獲得無標記植物的轉化方法及由此獲得的植物的製作方法

2023-10-06 08:29:24

專利名稱：獲得無標記植物的轉化方法及由此獲得的植物的製作方法
自從上世紀70代末和80年代初，發現土壤桿菌spp(agrobacteriumspp)的Ti(腫瘤誘導(tumor inducing))質粒可用作植物遺傳工程化中的載體後，使用轉化細菌如土壤桿菌spp轉化植物來獲得可表達感興趣的異源基因或基因片段的方法已為大家知曉。野生型質粒誘導植物細胞產生腫瘤細胞，但是它可經修飾並攜帶外源基因構建體進入細胞而無需使受體細胞腫瘤化。在腫瘤誘導過程中，Ti質粒的一個特異性片段，稱為T-DNA(轉移DNA(transferred DNA))，整合進入宿主植物細胞核DNA。在植物的遺傳工程化中，所述T-DNA被修飾並攜帶可被整合進入植物DNA的外源基因構建體以獲得轉基因植物。
獲得轉基因植物的轉化步驟通常是用一個含有本來非致瘤性土壤桿菌株的轉化細菌感染植物細胞，該細菌具有含T-DNA載體構建體並允許所述構建體轉移進植物細胞基因組的重組核酸，所述構建體基本上包含希望在最終的轉化植物中表達的所需核酸，基因或基因片段和選擇標記核酸或選擇基因。這個所需的異源基因和標記通常位於質粒或載體的一段T-DNA上，該DNA側翼有至少一個，或位於被稱為T-DNA邊界的兩個通常為24個鹼基對長的不完全(imperfect)正向重複之間。轉移異源基因/選擇基因構建體進入植物細胞發生在vir基因(定位於相同或不同的質粒)涉及的調控T-DNA/基因構建體的轉移和整合過程中。Vir-蛋白(D1和D2)在精確位點產生邊界重複的缺口，T-DNA構建體從質粒的T-DNA邊界處被切下並插入植物基因組。
這樣處理後的植物細胞在適當的環境中生長，所有的植物都可再生，其中的一些帶有所需基因。為了在未經轉化的細胞背景中選擇所需的轉化細胞，編碼所述選擇基因的DNA及其表達方式通常與允許轉化株回收的T-DNA上的感興趣的基因有物理上的連接。通常認為在T-DNA上存在這樣的選擇或標記序列是有效回收的一個絕對條件；否則，數以千計到數以萬計的假定轉化株需要被篩選以證明所需異源基因的存在和功能性插入。或者，假定的轉化株總是在選擇培養基或選擇壓力下生長，這適合讓選定的選擇標記使轉化細胞比最初的過剩的非轉化細胞具有選擇性優勢。
歷史上，植物選擇標記是顯性基因，表達後可對抗加入再生培養基的選擇性物質，但是它自身非細胞生長所必需。將這樣的選擇物質例如抗生素、除草劑、胺基酸或胺基酸類似物以毒性濃度加入植物或植物培養基中。在植物轉化中使用最廣泛的選擇標記或選擇基因，在EP 131623中提到的對抗選擇物質卡那黴素的細菌新黴素磷酸轉移酶基因(nptI、nptII和nptIII基因)和在EP 186425中提到的對抗潮黴素的aphIV基因。EP 275957揭示了抗除草劑L-2-氨基-4-(羥基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinotricin)的鏈黴菌屬viridochromogenes乙醯基轉移酶基因的應用。在EP 218571中提到了對抗除草劑草甘膦(glyphosate)的植物基因。抵抗力是基於編碼與N-磷酸甲基甘氨酸(N-phosphomethylglycine)耐受性相關的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合酶(5-enolshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)基因的表達。某些胺基酸例如賴氨酸、蘇氨酸或賴氨酸衍生物氨基乙烷基胱氨酸(AEC)和色氨酸類似物如5-甲基色氨酸，由於高濃度使用時可抑制細胞生長，也可用作選擇物質。在這個選擇系統中，選擇標記基因的表達導致可在選擇下生長的轉基因細胞的胺基酸生產過剩。
另一類選擇標記是那些可以支持轉化植物細胞在非轉化細胞不能充分生長的狀態下生長和增殖的標記，例如，缺乏植物生長激素的狀態。一個選擇標記基因可編碼一個酶，其表達後，將加密(encryptic)碳源轉換為支持轉化植物細胞在含最低營養物的環境下生長和繁殖的碳源，並且在此環境下碳源被加密碳源或隱藏的碳源所代替，不能被非轉化細胞所利用。這樣一個選擇標記例如是磷酸甘露糖異構酶，其將不能利用的甘露糖-6磷酸轉換為可被植物細胞用作碳源的果糖-6-磷酸(US 6143562中提到)或赤色鏈黴菌的木糖異構酶(Haldrup A.等1998，Plant CellReport 1876-81)。
然而另一類選擇標記基因允許對推測的已轉化植物細胞進行篩選，而不是對轉化細胞抵抗毒性物質如抗生素的直接遺傳選擇。為此，它們也常被稱為篩選性標記。這些基因稱作報導基因，包括例如β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、β-牛乳糖、螢光素酶、氯黴素乙醯基轉移酶和綠色螢光蛋白(GFP)。
或者，篩選標記可以提供一些其他可見的活性反應。例如，物質存在時，其產生不表達篩選標記基因的植物或植物細胞相關的獨特外觀或生長模式，此物質或者直接應用於植物或植物細胞或存在於植物或植物細胞生長培養基中。
通常，包含這樣篩選性標記基因的植物或植物細胞具有便於鑑定的獨特表型，即，它們可與非轉化細胞區別開。特有的表型可鑑定包含該構建體的細胞、細胞群、組織、器官、植物部分或整個植物。形態異常誘導(MAI)標記基因的例子是土壤桿菌的異戊烯轉移酶基因(Keller等WO 00/37060)。異戊烯轉移酶是一種植物生長激素——細胞分裂素生物合成的一個限速酶。導入了ipt基因的植物細胞產生細胞分裂素，導致含有ipt基因的細胞的增殖和分化混亂，而引起了各種形態異常。
在最終獲得的轉基因植物中，抗生素抗性基因和其他選擇標記序列的存在在大多數情況下認為是不合需要的。雖然，認為這些序列對轉化過程是必需的，通常對於最終轉化植物的確是無用的，並且事實上由於大量的原因消費者想要減少它。消費者組織對在食物產品中抗性標記的廣泛分布表示關切，提出存在轉基因選擇基因橫向轉移進入腸道細菌的理論風險。
環境組織關注轉基因植物與相關物種之間交叉授粉的風險，它可導致抗性轉移到雜草裡，危害轉基因農作物的長期使用並導致潛在的生態學問題。因此，生產無標記植物將可能減輕公眾接受轉基因農作物的厭煩情緒。
目前為止，已發展了許多系統促進除去選擇標記基因。兩個不同構建體的共轉化(co-transformation)可產生整合了兩個基因的轉基因系並且在遺傳交叉後，選擇標記可與感興趣的基因隔離開來。WO 95/16031，US 6265638和WO 00/18939提到通過共轉化除去選擇標記基因。但是，共轉化系統要求標記基因定位於非連鎖的位置，意味著篩選許多更獨立的轉化事件。而且，許多交叉授粉和特別是無性繁殖的農作物，尤其是有塊莖的農作物如馬鈴薯和木薯，是高度雜合的，通過遺傳隔離除去標記序列將需要許多年才能找到一個具有合適的野生性能的克隆。幾個轉座元件系統和位點特異重組系統已被用於除去標記(Sugita K，等2000Plant J 22461-469；Zuo J，等2001 Nature Biotech 19157-161)。EP 716147描述載體介導一個所需基因進入植物，其包含感興趣的基因和至少一個放置在可切除的DNA元件即轉座元件或位點特異重組系統中的形態異常誘導(MAI)標記基因。轉化含有基因構建體MAI的植物可通過肉眼觀察枝的異常形態而易於檢測。同樣地，轉座元件轉座後或重組系統位點特異切除後，通過觀察出現正常形態的枝，很容易檢測出MAI基因功能的丟失。不需進行交叉步驟，可生成這樣的無標記基因的轉基因植物。這些系統要求表達一個轉座酶或重組酶，其介導重組或轉座酶靶序列之間的相等區域的缺失和隨後通過遺傳隔離除去標記基因。並且，對於主要為無性繁殖的物種，這些系統是耗費時間的，也是不切實際的。而且，缺失的片段可再插入基因組的其他位置。另一個誘導DNA缺失的方法是構建2個同源序列之間的染色體內同源重組。染色體內同源重組頻率對於有效應用這個系統產生轉基因區域的缺失而言極低。利用噬菌體λ的attP區可以提高這個重組頻率(Zubko E.等2000 Nature Biotech 18442-445)。但是，這個過程仍然不可預知並且效率太低以至不能產生數百至數千個獨立的轉化事件來發現適合於農業生產的克隆。不使用選擇標記來回收轉基因細胞的系統已被描述。在WO 98/51806中揭示了一個通過使用節培養物(nodal culture)和非選擇性篩選分析富集轉基因部分而不使用選擇標記的回收轉化細胞的方法。這個方法涉及包含非選擇性的可分析的轉基因的培養轉化植物細胞或組織直到發育了包含分生組織的節點。隨後，使用一個非選擇性測定分析植物組織，如酶分析或ELISA。用這個方法回收的分析陽性植物是嵌合的並有轉化部分。從陽性組織結的外植體富集這些轉化部分並培養成枝。再使用非選擇性測定分析枝和葉，希望回收了富含轉化部分的植物以便於最終經過幾輪分析後，獲得接近均一的轉基因植物。

發明內容
本發明提供了產生轉基因植物的方法，所述轉基因植物特別是交叉授粉和無性繁殖的農作物，其包含一個所需基因，並且基本上無其他外源或異源輔助核酸如選擇標記基因，因此不需經選擇物質處理進行篩選。所有上述提及的產生無標記轉化株的系統都假設分離不含選擇標記的非嵌合轉化株實際上是不可行的，至少使用T-DNA構建體或相應的轉化細菌的轉化方案是不行的。在此提供的方法可以產生包含所需基因的植物，但其基本上沒有用於轉化植物的載體序列和/或標記序列。令人驚訝的是，本發明提供了轉化植物或植物細胞的方法，包括使用轉化細菌如土壤桿菌spp，和它的T-DNA來獲得表達所需的感興趣的異源基因的非嵌合轉基因植物，其中所述T-DNA具有所需基因或基因片段，但是不包含額外的選擇基因或其片段。
為此，本發明提供了含有T-DNA或其功能性等價物的分離或重組核酸，其允許所述T-DNA轉移進植物細胞的基因組或核DNA，所述T-DNA具有不含編碼選擇標記的核酸的核酸，並提供了這樣的T-DNA構建體在植物遺傳工程化中的應用。因此，此處提供的方法不需要在選擇性培養基中或處於選擇性壓力下生長假定的轉化株而使真正的轉化植物出現。相反，所需轉化株的選擇易於通過檢驗所需異源基因或基因片段或自身構建體的存在而實現，例如，使用熟知的核酸技術，如聚合酶鏈反應檢測或常規Southern印跡實驗的互補序列雜交法。很顯然對本領域中的技術人員，通過監測基因表達產物的存在或缺失或量的改變可分析所需異源基因或基因片段的存在。例如，一個可用ELISA(酶聯免疫吸附測定)檢測的表達蛋白，用ELISA分析該蛋白的存在。而且，此處提供的方法可涉及生物鑑定或化學分析方法如氣相層析/質譜(GC/MS)。需要對用於轉移所述T-DNA構建體進入植物細胞DNA的重組T-DNA構建體，特別是具有所需無編碼選擇標記核酸的外源核酸的構建體部分的存在或缺失進行檢測。本發明優選的核酸包含一個T-DNA構建體，其包含至少一個T-DNA邊界，但是為了易於整合，優選的所述外源核酸的兩側有T-DNA邊界重複序列或其功能性等價物。土壤桿菌宿主細胞的VirDl和VirD2蛋白識別邊界重複序列，並在每個邊界重複鏈末端的第三和第四個鹼基之間產生一個單鏈切口。這些切口決定了分別位於左右邊界的T鏈的啟始終止位點。發現左邊界對於T-DNA的轉移是非必需的，但它幫助定義界定了T-DNA的左末端。右邊界對於T-DNA轉移似乎極其重要。T-DNA右邊界區域缺失的Ti質粒通常不具有毒力(Holsters，M.等Plasmid 3，212-230，1980)。缺失左邊界區域對於毒力無影響。重複序列的序列前後關係決定了它們在T-DNA轉移時的相對活性。(Wang等Mol.Gen.Genet.210，338-346，1980)。一個典型的pBIN19質粒的邊界重複的實例是右邊界5』-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3』和左邊界5』-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC-3』。當然，用本發明的核酸很容易實現本發明，其中所述Ti-DNA來源於土壤桿菌spp的Ti質粒，特別是其中所述土壤桿菌包含一個根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)，所述細菌和專門技術可廣泛獲得。
在一個實施方式中，提供了本發明的核酸，其中所述外源核酸可以調控所述基因組中靶基因的表達。通過「sense」技術可以實現上調(或過表達)和下調。如果全長拷貝的靶基因插入了基因組，則可獲得一系列表型，一些過表達靶基因，一些低表達。篩選用這個方法生產的植物種群並分離各個表型。一個優選的實施例包含一個方法，其中所述調控包含下調。抑制一個靶基因的表達，通常稱為「基因沉默」，可通過「反義下調」和「有義下調」(也稱為「共抑制(cosuppression)」)實現。在反義下調中，與內源性靶基因的全部或部分互補的DNA片段以反方向插入基因組。雖然還沒有完全闡明機制，一個理論是，這樣一個反義基因轉錄產生的mRNA與內源性基因mRNA轉錄產物在序列上互補。反義mRNA與天然產生的「有義」mRNA結合形成一個抑制天然mRNA翻譯成蛋白的雙螺旋。反義下調技術為本領域技術人員熟知並在全世界的實驗室常規使用。因此，將靶基因編碼序列的至少一個片段的拷貝插入靶生物體的基因組實現基因沉默，其拷貝包含或者全部或者部分或截短的序列並為有義或反義方向。此外，使用可能得自於基因組基因序列的內含子序列構建抑制載體。有報導，在生物體中已實現轉基因和內源性基因的基因沉默，其中只在啟動子區域內序列一致。
在一個更優選的實施方式中，本發明提供了一個T-DNA構建體，其中所述外源核酸包括至少一個部分所述靶基因的聚核苷酸區域的反向重複。雖然，反義和有義下調可導致完全的靶基因沉默，通常效率不是很高。最多有25％的反義轉化株呈現完全的沉默，而只有約10％的用有義構建體獲得的轉化株顯示一定水平的沉默(Smith等，2000，Nature 407319-320；Wolters和Visser，2000，Plant Mol Biol 43377-386)。最近，觀察到當基因沉默載體包括一個靶基因的多聚核苷酸區域的所有或部分反向重複時，對生物體內選擇靶基因的抑制是增強的。反向重複序列由一個T-DNA組成，其帶有一個操縱有義cDNA拷貝表達的啟動子和一個位於相同的cDNA的反義拷貝前面的另一啟動子(Chuang和Meyerowitz，2000 Proc Natl Acad Sci USA 974985-4990)，或者該T-DNA包含在2個末端側翼存在啟動子的cDNA序列(LaCount等2000 Mol Biochem Parasit11167-76)，或者該T-DNA包含操縱該cDNA(的部分)的反向重複序列轉錄的啟動子(Hamilton等1998；Smith等2000 Nature 407319-320；Wang和Waterhouse，2000 Wang MB，Waterhouse PM(2000)Plant Mol Biol4367-82)，或者被沉默基因的啟動子(Mette等2000 EMBO J 195194-5201)。據報導在使用一個內含子作為重複序列間的間隔區時，一些反向重複構建體導致了100％的轉化株呈現靶基因沉默(Smith等2000Nature 407319-320)。間隔片段增加了正確反向重複序列的穩定性，但是對於沉默的特異性不是必需的。在本發明核酸的一個特殊優選實施方式中，所述靶基因編碼澱粉粒束縛澱粉合酶(granule-bound starch synthase，GBSSI)。此處詳細描述了在編碼轉基因馬鈴薯澱粉粒束縛澱粉合酶(GBSSI)的靶基因的短重複區域後完全沉默的轉化株發生頻率有顯著增加。
還提供了本發明的核酸，其中所述外源核酸可以在所述植物細胞內表達異源多肽。適當的多肽是多形式的，所需轉化非標記進入植物的外源核酸或基因的典型實例是那些編碼修飾新陳代謝和分解代謝過程的蛋白和酶。其他實例是可編碼增加植物作為食物或農作物時營養價值的蛋白的基因。典型的實例包括可抑制抗營養因子形成的植物蛋白和具有更多所需胺基酸成分(如，較非轉基因植物具有更高的賴氨酸含量)的植物蛋白。一個優選的實施方式中，所述核酸或所需基因編碼包含酶的多肽。所需基因可編碼在食物處理過程中使用的酶，如凝乳酶、奇(異果)甜蛋白和α-牛乳糖。所需基因也可以編碼引入或增加病原體抗性的物質。所需基因可編碼有利於動物或人類的非天然植物混合物。例如，所需基因可編碼藥物性活性蛋白或酶如胰島素、幹擾素、人血清白蛋白、人生長因子和凝血因子等任何一個治療用化合物。在這點上，轉化細胞或生物體可製備合意的很易從如塊莖中回收的所需混合物。優選地，所需基因是編碼具有高營養價值的蛋白或肽、反饋不敏感的胺基酸生物合成酶類如二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)(EC 4.2.1.52，DHPS)、具有抗病性的酶或肽、有義或反義轉錄如馬鈴薯塊莖儲藏蛋白、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、α-澱粉酶、分支酶、澱粉粒束縛澱粉合酶、可溶性澱粉合酶、蛋白酶或葡聚糖酶的基因。
本發明也提供了包含本發明的核酸的載體或質粒和包含這樣載體或核酸的宿主細胞。一個優選的宿主細胞包含土壤桿菌。對操作本發明的轉化方法，優選使用充分致命性的土壤桿菌如根癌土壤桿菌，例如代表性的A281株或其來源的菌株或本領域可獲得的其他毒性株。這些土壤桿菌株帶有一個來源於包含virB、virC和virG基因的Ti質粒pTiBo542的毒力區域的DNA區域。根癌土壤桿菌的毒力基因(vir gene)產物協調T-DNA的處理和它進入植物細胞的轉化。Vir基因表達由virA和virG控制，其中通過磷酸化作用，virA在感受到誘導信號後激活virG。VirG依次誘導virB、C、D、E的表達。這些基因編碼的蛋白涉及DNA的轉化。PTiBo542毒力增強被認為是Ti質粒上的超毒性virG基因引起的(Chen等Mol.Gen.Genet 230302-309，1991)。但是，除使用感染性土壤桿菌外，當人們希望實施本發明時，存在其他的方法可有效的傳遞DNA進入受體植物細胞。傳遞DNA進入植物細胞的合適方法事實上包括DNA導入細胞的任何方法，如PEG介導的轉化原生質體的DNA的直接傳遞(Omirulleh等，1993)，乾燥或抑制介導的DNA吸收(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199183-188，1985)、電穿孔法(U.S.專利號5,384,253)、金剛砂光纖振蕩(Kaeppler等，1990；U.S.專利號5,302,523；和U.S.專利號5,464,765)、DNA包被顆粒的加速度法(U.S.專利號5,550,318；U.S.專利號5,538,877；和U.S.專利號5,538,880)。通過應用這些技術，任何植物種類的某些細胞可被穩定地轉化，並且這些細胞發育為轉基因植物。
在微彈法中，顆粒可被核酸包被並經推動力傳遞進入細胞。代表性的顆粒包括那些由鎢、金、鉑和相似物組成的顆粒。預期在一些情況下，DNA沉澱在金屬顆粒上對於使用微彈法將DNA傳遞給受體細胞不是必需的。但是，預期顆粒可能包含DNA而不是被DNA包被。與目前發明相一致的微彈轉化法、物理和生物因素都可被優化。物理因素是那些涉及操作DNA/微粒沉澱物或那些影響大的或微小顆粒的射程和速度的因素。生物因素包括涉及轟擊之前和之後的操縱細胞的所有步驟，如靶細胞的滲透性調控以有助於減輕轟擊相關的損傷，與顆粒彈道相關的靶組織的定向，和轉化DNA的性質，如線性化的DNA或完整的超螺旋的質粒。人們認為轟擊前的操作對於成功轉化是非常重要的。
因此，人們希望在小範圍研究調整不同的轟擊參數以得到完全優化的條件。人們特別希望調整物理因素可能是DNA濃度、間隙距離、飛行距離、組織距離和氦壓力。進一步預期氦的級別可影響轉化效率。人們也可通過改變影響受體細胞生理狀態並因此影響轉化和整合效率的環境來優化損傷減少因素。例如，調整滲透狀態、組織水合和次培養期或受體細胞的細胞周期以優化轉化。用於微粒轉化的轉化DNA包含一個表達盒，通常其含有希望導入細胞的cDNA，一個基因或幾個基因，並進而包括可操縱連接外源基因的啟動子和3』區域。在本發明中描述了最優化的基因構建體。DNA片段額外包括第2、第3、第4、第5、第6或任意附加數目的被放置在單個DNA分子上並被轉化進入受體細胞的外源基因。
本發明的一個特殊實施例中，DNA片段不包括轉化選擇或篩選標記基因。通常，除所需基因外，人們使用選擇或篩選標記基因提高鑑別轉化株的能力。「標記基因」是賦予表達標記基因的細胞清晰表型的基因，因此可以區別這樣的轉化細胞與無標記的細胞。這樣的基因可以編碼選擇或篩選標記，取決於是否標記賦予了可通過化學方式進行選擇的特性，即，通過使用選擇性物質(如除草劑、抗生素、胺基酸類似物或相似物)，或者它是否僅僅是一個通過觀測或測試而鑑別的特性，即，通過「篩選」(如R-基因座(R-locus)特性、β-葡萄糖苷酸酶或uidA基因)。為生產無載體DNA序列的轉化株，希望傳遞DNA進入不包含維持細菌宿主內質粒載體所必需的DNA序列的細胞，如E.Coli，例如抗生素抗性基因，包括但不限制於氨卡青黴素、卡那黴素和四環素抗性，及DNA複製的原核起點。在這種情況下，包含轉化DNA的DNA片段可在轉化前被純化。例如在瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳實現純化，隨後從瓊脂糖凝膠上回收DNA片段。
經去磷酸化或核酸片段平末端化對核酸片段末端進行的修飾可控制引入的轉基因拷貝數量和有效地生產低拷貝轉化株(WO 99/32642)。本發明用微彈法轉化的受體植物細胞可能來源於潛在的任何可轉化的單子葉或雙子葉植物。本發明使用的優選的單子葉植物細胞來源於大米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、粟、高粱、甘蔗、草坪和玉米。本發明使用的優選的的雙子葉植物細胞包括棉花、西紅柿、柑橘、菸草、大豆和特殊的馬鈴薯和木薯。
實現將外源DNA傳送進入受體細胞後，通常下一步涉及鑑定轉化細胞以便更進一步培養和再生植物。在本發明中，傳送了外源DNA後的細胞在支持植物再生的培養基中培養。枝發育後，使用DNA或RNA檢測方法檢測包含一個或更多轉基因的苗。方法包括依據標準方法從苗或一組小苗中分離核酸。(Sambrook等，1989)。本發明提供了使用核酸檢測方法決定是否一個轉化植物細胞或其子代轉化了重組核酸，該方法包含測試所述細胞或所述子代是否存在或缺失所述核酸或其來源的基因產物。核酸可以是基因組DNA、RNA或mRNA。例如，使用這樣一個方法測試出現在基因構建體中的特殊基因的存在和重排，即，使用一種質量控制檢查是否一個植物細胞已被充分轉化。本發明提供了使用mRNA檢測方法決定是否轉化的植物細胞或其子代的核酸構建體充分整合進入植物基因組並轉錄為mRNA構建體。使用直接(DNA)或間接(RNA)擴增方法在樣品中鑑定了部分轉基因的所需特異性核酸。其次，檢測已鑑定的產物。在某些應用中，通過可見方法進行檢測(如，凝膠的溴化乙錠染色)。或者，檢測涉及化學發光、放射標記或螢光標記的放射性閃爍照相或甚至電或熱脈衝信號系統來間接鑑定產物。使用一系列不同的測試方法篩選使用本發明的方法產生的轉基因植物。這些技術用於檢測特殊基因的存在及可能出現在基因構建體裡的重排。這些技術包括但是不限於，聚合酶鏈反應(PCR)、螢光原位雜交(FISH)、直接DNA測序、PFGE分析、Southern或Northern印跡、單鏈構象分析(SSCA)、RNA酶保護分析、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)、斑點印跡分析、變性梯度凝膠電泳、限制性片段長度多態性(RFLP)和PCR-SSCP或基於DNA技術的晶片。本發明提供了應用核酸檢測方法來決定是否轉化的植物細胞或其子代被重組核酸轉化，該核酸包含一個整合進入植物細胞基因組的T-DNA構建體或功能性等價核酸構建體。而且，本發明提供了使用核酸測試方法決定是否一個轉化植物細胞或其子代被重組核酸轉化，包括測試所述細胞或所述子代的非所需載體材料例如載體主鏈序列的存在或缺失。例如，使用本發明的方法檢測是否轉化的植物細胞基本上沒有輔助的非所需核酸。用核酸測試方法鑑別轉化的苗，然後讓其發育成植物。再生植物進入莖和根發育階段後，它們可被移入溫室進一步生長和測試。
此外，本發明提供了包含本發明核酸的植物細胞和來源於這樣植物細胞的再生植物，或其部分。特別提供的是塊莖植物或其部分，其優選的選自馬鈴薯或木薯植物種群。此處提供的這樣的馬鈴薯或木薯植物包含所謂的無標記的高支鏈澱粉塊莖(例如馬鈴薯或木薯)，由於編碼澱粉粒束縛澱粉合酶基因的下調而基本上缺少直鏈澱粉。這樣的馬鈴薯或木薯植物含有的直鏈澱粉容量少於5％，並且基本上不含有任何轉化選擇標記基因例如抗生素或抗除草劑基因。此外，在優選的這些植物的基因組中沒有整合用於轉化過程的載體序列，例如全部或部分土壤桿菌Ti質粒，和包含低拷貝數的T-DNA插入，優選一個拷貝。也提供了高賴氨酸植物(優選馬鈴薯或木薯)，其含有的賴氨酸超過總游離胺基酸含量的20％，或甲硫氨酸超過總游離胺基酸含量的15％，或超過30％的直鏈澱粉，或超過2％的凝固蛋白質，而基本上不包含轉化選擇標記基因例如抗生素或抗除草劑基因，在它們的基因組中沒有整合用於轉化過程的載體序列，例如全部或部分土壤桿菌Ti質粒，並包含低拷貝數的T-DNA插入，優選一個拷貝。
本發明提供了轉化植物細胞的方法，包含提供本發明的重組核酸給植物細胞，包含測試所述細胞或至少部分所述細胞子代中所述核酸或其來源的基因產物的存在或缺失，其中所述測試包含核酸檢測方法的使用。在一個實施方式中，使用核酸檢測方法篩選假定的轉化株種群檢測其子代來源的植物細胞中外源核酸的存在或缺失，在未轉化細胞的背景下鑑別所需的轉化細胞。特別地，核酸測試方法，例如PCR方法，用於鑑別轉化的塊莖植物細胞，其優選的選自馬鈴薯或木薯植物。在一個實施方式中，本發明提供了不包含選擇標記基因的產生和分離顯示內源基因沉默或內源基因過表達的轉化株的方法。
在此，我們顯示使用這個方法甚至可能獲得基本上無標記基因、無載體DNA主鏈的轉化株，只有1個T-DNA的插入，其中內源基因沉默或過表達。此外，已經證明這個方法可產生均一的和非嵌合的轉化株。在另一個實施例中，提供了表達異源基因的轉化株的生產和分離方法，同樣地，所述轉化株基本上無標記和載體DNA主鏈。用本發明的方法鑑別的轉化細胞可進一步培養並獲得帶有所需基因的基本上無標記的植物。本發明提供了使用蛋白質測試方法決定是否在轉化植物細胞或其子代內的重組核酸構建體充分地整合進入植物基因組並調控植物細胞基因組的靶基因表達。本發明的蛋白質測試方法也可用於確定植物細胞內蛋白質的表達水平，其中基因表達是被調控的，例如，採用基因沉默或下調技術抑制靶基因表達。採用酶分析或免疫測定，例如，ELISA分析、Western印跡、斑點印跡分析或類似實驗確定外源核酸轉化植物細胞後靶基因的下調程度或基因的過表達水平，進行轉化株的選擇。本發明的蛋白質測試方法可以檢查在植物細胞或其子代的某個發育階段中是否在植物細胞或植物組織中表達外源核酸。這樣的外源核酸可編碼異源多肽，例如一個酶。如述，提供了一個方法，其中不需要在選擇培養基的選擇壓力下培養真正的轉化細胞以排除非轉化細胞，使用本發明方法的轉化效率很高以至不再需要選擇培養。本發明提供了轉化植物細胞的方法，其包含提供含有T-DNA構建體或其功能等價物的重組核酸給植物細胞，其中所述植物細胞為塊莖植物細胞，包含測試所述塊莖植物細胞或至少其部分子代的所述核酸或其基因產物的存在或缺失，其中所述測試包含使用核酸測試方法。本發明方法的一個方法特別適宜獲得無標記塊莖植物，因為塊莖植物是高度雜合併且通過常規遺傳分離基本上不遠交異型雜交標記基因。在本發明中，要求測試至少部分所述細胞的子代中本發明的核酸的至少功能性部分的存在或缺失。這樣的子代由部分根或枝，或單個細胞組成，因此，為進一步的再生和無性繁殖留下充足的轉化材料。優選的通過使用核酸測試方法和/或表型篩選選擇轉化株如轉化的枝。採用Southern雜交、聚合酶鏈反應程序和其他本領域內可獲得的測試方法檢測帶有所需基因和無輔助核酸的轉化株。這樣的測試可進一步包含測試至少部分所述細胞的子代中存在或缺失非所需的載體核酸。簡言之，這個發明提供了生產包含所需基因和基本上無輔助的非所需核酸的轉基因植物的方法。在優選的實施例中，本發明提供了轉化植物的最優化的轉化步驟，使用(優選有毒力的)土壤桿菌株，優化的有效抑制或過表達基因的基因構建體和生化測試而不是選擇壓力測試轉化株的有效方法，例如，通過Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應(PCR)程序或其他可獲得的核酸測試方法。
在另一個優選的實施方式中，本發明提供了轉化塊莖植物細胞的方法，提供含有無編碼選擇標記的核酸的T-DNA構建體的重組核酸給所述細胞，所述構建體具有編碼澱粉粒束縛澱粉合酶(GBBI)的靶基因，包含測試至少部分所述塊莖植物細胞子代中所述靶基因的存在或缺失，其中所述測試包含使用核酸檢測方法，例如使用PCR技術。


圖1.GBSS cDNA反義基因沉默載體圖譜圖2.質粒pMTL1.1圖譜，該質粒包含用於製備圖4、5、6、7、8、13、14和15質粒的GBSS cDNA的1.1 kb的5′末端圖3.質粒pMTL1.3圖譜，該質粒包含用於製備圖4、5、6、7、8、13、14和15質粒的GBSS cDNA的1.3kb的3′末端。
圖4.帶有nptII選擇標記基因的GBSSI基因沉默載體pKGBA50-IR1.3，其包含被GBSS cDNA的1.1kb的5′末端中斷的反向重複構型的GBSS的cDNA的1.3kb的3′末端。
圖5.帶有nptII選擇標記基因的GBSSI基因沉默載體pKGBA50-DR1.3，其包含被GBSS cDNA的1.1kb的5′末端中斷的串聯重複構型的GBSS cDNA的1.3kb的3′末端。
圖6.帶有nptII選擇標記基因的GBSSI基因沉默載體pKGBA50-IR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中斷的反向重複構型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。
圖7.帶有nptII選擇標記基因的GBSSI基因沉默載體pKGBA50-DR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中斷的串聯重複構型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。
圖8.無選擇標記的GBSSI基因沉默載體pKGBA50mf-IR1.1，其包含被GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中斷的反向重複構型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端。
圖9.帶有4個不同GBSSI基因沉默構建體的馬鈴薯植物cv.Karnico的轉化結果，與傳統的GBSSI反義構建體相比，這些構建體包含反向或串聯重複構型的GBSSI cDNA。挑選出轉化株後，對體外生長的植物加入塊莖誘導培養基。2至6周後，多數枝發育出試管薯。切下塊莖表面所得的澱粉用碘染色。含有被碘溶液染成蘭色的顆粒的轉化株是非沉默的(無)，著紅色的塊莖為沉默的(完全地/強烈地)和著「弱或中等」顏色指示部分沉默的轉化株。
圖10.包含反饋不敏感的無植物轉化選擇標記的受GBSSI啟動子控制的馬鈴薯DHDPS cDNA的質粒pAAP105mf的圖譜。
圖11.來源於不同的獨立轉化株或對照植物的試管薯的游離賴氨酸濃度(佔游離胺基酸總量的％)對體外生長的植物加入塊莖誘導培養基誘導塊莖。2至6周後，大多數枝發育出試管薯。將組織(0.5-1.0克)在2ml含有1mM二硫蘇糖醇的Pi緩衝液中勻漿。加入正亮氨酸作為內在標準。用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)提取來部分純化游離的胺基酸。凍幹濃縮到3ml後，取20微升樣品用HPLC陽離子交換柱(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia biotech)分析。
圖12.質粒pAAP172圖譜，其包含1.1kb的反饋不敏感的用於製備圖13、14和15質粒的受馬鈴薯GBSSI啟動子控制的馬鈴薯DHPS*cDNA。
圖13.構建GBSSI基因沉默載體pKGBA50mf-R1.1，它包含pAAP105的反饋不敏感的馬鈴薯DHPS*cDNA。
圖14.pDHPS-IR1.1(串聯)的T-DNA，其包含GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中斷的反向重複構型的GBSS cDNA的1.1kb的5』末端，和無植物轉化選擇標記的串聯方向的反饋不敏感的馬鈴薯DHPS*cDNA。
圖15.pDHPS-IR1.1(串聯)的T-DNA，其包含GBSS cDNA的1.3kb的3′末端中斷的反向重複構型的GBSS cDNA的1.1kb的5′末端，和無植物轉化選擇標記的反向方向的反饋不敏感的馬鈴薯DHPS*cDNA。
圖16.Southern印跡分析分離無標記、無載體和無直鏈澱粉的馬鈴薯轉化株的DNA。從17個轉化株和一個未轉化的對照株(Karnico)中分離基因組DNA，使用HindIII消化並用NOS終止子探針探察。
具體實施例方式
植物轉化的最優化本發明提到的高通量生產無標記的轉化株要求不依賴於基因型的高效轉化頻率。最優化單和雙子葉植物的轉化方案是許多研究的課題。對轉化塊莖植物如馬鈴薯而言，一些轉化方法已經發表。在這些方案的許多方法中，轉化效率非常倚賴基因型。不同方案間本質的區別是是否在整個再生周期中存在植物生長素或是否愈傷開始階段後不存在生長素而存在赤黴素。發表的方案中的培養基組分和生長素和細胞因子類型和水平也存在不同(Hulme等1992 Plant Molec.Biology 31，161-167)。大量的調查顯示乙烯堆積可抑制馬鈴薯植物的再生，這個抑制作用在存在乙烯生物合成或乙烯活性抑制劑時被克服(Perl等1988 Plant Cell Rep.7，403-406)。因此，一些方案在再生培養基中加入硫代硫酸銀(STS)。轉化方案可進行其他修改以增加轉化效率。例如，WO 0034491提到接種土壤桿菌後，降低潮溼條件使外植體重量減輕可提高轉化效率。在共培養期間減輕外植體重量的可能方法包括增加培養基的滲透壓、添加乾燥劑包括氧化鈣或硫酸或風乾外植體。
但是對於商業性的轉化，單一的對於大範圍栽培品種有效的方案是便利的。比較大量不同的關於再生一系列馬鈴薯栽培品種的方案，Hulme等(1992 Plant Molec.Biology 31，161-167)得出結論，與那些迄今為止已發表的大量馬鈴薯栽培品種方案比較，Hovenkamp Hermelink等(1988Euphytica 39，213-219)的方案較好。在此，我們證明2個關於再生的轉化方案對所獲得的無標記轉化株的數量有重要影響。
轉化效率的最優化優選的用於本發明方法的土壤桿菌株是被修飾包含所需基因，或在轉化細胞中表達的核酸。將被轉移的核酸摻入T區域並且側翼存在至少一個T-DNA邊界序列。本領域已知多種土壤桿菌種，特別對轉化雙子葉植物，包括根癌土壤桿菌和髮根土壤桿菌。見，例如，Hooykaas，P.J.1989Plant Mol.Siol.13327；Smith等1995 Crop Science 35301；Chilton，M.O.1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903119；19148；Ishida等1996 NatureBiotechnol.14745；Komari，T等1996 The Plant Journal 10165。在Ti質粒中，T區域與負責轉移和整合功能的vir區不同。雙元載體系統已得到發展，可操縱的帶有外源DNA的T-DNA和vir功能存在於分離的質粒上。照此，包含外源DNA(所需的被轉移的核酸)的修飾了的T-DNA區域被構建在E.Coli中複製的小質粒內。採用三親本雜交或電穿孔法或凍溶程序將這個質粒接合轉化進包含帶有毒力基因的相容質粒的根癌土壤桿菌中。轉移T-DNA進入植物基因組in trans提供了Vir功能。劇毒vir區域的存在對轉化效率有很大影響。優選的是農杆氨酸的雙元的根癌土壤桿菌株。特別優選可公共獲得的根癌土壤桿菌株EHA101、AGL0或AGL1。這些菌株包含C58細菌染色體和產生於劇毒的根癌土壤桿菌A281的在文獻中稱為TiBO542的Ti質粒的disarmed衍生物。[見，例如，Hood E.E.等，(1986)J.Bacteriology 1681291-1301，Lazo GR.等(1991)Biotechnology9963-967]。
或者，被使用的土壤桿菌株包含具有增強毒性的質粒。優選的是用超雙元載體來實踐本發明。已構建了這樣的超雙元載體，其包含了顯示出極高轉化效率的根癌土壤桿菌A281內的Ti質粒pTiBo542(Jin等(1987))毒力區域的DNA區域(Hood等(1984)Biotechnol.2702-709；Hood等(1986)J.Bacterial.1681283-1290；Komari等(1986)J.Bacteriol.16688-94；Jin等(1987)J.Bacterial.1694417-4425；Komari T.(1989)Plant Science 60223-229；ATCC Accession No.37394)。
超雙元載體包括pTOK162(日本專利申請號(Kokai)4222527、EP-A-504,869、EP-A-604,662和美國專利號5,591,616)和pTOK233(Komari，T.(1990)Plant Cell Reports 9303-306；和Ishida等(1996)NatureBiotechnology 14745)。超雙元載體pTOK162在E.coli和根癌土壤桿菌內複製。另外，載體包含pTiBo542毒性區域的virB、virC和virG基因。經三重雜交，質粒被導入土壤桿菌株(Ditta G等，1980；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777347-7351)。除土壤桿菌株型之外，已知添加酚類化合物如乙醯丁香酮到土壤桿菌懸液可增強轉化效率(見Townsend，J.A.等，US5,563,055)。典型的濃度範圍在100-200μM範圍內。
基因構建體的最優化抑制靶基因的表達，一般稱為「沉默」，可以通過「反義下調」和「有義下調」(也稱為「共抑制」)來實現。反義下調中，與全部或部分內源靶基因互補的DNA片段以反方向插入基因組。該機制尚未完全闡明，一個理論是該反義基因的轉錄產生的mRNA與內源基因轉錄的mRNA在序列上互補。反義mRNA於是和天然產生的有義mRNA結合形成二聚體抑制天然mRNA翻譯為蛋白質。
反義下調技術為本領域所熟知而且在全世界實驗室中被經常使用。過表達和下調都可通過「有義」技術實現。如果靶基因的全長拷貝插入基因組則可獲得一系列表型，有的過表達靶基因，有的低表達。本方法產生的植物能被篩選和分離個體表型。
因此基因沉默可以通過將靶基因的額外拷貝插入目標生物體的基因組實現，該拷貝編碼的序列可以包含全部或部分或是截斷了的序列並可以是有義或反義方向。另外，可能從基因組基因序列獲得的內含子序列可被用來構建抑制載體。已經有報導在轉生物體中實現了轉基因和內源基因的基因沉默，其中只在啟動子區域存在序列一致性。
儘管反義和有義下調可以導致靶基因的完全沉默，但效率通常不是很高。反義轉化株最多25％出現完全沉默，而通過有義構建體獲得的轉化株只有大約10％出現了一定水平的沉默(Smith等2000 Nature 407319-320；Wolters和Visser，2000 Plant Mol Biol 43377-386)。最近，已經觀察到當基因沉默載體包括靶基因的多聚核苷酸的所有或部分反向重複序列時，生物體中選定的靶基因抑制提高了(如WO 99/61632、WO98/53083和WO 99/53050所提到的)。
反向重複序列組成可以是具有驅動cDNA有義拷貝表達的啟動子和位於相同的cDNA的反義拷貝前面的另一個啟動子(Chuang和Meyerowitz，2000 Proc Natl Acad Sci USA 974985-4990)的T-DNA或該T-DNA包含兩端由啟動子銜接的cDNA序列(LaCount等2000 MolBiochem Parasit 111；67-76)，或該T-DNA包含驅動cDNA(部分)反向重複序列轉錄的啟動子(Hamilton等1998；Smith等2000 Nature 407319-320；Wang和Waterhouse，2000 Wang MB，Waterhouse PM(2000)Plant Mol Biol 4367-82)或基因的啟動子(Mette等2000 EMBO J 195194-5201)被沉默了。
在使用內含子作為重複序列間隔時，有些反向重複構建體被報導導致了100％轉化株顯示靶基因的沉默(Smith等2000 Nature 407319-320)。間隔片段賦予了正確的反向重複序列的穩定性，但對沉默的特異性不是必需的。
此處我們證明了超過60％的GBSSI轉化的馬鈴薯與野生型比較，表現了充分的或者甚至很強的減弱的GBSSI活性，其中GBSSI反義基因包含它5』區的額外的上遊反向拷貝。只有14％的用沒有反向重複序列的相似構建體轉化的植物具有減弱的GBSSI活性。
儘管本發明工作的機制尚未完全了解，我們相信反向重複序列的存在可以產生雙鏈RNA，其來源於與被沉默的基因同源的DNA序列。反過來，它被認為引起了由要被沉默的基因轉錄出的內源ssRNA的降解。基於其他人員的研究(Hamilton AJ等(1998)Plant J 15737-746 Stam，M(1997)Annals of Botany 793-12)，我們猜想GBSSI基因表達的抑制主要在轉錄後。或者，Mette MF等((2000)EMBO J 195194-5201)描述了含有驅動要被沉默的基因的啟動子(部分)(Mette等2000 EMBOJ 195194-5201)的反向重複序列轉錄的啟動子的T-DNA導致了轉錄後沉默和啟動子甲基化。
植物中靶基因的過表達水平可被許多因素影響。一個因素是使用的轉錄啟動子的選擇。有很多植物相容的啟動子，包括組織特異的和可誘導的啟動子。證明很好的組成性啟動子包括CaMV 35S啟動子和這個啟動子的串聯排列，如歐洲專利申請No.0342926所提到的。可以操縱表達水平的其它因素是轉錄修飾因子，例如內含子、多聚腺苷酸化和轉錄終止位點。在翻譯水平，可考慮的因素是核糖體結合位點和基因的編碼傾向性。位於啟動子和靶基因間的苜蓿花葉病毒被殼蛋白基因的被殼蛋白基因的mRNA的非翻譯前導序列衍生的翻譯增強子序列可以提高翻譯效率，如US 6037527所提到的。本發明的構建體也可以包含一個或多個編碼信號蛋白的序列，包括前-、原-或前原-序列。這些通常位於序列前方，所以靶基因和信號蛋白表達為融合體。信號序列可以保證任何成熟的融合體形成所需的翻譯後修飾和/或可以特異的指導表達的融合產物到達植物或植物細胞中的部分或細胞器。
而且，已觀察到插入基因組中不同的位點的相同的構建體在植物中表達水平不同。相信這個結果至少部分是由於基因在染色體的位置，即，單個種群有不同的表達水平。這個現象，稱為「位置效應(position effect)」變化，是在獨立的轉化株中同一個基因的表達多樣性。使用所謂的核基質結合序列或支架結構(scaffold)結合序列的天然產生的DNA序列解決這個問題，已在US專利5773689和WO 94/24293中提出。WO 0032800指出核基質結合序列可以在代表單子葉植物和雙子葉植物的植物種類中提高表達。
在優選的實施方式中，控制基因表達的啟動子是強的和組織特異的。已知組織特異的啟動子的例子包括定向於塊莖(tuber-directed)的I型馬鈴薯塊莖儲藏蛋白啟動子(Bevan等，(1986)Nucleic Acids Res 144625-38)、馬鈴薯塊莖GBSSI基因相關聯的啟動子(Visser等1991 PlantMolec Biol 17，691-699)、大豆的β大豆伴球蛋白啟動子(也被稱為7S蛋白的啟動子，其驅動定向於種子(seed-directed)的轉錄(Bray 1987 Planta172364-370))和玉米胚乳的玉米蛋白基因的定向於種子的啟動子(Pedersen等，1982 Cell 291015-26)。
或者，靶基因置於CaMV 35S啟動子的轉錄控制之下。在這個構建中，通過將代表CaMV 35S啟動子部分的DNA片段置於順行的重複序列串聯排列中來提高轉錄活性。
挑選單拷貝和不含載體DNA的轉化株轉化後，T-DNA在宿主植物基因組中以單或多拷貝存在。而且，邊沿外的DNA有時也整合到宿主植物的基因組中。該報導的情況是，在20-30％的轉基因植物(Martineau，B等The Plant Cell 6，1032-1033，1994)和75％的菸草轉化株(Kononov，ME等，The Plant J11，945-957)中是如此。處理轉基因植物和/或轉基因食品要求的註冊當局認為帶有選擇標記，載體DNA和T-DNA多拷貝/插入的轉基因植物應儘量避免。本實施方式中，沒有骨架載體DNA的轉化株通過PCR或Southern印跡選擇。或者通過在T-邊界外插入一個編碼序列抑制載體DNA向植物的轉移，該編碼序列編碼對植物有毒性的(多)肽，所以存在一個對含有過量載體DNA的植物的負選擇(如WO 99/01563所提到的)。
實施例1有效抑制GBSSI表達的基因構建體的最優化基因構建體反義GBSSI構建體pKGBA50(圖1)已在Kuipers等(1995)Mol GenGenet 246745-755中描述。除了選擇標記基因NPTII，其包含在GBSSI啟動子後面的反義方向的2.4Kb的GBSSI cDNA。兩個GBSSI cDNA片段，1.1Kb的5』部分和1.3Kb的3』部分，作為EcoRI片段分別克隆進質粒pWx1.1和pWx1.3(Visser等1991 Mol Gen Genet 225289-296)。這些EcoRI片段克隆進載體pMTL25(Chambers等1988 Gene 68139-149)，生成質粒pMTL1.1和pMTL1.3，見圖2和3。質粒pMTL1.3用BamHI消化。±1.3Kb的BamHI片段克隆進BamHI消化了的pKGBA50。這產生了兩個新的雙元載體pKGBA50-IR1.3(圖4)，其具有一個1.3Kb片段的反向重複序列，和pKGBA50-DR1.3(圖5)，含有1.3kb片段的正向重複序列。質粒pMTL1.1用SalI消化。±1.2kb的SalI片段克隆進SalI消化了的pKGBA50。這產生了兩個額外的雙元載體pKGBA50-IR1.1(圖6)，其含有1.1kb片段的反向重複序列，和pKGBA50-DR1.1(圖7)，其具有1.1kb片段的正向重複序列。
所有構建體都轉化進E.coli DH5 α(GIBCO BRL)。雙元載體pKGBA50-IR1.3，pKGBA50-IR1.3，pKGBA50-IR1.1，pKGBA50-DR1.1和pKGBA50-IR1.1通過三親交配法轉化進土壤桿菌LBA4404(pAL4404)(Hoekema等1983 Nature 303179-180)，在E.coli HB101中使用輔助質粒pRK2013(Figurski和Helinski，1979 Proc Natl Acad Sci USA 761648-1652)。
轉化馬鈴薯馬鈴薯栽培品種「Karnico」(匿名，1994 Beschrijvende Rassenlijstvoor Landbouwgewassen CPRO-DLO，Wageningen，荷蘭，342pp.)已被轉化了反義構建體pKGBA50(Kuipers等1995 Mol Gen Genet 246745-755)。相同的馬鈴薯栽培品種轉化了pKGBA50-IR1.3(構建體A7)，pKGBA50-DR1.3(構建體B 1)，pKGBA50-IR1.1(構建體C2)和pKGBA50-DR1.1(構建體D4)。體外生長的植物，用節間切割通過土壤桿菌共培養進行轉化，依據Visser RGF(1991)在K Lindser(ED)植物組織培養手冊，Kluwer Academic Publishers，Dorrecht/Boston/London，PP.B51-9中描述的方法進行。在含有20g/L蔗糖，100mg/L卡那黴素的MS20培養基(Murashige和Skoog，1962 Physiol Plant 15473-497)中選擇轉化株。
體外塊莖形成枝移到含有50ml固化的MS30培養基的罐中。3-4周後，加入20ml液體培養基，其組成為含有325g/L蔗糖和1.75g/L CCC(氯化氯膽鹼，或矮狀素)的KI培養基(『knolinducerend』(＝塊莖誘導)培養基，Duchefa)。將罐子置於18℃的避光房間內生長。2-6周後，大多數枝上生長了試管薯。
澱粉染色切割試管薯並用碘酒溶液(1.7％(w/v)碘酒和3.3％(w/v)碘化鉀溶液)染色，評估澱粉顆粒中直鏈澱粉的存在。澱粉顆粒的染色用顯微鏡觀察。
DNA分析DNA從體外枝中通過CTAB DNA分離方法分離，如Rogers和Bendich(1998)植物分子生物學手冊A6 Kluwer Academic Publ，Dordrecht，pp1-10中描述。使用引物NPT3和NPT4(序列號3和4)進行PCR，檢測NPTII選擇標記基因的存在。隨後，用引物NPT1和NPT2，trfA1和trfA2，insB1和insB2(序列號1，2，5，6，7和8；Wolters等1998 MolBreeding 4343-358)進行PCR，研究轉化株中骨架載體DNA的存在。
4μg的轉化株DNA用HindIII消化，片段用凝膠電泳分離，及進行Southern印跡實驗。印跡和pBI101的NPT3+NPT4 PCR產物(Jefferson等1987 EMBO J 63901-3907)組成的NPTII探針雜交，檢測T-DNA插入的數量。
沉默的效率每個構建體轉化株的數量，從中獲得了試管薯，示於表1。碘酒染色結果在表1和圖9中給出。作為參考，還包括了用反義構建體pKGBA50獲得的結果。14％用反義構建體pKGBA50獲得的轉化株顯示了完全抑制了GBSSI活性，由用碘酒溶液染成的紅色澱粉顆粒表明。與反義構建體相比，正向重複構建體pKGBA50-DR1.3(B1)和pKGBA50-DR1.1(D4)產生了較低百分率(2-6％)完全沉默的轉化株。相反，反向重複構建體pKGBA50-IR1.3(A7)和pKGBA50-IR1.1(C2)導致了較高百分率的轉化株顯示完全抑制GBSSI，與反義構建體相比對A7是20％和對C2是62％。因此，反向重複構建體pKGBA50-IR1.1(C2)在完全沉默GBSSI活性上比反義構建體pKGBA50有效4.5倍。反向重複構建體C2比構建體A7有效的多大部分(62％)C2轉化株顯示了強的或完全的沉默，而大部分A7轉化株(47％)顯示了中等水平的沉默。這暗示或者是存在於反向重複序列中的編碼序列(5』或3』區)的區域是重要的，或者與啟動子相關的反向重複序列的方向(反義DNA-間隔序列-有義DNA對有義DNA-間隔序列-反義DNA)是有效的決定因素。相似的，正向重複構建體B1和D4間存在差別；大部分(51％)B1轉化株顯示了低水平的沉默，而多數D4轉化株(85％)顯示根本沒有沉默。因此，GBSSI cDNA的1.1kb區域在反向重複方向時對沉默是最有效的，而它在正向重複方向時是最無效的。這暗示尋找最適的序列去構造反向重複構建體來產生最大的沉默效果是很重要的。
分子分析從20個A7轉化株中分離DNA。所有都顯示了預期的NPTII PCR片段，表明所有都含有至少一個T-DNA插入。20個中有9個顯示了存在非T-DNA載體DNA，由NPTIII和trfA基因的PCR決定(表2)。因此，大約一半的轉化株不含有骨架載體DNA。
從40個顯示了強的完全沉默GBSSI的C2轉化株中分離DNA。用NPTII引物，所有都顯示了預期的PCR片段。用骨架載體DNA引物的PCR分析證明其中17個轉化株含有非T-DNA序列，而23個是陰性的(表3)。HindIII消化的DNA和NPTII探針雜交的Southern印跡分析顯示20個轉化株中有5個含有單鏈T-DNA插入。其中4個沒有骨架載體DNA。因此，這證明用反向重複構建體pKGBA50-IR1.1可能獲得具有單鏈T-DNA插入和沒有骨架載體DNA的完全沉默的轉化株。
實施例2分離沒有選擇標記基因的GBSSI沉默的轉化株基因構建體實施例1顯示GBSSI cDNA的1.1kb區域在反向重複方向對沉默是最有效的和可能用這個構建體(pKGBA50-IR1.1)獲得具有單鏈T-DNA和沒有骨架載體DNA的完全沉默了的轉化株。
在以前的實施例中，用存在於構建體pKGBA50-IR1.1上的選擇標記基因NPTII在卡那黴素上選擇轉化株。為分離沒有選擇標記基因的轉化株，雙元載體pKGBA50-IR1.1用酶PmeI和ClaI消化(見圖1)。PmeI產生平末端。ClaI粘性末端用Klenow聚合酶處理為平末端，然後載體DNA用T4 DNA連接酶通過平末端連接進行環化。這產生了載體pKGBA50mf-IR1.1(沒有標記基因)(圖8)。這個構建體轉化進E.coli DH5α(GIBCO BRL)。雙元載體pKGBA50mf-IR1.1通過三親雜交法轉化進土壤桿菌LBA4404(pAL4404)(Hoekema等1983)，在E.coli HB101中使用輔助質粒pRK2013(Figurski和Helinski，1979)和土壤桿菌株Agl-0(Lazo等1991)。已知Agl-0菌株比LBA4404毒性更大。
轉化馬鈴薯和選擇轉化株馬鈴薯栽培品種Karnico的體外生長的植物的節間切割用來通過土壤桿菌共培養進行轉化，依照Visser(1991)描述的方法。馬鈴薯栽培品種Karnico轉化了土壤桿菌LBA4404或土壤桿菌Agl-0的pKGBA50mf-IR1.1，依照相同的方法。沒有進行選擇。4周後，收穫第一個枝並連續收穫枝3個月。每個莖外植體收穫了不超過兩個再生體並且枝生長於MS20培養基。1-2周後，收集8個或更多獨立的枝的葉或莖物質並且建立成庫(庫的大小依賴於預期的轉化株的頻率)。枝的這些庫的DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離在96孔酶標板中。使用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自再生體庫的DNA進行PCR分析，檢測轉化株的存在。各個枝的PCR陽性庫的葉和/或莖收集在96孔酶標板中並且用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離基因組DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自各個再生體的DNA進行PCR分析，檢測轉化株的存在。
體外塊莖形成對PCR陽性枝，加入20ml液體培養基，其組成為含有325g/L蔗糖和1.75g/L CCC(氯化氯膽鹼，或矮狀素)的KI培養基(knolinducerend(＝塊莖誘導)培養基，Duchefa)。將罐子置於18℃的避光房間中生長。2至6周後，大部分枝上形成了試管薯。
澱粉染色切割試管薯並用碘酒溶液染色評估澱粉顆粒中直鏈澱粉的存在。澱粉顆粒的染色用顯微鏡觀察。
DNA分析用CTAB DNA分離方法分離體外枝的DNA，如Rogers和Bendich(1998)所描述。用引物NPT1和NPT2，trfA1和trfA2，insB1和insB2(序列號1，2，5，6，7和8；Wolters等1998 Mol Breeding 4343-358)進行PCR，研究轉化株中骨架載體DNA的存在。4μg轉化株的DNA用HindIII消化，凝膠電泳分離片段並進行Southern印跡實驗。印跡和NOS終止探針雜交，檢測T-DNA插入的數量。
生產不定枝(adventitious shoot)按照Hovenkamp-Hermelink等(1998)，會產生沒有標記基因，沒有直鏈澱粉，沒有載體DNA和沒有基因型的不定枝。每個基因型的10至20個無菌培養的枝的葉子在添加了10mg/l BAP和10mg/l NAA的147mg/lCaCl2·2H2O和80mg/l NH4NO3的溶液中漂浮。漂浮一晚(16小時)後，葉子切為3-4mm寬的外植體，每個基因型100個外植體並置於含有40g/l甘露醇、10g/l蔗糖、2.25mg/l BAP、0.0175mg/l IAA和8g/1瓊脂的胼胝誘導MS培養基中。6天後，外植體轉移到添加了15g/l蔗糖、2.25mg/lBAP、5mg/l GA3和8g/l瓊脂的MS培養基中再生。外植體每3周轉移至新鮮的再生培養基中。收集不定枝(每個外植體2-4個)，每個基因型至少收集100個枝並且在含20g/l蔗糖的MS培養基的容器中生長。當枝形成了多於4個節時，他們用於如上所述的體外塊莖形成和沒有直鏈澱粉的澱粉篩選。
沒有標記轉化的效率在5個獨立的實驗中，大約馬鈴薯栽培品種Karnico的8000個莖外植體和土壤桿菌LBA4404或者AGL-0的pKGBA50mf-IR1.1孵育。接種後1至4個月後，每個外植體收集1或2個再生的枝並在Murashige和Skoog培養基上生長。1至2周後，收集至少8個獨立的枝的葉或莖物質並建庫。枝的這些庫的DNA分離在96孔酶標板中。用聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的方法，我們檢測了枝庫中的轉化株的存在。PCR陽性庫中，對分離自各個再生植物的DNA進行了分析，以檢測轉化株的存在。LBA4404轉化後，少於0.2％的收集的枝是PCR陽性的，而AGL-0轉化的這個百分率為4.6％(表4)。5個獨立的AGL-0轉化實驗的PCR陽性轉化株的頻率在1.3和5.6％，而對LBA4404這變化在0到0.8％之間。
為確定顯示所需沒有直鏈澱粉表型的PCR陽性枝的頻率，枝在體外生長在高蔗糖條件下以誘導塊莖。發育了的試管薯用碘酒染色並且澱粉顆粒通過顯微鏡評估直鏈澱粉的存在。所分析的220個PCR陽性的轉化株中，大約45％顯示完全抑制了GBSSI活性，由紅色的澱粉顆粒表明。這個百分比仍然比用NptII作為選擇標記的pKGBA50mf-IR1.1獲得的60％的植物沒有直鏈澱粉的低，這暗示偶然的我們可能用PCR檢測系統選擇了假陽性。
然而結果有力地表明了不用標記基因選擇轉化株的可行性並且獲得沒有標記轉化體的效率可通過使用毒性土壤菌株和優化了的基因沉默構建體來提高。
選擇單拷貝和沒有載體DNA的轉化株因為鑑於DNA整合的所有爭論，除了感興趣的轉化株基因，應該也分離了不具有載體DNA和多插入的T-DNA的轉化株。DNA整合進邊界外的宿主植物的基因組據報導在20到75％的轉化的植物中發生。通過使用針對pBIN19載體的5個開放閱讀框架的引物的PCR分析了選擇的沒有標記、沒有直鏈澱粉的馬鈴薯轉化體中骨架載體DNA的存在。99個檢測的沒有直鏈澱粉的轉化株中39個對5個DNA片段是陰性的。這39個沒有載體DNA的轉化株進一步通過以NOS終止子作為探針的Southern印跡雜交進行分析(圖10)。這些分析顯示大多(30)轉化株含有3個或更少拷貝數的T-DNA插入。然而，分析的39個轉化株中14個含有單鏈T-DNA插入。
因此，這證明了不用選擇標記基因獲得沒有骨架載體DNA的轉化株的可行性，該轉化株只含有一個插入的T-DNA，其中內源基因被完全沉默。
嵌合性為研究是否PCR選擇的轉化株是來自多個細胞再生的嵌合體，我們用對直鏈澱粉合成始終抑制的碘酒溶液將切割的塊莖的表面染色。每個獨立的轉化株的一個塊莖染色過程中，沒有觀察到扇形染色。所有塊莖或者全紅或者全藍。用碘酒對60個獨立的轉化株，每個轉化株超過20個塊莖的染色顯示只有一個系具有紅色和藍色扇形的細胞。這些結果表明嵌合發生了，然而，頻率非常低。進而，使用不定枝法對28個獨立的沒有標記、沒有直鏈澱粉和沒有載體DNA的轉化株進行嵌合體的篩選。每個基因型產生了超過100個的不定枝並且每個枝都用於體外塊莖形成和篩選沒有直鏈澱粉的表型。篩選了超過3000個枝後，我們沒有發現一個形成了含有直鏈澱粉的試管薯的不定枝。這證明我們的沒有標記的轉化方法不或以很低比率產生嵌合植物。
實施例3轉化方法對獲得沒有標記轉化株效率的影響為決定轉化方法對獲得沒有標記轉化株效率的影響，測試了兩個轉化方法。
馬鈴薯栽培品種Karnico通過共培養轉化了帶有含有植物轉化載體pKGBA50mf-IR1.1的根癌土壤桿菌AGL0的外植體。轉化方法1.1(Visser，1991)馬鈴薯栽培品種Karnicode枝尖在pH5.6下培養在含有MS主要和次要鹽分、3％蔗糖、0.8％瓊脂的培養基中。培養物在21℃，16小時光周期下生長4周。將莖的結間部切成2到5mm長並在共培養前，在放在固體R3B培養基之上的兩層濾紙上放置1天。使用的R3B培養基含有MS(4.71g/l)培養基的鹽分和維生素，並加入了3％蔗糖，2mg/l NAA，1mg/lBAP和0.8％瓊脂，pH5.8。濾紙層覆蓋有2ml的pH為6.5的MS(4.71g/l)，2.0g/l酪蛋白水解產物，3％蔗糖，1mg/l2，4D和0.5mg/L細胞分裂素組成的PACM液體培養基。和培養了兩天的土壤桿菌共培養5到10分鐘，然後外植體印跡到濾紙上以除去多餘的細菌。完成印跡後，外植體轉移回同樣的培養皿並在21℃，16小時光周期下孵育兩天。
兩天後，外植體轉移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％瓊脂、200mg/l頭孢噻肟鈉、200mg/l萬古黴素和1mg/l玉米苷組成的Zcvh培養基中。培養物每兩周轉移至新鮮的Zcvh培養基。4周後收集第一批枝並轉移至含有MS主要和次要鹽分、3％蔗糖、0.8％瓊脂、pH5.6的培養基中。每個外植體收集不超過2個枝並且收集持續大約3個月。轉化方法2(Edwards等Plant Molec Biol 1789-100，1991)馬鈴薯栽培品種Karnico的枝尖培養在含有MS主要和次要鹽分、3％蔗糖、0.8％瓊脂、pH5.6的培養基中。培養物在21℃，16小時光周期下生長4周。將莖的結間部切成2到5mm長並在共培養前，在放在固體R3B培養基之上的兩層濾紙上放置1天。使用的R3B培養基含有MS(4.71g/l)培養基的鹽分和維生素，並加入了3％蔗糖、2mg/l NAA、1mg/lBAP和0.8％瓊脂，pH5.8。濾紙層覆蓋有2ml的pH為5.8的MS(4.71g/l)、2.0g/l酪蛋白水解產物、3％蔗糖、1mg/l 2，4D和0.5mg/L細胞分裂素組成的PACM液體培養基。和培養了兩天的土壤桿菌共培養30分鐘，然後外植體印跡到濾紙上以除去多餘的細菌。完成印跡後，外植體轉移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％瓊脂、2mg/l 2，4D和0.5mg/l玉米苷組成的，pH5.8的固體PCM培養基中並在21℃下，黑暗中孵育兩天。兩天後，外植體轉移至含有200mg/l頭孢噻肟鈉的PCM培養基中，在21℃，16小時光周期下孵育4天。
這樣4天後，外植體轉移至4.71g/l MS、2.0％蔗糖、0.8％瓊脂、2mg/lGA3、1.0mg/l玉米苷、pH5.8和200mg/l頭孢噻肟鈉組成的固體PSM培養基中。每三周將培養物轉移至含有200mg/l頭孢噻肟鈉的新鮮PSM培養基中。四周後，收集第一批枝並轉移至含有MS主要和次要鹽分、3％蔗糖、0.8％瓊脂、pH5.6的培養基中。每個外植體收集不超過兩個枝而且收集持續大約3個月。
1到2周後，收集8個或更多的獨立的枝的葉子或莖物質並建庫(庫大小依賴於預期轉化株的頻率)。將枝的這些庫中的DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離在96孔酶標板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自再生體的庫的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。將各個枝的PCR陽性庫的葉子和/或莖物質收集在96孔酶標板中並用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離基因組DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自各個再生體的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。
結果使用轉化方法1和2對馬鈴薯栽培品種Karnico的1000莖外植體進行了兩個獨立的轉化。從中收集枝的外植體的頻率在兩個轉化方法間是可比較的。方法1產生了74％有枝的外植體而用方法2有67％的外植體形成了一個或多個枝。可是獲得的PCR陽性枝的頻率在兩種方法中非常不同。用方法20.6％至1.0％收集到的枝是PCR陽性的，而用方法1這個百分比在5.5％到6.0％之間。
因此，使用最優化的轉化方法可以產生5到10倍數量的PCR陽性枝並提高沒有標記的轉化的效率。
實施例4沒有標記地選擇高賴氨酸馬鈴薯轉化株基因構建體反饋不敏感的馬鈴薯DHPS通過改變進化保守的134位胺基酸殘基(天冬醯胺)為半胱氨酸生成，如EP 99204520所提到的。構建含有突變體DHPS基因的嵌合基因，首先將DHPS cDNA從pTriplex載體(pAAP42)克隆在pCR-Script SK(+)(pAAP55)中再從這個載體將其作為XbaI-EcoRI片段克隆在XbaI-EcoR消化了的pBluescript SK載體中(pAAP57)。5』端，突變的DHPS cDNA融合到了800bp長的GBSSI啟動子片段的HindIII-SaII片段。突變DHPS序列的下遊，根癌土壤桿菌的胭脂鹼合成酶基因的終止信號作為SstI-EcoRI片段插入(Greve，H.D.等(1983)J.Mol.Appl.Genet.1499-511)。全部的嵌合基因克隆進pBINPLUS的HindIII-EcoRI位點，pBINPLUS已先被ClaI消化及RcaI部分消化和再連接以除去NPTII選擇標記(Van Engelen，F.A.等(1995)TransgenicResearch 4288-290)。這產生了載體pAAP105mf(圖10)。所有構建體都轉化進E.coli DH5α(GIBCO BRL)。
轉化馬鈴薯植株雙元載體pAAP 105mf用來進行冰凍融化轉化根癌土壤桿菌株AGL0(Hofgen，R和Willmitzer，L(1988)Nucl.Acids Res.169877)。轉化了的AGL0隨後用於接種馬鈴薯(solanum tuberosum，Karnico種類)莖外植體。沒有進行選擇。四周後，收集第一批枝並且枝的收集持續大約三個月。每個莖外植體收集不超過兩個再生體而且枝生長在MS20培養基中。1到2周後，收集8個或更多的獨立的枝的葉子或莖物質並建庫(庫大小依賴於預期轉化株的頻率)。枝的這些庫中的DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離在96孔酶標板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自再生體庫的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。各個枝的、PCR陽性庫的葉子和/或莖物質收集在96孔酶標板中而且基因組DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自各個再生體的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。
體外形成塊莖對PCR陽性枝，加入20ml液體培養基，其組成為KI培養基。罐子放在室溫下的黑暗的生長室中。2到4周後，大部分枝發育了試管薯。
轉基因植物中游離胺基酸含量的分析用研缽和槌在含有1mM二硫代蘇糖醇的2ml的50mM Pi緩衝液(pH7.0)中勻漿組織(0.5-1.0克)。加入正亮氨酸作為內對照。游離胺基酸用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12，體積比)萃取進行部分純化。收集水相，有機相再萃取兩次。用凍幹法濃縮至3ml後，20微升樣品使用陽離子交換柱通過HPLC進行分析，用胺基酸的柱後茚三銅衍生法在570nm和440nm檢測(BIOCHROM 20，Amersham Pharmaciabiotech)。圖11顯示了賴氨酸在12個對照沒有轉化的馬鈴薯植株的塊莖和17個含有突變DHPS基因構建體pAAP105mf的馬鈴薯植株中佔總胺基酸的百分比。賴氨酸水平從對照野生型馬鈴薯中2-2.5％升高至在轉化塊莖中最多30個百分比，導致了賴氨酸成為了「大多數」胺基酸而不是「低水平」的必需胺基酸。
實施例5沒有直鏈澱粉的高賴氨酸馬鈴薯轉化株的無標記選擇基因構建體合成了含有在5』端HindIII-相容的突出端(overhang)和3』端EcoRI-相容的突出端的連接子( 5』-AGCTGCATATGAAGCTTTCTAGATCTGAATTCCATATGT-3』和3』-CGTATACTTCGAAAGATCTAGACTTAAGGTATACATTAA-5』)。這個連接子連接到HindIII/EcoRI消化的pUC28質粒上(Benes等1993 Gene130151-152)，產生了質粒pAAP171。構建體pAAP105，含有突變DHPS基因的雙元載體用HindIII和EcoRI消化。含有GBSSI啟動子-DHPS基因-NOS終止子的2.2kb的片段克隆進HindIII/EcoRI消化的pAAP171中。這產生了構建體pAAP172(見圖12)。
構建體pAAP172用NdeI和ScaI(ScaI位點存在於pUC28骨架中)消化。消化了的DNA用酚/氯仿提取，再用乙醇沉澱。雙元載體pKGBA50mf-IR1.1用VspI消化，再用鹼性磷酸酶處理，酚/氯仿提取，乙醇沉澱。PAAP172的2.2kb的NdeI片段連接進VspI消化的pKGBA50mf-IR1.1載體(圖13)，產生了兩個不同的構建體pDHPS-IR1.1(串聯)，其中兩個GBSSI啟動子指向同一個方向(圖14)，和pDHPS-IR1.1(反向)，其中兩個GBSSI啟動子指向相反方向(圖15)。這些構建體從E.coli DH5α轉化進根癌土壤桿菌Agl-0。
轉化馬鈴薯和轉化株的選擇馬鈴薯栽培品種Kamico的體外生長植株的節間切割物通過和根癌土壤桿菌共培養進行轉化，依照Visser(1991)描述的方法。
馬鈴薯栽培品種Kamico用相同的方法轉化了根癌土壤桿菌Agl-0中的pDHPS-IR1.1(串聯)和pDHPS-IR1.1(反向)。沒有進行選擇。四周後，收集第一批枝並持續收集大約三個月。每個莖外植體收集了不超過兩個再生體而且枝生長於MS20培養基中。1到2周後，收集8個或更多獨立的枝的葉子或莖物質並建庫(庫大小依賴於預期轉化株的頻率)。原則的這些庫中的DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離在96孔酶標板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自再生體庫的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。收集各個枝的PCR陽性庫的葉子和/或莖物質於96孔酶標板中並且用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離基因組DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自各個再生體的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。
體外形成塊莖對PCR陽性枝，加入20ml液體培養基，其組成為Kl培養基。罐子置於18℃下的黑暗的生長室中。2到4周後，大部分枝發育了試管薯。
澱粉染色切割試管薯並用碘酒溶液染色以評估澱粉顆粒中直鏈澱粉的存在。澱粉顆粒的染色用顯微鏡觀察。
轉基因植物中游離胺基酸含量的分析用研缽和槌在含有1mM二硫代蘇糖醇的2ml 50mM Pi緩衝液(pH7.0)中勻漿組織(0.5-1.0克)。加入正亮氨酸作為內對照。游離胺基酸用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)萃取進行部分純化。收集水相，剩餘的再萃取兩次。用凍幹法濃縮至3ml後，20微升樣品使用陽離子交換柱通過HPLC進行分析，用胺基酸的柱後茚三銅衍生法在570nm和440nm檢測(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia biotech)。
實施例6沒有直鏈澱粉的木薯轉化株的無標記選擇以下部分描述了根癌土壤桿菌介導的轉化步驟以產生遺傳修飾的木薯植株，其澱粉主要組成為支鏈澱粉，而沒有可選擇的標記基因如nptII、pat、basta、htp或其它的輔助。
基因構建體設計PCR引物(序列號12-20)以擴增木薯GBSSI cDNA序列部分兩個嵌套的正向和一個反向引物用於以下三個區域5』部分(1-800鹼基)、中間部分(800-1500鹼基)和3』部分(1200-2000鹼基)。正向引物含有EcoRI限制位點，而反向引物含有XbaI限制位點。GBSSI cDNA的三個部分的每一個的PCR產物都用EcoRI消化和連接。所得連接產物含有木薯GBSSI cDNA的部分反向重複序列，在兩個嵌套的正向引物間的序列作為間隔區。這個序列用XbaI消化並克隆進載體pMTL24(Chambers等1988)。反向重複序列用BamHI消化而從這個載體中除去，隨後連接馬鈴薯GBSSI啟動子和BamHI消化了的雙元載體pKGBA50mf-IR1.1的NOS終止子(見圖8)。這樣，獲得了無三個標記基因的木薯GBSSI反向重複構建體。這些轉化進根癌土壤桿菌菌株Agl-0。
使用的植物材料和組織培養培養基TMS60444和Adira4植株的培養是每個月將一個節點的切割物亞克隆至補充了Murashige和Skoog(1962，Physiol.Plant.15473-497)鹽和維生素和40g/l蔗糖的培養基中(MS4)。脆弱胚胎發生癒合組織(friableembryogenic callus(FEC))系如下產生-從供體植株中分離分裂組織或未成熟葉子-在補充了6mg/l NAA和6mg/l毒莠定(Picloram)的MS40上培養分裂組織/未成熟葉子-分離完整的胚胎發生組織並在補充了Gresshoff和Doy(1974，Planta107161-170)鹽和維生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的培養基(GD6)中培養-分離FEC(小塊聚集的，球形單位)，在GD6培養基中培養。FEC在GD6培養基中每3周進行亞培養來維持。通過轉移0.5gFEC到含有50ml補充了Schenk和Hildebrandt(1972，Canadian Journal of Botany 50199-204)鹽和維生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的液體培養基(SH6)的200ml燒瓶產生液體培養物。培養基每周換兩次並在2周後每個燒瓶中的內含物分到5個新燒瓶中。燒瓶在搖床(LAB-line InstrumentsInc.Model 3519)上以120rpm培養。
用土壤桿菌感染FEC100mg的TMS604444的FEC樣品作為起始材料。FEC分散在補充了Gresshoff和Doy鹽和維生素、60g/l蔗糖、10g/l瓊脂和10mg/l毒莠定的培養基中，並加入幾滴含有GBSSI反向重複構建體的土壤桿菌菌株Agl-0。兩天後，用無菌蒸餾水洗FEC兩遍以除去多餘的土壤桿菌。次後，FEC轉移到含有Schenk和Hildebrandt鹽和維生素、60g/l蔗糖、10g/l瓊脂和10mg/l毒莠定的液體培養基(SH6)中，其補充了抗生素如頭孢噻肟鈉以殺死土壤桿菌。一周後更新培養基，兩周後FEC仔細的分散在補充了頭孢噻肟鈉的GD6培養基中。兩周後，10個感染樣品的50mg FEC使用PCR為基礎的選擇系統來評價轉基因的整和程度。收集小部分FEC物質並用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離細胞的DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對DNA分離物進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。10個樣品中有2個是GBSS-0/BINMCS引物陽性的。這些樣品培養在補充了頭孢噻肟鈉的成熟培養基中。成熟培養基組成為Murashige鹽和維生素、40g/l蔗糖、10g/l瓊脂(MS4)和1mg/l毒莠定。組織每隔兩周轉移至新鮮的成熟培養基中，總共培養四個月。其間，分離從FEC發育而來的torpedo定形的體細胞胚並培養在補充了0.1mg/l BAP和頭孢噻肟鈉的MS4培養基中以讓其發育成成熟的體細胞胚。成熟的體細胞胚首先在補充了1.0mg/l BAP和頭孢噻肟鈉的液體MS4中培養一周，然後轉移至補充了1.0mg/l BAP的固體MS4培養基中。體細胞胚發育的枝在補充了頭孢噻肟鈉的MS4中生根。所有生根的植物用於PCR為基礎的選擇系統。收集8個枝的葉子材料並建庫。枝的這些庫中的DNA用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離在96孔酶標板中。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自再生體庫的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。收集各個枝的PCR陽性庫的葉子和/或莖材料在96孔酶標板中並且用購自Promega的Magnesil基因組DNA分離試劑盒分離基因組DNA。用引物BINMCS和GBSS-0(序列號9和10)對分離自各個再生體的DNA進行PCR分析，以檢測轉化株的存在。總共，從兩個種系獲得了1264和984個植株，其中分別有5個和38個植株是PCR陽性的。PCR陽性植株生長在溫室的小罐中。三個月後從塊莖中分離澱粉並分析直鏈澱粉的含量。在27個植株中基本沒有直鏈澱粉。
表1.由不同構建體獲得的轉化子的沉默水平GBSSI的沉默水平構建體轉化子的數量完全/強 中等 弱 無C2133 83(62％) 6(5％) 2(2％) 42(31％)A7118 24(20％) 55(47％) 10(8％) 29(25％)D466 4(6％) 2(3％) 4(6％) 56(85％)B177 2(2％) 7(9％) 39(51％)29(38％)反義 144 20(14％) 20(14％) 22(15％)82(57％)
表2.各個A7轉化子的分子分析PCR片段轉化子 沉默水平NPTIINPTIIItrfAA7-1弱 + - -A7-3無 + - -A7-7弱 + - -A7-11 無 + - -A7-14 強 + + +A7-22 強 + + +A7-26 強 + + +A7-32 強 + - -A7-41 弱 + - -A7-42 強 + + +A7-43 強 + + +A7-44 強 + - -A7-48 弱 + - -A7-53 強 + + +A7-62 中等 + + +A7-74 強 + - -A7-76 弱 + - -A7-84 強 + + -A7-95 完全 + + -A7-98 弱 + - -
表3.各個C2轉化子的分子分析PCR片段T-DNA轉化子 沉默水平NPTIINPTIIItrfAInsB條帶數量C2-1強 ++ ND ND 4C2-5中等 ++ - - NDC2-6弱 +- - - NDC2-7完全 ++ ND ND ＞5C2-8完全 ++ ND ND ＞5C2-10 強 ++ ND ND 3C2-11 完全 ++ + ND ＞5C2-14 完全 +- - ND 3C2-15 完全 +- - ND 4C2-16 中等 +- - ND 2C2-17 完全 +？+ ND 3C2-20 完全 +- - ND 1C2-25 完全 ++ ND ND 2C2-29 完全 +- - ND 1C2-30 完全 ++ ND ND ＞4C2-33 強 +- - - NDC2-38 強 +- - ND 1C2-41 強 +- - - NDC2-43 強 ++ + - NDC2-47 完全 +- + - NDC2-65 完全 ++ ND ND ＞4C2-66 完全 +- - ND 2C2-70 強 +- - - ND
C2-71完全 +-- ND 2C2-75強 +-- - NDC2-80強 +-- - NDC2-83強 ++ND ND 1C2-85強 +++ + NDC2-86中等 +-- - NDC2-95強 +-- - NDC2-112 強 +++ - NDC2-114 完全 +-- ND 1C2-116 強 ++ND ND 4C2-151 強 +-- - NDC2-152 強 +-- - NDC2-156 完全 +-- - NDC2-167 強 ++- + NDC2-168 強 +-- - NDC2-170 強 +-- - NDC2-180 強 +-- - NDND＝未測定表4.土壤桿菌菌株對馬鈴薯轉化效率的影響

a由測試的枝的總數得到的PCR陽性枝的數量(％)b由測試的轉化株的總數得到的無直鏈澱粉轉化株的數量(％)
引物序列序列號1(NPT1)5』-TCC ACC TTA TCG GCA ATG AA-3′序列號2(NPT2)5』-CGG CAG TGA GAG CAG AGA TA-3′序列號3(NPT3)5』-TCG GCT ATG ACT GGG CAC AAC AGA-3′序列號4(NPT4)5』-AAG AAG GCG ATA GAA GGC GAT GCG-3′序列號5(trfA1)5』-TTC TCC TCG TGC TCG TAA AC-3′序列號6(trfA2)5』-GGT CGC TGG TAT TCG TGC-3′序列號7(insB1)5』-GCG CTA TCT CTG CTC TCA CT-3′序列號8(insB2)5』-AAC GGC CTC ACC CCA AAA A-3′序列號9(BINMCS)5』-GCA CCC CAG GCT TTA CAC TT-3』序列號10(GBSS-0)5』-TAC CGC TAC CAC TTG ACA TTC-3』
序列號115』AGCT GCATATGAAGCTTTCTAGATCTGAATTCCATATGT 3』3』 CGTATACTTCGAAAGATCTAGACTTAAGGTATACATTAA 5』序列號12Primer 5CASGBF15』-TAG AAT TCA CCA GCG GAA CCT ATT TT-3』序列號13Primer 5CASGBF25』-ATG AAT TCG GAC CCA AAC TAT CAC TC-3』序列號14Primer 5CASGBR15』-TGT CTA GAA TGG AAG CAG AGC AGT GT-3』序列號15Primer MCASGBF15』-CAG AAT TCA AGC CAT TTA CCA ACC TA-3』序列號16Primer MCASGBF25』-ATG AAT TCT ATG AGA AGC CCG TGA AG-3』序列號17Primer MCASGBR15』-CAT CTA GAG AAC CAG CAT AAA GTC AG-3』序列號18Primer 3CASGBF15』-TAG AAT TCG GCT TCA TTG GTA GAT TA-3』序列號19Primer 3CASGBF25』-TAG AAT TCA TTG AGC ATC TGG AGG TT-3』序列號20Primer 3CASGBR15』-TAT CTA GAC CAT TCA CCC TTC ACA AA-3』
權利要求
1.一種包含T-DNA構建體的重組核酸，其允許所述構建體轉移進入植物細胞基因組中，所述構建體具有一種不含編碼選擇標記的核酸的外源核酸。
2.權利要求1的核酸，其中所述T-DNA構建體包含至少一個T-DNA邊界。
3.權利要求1或2的核酸，其中所述外源核酸側翼存在T-DNA邊界重複序列。
4.權利要求1至3中任一項的核酸，其中所述T-DNA來源於土壤桿菌spp的Ti質粒。
5.權利要求4的核酸，其中所述土壤桿菌包含根癌土壤桿菌。
6.權利要求1至5中任一項的核酸，其中所述外源核酸允許在所述基因組中調控靶基因的表達。
7.權利要求6的核酸，其中所述調控包含下調。
8.權利要求7的核酸，其中所述外源核酸包括所述靶基因的至少部分多核苷酸區域的反向重複序列。
9.權利要求6至8中任一項的核酸，其中所述靶基因編碼澱粉粒束縛澱粉合酶(GBSSI)。
10.權利要求1至5中任一項的核酸，其中所述外源核酸允許在所述植物細胞中表達異源多肽。
11.權利要求10的核酸，其中所述異源多肽包含一種酶。
12.權利要求11的核酸，其中所述酶包含二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶(DHPS)，優選地為反饋不敏感的二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶。
13.包含權利要求1至12中任一項的核酸的載體或質粒。
14.包含權利要求1至12中任一項的核酸或權利要求13的載體的宿主細胞。
15.權利要求14的宿主細胞，其包含土壤桿菌。
16.權利要求15的宿主細胞，其包含基本上有毒力的土壤桿菌。
17.權利要求15或16的宿主細胞，其中所述土壤桿菌包含根癌土壤桿菌。
18.權利要求17的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含根癌土壤桿菌A281或由其衍生的細胞。
19.包含權利要求1至12中任一項的核酸的植物細胞。
20.來源於權利要求19的植物細胞的植物或其部分。
21.權利要求20的塊莖植物或其部分。
22.權利要求21的植物或其部分，其選自於馬鈴薯或木薯植物。
23.轉化植物細胞的方法，包含將權利要求1至12中任一項的核酸提供給植物細胞。
24.權利要求23的方法，進一步包含在來源於選擇培養基的基本上無選擇壓力條件下培養所述細胞。
25.權利要求23或24的方法，進一步包含測試至少一部分所述細胞子代中是否存在權利要求1至12中任一項的核酸的至少功能性部分。
26.權利要求23至25中任一項的方法，進一步包含測試至少一部分所述細胞子代中是否存在非所需的載體核酸。
27.由權利要求23至26中任一項的方法可獲得的植物細胞。
28.來源於權利要求27的植物細胞的植物或其部分。
29.權利要求28的塊莖植物或其部分。
30.權利要求29的植物或其部分，其選自於馬鈴薯或木薯植物。
全文摘要
本發明涉及獲得轉基因植物的轉化方法和用所述方法獲得的植物。本發明提供了轉化植物細胞的方法，包含提供給植物細胞含有T－DNA構建體並可以轉移所述構建體進入植物細胞基因組的重組核酸，所述構建體具有不含編碼選擇標記的核酸的外源核酸。
文檔編號C12N15/82GK1535316SQ02814915
公開日2004年10月6日 申請日期2002年7月26日 優先權日2001年7月27日
發明者安娜·瑪麗亞·阿格尼絲·沃爾特斯, 理察·赫拉爾杜斯·弗朗西斯庫斯·菲瑟, 英格麗德·瑪麗亞·范德梅爾, 保羅·赫瑞斯, 尼古拉斯·克萊門斯·瑪麗亞·亨裡克斯·德費騰, 赫拉爾杜斯 弗朗西斯庫斯 菲瑟, 安娜 瑪麗亞 阿格尼絲 沃爾特斯, 德 瑪麗亞 範德梅爾, 斯 克萊門斯 瑪麗亞 亨裡克斯 德費騰, 赫瑞斯 申請人:馬鈴薯及衍生產品合作銷售生產阿韋貝公司, 馬鈴薯及衍生產品合作銷售生產阿韋貝