從天然原料分離和提純紫杉醇的改進方法

2023-10-17 15:53:14 2

專利名稱：從天然原料分離和提純紫杉醇的改進方法
技術領域：
本發明涉及一種從天然原料分離和提純紫杉醇的改進方法。
背景技術：
本申請人CHAICHEM PHARMACEUTICALS INTERNATIONAL的美國專利No.6,452,024及其相應的外國專利公開並要求保護以前的類型的方法，與該美國專利的前序中作為先有技術公開的所有以前的方法相比，其特別令人感興趣。更準確地說，在該美國專利中公開的方法很有意義，是因為其可以-在萃取不同種的紫杉的樹皮、針葉和/或樹枝後更容易地得到生物質(biomass)；-增加這樣得到的並且必須要通過色譜法提純的生物質的量；-減少提純的步驟；-增加得到的紫杉醇的量；和-將生產成本降低到更經濟的水平。
在該美國專利No.6,452,024中公開的方法基本上包括下述步驟a)用有機溶劑從紫杉烷的天然來源萃取含有紫杉醇的原料；b)將所述原料與鹼性或酸性介質接觸，沉澱得到生物質，分離並乾燥所述的生物質；c)通過將生物質溶於丙酮從分離和乾燥的生物質中除去樹脂和天然色素，然後向其中加入至少一種非極性溶劑(諸如己烷或庚烷)直至得到富含紫杉醇的油相。
d)將前述步驟收集的富含紫杉醇的油相與酸性介質接觸(當步驟(b)用鹼性介質進行時)或與鹼性介質接觸(當步驟(b)用酸性介質進行時)，以便通過沉澱得到沉澱物，分離沉澱物並將其乾燥；和
e)將分離到的沉澱在揮發性溶劑中的溶液用色譜法提純至少一次，然後將通過色譜法得到的提純溶液結晶至少一次。
在上述美國專利中，還公開了步驟(e)優選包括e1)第一次色譜提純，包括將在步驟(d)分離的沉澱溶於揮發性溶劑，製備這樣得到的溶液與矽膠的混合物，將該混合物在含有矽膠的色譜柱中處理，回收富含紫杉醇的級分；e2)第二次色譜提純，包括將前一步驟回收的富含紫杉醇的級分蒸發至幹直至得到殘餘物，然後將所述殘餘物溶於揮發性溶劑製備混合物，所述混合物用色譜法在與前述子步驟相同的條件下再提純以便得到另一富含紫杉醇的級分；e3)第一次結晶，包括將在前述子步驟得到的另一富含紫杉醇的級分蒸發至幹直至得到殘餘物，將所述殘餘物溶於丙酮製成混合物，用非極性溶劑結晶含於所述混合物中的紫杉醇；e4)第二次結晶，包括將前述子步驟得到的紫杉醇晶體溶於丙酮，然後在與前述子步驟相同的條件下重結晶所述紫杉醇；e5)第三次色譜法提純，包括將前述子步驟重結晶得到的晶體溶於揮發性溶劑得到溶液，製備所述溶液與矽膠的混合物，將所述混合物在含有矽膠的色譜柱中處理以便用洗脫溶劑得到再一種富含紫杉醇的級分；和e6)第三次結晶，包括將前述子步驟得到的再一種富含紫杉醇的級分蒸發至幹直至得到殘餘物，將所述殘餘物溶於醇、酮、或醇-酮混合物得到另一種混合物，用水結晶所述另一種混合物中所含的紫杉醇。
如前所述，上述美國專利No.6,452,024中公開的方法由於比現有方法更簡單、有效且更經濟而非常令人感興趣。但是，該方法仍然需要許多通過色譜法和結晶純化的分離步驟，當用紫杉烷天然來源的針葉和枝條進行萃取時，需要除去大量的溶劑可溶性雜質。這仍然導致了高生產成本，特別是因為在不同種紫杉中紫杉醇的含量低。另外，可被提純的生物質的量是非常有限的，因為色譜柱的尺寸很小以及在提純後得到的紫杉醇產量低。

發明內容
本發明的目的在於提供一種改進的方法，解決了上文提及的大部分問題。
更具體地，本發明的目的是提供一種改進的方法，其能夠-在萃取不同種類的紫杉的樹皮、針葉和/或枝條後得到含更多紫杉醇及其類似物的溶液；-減少雜質，並減小通過沉澱從生物質中獲得的紫杉醇及其類似物萃取液的體積；-進一步增加必須通過色譜法提純的生物質的量；-進一步減少提純步驟；-進一步增加得到的紫杉醇的量；並且-進一步將生產成本降低到更經濟的水平。
根據本發明的從含紫杉醇的紫杉烷天然來源提取和純化紫杉醇的改進方法包括下述基本步驟a)用去離子或純水洗滌含有紫杉醇的原料，所述原料來自所述紫杉烷的天然來源，所述的洗滌能夠將可溶性雜質從所述原料中除去；b)用有機溶劑從所述洗滌後的原料中，萃取出含紫杉醇的溼原料；c)將所述的溼原料和鹽接觸，通過沉澱得到生物質，然後分離並乾燥所述的生物質；d)通過將所述生物質溶於丙酮或丙酮-己烷混合物中從這樣分離並乾燥的生物質除去樹脂和天然色素，然後向其中加入至少一種極性溶劑直至得到富含紫杉醇的油相；e)將前述步驟中得到的富含紫杉醇的油相在揮發性溶劑中用色譜法提純至少一次，得到提純的溶液，然後將通過色譜法得到的提純溶液至少結晶一次。
這樣得到的結晶產物實際上是紫杉醇晶體的混合物，所述晶體被過濾並乾燥後，其基本上由下述成分組成
-約60％純度高於99％的晶體，；-約30％純度高於98％(＜99％)的晶體，；和-約10％純度高於92％(＜98％)的晶體。
純度小於99％的晶體可被分離，混合在一起，然後通過色譜提純以便得到更多純度高於99％的最終產物。
參考附圖和所附的實施例，通過閱讀下述非限制性的描述可更好地理解本發明與最接近先有技術的根本區別、其優點和其可簡化實施的方式。


圖1a和1b是根據本發明方法的基本步驟和在最接近先有技術(即，美國專利No.6,452,024)中所公開方法的流程圖的比較。
發明詳述如前所述，根據本發明的改進方法用於從原料中萃取和提純紫杉醇，所述原料來自含有要被萃取的紫杉醇的紫杉烷的天然來源。
用於進行根據本發明方法的、用作起始原料的紫杉烷天然來源是紫杉屬的。更具體地，其包括任何含紫杉醇及其衍生物的針葉樹種。這類含紫杉醇的針葉樹樹種可以包括短葉紫杉、歐洲紫杉、加拿大紫杉、喜馬拉雅紫杉、雲南紫杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、東北紫杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
根據本發明的方法的優點是可使用含紫杉醇的紫杉烷天然來源的任何部分。優選使用所選擇的一種或多種針葉樹的樹皮。或者，使用所選擇的針葉樹的枝條和針葉。
根據本發明方法的各個步驟的詳細說明步驟1-洗滌根據本發明的改進方法的第一步包括用去離子水或純水洗滌來自紫杉烷天然來源的含紫杉醇及其類似物的原料。原料可以包括樹皮、枝條、針葉等，將其用水完全浸沒，在20-100℃之間的溫度進行或不進行攪拌(優選在20-25℃)2至24小時(優選3小時)。之後將水排乾。這能夠將水溶性雜質從原料中除去。
步驟2-萃取所述改進方法的第二個步驟包括用有機溶劑從第一步驟得到的洗滌後的原料萃取出含有紫杉醇及其類似物的溼原料。
在該萃取步驟中使用的有機溶劑優選選自醇、酮和其混合物。作為這類優選的溶劑，可提及的有甲醇、丙酮以及甲醇和丙酮的混合物。
在使用醇和酮的混合物的情況下，醇和酮優選以9∶1至1∶9之間的體積比存在。更優選混合物的體積比等於約1∶1。
還優選將這樣得到的萃取液過濾除去沉澱，然後轉移到雙層壁罐中，在雙層壁中間通入優選65-70℃的熱水。從罐中蒸餾有機溶劑。通常，收集的溶劑量是起始體積的約70％。其餘的含紫杉醇的溶液隨後被排入另一個罐。該餘液實際上是非濃縮的萃取液，因為其中含有殘餘水。
步驟3-生物質的分離根據本發明的改進方法的第三個步驟包括從前述步驟得到的溶液分離生物質。
為了該目的，從前述步驟得到的非濃縮萃取液用甲醇和水稀釋，然後鹽析得到生物質沉澱。優選將氯化鈉作為鹽析萃取液所用的鹽。但是，其它的鹽可以用於相同的反應，如氯化銨、硫酸銨、乙酸鈉或乙酸鉀、氯化鉀、磷酸鈉或磷酸鉀或檸檬酸鈉或檸檬酸鉀，所有這些鹽是在水溶液中可溶的。
優選將氯化鈉(或任何其它選擇的鹽)迅速地在劇烈攪拌下加入到非濃縮萃取液中。通過以每升溶液含有10-200克之間的濃度加入氯化鈉，需要的生物質迅速形成。優選加入的氯化鈉的濃度是每升非濃縮萃取溶液用50-100克，優選50-75克。
形成並已經沉澱出的生物質通過過濾或離心從溶液分離。這樣分離的生物質是溼的，可將其立即送入下一步驟，或在空氣或真空下乾燥，優選通過通風或冷凍乾燥。
步驟4-除去樹脂和天然色素根據本發明的改進方法的第四個步驟包括處理前述步驟分離到的生物質以便除去其中所含的樹脂和天然色素。
這一步驟可根據在前述步驟中得到的生物質的種類進行，即，取決於其是幹的還是溼的。
A-當在先的沉澱步驟得到的生物質是乾燥的時，則通過向其中加入丙酮和己烷的混合物(優選體積比1/1)將其返回到溶液中，丙酮和己烷的混合物優選等同於沉澱前在步驟2中得到的非濃縮萃取液的體積的約1/25。
更優選通過先加入丙酮和己烷的混合物然後加入1.5體積的另外的純己烷將乾燥的生物質返回到溶液中。丙酮對己烷的最終比例是1體積丙酮對4體積己烷。在這種溶解後，將純水加入到得到的溶液中形成富含紫杉醇的油相。基於每100體積所加入的丙酮，優選以2-10體積、更優選5-7體積的量加入水。
然後將這樣得到的混合物送入潷析瓶。回收沉在瓶底的含紫杉醇及其它紫杉烷的油相。然後蒸發該油相，準備在矽膠上用色譜法提純。
B-當在第三個步驟中離心後得到的生物質是溼的時(即，其沒有進行乾燥)，則將這種溼的生物質返回到丙酮和己烷混合物(優選A體積比1∶1)形成的溶液，而不加入任何水。丙酮的體積優選等於在沉澱前第二步驟得到的非濃縮萃取液體積的約1/20。
在這種溶解後，將至少一種非極性溶劑加入得到的溶液中形成富含紫杉醇的油相，以相同的方法將其從己烷分離。
用於該目的的一種或多種非極性溶劑優選選自與丙酮混溶的烴類，如戊烷、己烷或庚烷。當使用己烷時，通常所用己烷的體積是丙酮溶液體積的3-4倍。
在溼生物質含水太多的情況下，得到的富含紫杉醇的油相必須在將其塗敷在矽膠上之前進行處理除去殘餘水，將這樣塗敷後的矽膠進行色譜法以便回收和提純紫杉醇及其類似物。除去水可使在將塗敷的矽膠在加載到色譜柱上之前更迅速地乾燥。
在富含紫杉醇的油相中的殘餘水可通過用與水不溶混的溶劑萃取除去。然後傾析混合物，將有機相與水分離。使用的不溶於水的溶劑優選選自滷代烴或醚。作為這類溶劑的實例可提及的有二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚。
將得到的萃取液回收，在真空下濃縮，並且就此準備在矽膠上用色譜法提純。
步驟5-色譜法提純根據本發明的方法的第五個步驟和最後一個步驟是色譜提純至少一次在前述步驟得到的富含紫杉醇的油相，然後將通過色譜法得到的提純溶液結晶至少一次。
為此，將第四個步驟得到的濃縮的富含紫杉醇的油相進行至少一次色譜提純，然後將通過色譜法得到的提純溶液至少結晶一次。但是優選將第四個步驟得到的濃縮的富含紫杉醇的油相進行若干次色譜提純和若干次結晶，色譜提純的次數優選兩次，結晶次數優選三次。
現將這些逐步提純和結晶作為子步驟A至E進行描述。
A-第一次色譜提純在第一次色譜提純步驟中，在本方法第四個步驟得到的富含紫杉醇的油相與矽膠混合，然後通風乾燥。將塗敷了所述油相的矽膠裝載到含有相同類型矽膠的色譜柱上。在柱中，提純紫杉醇，所用洗脫混合物含有30-40％的丙酮和60-70％的己烷。優選洗脫混合物含約35％的丙酮和約65％的己烷。
使用的柱優選高142釐米，內徑7.6釐米或15.2釐米，這取決於被提純的紫杉醇的量。優選含4-6克紫杉醇的富含紫杉醇的油相在直徑7.6釐米的柱中提純。含20-24克紫杉醇的油相使用柱直徑15.2釐米的柱。較小的柱(7.6釐米直徑)含2.2-2.3公斤矽膠，較大的柱(15.2釐米直徑)含8-9公斤矽膠。
柱的矽膠用由丙酮和己烷組成的洗脫混合物洗滌和平衡。級分的洗脫用相同的溶劑混合物進行，優選在7.6釐米直徑柱中流速約100毫升/分鐘，在15.2釐米直徑柱中流速400毫升/分鐘。在兩種情況下，體積優選控制在0-30psi的壓力下。
B-第一次結晶B.1-在這一步驟，將在前述步驟通過色譜法得到的含紫杉醇的級分蒸發至幹，然後返回丙酮形成溶液。調節丙酮的量從而使對於相應於紫杉醇HPLC分析峰最大值所述溶液在228nm的吸光度為1.0-1.5O.D.。然後通過在該丙酮溶液中加入3-4體積己烷結晶紫杉醇。
B.2-或者，將在前步驟通過色譜法得到的含紫杉醇的級分通過蒸發減少到初始體積的1/5或直至對於相應於紫杉醇HPLC分析峰最大值達到1.0-1.5O.D.。這樣，紫杉醇留在丙酮-己烷(35-65％)溶劑混合物中。然後，通過在該溶液中加入2-3體積己烷結晶紫杉醇。
晶體迅速形成。混合物在室溫或在2-8℃溫度下放置過夜以完成結晶。
C-第二次結晶在這一步驟，在前述步驟通過結晶得到的晶體通過過濾或離心分離，然後返回到丙酮中形成溶液，調節丙酮的體積從而使對於相應於紫杉醇HPLC分析的峰所述溶液的吸光度為1.0-1.5O.D.。
然後通過向丙酮溶液中加入每體積丙酮溶液3-4體積己烷重結晶該溶液所含的紫杉醇。
在這一步驟得到的晶體通過HPLC分析，紫杉醇純度在85-95％之間。
通過過濾從上述兩個結晶步驟分離晶體後，將己烷相與從第一次色譜法得到的級分混合，該級分相應的峰被確定為9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素(acetylbaccatin)III。在達到紫杉醇峰之前，該成分在若干級分中被洗脫。然後將混合物蒸發至幹。這樣獲得的殘餘物通過加入甲醇轉化為淺黃色9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III晶體。過濾分離晶體，然後返回到丙酮中形成溶液，加入4體積的己烷快速結晶。在這一步驟通過過濾得到的9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III晶體可用與上述公開的相同方法重結晶，HPLC分析表明純度高於98％。
D-第二次色譜提純D.1在這一步驟中，過濾在前述步驟得到的紫杉醇晶體，然後返回到丙酮中形成溶液。過濾該紫杉醇溶液除去不溶於丙酮的顆粒。然後將這樣得到的溶液與矽膠混和並通風乾燥。
將塗敷了紫杉醇的矽膠裝載到含有相同類型矽膠的色譜柱上。然後用基於洗脫混合物的有機溶劑第二次重提純紫杉醇。優選洗脫混合物包括30-40％的丙酮和70-60％的己烷。
更優選步驟C得到的晶體用丙酮溶解，與矽膠混合，然後乾燥。將被紫杉醇浸漬的矽膠加載到色譜柱上(優選142釐米長、7.6釐米或15.2釐米內徑，取決於被提純的紫杉醇的量)。7.6cm直徑的柱可含2.2至2.3公斤的矽膠，15.2釐米直徑的柱可含8公斤的矽膠。在柱中的矽膠用丙酮和己烷(優選35∶65％每體積)組成的溶液洗滌和平衡。級分的洗脫用相同的溶劑混合物進行，優選在7.6釐米直徑的柱中流速約100毫升/分鐘，或者在15.2釐米直徑的柱中流速400毫升/分鐘。兩種柱都在0-30psi的壓力操作。
D.2或者，過濾在前述步驟C得到的紫杉醇晶體，然後返回到二氯甲烷中形成溶液。過濾該紫杉醇溶液除去不溶於二氯甲烷的顆粒。
然後將這樣得到的溶液與矽膠混和並通風乾燥。將塗敷了紫杉醇的矽膠裝載到含有相同類型矽膠的色譜柱上。然後用基於洗脫混合物的有機溶劑第二次重提純紫杉醇。優選洗脫混合物包括95-98％的二氯甲烷和2-5％的異丙醇。更優選步驟C得到的晶體用二氯甲烷溶解，與矽膠混合，然後乾燥。將被紫杉醇浸漬的矽膠加載到色譜柱上(優選142釐米長、7.6釐米或15.2釐米內徑，取決於被提純的紫杉醇的量)。7.6釐米直徑的柱可含2.2至2.3公斤的矽膠，15.2釐米直徑的柱可含8公斤的矽膠。在柱中的矽膠用二氯甲烷和異丙醇(優選97.5∶2.5％每體積)組成的溶劑洗滌和平衡。級分的洗脫用相同的溶劑混合物進行，優選在7.6釐米直徑的柱中流速約100毫升/分鐘，在15.2釐米直徑的柱中流速400毫升/分鐘。
E-第三次結晶在這一步驟中，在步驟D通過色譜法回收的富含紫杉醇的級分根據它們的純度合併，優選根據98-99％和90-98％的純度合併。然後將其蒸發至幹，然後溶於丙酮、醇(乙醇)、乙酸乙酯或乙醚中形成溶液。
調節加入的丙酮的體積使得相對於根據HPLC分析紫杉醇相應的峰溶液的吸光度為1.0-1.5O.D.。當使用上述的其它溶劑時，即，醇(乙醇)、乙酸乙酯或乙醚，紫杉醇濃度更加重要，通常是紫杉醇丙酮溶液濃度的5倍以上。
然後將紫杉醇進行第三次重結晶，優選如下1.通過在丙酮溶液中加入每體積丙酮3-4體積的己烷。
2.通過在醇溶液或乙酸乙酯溶液中加入每體積醇或乙酸乙酯至少3體積的己烷。
3.通過在乙醚溶液中加入每體積乙醚至少2體積的己烷。
在上文公開的最後提純和重結晶步驟中，在紫杉醇溶液中加入己烷可在室溫進行。這會減慢晶體的形成，但是在2-4℃或在室溫過夜後將會結晶完全。過濾晶體，在真空下乾燥，以便得到細小的分離的粉末。然後將所述晶體溶於醇(甲醇或乙醇)或丙酮，之後加入水中形成懸浮液，在約-60℃的溫度在66-72小時期間冷凍乾燥。
然後將得到的紫杉烷級分用HPLC色譜(Waters system)分析，使用自動取樣器(Waters 717 plus)、光二極體矩陣檢測器(Waters 996)、多溶劑輸送系統(Waters 600E)和C18 Nova-Pak柱、60、4μm(3.9×150毫米)。
級分的分析可通過注入5ul進行。以流速1毫升/分鐘採用乙腈-水-甲醇的溶劑梯度(開始為25∶50∶30體積比，最終為35∶35∶30體積比)洗脫所述的柱。
在228nm測定化合物的峰，樣品的分析時間約36分鐘。紫杉醇峰的保留時間約18.9±0.2分鐘，而9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III峰為6.5±0.2分鐘。
優選在色譜提純步驟用於溶解殘餘物的揮發性溶劑選自丙酮、C1-C3輕醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或這些溶劑的混合物。
在該步驟E的結束，在己烷中結晶紫杉醇後和在過濾並乾燥後，得到紫杉醇晶體的混合物。該紫杉醇晶體混合物的組成是-60％純度高於99％的晶體，-30％純度高於98％低於99％的晶體，和-10％純度高於92％低於98％的晶體。
本發明和申請人的美國專利No.6,452,024公開和要求保護的方法之間的根本區別如前所述，附圖1a和1b是美國專利No.6,452,024中公開和要求保護的方法的基本步驟與本發明方法比較的流程圖1.如這些流程圖中所示，在根據本發明的方法中，含待萃取的紫杉醇的原料優選由乾燥的針葉和枝條構成，將其在用諸如甲醇或丙酮的有機溶劑萃取之前用純水洗滌。在這種洗滌之後得到的水含一些水溶性的被丟棄的成分。然後將溼的針葉和枝條用甲醇或丙酮或兩者的混合物「覆蓋」，隨後在20℃進行一段時間的萃取，例如16個小時。然後將萃取液通過一個筒式過濾器，注入一個雙層壁的罐，通過循環夾套中加熱的水蒸餾溶劑。如前所述，含一些殘餘水的萃取液被稱作「非濃縮的萃取液」。
相反，在美國專利No.6,452,024中，是用甲醇和二氯甲烷的溶劑混合物直接進行乾燥的針葉和枝條的萃取。在蒸餾之後得到濃縮的萃取液非常粘滯(visquous)並且含有大量的樹脂和天然色素。該萃取液可被稱作「濃縮的萃取液」。
2.在根據本發明的方法中，將氯化鈉加入到非濃縮的萃取液，形成的生物質立即沉澱出來。該生物質通過離心分離。
在美國專利No.6,452,024中，先前在甲醇中稀釋的濃縮萃取液在鹼性或酸性介質中沉澱得到生物質。形成的沉澱非常細小和輕，在分離前通過加入氯化鈉鹽析。
3.然後，在根據本發明的方法以及在美國專利No.6,452,024公開的方法中，生物質溶於丙酮，將給定量的(優選4體積)的非極性溶劑(如己烷)加入到丙酮溶液形成富含紫杉醇的油相。
但是在根據本發明的方法中，這樣得到的富含紫杉醇的油相易於在色譜柱中用矽膠在低壓力下提純。相反，在美國專利No.6,452,024公開的方法中，得到的富含紫杉醇的油相必須在酸性或鹼性介質中進行第二次沉澱。在通過添加氯化鈉鹽析後，通過離心分離沉澱。將得到的沉澱乾燥，然後溶於丙酮。只有在那時丙酮溶液易於在色譜柱中用矽膠在低壓力下提純。
4.在根據本發明方法的第一次色譜提純中，富含紫杉醇的油相與矽膠混合，然後通風乾燥。然後將被生物質覆蓋的矽膠加載在色譜柱上。紫杉醇用丙酮和己烷的洗脫混合物提純。將通過色譜法得到的含紫杉醇的級分收集在一起，然後結晶。通過過濾或離心得到的晶體溶於丙酮，然後第二次重結晶。通過過濾或離心分離晶體，易於第二次再提純和最後用矽膠在低壓的色譜柱提純。
在美國專利No.6,452,024公開的方法的第一次色譜提純步驟中，富含紫杉醇的油相與矽膠混合，通風乾燥。然後將被生物質覆蓋的矽膠加載在色譜柱上。紫杉醇用丙酮和己烷的洗脫混合物提純。將通過色譜法得到的含紫杉醇的級分收集在一起，然後通過第二次色譜用在前步驟所用的條件再提純。通過第二次色譜得到的含紫杉醇的級分收集在一起然後結晶。將通過過濾或離心得到的晶體溶於丙酮，然後第二次重結晶。通過過濾或離心分離晶體，易於第三次再提純和最後用矽膠在低壓下進行色譜柱提純。
因此，在美國專利No.6,452,024公開的方法中，要進行的色譜的次數更多(是3次而不是2次)。
5.當然，在兩種情況下，在本發明中來自第二和最後色譜柱的含紫杉醇的級分或在美國專利No.6,452,024中來自第三和最後一個色譜柱的那些級分被集中在一起，然後結晶，形成最終產物。
因此，現在可以更好地理解與美國專利No.6,452,024的方法相比本發明的主要優點是，根據本發明的方法從起始的針葉萃取步驟到生物質的獲得包括了更少的製備步驟，以及更少的提純步驟以兩次色譜法代替了美國專利No.6,452,024的三次色譜。
根據本發明的方法還使用了更少的溶劑，並且為了得到相同量的最終產物需要使用的原料更少。因此，根據本發明的改進方法的生產費用不僅比用於提純紫杉醇的常用和傳統方法低得多而且比美國專利No.6,452,024低得多。
具體實施例方式
給出以下實施例僅用於具體說明，不應認為是對本發明範圍的限制。
實施例1洗滌將100公斤的乾燥和磨碎的加拿大紫杉的針葉和枝條裝入棉布袋。將該袋放入不鏽鋼罐中，所述罐內加入400升的蒸餾水。在室溫下將棉布袋完全浸沒在水中3小時，排出含水可溶性雜質的溶液。
在實踐中，該洗滌過程可重複一次或兩次，溼的針葉通過棉布袋保留在罐中。
萃取將250升的甲醇加入盛有溼的針葉和枝條的罐中。在室溫萃取16小時。將萃取液泵送通過過濾器進入第二雙層壁罐。藉助在雙壁罐中循環的80℃的熱水蒸餾甲醇。回收的甲醇輸入盛針葉的罐用於漂洗，純甲醇的體積達到400升結束。然後將漂洗的甲醇泵送並蒸餾直至回收約75％的甲醇體積。在此後被稱為「非濃縮的萃取液」的約100-120升殘餘溶液被輸入另一個罐中，並保存至萃取液溫度降至室溫。
通過鹽析沉澱生物質非濃縮的萃取液用10升甲醇(與非濃縮萃取液的體積相比約10％的甲醇)澄清。在攪拌下迅速添加氯化鈉，沉澱分離生物質。氯化鈉的濃度是每升萃取液溶液約50克。沉澱立即形成，混合物不攪拌放置過夜。然後排出上層清液，重的沉澱物不用過濾或離心就可容易地回收。
如果有必要，通過添加氯化鈉得到的生物質可通過過濾或在20℃以4200rpm速度離心30分鐘迅速回收(J6 MC Beckman離心機，4.2 JSrotor)。應當理解，連續作業的離心機優選可用於處理大量的沉澱物。
用二氯甲烷或乙醚萃取含10-去乙醯基漿果赤黴素III和漿果赤黴素III的上層液。通過蒸發濃縮有機相，可萃取處理這些紫杉烷的類似物。
除去樹脂和色素1.空氣乾燥得到的沉澱物。或者，可將其真空乾燥或冷凍乾燥(冷凍乾燥器-FTS System)。沉澱物重約1.3公斤-1.5公斤。該沉澱物溶解在6升丙酮-己烷混合物(1∶1)，然後在0-2℃在30分鐘期間過濾(或在4200rpm離心)，以便除去其中所含的不溶性顆粒。然後，將丙酮-己烷溶液轉移到燒杯內，與1.5體積的純己烷(9升)通過逐步加入1/2體積的己烷分別攪拌數分鐘混合，加入5％-20％的純水，優選5％至10％，形成油相。根據所用丙酮的體積計算水量。混合物然後送入分液瓶，分配約30分鐘。在瓶底部回收紫杉醇富集相，在脫色(percolorization)前將得到的溶液蒸發濃縮至起始體積的1/10。該製品易於吸附在矽膠上用於色譜法提純步驟。
2.在離心但不乾燥後，將這樣得到的沉澱物溶於3升丙酮，然後在0-2℃在30分鐘期間過濾(或在4200rpm離心)除去其中所含的不溶性顆粒。然後，將丙酮溶液轉移到燒杯中與4體積的己烷(12升)通過逐步加入1體積己烷分別攪拌數分鐘混合。迅速形成油相。混合物然後送入分液瓶，分配約30分鐘。在瓶底部回收紫杉醇富集相。這種溶液含一些殘餘水，因此通過加入1體積二氯甲烷萃取。
從該混合物分離出水，在除去樹脂和色素或蒸發至幹之前，將含紫杉醇的較低的二氯甲烷相濃縮至所得丙酮溶液的起始體積的1/5。就後者來說，幹的殘渣溶於0.5升丙酮。
實施例2在低壓下在矽膠上第一次色譜提純在實施例1中除去樹脂和色素之後得到的含紫杉醇及其類似物的丙酮溶液與500克矽膠(230-400目)混合。被萃取液浸漬的矽膠通風乾燥(或在真空下乾燥)。乾燥後的總重約900-950克，將該材料的一半裝載到含2.2公斤矽膠(230-400目)的柱(142×7.6釐米內徑)上。用丙酮和己烷(35∶65％，體積/體積)的混合物洗滌和平衡矽膠。用相同的溶劑，使用Dynamax溶劑輸送系統進行洗脫。在0-30psi的壓力洗脫的流速大約100毫升/分鐘。溶劑混合物的體積為約40升，分批收集各級分，每批1升。HPLC分析表明有9至10個級分(從第26或第27至第35或第36)含約0.2毫克/毫升至0.7毫克/毫升的紫杉醇，它們的純度變化為10％-58％。含更多紫杉醇的級分具有更高的純度。每個級分的紫杉醇量通過與紫杉醇標準樣品的面積相比來確定。
值得注意的是，從一次提純到另一次提純，含紫杉醇的級分可能相對於其它級分有所偏差。
雜質量最高的級分被丟棄。通常，含紫杉醇小於0.3毫克/毫升的第一個級分被淘汰。
實施例3在低壓下在矽膠上第一次色譜提純在實施例1中除去樹脂和色素之後得到的含紫杉醇及其類似物的丙酮溶液與500g矽膠(230-400目)混合。被萃取液浸漬的矽膠通風乾燥(或在真空下乾燥)。乾燥後的總重約920克，將該材料的一半裝載到含2.2公斤矽膠(230-400目)的柱(142×7.6釐米內徑)上。用丙酮和己烷(40∶60％，體積/體積)的混合物洗滌和平衡矽膠。用相同的溶劑，使用Dynamax溶劑輸送系統進行洗脫。在0-30psi的壓力洗脫的流速大約100毫升/分鐘。溶劑混合物的體積大約30升，分批收集各級分，每批1升。HPLC分析表明有7至8個級分(從第16或第17至第23或第24個級分)含約0.1毫克/毫升至0.7毫克/毫升的紫杉醇，它們的純度變化為8-45％。含更多紫杉醇的級分具有更高的純度。每個級分的紫杉醇量通過與紫杉醇標準樣品的面積相比來確定。
再次，值得注意的是，從一次提純到另一次提純，含紫杉醇的級分可能相對於其它級分有所偏差。
雜質量最高的級分被丟棄。通常，含紫杉醇小於0.3毫克/毫升的第一個級分被淘汰。
實施例4第一次結晶在實施例2和3中的第一次色譜法提純後，將紫杉醇濃度高於0.3毫克/毫升的級分合併，然後蒸發至幹。殘餘物溶於丙酮，調節丙酮的體積使得HPLC的紫杉醇最大峰值在1.0至1.5O.D.。然後將4體積的己烷加入丙酮溶液，在接下來的1小時期間開始結晶。混合物保持在2-8℃或在室溫下過夜至完全結晶。
第二次結晶然後，得到的晶體過濾(或離心)，隨後溶於丙酮。調節丙酮的體積使得通過HPLC紫杉醇峰的最大值O.D.在1.0至1.5範圍內。然後以相對於丙酮溶液4體積的比例加入己烷。在接下來的1小時中形成晶體。混合物保持在2-8℃或在室溫過夜至完全結晶。過濾或離心晶體，在空氣或真空下乾燥。HPLC分析表明紫杉醇含量約85％或更高。9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III的直接分離和第一次結晶在實施例2中通過第一次色譜提純得到的含9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III(級分第20至第25)或在實施例3中的級分第13至第15與從第一和第二次結晶步驟得到的含9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III的己烷/丙酮溶液(母液)合併在一起，然後蒸發至幹。通過加入甲醇形成結晶，然後過濾或離心回收。得到的晶體溶於丙酮，用3體積己烷結晶。產物確定為9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III，純度＞95％。
9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III的第二次結晶這樣得到的9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III晶體溶於丙酮，然後將1體積己烷加入所述丙酮溶液。緩慢攪拌混合物，再加入2體積己烷。將溶液緩慢結晶。過濾或離心回收白色晶體，通風乾燥或在真空下乾燥。該晶體的HPLC分析表明9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III含量等於或大於98％。
實施例5在低壓下在矽膠上第二次色譜提純實施例4中第二次結晶後得到的紫杉醇晶體溶於75至100毫升丙酮，然後過濾除去不溶性顆粒，隨後被吸附在75至100克矽膠上。被紫杉醇塗敷的矽膠通風乾燥或在真空下乾燥。乾燥的矽膠加載在含2.2公斤的矽膠(230-400目)的柱(142×7.6釐米內徑)的頂部。用丙酮和己烷(35∶65體積/體積)的混合物洗滌和平衡矽膠。在0-30psi的壓力和約100毫升/分鐘的流速，用相同的溶劑，使用Dynamax溶劑輸送系統進行洗脫。溶劑混合物的體積約40升，分批收集各級分，每批1升。HPLC分析表明有9至10個級分(從第26或第27至第34或第35個級分)含約0.2毫克/毫升至0.6毫克/毫升的紫杉醇，它們的純度變化為85％到99％。將純度高於98％的含紫杉醇的級分合併在一起用於第三次和最後一次結晶。
再次指出，從一個提純步驟到另一個提純步驟，含紫杉醇的級分可能相對於其它級分有所偏差。
實施例6在低壓下在矽膠上第二次色譜提純實施例4中第二次結晶後得到的紫杉醇晶體溶於75至100毫升二氯甲烷，然後過濾除去不溶性顆粒，隨後與75至100克矽膠接觸。被紫杉醇塗敷的矽膠通風乾燥或在真空下乾燥。將乾燥的矽膠加載在含2.2公斤的矽膠(230-400目)的柱(142×7.6釐米內徑)的頂部。用二氯甲烷和異丙醇(97.5∶2.5體積/體積)的混合物洗滌和平衡矽膠。在0-30psi的壓力和約100毫升/分鐘的流速，用相同的溶劑，使用Dynamax溶劑輸送系統進行洗脫。溶劑混合物的體積大約50升，分批收集各級分，每批1升。HPLC分析表明有20個級分(從第28至第48個級分)含約0.1毫克/毫升至0.3毫克/毫升的紫杉醇，它們的純度變化為98％到＞99％。將純度高於98％的含紫杉醇的級分合併在一起用於第三次和最後一次結晶。
第三次結晶在實施例5或實施例6第二次色譜提純後，合併然後將紫杉醇純度高於98％的級分蒸發至幹。殘餘物溶於丙酮，調節丙酮的體積使得HPLC分析的紫杉醇最大峰值在1.0至1.5O.D.。然後將4體積的己烷加入丙酮溶液，在接下來的1小時期間開始結晶。混合物保持在2-8℃或在室溫下過夜至完全結晶。過濾或離心回收白色晶體，通風乾燥或在真空下乾燥。通過HPLC分析的晶體純度如下-實施例5得到的為99.20至99.50％；和-實施例6得到的為99.50至99.90％。
如上文所公開的，第二次色譜提純後從含紫杉醇級分獲得的殘餘物可以溶於乙醇、乙酸乙酯或乙醚。那些溶劑的體積比先前所用的丙酮小5倍，這意味著紫杉醇濃度高5倍(10毫克/毫升)。
在實踐中-將1至2體積己烷隨後加入到醚溶液；或者-將3至4體積己烷隨後加入到乙醇或乙酸乙酯溶液，在接著的1小時期間開始結晶。
混合物保持在2-8℃或在室溫下過夜至完全結晶。那些晶體的純度與用丙酮結晶時的非常相似。
保存純度不及98％的晶體，用上述第二次提純所述的相同條件一起通過色譜重提純。這次再提純又得到這些晶體總量的約75％，純度大於99％。
將所述的晶體溶於最小體積的乙醇或甲醇或丙酮，然後返回到含有純水的小瓶裡。溶劑的體積是純水體積的約10-15％。在72小時內將紫杉醇凍幹，溫度從-60℃到+20℃以每分鐘0.02℃變化，壓力為100毫託。
權利要求
1.用於從含有待提取的紫杉醇的紫杉烷的天然來源提取和純化紫杉醇的方法，所述方法包括下述步驟a)用去離子或純水洗滌含有紫杉醇的原料，所述原料來自所述紫杉烷的天然來源，所述的洗滌將可溶性雜質從所述原料中除去；b)用有機溶劑從所述被洗滌原料中萃取出含紫杉醇的溼原料；c)將所述的溼原料和鹽接觸，通過沉澱得到生物質，然後分離並乾燥所述的生物質；d)通過將所述生物質溶於丙酮或丙酮-己烷混合物中從這樣分離並乾燥的生物質除去樹脂和天然色素，然後向其中加入至少一種極性溶劑直至得到富含紫杉醇的油相；e)將前述步驟中得到的富含紫杉醇的油相在揮發性溶劑中用色譜法提純至少一次，得到提純的溶液，然後將通過色譜法得到的提純溶液至少結晶一次。
2.根據權利要求1的方法，其中含紫杉醇的紫杉烷的天然來源包括選自下述的針葉樹短葉紫杉、歐洲紫杉、加拿大紫杉、喜馬拉雅紫杉、雲南紫杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、東北紫杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
3.根據權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)中，所述原料選自所述針葉樹的樹皮、樹枝和針葉或其混合物。
4.根據權利要求1至3的方法，其中在步驟(b)中，所述有機溶劑選自醇或酮以及醇和酮的混合物。
5.根據權利要求4的方法，其中在步驟(b)中，所述有機溶劑是甲醇、丙酮或以9∶1到1∶9的體積比存在的甲醇和丙酮的混合物。
6.根據權利要求1至5任一項的方法，其中在步驟(c)中，用於通過沉澱得到生物質的鹽選自氯化鈉、氯化銨、硫酸銨、乙酸鈉、乙酸鉀和其混合物。
7.根據權利要求6的方法，其中在步驟(c)中，所述鹽是氯化鈉；以每升步驟(b)萃取得到的溼原料10-100克的濃度使用。
8.根據權利要求6或7的方法，其中在步驟(c)中，將沉澱的生物質用過濾或離心法分離，然後用空氣直接乾燥或冷凍乾燥。
9.根據權利要求1至8任一項的方法，其中在步驟(d)中，將在步驟(c)中得到的乾燥生物質通過加入丙酮然後加入水被溶解，加入的水的比例是以每100體積加入的丙酮計用2-10體積水，並且其中，在所述的步驟(d)中，所述至少一種非極性溶劑選自己烷和戊烷。
10.根據權利要求1-9任一項的方法，其中步驟e)包括下述子步驟e.1)製備在步驟(d)中得到的富含紫杉醇的油相和矽膠的混合物，用洗脫溶劑在含矽膠的色譜柱中處理所述的混合物，得到第一紫杉醇富集級分；e.2)將第一紫杉醇富集級分蒸發至幹直至得到殘留物，將所述殘留物溶於丙酮製備混合物，用非極性溶劑結晶混合物中所含的紫杉醇，或蒸發第一紫杉醇富集級分直至達到一個可接受的紫杉醇濃度，然後用非極性溶劑結晶混合物中所含的紫杉醇；e.3)在丙酮中溶解子步驟(e.2)得到的紫杉醇晶體，然後用非極性溶劑重結晶紫杉醇；e.4)將子步驟(e.3)得到的晶體溶於揮發性溶劑得到溶液，製備所述溶液與矽膠的混合物，然後在含矽膠的色譜柱中用洗脫溶劑處理所述的混合物，得到帶有洗脫溶劑的第二紫杉醇富集級分；和e.5)將子步驟(e.4)得到的第二紫杉醇富集級分蒸發至幹直至得到殘留物，將殘留物溶於丙酮、醇、醚、乙酸乙酯或其混合物，然後用非極性溶劑結晶紫杉醇。
11.根據權利要求10的方法，其中在步驟(e.1)中，將步驟(d)得到的富含紫杉醇的油相與矽膠混合，然後在空氣中乾燥；回收矽膠並加載在也含有矽膠的色譜柱中；然後用洗脫混合物提純紫杉醇，所述的洗脫混合物含有30％-40％的丙酮和60％-70％的己烷；和在步驟(e.3)中，將步驟(e.2)得到的結晶通過過濾或離心分離，溶於丙酮中形成溶液，調節丙酮的體積從而使對於相應於HPLC分析的峰所述溶液的吸光度為1.0-1.5O.D.(光密度)，然後通過在該溶液中加入3-4體積己烷重結晶紫杉醇。
12.根據權利要求10或11的方法，其中在步驟(e.2)中，將在步驟(e.1)中通過色譜法得到的含紫杉醇的富集級分收集在一起，蒸發至幹，然後溶於丙酮形成溶液，調節丙酮的量從而使得對於相應於HPLC分析的峰所述溶液的吸光度為1.0至1.5O.D.(光密度)；然後通過在所述溶液中加入3-4體積己烷結晶紫杉醇。
13.根據權利要求10或11的方法，其中在步驟(e.2)中將在步驟(e.1)中通過色譜法獲得的含紫杉醇的富集級分收集在一起並蒸發直至對於相應於HPLC分析的峰所述富集級分的吸光度達到1.0至1.5O.D.(光密度)；然後通過在所述富集的溶液中加入1.5-2體積的己烷結晶紫杉醇。
14.根據權利要求10至13任一項的方法，其中在步驟(e.4)中，過濾或離心在步驟(e.3)中得到的晶體，然後溶於丙酮形成溶液；所述溶液然後與矽膠混合併在通風下乾燥；被紫杉醇覆蓋的矽膠被加載到也含有矽膠的色譜柱中；然後用有機溶劑基的洗脫混合物再提純紫杉醇，所述洗脫混合物含有30％-40％的丙酮和60％-70％的己烷。
15.根據權利要求10至13任一項的方法，其中在步驟(e.4)中，過濾或離心在步驟(e.3)中得到的晶體，然後溶於丙酮形成溶液；所述溶液然後與矽膠混合併在通風下乾燥；被紫杉醇覆蓋的矽膠被加載到也含有矽膠的色譜柱中；然後用有機溶劑基的洗脫混合物再提純紫杉醇，所述的洗脫混合物含有95％-98％的二氯甲烷和2％-5％的異丙醇。
16.根據權利要求10至15任一項的方法，其中在步驟(e.5)中，將在步驟(e.4)中通過色譜法得到的含紫杉醇的富集級分根據它們的純度合併，蒸發至幹，然後溶於丙酮形成溶液，調節丙酮的量從而使得對於相應於HPLC分析的峰所述溶液的吸光度為1.0至1.5O.D.(光密度)；然後通過在所述溶液中加入3-4體積己烷結晶紫杉醇。
17.根據權利要求10至15任一項的方法，其中在步驟(e.5)中，將在步驟(e.4)中通過色譜法獲得的含紫杉醇的富集級分收集在一起並蒸發直至對於相應於HPLC分析的峰所述富集級分的吸光度達到1.0至1.5O.D.(光密度)；然後通過在所述富集的溶液中加入1.5-2體積的己烷結晶紫杉醇。
18.根據權利要求10至15任一項的方法，其中在步驟(e.5)中，將在步驟(e.4)中通過色譜法得到的含紫杉醇的富集級分根據它們的純度合併，蒸發至幹，然後溶於乙醇形成溶液，調節乙醇的量從而使所述溶液相應於HPLC分析達到約5-10mg/ml的紫杉醇濃度；然後通過在所述溶液中加入3-4體積己烷結晶紫杉醇。
19.根據權利要求10至15任一項的方法，其中在步驟(e.5)中，將在步驟(e.4)中通過色譜法得到的含紫杉醇的富集級分根據它們的純度合併，蒸發至幹，然後溶於乙酸乙酯形成溶液，調節乙酸乙酯的量從而使所述溶液相應於HPLC分析達到約5-10mg/ml的紫杉醇濃度；然後通過在所述溶液中加入3-4體積己烷結晶紫杉醇。
20.根據權利要求10至15任一項的方法，其中在步驟(e.5)中，將在步驟(e.4)中通過色譜法得到的含紫杉醇的富集級分根據它們的純度合併，蒸發至幹，然後溶於乙醚形成溶液，調節乙醚的量從而使所述溶液相應於HPLC分析達到約5-10毫克/毫升的紫杉醇濃度；然後通過在所述溶液中加入1-2體積己烷結晶紫杉醇。
21.根據權利要求10至20任一項的方法，其中在步驟(e.3)中，所述揮發性溶劑選自丙酮、C1-C3輕質醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷和其混合物。
22.根據權利要求10-21任一項的方法，包括附加步驟從步驟(e.1)分離紫杉醇之前的洗脫級分中以及從步驟(e.2)和(e.3)結晶後得到的混合物中用甲醇萃取9-二氫-13-乙醯基漿果赤黴素III的晶體；並且將這樣萃取的結晶用丙酮-己烷的混合物重結晶。
全文摘要
公開了一種從含紫杉醇的紫杉烷天然來源提取和純化紫杉醇的方法，包括步驟a)用去離子或純水洗滌含有紫杉醇的原料，該原料來自紫杉烷天然來源，所述的洗滌將可溶雜質從所述原料中除去；b)用有機溶劑萃取洗滌後的原料，得到含紫杉醇的溼原料；c)將所述的溼原料和鹽接觸，通過沉澱得到生物質，然後分離並乾燥所述的生物質；d)通過將所述生物質溶於丙酮或丙酮－己烷混合物中從這樣分離並乾燥的生物質除去樹脂和天然色素，然後向其中加入至少一種極性溶劑直至得到富含紫杉醇的油相；e)將前述步驟中得到的富含紫杉醇的油相在揮發性溶劑中用色譜法提純至少一次，得到提純的溶液，然後將通過色譜法得到的提純溶液至少結晶一次。這種方法有利地減少了雜質和通過沉澱從生物質中得到紫杉醇及其類似物萃取物的體積，減少了提純的步驟，增加了得到的紫杉醇的量；並且將生產成本降低到更經濟的水平。
文檔編號C07D305/14GK1774431SQ200480009790
公開日2006年5月17日 申請日期2004年1月27日 優先權日2003年2月27日
發明者T·拜-卡克, M·伯蒂爾 申請人:沙徹姆製藥國際公司