，而並非想要對本發明的範圍進行限定。
權利要求
1. 化合物N-(N-叔丁氧羰基-N-乙基甘氨醯基)-(L)-天冬氨酸β-苄酯。
2. 化合物N-[N-[N-[4-[N-苄氧基羰基哌啶-4-基]丁醯基-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯基β-苄基酯]-(L)-β-環己基-丙氨醯胺。
3. 化合物4-(哌啶-4-叉)丁酸。
4. 化合物N-[N-[N-[3-[N-苄氧基羰基-4-哌啶基]亞丙基羰基]-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯基β-苄基酯]-(L)-β-環己基-丙氨醯胺。
5. 不吸溼結晶形式的N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯基]-(L)-β-環己基-丙氨醯胺化合物或其可藥用鹽。
6. 一種藥物組合物，該組合物包含權利要求1的化合物以及可藥用載體。
7. 製備不吸溼結晶形式N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯基]-(L)-β-環己基-丙氨醯胺的方法，該方法包括將吸溼性結晶形式N-[N-[N-(4-(哌啶-4-基)丁醯基)-N-乙基甘氨醯基]-(L)-天冬氨醯基]-(L)-β-環己基-丙氨醯胺在大約20℃至大約80℃下暴露在大約40％-100％相對溼度中。
8. 根據權利要求7的方法，其中所述暴露是在大約65％-大約80％相對溼度下進行。
9. 根據權利要求7的方法，其中所述暴露是在大約40℃-大約80℃下進行。
10. 根據權利要求7的方法，其中所述暴露是在靜態條件下進行。
11. 根據權利要求7的方法，其中所述暴露是在動態條件下進行。
12. 製備下式鹽化合物的方法
其中B代表烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；E1代表H；E2代表天然α-胺基酸的-碳側鏈，H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環基，取代雜環基，雜環基烷基，取代的雜環基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起形成4-、5-、6-、或7-元氮雜環烷烴環；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨立地代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基或烷基芳烷基；p代表1-4；和P1代表酸保護基，該方法包括偶聯下述兩式化合物
其中P2代表對酸不穩定的氨基保護基，形成下式第一中間體化合物
然後將下式化合物
偶聯到第一中間體化合物上，形成下式第二中間體化合物
接著用三氟乙酸除去第二中間體化合物的P2保護基，得到所要的鹽化合物。
13. 權利要求12的方法，其中P1為對氫化不穩定的酸保護基。
14. 下式化合物
其中P3代表氨基保護基；B代表烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；P1代表酸保護基；E1代表H；E2代表天然α-胺基酸的α-碳側鏈，H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環基，取代雜環基，雜環基烷基，取代的雜環基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起形成4-、5-、6-、或7-元氮雜環烷烴環；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨立地代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基，或烷基芳烷基；和p代表1-4。
15. 根據權利要求14的化合物，其中P1代表對氫化不穩定的酸保護基，且P3代表對氫化不穩定的氨基保護基。
16. 根據權利要求15的化合物，其中B代表烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基或烷基芳烷基；E1代表H；E2代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基或取代芳烷基；L代表OR1或NR1R2；R1和R2獨立地代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基或烷基芳烷基；和p代表1或2。
17. 根據權利要求16的化合物，其中B代表烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基或烷基環烷基烷基；和E2代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基或烷基環烷基烷基。
18. 根據權利要求17的化合物，其中B代表烷基；E2代表烷基，環烷基或環烷基烷基；R1和R2獨立地代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基或烷基環烷基烷基；和p代表1。
19. 根據權利要求18的化合物，其中P3代表苄氧基羰基；B代表乙基；P1代表苄基；E2代表環己基甲基；和G代表NH2。
20. 製備下式化合物的方法
其中P3代表氨基保護基；B代表烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷芳基，或烷基芳烷基；P1代表酸保護基；E1代表H；E2代表天然α-胺基酸的α-碳側鏈，H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，雜環基，取代雜環基，雜環基烷基，取代的雜環基烷基，或者E1和E2與連接E1和E2的氮和碳原子一起連接成4-、5-、6-、或7-元氮雜環烷烴環；G代表OR1或NR1R2；R1和R2獨立地代表H，烷基，環烷基，環烷基烷基，烷基環烷基，烷基環烷基烷基，芳基，芳烷基，烷基芳基，或烷基芳烷基；和p代表1-4，該方法包括使下式((哌啶-4-叉)丁酸)化合物
與下式三肽或其酸加成鹽偶聯
21. 權利要求20的方法，其中P1代表對氫化不穩定的酸保護基，且P3代表對氫化不穩定的氨基保護基。
22. 下式化合物
其中P3代表氨基保護基。
23. 根據權利要求22的化合物，其中P3代表對氫化不穩定的氨基保護基。
24. 根據權利要求23的化合物，其中P3代表苄氧基羰基。
全文摘要
本發明涉及不吸溼穩定結晶形式的抗血栓形成化合物N－[N－[N－(4－(哌啶－4－基)丁醯基)－N－乙基甘氨醯基]－(L)－天冬氨醯基]－(L)－β－環己基—丙氨醯胺、製備所述穩定晶形的方法、其藥物組合物、以及其中間體。本發明還涉及製備式(Ⅱ)化合物的方法,其中:A,B,Z,E
文檔編號A61K38/00GK1231659SQ97198210
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月21日 優先權日1996年8月21日
發明者Z·J·克贊, J·J·曼塞爾, D·託勒多－維拉絲奎諮, V·溫迪施, R·G·伍德沃德, D·C·薩拉扎, N·M·維默裡, A·J·加德託, M·R·帕沃斯, G·G·庫比克, R·C·劉, B·J·瓦納瑟, J·P·舍比恩, W·羅德裡奎茲, A·W·斯勒德斯基 申請人:羅納·布朗克羅爾藥製品有限公司