構建產生胺基酸的細菌的方法,及通過發酵該經構建的產生胺基酸的細菌以製備胺基酸...的製作方法

2023-10-05 01:25:04 1

專利名稱：構建產生胺基酸的細菌的方法,及通過發酵該經構建的產生胺基酸的細菌以製備胺基酸 ...的製作方法
背景技術：
本發明是關於構建一種具有高產量的產生胺基酸能力的細菌突變株的方法，以及經發酵作用由此突變株產生L-胺基酸的方法。
構建經由發酵而產生胺基酸的突變株的方法大致可分為兩種。一種是應用化學突變劑將突變隨機導入DNA中，另一種是通過基因重組作用。就後者方法而言，可經由加強關於此物質生物合成代謝路徑的基因，或通過減弱一會破壞此物質的酶基因，從而得到目的物質生產能力增強的菌株。基於此觀點，為加強目的基因而在細胞中利用一個其染色體能獨立複製的質粒。
然而利用質粒加強目的基因的方法有一些問題，特別是目的基因的加強程度由所用質粒的拷貝數而測定。因此有一些種類的目的基因拷貝數過多而導致表達過度進而嚴重抑制生長，反而所要物質的產生力較低。在此種情況下雖然使用低拷貝數的質粒對目的基因的加強程度較低，但對質粒的種類有多種限制，且對目的基因的表達程度不能進行自由調整。
另一問題是質粒的複製通常不穩定，且質粒常被移除。
舉例來說，特開昭61-26818公開了一來源於產生穀氨酸的棒狀菌的重組DNA，此重組DNA包含-DNA片段，它具有產生穀氨酸脫氫酶(GDH)的基因(glutamate dehydrogenase gene)，以及含有細胞內自動複製的必要基因的-DNA片段。本文也公開了導入此重組DNA到-細胞內，而形成GDH強化株，通過微生物生長而促進物質(譬如胺基酸和蛋白質等)的產生。
另一方面，在日本專利2,520,895中，將上述的重組DNA導入棒狀桿菌中得到一具有增強酶活性的菌株，且通過發酵此菌株而產生L-穀氨酸。然而L-穀氨酸的產生及產量並不令人滿意。因此，需要進一步增強L-穀氨酸的產生力。而增強方法已達成，亦即將含有衍生自產生穀氨酸的棒狀菌的產生穀氨酸脫氫酶基因和異檸檬酸合成酶基因(ICDH)兩種基因的重組DNA轉入產生穀氨酸的棒狀菌內。
更進一步，特表平6-502548公開棒狀桿菌的表達，和含有一棒狀桿菌菌株和一分泌匣的分泌系統；此分泌匣包含用於在此菌株中表達的第一功能性DNA序列，用於編碼胺基酸多肽和/或蛋白質的第二DNA序列，以及插入介於第一DNA序列和第二DNA序列間的第三DNA序列，其中的第三DNA序列編碼的蛋白質要素是選自PS1和PS2可保證由該棒狀桿菌進行此胺基酸，多肽和/或蛋白質的分泌。具體而言，多肽的分泌已公開於文中。特別的是誘發棒狀桿菌菌株的NTG突變作用，且篩選一具有4-氟穀氨酸(4FG)抗性的突變株，由於4FG類似穀氨酸，因此以PCGL141轉化之。文中也公開可從類似抗性細菌中取得加強表達GDH的菌株。文中也公開觀察到GDH啟動子核苷酸序列251到266的突變作用。
發明的公開本發明目標是提供一方法構建一突變株，使其不需使用質粒就能適當加強控制目的基因的表達，且可通過重組作用或突變作用產生高產量的胺基酸。
本發明的另一目標是提供一GDH啟動子，在棒狀桿菌菌株中不需要嚴重增加副產物天冬氨酸和丙氨酸的量就具有產生高產量穀氨酸的能力。
本發明的另一目標是提供一具有上述GDH啟動子序列的GDH基因。
本發明的進一步目標是提供一具有上述基因的棒狀桿菌菌株，且能產生L-穀氨酸。
本發明的進一步目標是提供一方法，通過發酵作用產生胺基酸，其中應用所構建的產生胺基酸的微生物。
本發明的進一步目標是提供一產生穀氨酸的發酵方法，通過利用產生穀氨酸棒狀菌在低成本下增加穀氨酸的產量。
本發明已有效的解決上述問題，在染色體上改變胺基酸生物合成基因的啟動子而控制目的基因的表達量。特別的是本發明已有效解決上述問題，是通過在啟動子的特異區域-35區域或-10區域導入一特殊的突變。
亦即本發明提供一產生具有增強的胺基酸或核酸產生力的棒狀菌的方法，步驟包括在棒狀菌染色體上的胺基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列引起突變而使其接近共有序列，或以重組作用在棒狀菌染色體上的胺基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中導入一變化而使其接近共有序列，得到棒狀細菌的突變株，培養此突變株，並篩選能大量產生指定的胺基酸或核酸的突變株。
本發明也提供一產生穀氨酸脫氫酶(GDH)基因的啟動子，其中該啟動子具有選自位於-35區域的CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一種DNA序列和/或-10區域TATAAT序列或ATAAT已被其它鹼基取代序列，且此序列不抑制啟動子功能。
本發明也提供一具有上述啟動子的穀氨酸脫氫酶基因。
本發明也提供一具有上述基因的產L-穀氨酸棒狀菌。
本發明也提供一通過發酵生產胺基酸和核酸的方法，包括培養通過上述方法所構建的胺基酸和核苷酸生產能力增強的棒狀菌，在培養基中培養，以及在培養基中累積目的胺基酸和核酸，並從培養基中收集此胺基酸。
本發明也提供一通過發酵生產L-穀氨酸和核酸的方法，包括在液態培養基中培養產L-穀氨酸的對4-氟穀氨酸抗性的棒狀菌，以及在培養基中累積L-穀氨酸，並從培養基中收集此胺基酸。
附圖簡述

圖1顯示含有突變啟動子的GDH基因的構建流程。
圖2顯示含有突變啟動子的CS基因的構建流程。
圖3顯示攜帶lacZ為報告基因的穿梭載體的構建流程。
實施本發明的最佳方式本發明中的「產生穀氨酸的棒狀菌」包括以往歸類為短桿菌屬而現在統歸於棒狀桿菌屬的細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981))，或包括與棒狀桿菌屬非常接近的短杆細菌屬。因此本發明中應用的突變株可從如下所述的屬於棒狀桿菌屬或短桿菌屬的棒狀穀氨酸生產菌來進行誘導。另外，本說明書中未提及穀氨酸生產性的時候，將棒狀桿菌屬細菌及短桿菌屬細菌僅叫做棒狀菌。嗜乙醯乙酸棒狀桿菌 ATCC 13870醋谷棒狀桿菌 ATCC 15807美棒狀桿菌 ATCC 15991穀氨酸棒狀桿菌 ATCC 13032分叉短桿菌 ATCC 14020乳酸發酵短桿菌 ATCC 13869百合棒狀桿菌 ATCC 15990黃色短桿菌 ATCC 14067梅拉司克棒狀桿菌 ATCC 17965糖短桿菌 ATCC 14066伊馬瑞短桿菌 ATCC 14068薔薇短桿菌 ATCC 13825嗜硫短桿菌 ATCC 19240嗜氨微桿菌 ATCC 15354產熱氨棒狀桿菌 AJI 2310(FERM 9246)所產生的胺基酸並沒有特別限制，只要是由相關合成基因及其啟動子可證實的即可。關於生物合物的有效酶實施例包括穀氨酸發酵作用中的GDH，檸檬酸合成酶(CS)，異檸檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脫氫酶(PDH)和烏頭酸酶(ACO)。
賴氨酸發酵過程所用的酶包括生物合成酶，譬如天冬氨酸激酶(AK)，二氫吡啶二羧酸合成酶；二氫吡啶二羧酸還原酶，二氨基庚二酸脫氫酶和二氫基庚二酸脫羧酶。涉及賴氨酸薄膜排出的賴氨酸排出蛋白質(lysE基因)也是有效的。
精氨酸發酵過程所用的酶包括N-乙醯穀氨酸合成酶，N-乙醯穀氨酸激酶，N-乙醯穀氨酸磷酸還原酶，乙醯鳥氨酸轉氨酶，N-乙醯鳥氨酸酶；鳥氨酸轉氨基甲醯酶，精氨基琥珀酸合成酶，和精氨基琥珀酸酶。，通過這些酶進行催化反應形成胺基酸。這些酶是有效用的。這些酶是依序分別由argA,argB,argC,argD,aegE,argF,argG和argH所編碼的酶。
絲氨酸發酵過程所用的有效酶包括3-磷酸甘油酸脫氫酶，磷酸絲氨酸轉氨酶，磷酸絲氨酸磷酸酶等等。
苯丙氨酸發酵過程所用的有效酶包括生物合成酶，譬如脫氧阿拉賓庚酸磷酸合成酶(deoxyarabinohepturonic acid phosphoric acid syntheticenzyme),3-去氫奎尼酸合成酶，3-去氫奎尼酸脫水酶，莽草酸脫氫酶，莽草酸激酶，5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶，分支酸(chorismic acid)合成酶，分支酸變位酶，代丙酮酸脫水酶(prephenatedehydroratase)等等。糖代謝酶譬如轉酮醇酶，轉醛醇酶，磷酸烯醇丙酮酸合成酶等等亦有效。
除了上述苯丙氨酸發酵所需的各種有效酶及上述絲氨酸發酵所需的各種有效之外，色氨酸發酵過程所用的有效酶包括屬於色氨酸操縱子的酶。
脯氨酸發酵過程所用的有效酶包括γ-穀氨酸激酶，γ-穀氨酸半醛脫氫酶，吡咯啉-5-羧化還原酶，和上述穀氨酸發酵所需的各種有效酶。
穀氨酸發酵過程所用的有效酶包括谷醯氨酸合成酶，和上述穀氨酸發酵所需的各種有效酶。
在肌苷的產生中，加強5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧醯氨轉甲醯基酶等等的表達被認為是有用的。
在鳥苷的產生中，加強5′-肌苷酸脫氫酶和5′-黃苷酸氨基酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧醯氨轉甲醯基酶等等的表達被認為是有用的。
在腺苷的產生中，加強腺苷琥珀酸合成酶和5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸轉氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧醯氨轉甲醯基酶等等的表達被認為是有用的。
在核苷酸的產生中，加強磷酸核糖基轉移酶，肌苷激酶，鳥苷激酶和腺苷激酶的表達被認為是有用的。
在本發明中產生胺基酸的棒狀菌突變株的取得，是在一產生胺基酸的棒狀菌的染色體上的所要的胺基酸-生物合成基因的啟動子序列造成突變而得，此類啟動子序列如上述的GDH，以化學劑導致突變，或通過基因重組導入一突變而使其接近共有序列。
「共有序列」一詞是指在各種啟動子序列中出現頻率最高的鹼基序列。共有序列包括那些位於大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的序列。大腸桿菌的共有序列敘述於Diane K.Hawley and William R.McClure Nuc.Acid.Res.11:2237-2255(1983)，枯草桿菌的共有序列敘述於Charles etal.Mol.Gen.Genet 186:339-346(1982)。
突變可如GDH般只在一啟動子造成，或如GDH，檸檬酸合成酶(CS)和異檸檬酸合成酶(ICDH)在兩個或更多啟動子序列造成突變。
在本發明中所得到的突變株，經培養能產生大量所指定的胺基酸。
目前已證明穀氨酸的發酵作用中，衍生自產生穀氨酸的棒狀桿菌微生物的GDH在其上遊部分具有其啟動子序列[Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326]。
例如，如下可得到本發明的GDH啟動子、具有該GDH啟動子序列的GDH基因以及具有該基因的生產L-穀氨酸的棒狀桿菌菌株。
以UV，X-射線或放射線等處理，或以突變誘發劑處理以得到一可在包含4-氟穀氨酸的瓊脂板培養基中生長的抗4-氟穀氨酸菌株。也就是突變作用處理過的菌株塗於包含4-氟穀氨酸瓊脂平板上生長，因4-氟穀氨酸的濃度可抑制親代生長而分離出可生長的突變株。
更進一步，GDH基因的啟動子序列可用各種突變序列通過定位突變的方法置換之，而各序列和GDH活性間的關係可檢查其L-穀氨酸高克隆力。
本發明中特別優選位於產生GDH基因啟動子-35區域的DNA序列，至少有-DNA序列是選自CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA和/或位於啟動子-10區域TATAAT的DNA序列，或以其它鹼基置換TATAAT中的ATAAT鹼基而不抑制啟動子功能者。位於-10區域的TATAAT中的ATAAT以其它鹼基置換而不抑制啟動子功能者可以選擇使用的理由如下因為觀察到只以「T」置換野生型-10區域序列的CATAAT的第1個「C」(表1中的p6-4)就明顯增加GDH的比活性，因此認為以另一鹼基置換是可行的。
如上敘述的GDH基因的啟動子序列敘述於Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326。其中敘述為序列號1。而GDH基因其本身的序列也敘述於Sahm et al.,Molecular Microbiology(1992),6,317-326，亦為序列號1。
同樣的，亦可在檸檬酸合成酶(CS)或異檸檬酸合成酶(ICDH)的啟動子中產生突變。
如此，則GDH啟動子具有選自位於-35區域CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一個DNA序列和/或位於-10區域的TATAAT或其ATAAT鹼基已被其它鹼基置換但不抑制啟動子功能的序列。本發明也提供具有上述啟動子產生穀氨酸脫氫酶的基因。
CS的啟動子具有位於-35區域中的TTGACA序列和/或位於-10區域中的TATAAT序列，且沒有任何序列會抑制啟動子功能。本發明也提供具有上述啟動子的CS基因。
使用於ICDH的啟動子是具有在-35區域第一個或第二個啟動子(位點)的TTGCCA或TTGACA序列，和/或在-10區域第一個或第二個啟動子(位點)的TATAAT序列，但不抑制啟動子的功能。本發明也提供具有上述啟動子的icd基因。
使用於PDH的啟動子是在-35區域具有TTGCCA序列和/或在-10區域TATAAT序列，且引序列不抑制啟動子的功能。本發明也提供具有上述啟動子的PDH基因。
本發明也提供具有上述基因的產L-穀氨酸的棒狀菌。
精氨基琥珀酸合成酶的啟動子具有是選自位於-35區域的TTGCCA，TTGCTA和TTGTCA的至少一個DNA序列和/或位於-10區域的TATAAT序列或以其它鹼基置換位於TATTAT中的ATAAT鹼基，但序列不抑制此啟動子功能。本發明也提供具有上述啟動子的精氨基琥珀酸合成酶。
本發明也提供具有上述基因的產生精氨酸的棒狀菌。
培養本發明的棒狀菌可得到胺基酸，以產生L-穀氨酸為佳，是在液態培養基中形成所指定的胺基酸並通過累積，並從此培養基中收集胺基酸。
使用於培養本發明的上述菌株細菌的液態培養基是包含碳源，氮源，無機鹽，生長因子等等的一般培養基。
碳源包括碳水化合物類的葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜和澱粉水解物；醇類的乙醇和甘油；和有機酸類的醋酸。氮源包括硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，磷酸銨，醋酸銨，氨，蛋白腖，肉萃取物，酵母菌萃取物和玉米漿。當使用需特別營養的突變株時，則以標準品或天然物質形式將所要求的物質加入培養液中。
在生物素限制之下棒狀桿菌常產生L-穀氨酸。因此，在培養基中需限制生物素的量或將表面活性劑或青黴素等對生物素具抑制影響的物質加入培養基中。
發酵作用最好以搖動培養方法或有氧轉動培養方法在有氧條件下進行，而培養液pH維持在5到9持續2到7天。以尿素，碳酸鈣，氣態氨，氨水等等控制pH值。培養溫度以24～37℃為佳。
利用離子-交換樹脂方法或結晶法等常用方法控制液體培養液中L-穀氨酸的產生和累積。L-穀氨酸的分離可通過吸附在陰離子交換樹脂或通過中和結晶作用。
根據本發明，在產生胺基酸的棒狀菌胺基酸-生物合成基因的啟動子區域導入一突變來調控目的基因的表達，因此可得到高產量的指定胺基酸。此外，根據本發明的細菌並未發生任何目的基因的流失，與質粒相較之下能穩定得到高產量的指定胺基酸。如此，本發明具重要的工業價值。
本發明提供各種啟動子，特別是GDH的啟動子能賦予產生胺基酸的能力，特別是穀氨酸，在棒狀菌菌株內不需增加副產物天冬氨酸和丙氨酸的量就可得高產量穀氨酸。
在本發明中，將產生L-穀氨酸的棒狀菌導入突變，使所得菌株的突變發生在GDH基因的啟動子區域中，而此菌株對4-氟穀氨酸具抗性，且能在培養基中得到高產量的穀氨酸。因此，本發明非常有助於工業上的利用。
下列實施例將更進一步例證本發明。實施例1突變的GDH啟動子的製作以下列的定位突變方法製備突變的GDH啟動子(1)具有各種突變形式的啟動子的GDH基因的製備野生型棒狀菌GDH基因啟動子-35區域和-10區域的序列顯示在序列1。野生型的啟動子序列已發表於[Molecular Microbiology(1992),6,317-326]。
攜帶具有突變啟動子的GDH基因的質粒製備方法如下如圖1所示，以「細菌基因組DNA純化試劑盒」(Advanced Genetic TechnologiesCorp.)製備野生型棒狀桿菌ATCC 13869的染色體基因作為模板，通過PCR在GDH基因的上遊和下遊序列中擴增GDH基因。兩末端皆為平端。所得產物插入到質粒pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SmaⅠ位點。然後從具有棒狀桿菌複製起點的質粒pSAK 4中取得複製起點，將之插入到該質粒的SalⅠ位點而得到質粒pGDH。通過此方法，可使用序列表中所顯示的GDH基因上遊引物序列1到6為引物，得到具有上述各別啟動子序列的GDH基因。利用測序測定確認PCR擴增片段中任何突變，和啟動子序列中的非突變序列。pSAK4的構建如下質粒pHK4(特開平5-7491)具有衍生自質粒pHM 1519[Agric.Biol.Chem.,48,2901-1903(1984)]的複製起點，而pHM1519能在已得到的棒狀桿菌中自動複製，因此以BamHⅠ和KpnⅠ消化而得到具有複製起點的DNA片段。然後使用DNA平端試劑盒(Blunting kit of Takara Shuzo Co.,Ltd.)處理得到平端的DNA片段。然後連結SalⅠ連接子(linker)所得的產生插入pHSG 299(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SalⅠ位點而得到質粒pSAK4。(2)比較具有各啟動子序列的GDH的表達程度如上述所製備的質粒以電穿孔作用(特開平2-207791)導入野生型的棒狀菌菌株中。為比較這些菌株的GDH表達程度，GDH的比活性的測定是依照Sahm et al.的上述方法。結果顯示在表1。
表1
ATCC 1369／p 6-到ATCC 1369／p 6-分別相對應到序列號2到6。除了下列劃線部分改變之外，這些序列與序列號I(野生型)相同序列號1. 5'- TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGCCATAATTTGAACGT -Y2. CGGTCA CATAAT3. TGGTCA TATAAT4. TTGACA TATAAT5. TTGCCA TATAAT6. TTGTCA TATATT這些序列是雙鏈線形合成DNA。實施例2突變株菌株的製備(I)誘發對抗4-氟穀氨酸的突變株菌株AJ113029是公開在WO 96／06180中的產生谷氫酸的突變株菌株。雖然在31.5℃的培養溫度下不能產生穀氨酸，但若培養在37℃之下即使沒有生物素-抑制劑也能產生穀氨酸。在此實施例中，利用乳酸發酵短桿菌AJ 13029菌株作為親代以衍生突變株菌株。當然除了AJ 13029之外的產生穀氨酸菌株可使用作為親代，來衍生具4-氟穀氨酸抗性的突變株菌株。
將菌株AJ 13029的微生物培養於31.5℃的CM2B瓊脂培養基(表2)24小時以取得細胞。以250微克/毫升的N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍於30℃處理30分鐘。然後將具有存活率1％的細胞懸浮液塗於含有4-氟穀氨酸(4FG)的瓊脂平板培養基(表3)。於31.5℃培養20到30小時可形成菌落。在此實驗中，首先製備含有1毫克/毫升4FG的斜面培養基，然後其上製備相同培養基但不含4FG的平面培養基。如此，則可在瓊脂培養基表面得到4FG濃度梯度。當上述所得的突變株細胞接種於此平板時，在此菌株的生長限制邊界會形成一界線。採集在含有較高濃度4FG的區域所形成的菌落。因此從約10,000突變株菌株得到約50個菌株可抗4FG。
表2 CM2B瓊脂培養基成分 濃度蛋白腖(E本製藥社制)1.0％酵母菌萃取物(Ditco Co.)1.0％NaCl 10.5％d-生物素 10微克/升瓊脂1.5％(pH7.2以KOH調整)
表3瓊脂培養基成分 數量/每1公升水葡萄糖10克MgSO4·7H2O1克FeSO4·7H2O0.01克MnSO4·4-6H2O 0.01克鹽酸硫胺素 0.2毫克d-生物素 0.05毫克(NH4)2SO45克Na2HPO4·12H2O 7.1克KH2PO41.36克瓊脂 15克(2)4FG抗性突變株菌株的產生L-穀氨酸能力的確認約50個上述(1)所得的突變株菌株和親代AJ 13029菌株產生穀氨酸的能力確認如下所述。
將AJ 13029和突變株菌株分別於31.5℃的CM2B瓊脂培養基上培養20到30小時。然後培養在具有表4中所示的「培養基A」的液態培養中，而此培養是在31.5℃搖動培養。約22小時後加入表4中所示的最終濃度的B培養基。然後溫度轉移到37℃並再培養24小時。培養完全之後，以生物素分析儀(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)檢驗是否形成L-穀氨酸。結果發現50個菌株的培養中，有兩個菌株的穀氨酸產量高於親代菌株，且GDH活性較高(菌株A和菌株B)。測定此二菌株的GDH活性發現這兩個菌株的特殊GDH活性皆增加(表5)。以E.R.Bormann et al.[Molecular Microbiol.,6,317-326(1996)]的方法測定GDH活性。分析GDH的鹼基序列發現突變點只在GDH的啟動子區域內(表6)。
表4發成分培養基A 培養基B葡萄糖3克/100毫升 5克/100毫升KH2PO40.14克/100毫升0.14克/100毫升MgSO4·7H2O 0.04克/100毫升0.04克/100毫升FeSO4·7H2O 0.001克/100毫升 0.001克/100毫升MnSO4·4H2O 0.001克/100毫升 0.001克/毫升(NH4)2SO41.5克/100毫升 2.5克/100毫升黃豆蛋白質水解水溶液 1.5克/100毫升 0.38毫升/100毫升鹽酸硫胺素 0.2毫克/升0.2毫克/升生物素 0.3毫克/升0.3毫克/升抗發泡劑 0.05毫升/升 0.05毫升/升CaCO35克/100毫升 5克/100毫升pH7.0(以KOH調整)表5突變株菌株的穀氨酸形成和GDH活性菌株 Glu(g/dl)GDH比活性相對值AJ 130292.6 7.7 1.0FGR12.9 23.13.0FGR23.0 25.93.4表6突變株菌株GDH啟動子區域中的鹼基序列菌株 GDH啟動子序列-35- 10AJ 13029 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC CATAATFGR1 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC TATAATFGR2 TTGTCAT-CTGTGCGACACTGC TATAAT實施例3導入突變到產生穀氨酸棒狀菌的CS基因啟動子區域內在此實施例中，一菌株能加強編碼穀氨酸脫氫酶(GDH)和檸檬酸合成酶(CS)基因的啟動子。(1)gltA基因的克隆棒狀菌的gltA基因的鹼基序列是編碼檸檬酸合成酶，且已被證明[Microbial.140,l817-1828(1994)]。以這些序列為基礎的合成引物顯示在序列號7和序列號8。另一方面，使用細菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)製作乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA。加入無菌水到0.5微克染色體DNA,10微微摩爾的各寡核苷酸，8微升dNTP混合物(每一各2.5毫摩爾濃度)，5微升10×La Taq緩衝液(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和2單位La Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的混合液中使其最終PCR反應液為50微升。此反應液於94℃30秒(變性)，55℃15秒(退火)和72℃3秒(延長的)條件下進行30循環的PCR，以熱循環器TP 240(Takara Shuzo Co.,Ltd.)擴增包含gltA基因及其啟動子的3 kbp DNA片段。之後以SUPRECO2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)純化所得的擴增片段，然後使其平端。應用寶酒造公司的Bluntmg kit進行平端化處理。將此產物與SmaⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以連接起來。使用DNA連接試劑盒ver 2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)進行連接作用。連接反應完全後，將之轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內。將轉化產物塗到含有10微克/毫升IPTG(異丙基β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和40微克/毫升氯黴素的L培養基(含有10克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂；pH7.2)。過夜培養之後，挑起白色菌落並單個培養這些轉化菌落菌株。
以鹼性方法(由日本生物工學會編輯和培風館發行的生物工學實驗書，p.105,1992)從已轉化菌株製備質粒。並製備限制酶圖譜，相同於顯示在圖2的限制酶圖譜，命名為「pHSG 399CS」。(2)導入突變到gltA啟動子中使用Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo Co.,Ltd.)將突變導入gltA啟動子區域內。此方法具體描述如下。以EcoRⅠ和SalⅠ完全消化pHSG 399CS以得到含有gltA基因的EcoRⅠ-SalⅠ片段，然後與用EcoRⅠ和SalⅠ完全消化的pKF 19kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)片段連接起來。連接完全之後將其轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態細胞內。將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素(kanamycin)的L培養基。過夜培養之後，挑起白色菌落並分離單個菌落，獲得轉化體。從這些轉化菌株中製備質粒並將那些含有gltA基因者命名為pKF 19CS。
使用pKF 19CS為模板和顯示在序列號9,10及11的序列的末端磷酸化的合成DNA為引物以及附屬在Mutan Super Express Km的選擇引物。將PCR產物轉化到大腸桿菌MV 1184(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態細胞內。然後將轉化產物塗於含有25微克/毫升卡那黴素的L-培養基。過夜培養之後，挑起出現的白色菌落，分離單個菌落，獲得轉化體。從這些轉化菌株中製備質粒DNA。通過Sanger方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]以合成的序列號12 DNA序列測定gltA啟動子位點的鹼基序列。具體而言，以染劑終止測序試劑盒(AppliedBiosystems)和Genetic Analyzer ABl 310(Applied Biosystems)分析測定鹼基序列。以顯示在表7的序列所置換的gltA啟動子區域的產物分別命名為pKF 19CS1,pKF 19CS2和pKF 19CS4。
表7-35區域 -10區域pKF 19CS ATGGCT TATAGCpKF 19CS1 ATGGCT TATAACpKF 19CS2 ATGGCT TATAATpKF 19CS4 TTGACA TATAAT(3)突變株gltA質粒的構建步驟(2)中所構建的pKF 19CS,pKF 19CS1,pKF 19CS 和pKF19CS4以SalⅠ和EcoRⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)完全消化。另一方面，具有衍生自質粒pAM 330[特開昭58-67699]而能在棒狀菌中自動複製的複製起點的質粒pSFK 6(Japanese Patent Application No.Hei 11-69896)，使用EcoRI和SalⅠ完全分解，所得片段與含有gltA的2.5kb片段連接在一起。連接完全之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內。將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG,40克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基。過夜培養之後，挑起白色菌落並分離出單個菌落，獲得轉化體。從轉化菌株中製備質粒。這些含有gltA基因的質粒分別命名為pSFKC,pSFKC1,pSFKC2和pSFKC4。(4)測定突變株gltA質粒在棒狀菌內的CS表達量將上述步驟(3)所構建的質粒導入乳酸發酵短桿菌ATCC 13869內。具體而言，此過程是以電脈衝法(特願平2-07791)進行。使用含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基(包含10克/升bactotrypton,10克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂；pH7.0)於31℃篩選轉化產物。培養兩夜之後取得單個的菌落。這些含有pSKFC,pSKFC1,pSKFC2和pSKFC4的轉化體分別命名BLCS,BLCS1,BLCS2和BLCS4。將轉化體接種在含有表8中所示的成分的培養基中。然後於31℃培養到葡萄糖完全消耗完之前。離心培養液以分離菌體。以含有200毫摩爾濃度穀氨酸鈉的50毫摩爾濃度tris緩衝液(pH7.5)清洗細胞，然後再以相同溶液懸浮之。以UD-201(TOMY)超聲波破碎之後離心(10,000g)20分鐘，移除剩餘仍未破碎的細胞而得到一粗酶溶液。根據Methods Enzymol.13,3-11(1969)測定檸檬酸合成酶的活性。具體而言，將此粗酶溶液加入含有100毫摩爾濃度Tris HCl(pH8),0.1毫摩爾濃度DTNB,200毫摩爾濃度穀氨酸鈉和0.3毫摩爾濃度乙醯基輔酶A的反應液中，然後以日立分光光度計在30℃,412nm測定其吸光度增加，以此最為背景值。更進一步，加入草醋酸至其最終濃度為0.5毫摩爾濃度。測定在412nm時增加的吸光度，從背景值推算獲得檸檬酸合成酶的活性。以Protein Assay(BIO-RAD)測定粗酶溶液中的蛋白質濃度。使用牛血清白蛋白為標準蛋白質。結果顯示在表9中。可以確認，與野生型gltA啟動子相比，突變型gltA啟動子的檸檬酸合成酶活性增加。
表8成分濃度葡萄糖50克/升KH2PO41克/升MnSO4·7H2O 0.4毫克/升FeSO4·7H2O 10毫克/升黃豆蛋白質水解物 20毫克/升生物素0.5毫克/升鹽酸硫胺素2毫克/升2毫克/升表9菌株吸光度/分/毫克相對活性相對活性ATCC 13869 6.81.0ATCC 13869/pSFKC38.8 5.7 1.0ATCC 13869/pSFKC1 57.1 8.4 1.21ATCC 13869/pSFKC2 92.5 13.6 1.9ATCC 13869/pSFKC4 239.4 35.2 4.8(5)導入突變gltA基因到溫度敏感性質粒內為將含有突變gltA啟動子序列的基因整合插入到染色體中，則使用已知的在棒狀菌內複製的溫度敏感性質粒的方法來進行(特開平5-7491)。使用pSFKT7(特願平11-81693)作為質粒載體，在棒狀菌內其複製對溫度敏感。使用SalⅠ和BstPⅠ完全消化pKFCS1,pKFCS2和pKFCS3並使其平端，作為突變gltA啟動子序列。然後與已用SmaⅠ完全消化的pSFKT2連接起來。連接完全之後，轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)的感受態細胞內。將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基。過夜培養之後，挑起白色菌落並分離單個菌落，獲得轉化體。從已轉化品素中製備質粒。含有gltA基因的溫度敏感性穿梭載體命名為pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4。(6)導入突變gltA啟動子到染色體內將pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4以電脈衝法分別導入乳酸發酵短桿菌FGR2菌株。使用含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基於25℃篩選轉化產物。導入之後所得的菌株培養於CM2B液態培養基，然後以稀釋濃度為每一平板103到105cfu塗於含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板上於34℃培養。如此，則具有溫度敏感性的質粒的菌株由於在此溫度之下質粒複製受到抑制而變成對溫度敏感，所以不會形成菌落。另一方面，質粒DNA整合插入到染色體的菌株者因可形成菌落而能被篩選出來而取得個別分開的菌落。然後從此菌株提取染色體DNA作為模板，應用序列號8和13為引物進行PCR。之後確認約3kb的擴增片段。如此則證明此菌株已經由同源重組作用將衍生自溫度敏感性質粒的突變gltA基因整合插入到宿主染色體接近gltA基因中。衍生自pSFKTC1，2和4的菌株分別命名為BLCS11,BLCS12和BLCS14。(7)gltA啟動子-取代菌株的取得首先，從BLCS11，BLCS12和BLCS14菌株得到突變gltA基因通過同源性重組作用整合插入到染色體的卡那黴素敏感性菌株。將此質粒整合插入的菌株稀釋後塗於CM2B平板上並於34℃培養。形成菌落之後複印到含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板上，然後於34℃培養。如此則得到卡那黴素敏感性菌株。
從卡那黴素敏感性菌株中提取染色體作為模板，應用序列號7和8為引物進行PCR以製備gltA基因片段。然後使用SUPRECO2(TakaraShuzo Co，Ltd.)純化後以序列號13為引物進行測序反應測定其中的啟動子區域的序列。結果，與表7中的pKF19CS1啟動子序列相同的菌株命名為GB01，與pKF19CS2啟動子序列相同的菌株命名為GB02，以及和pKF 19CS4啟動子序列相同的菌株命名為GB03。當質粒及複製的gltA基因從染色體被移除時，原先位於染色體上的野生型gltA基因也一起與載體質粒被移除，然而通過質粒導入的突變株gltA基因仍留在染色體上。此事實指出基因取代已發生。(8)gltA啟動子突變株的檸檬酸合成酶的活性測定檸檬酸合成酶的活性測定可通過步驟(7)中所得到的FGR2,GB01,GB03和FGR2/pSFKC菌株以相同於步驟(4)的方法處理進行。結果顯示在表10。結果確認gltA啟動子取代的菌株的檸檬酸合成酶合性高於其親代菌株。
表10菌株 吸光度/分/毫克相對活性FGR2 7.9 1.0GB01 9.5 1.2GB02 15.0 1.9GB03 31.6 4.0FGR2/pSFKC 61.6 7.8(9)gltA啟動子取代菌株培養的結果將上述步驟(7)所得的每一菌株接種到含有表11中所顯示的成分的接種培養基中，在31.5℃搖動培養24小時。取300毫升的具有顯示在表11的成分的主要培養基於500毫升玻璃瓶發酵器中，然後加熱滅菌。取40毫升的上述接種培養物接種到此培養基內。然後於31.5℃開始培養，其攪動速率及通氣速率分別控制在800到1300rpm及1/2到1/1vvm。以氣態氨維持培養液pH值為7.5。初始培養8小時之後將溫度轉移到37℃。得20到40小時內葡萄糖完全消耗時就終止培養，而L-穀氨酸則形成且累積於培養液中，測定培養液中L-穀氨酸的含量。
結果如表12中所顯示，GB02和GB03菌株的L-穀氨酸產量有較大改進，而非GB01及FGE2/pSFKC菌株。從這些事實得知這些菌株的穀氨酸產量增加，通過導入突變到gltA啟動子中可增加CS活性2到4倍的好結果。
表11濃度成分 接種培養基主要培養基葡萄糖50克/升 150克/升KH2PO41克/升2克/升MgSO47H2O 0.4克/升 1.5克/升FeSO47H2O 10毫克/升 15毫克/升MnSO44H2O 10毫克/升 15毫克/升黃豆蛋白質水解物 20毫克/升 50毫克/升生物素0.5毫克/升2毫克/升鹽酸硫胺素2毫克/升 3毫克/升表12菌株L-穀氨酸(克/升)FGR28.9GB 01 9.1GB 02 9.4GB 03 9.4FGR2/pSFKC 9.1實施例4導入突變到穀氨酸產生菌棒狀菌的ICDH基因啟動子區域中在此實施例中製備一菌株，能增強編碼穀氨酸脫氫酶，檸檬酸合成酶和異檸檬酸合成酶基因的啟動子。(1)gltA基因的克隆編碼棒狀菌檸檬酸合成酶基因的icd基因鹼基序列已被證實[J.Bacterio1.177,774-782(1995)]。以此序列為基礎，合成如序列號14和15的引物。使用乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體DNA為模板進行PCR，擴增含有icd基因及其啟動子的3kbp DNA片段。所得的擴增片段以EcoRⅠ完全消化，然後與已用EcoRⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以連接起來。完全連接之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內。將轉化產物塗到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和40微克/毫升氯黴素的L-培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉化菌株得到轉化體。
攜帶icd基因的質粒命名為pHSG 399icd。(2)導入突變到icd啟動子內icd基因啟動子的正確位點目前尚未確定。研究增加icd基因mRNA轉錄量的可能性，是通過人為修飾編碼ICDH基因的上遊序列成啟動子類似序列而得知。具體而言，在ICDH蛋白質的第一個ATG的上遊約190bp(第一個啟動子)和約70 bp(第二個啟動子)的位於-10類似區域的DNA序列中導入突變。使用Mutan-Super Express Km(Takara ShuzoCo,Ltd.)導入突變到icd基因上遊區域內。此方法具體敘述如下。使用PstⅠ完全消化pHSG 399icd以得到含有icd基因啟動子的PstⅠ片段。然後將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pKF18kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)連接在一起。完全連接之後轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)感受態細胞內。將轉化產物塗到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉化菌株。從轉化菌株中製備質粒，並命名含有icd基因啟動子的質粒為pKF18icd。
使用pKF18icd為模板，及序列號16,17,18,19,20和21的5，末端磷酸化合成DNA及一篩選引物進行PCR。將PCR產物轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內。將轉化產物塗於含有25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後分別得到個別的已轉化菌株菌落。從被轉化菌株中製備質粒DNA，並以序列號22的合成DNA使用Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]測定icd啟動子位點的鹼基序列。具體而言，使用染劑終止測序試劑盒(Applied Biosystems)測定鹼基序列，並使用Genetic Analyzer ABI 310(Applied Biosystems)進行分析。以表7中所顯示的序列置換icd啟動子區域所得的質粒分別命名為pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5hdrpKFl8ICD 6。其中，以PstI完全消化pKFl8ICD2得到含有icd基因的啟動子PstⅠ片段。將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pKFl8KM(TakaraShuzo Co.,Ltd.)連接起來。完全連接之後，轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co,Ltd.)感受態細胞內。將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉化菌株。從被轉化菌株中製備質粒，並將含有icd基因啟動子者命名為pKFl8ICD2。使用pKFl8ICD2為模板，及序列號20和21的5′末端磷酸化合成DNA及一篩選引物進行PCR。將PCR產物轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內。將轉化產物塗於含有25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後，分別得到個別的已轉化菌株菌落。從被轉化菌株製備質粒DNA，並以序列號22的合成DNA測定位於icd啟動子位點內的鹼基序列。以表13中所顯示的序列置換icd啟動子區域所得的質粒分別命名為pKFl8ICD25和pKFl8ICD26。
表13質粒 第一個啟動子 第二個啟動子-35-10 -35 - 10pKFl8ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD04 GCGACT TAAAGT TTTCCA TATAATpKFl8ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAATpKFl8ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAATpKFl8ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAATpKFl8ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT(3)測定啟動子活性用質粒的構建為更簡單測定啟動子活性，利用報告基因來間接測定啟動子活性是可行的。理想的報告基因的特性是其活性能簡單被測定，甚至當一胺基酸加到N-末端時其活性並不會顯著變低，且不能產生背景反應，並具有適合基因操作的限制酶切位點。因為大腸桿菌的β半乳糖苷酶(LacZ)被廣泛使用作為報告基因，且棒狀桿菌屬沒有乳糖同化能力的基因[J.Gen.Appl.Microbiol.,18,399-416(1972)]，因此應用LacZ是適宜的報告基因。然後構建攜帶LacZ作為報告基因的質粒pNEOL(圖3)。此構建過程詳細敘述如下。使用得自大腸桿菌ME 8459(ME8459存放於基因學國家研究所(日本))的染色體DNA為模板，顯示在序列號23和24的合成DNA為引物進行PCR。使用SmaⅠ和BamHⅠ完全消化此PCR產物，然後與已用HindⅢ消化並平端的pKF3(TakaraShuzo Co,Ltd.)片段連接在一起。完全連接之後，轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態細胞內。將轉化產物塗於含有25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後，分別得到個別的已轉化菌株菌落。從被轉化菌株中製備質粒。其中取一質粒命名為pKF3nptⅡ。然後使用SalⅠ分解pKF3nptⅡ。另一方面，按實施例1(1)中所敘述的使用SmaⅠ和SalⅠ完全消化並平端pSAK4。將這些片段連接在一起以構建一穿梭載體pNEO，它可在棒狀桿菌中複製。此質粒對氯黴素和卡那黴素具抗性。更進一步，使用SmaⅠ和Sse 83871完全消化pNEO。所得的結果片段與已使用PstⅠ和SmaⅠ完全消化的pMC 1871(FarmaciaBiotech)連接在一起。如此，pNEOL能在棒狀菌中複製，且具有N端缺乏第8胺基酸的LacZ的報告基因的穿梭載體就構建完成了(參閱圖3)。(4)突變株icd啟動子活性的測定上述步驟(2)中所構建的具有突變icd啟動子的質粒，亦即pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFl8ICD25,pKFl8ICD26和pKFl8ICD等，使用SacⅡ和PstⅠ完全分解然後平端。之後與已使用SmaⅠ切割的pNEOL片段連接起來。完全連接之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內。將轉化產物塗於含有IPTG，X-Gal和40微克/毫升氯黴素的L-培養基中。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉化菌株。
從已轉化菌株中製備質粒。具有能產生ICDH和LacZ融合蛋白質的結構的質粒命名為pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD。使用電脈衝法將這些質粒和pNEOL導入乳酸發酵短桿菌ATCC 13869內。這些轉化產物的篩選是使用含有25微克/毫升卡那黴素和40微克/毫升X-Gal的CM2B平板培養基(含有10克/升bactotryptone,10克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂，pH7.0)在31℃培養兩晚。完全導入之後，形成菌落並分別挑起單個的菌落。含有pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD的轉化產物分別命名為BLAC1,BLAC2,BLAC3,BLAC4,BLAC5,BLAC6,BLAC25,BLAC26,BLAC和BNEOL。除了BNEO之外，全部轉化產生形成藍色菌落。如實施例3中的步驟(4)的相同方法，從轉化產物製備粗製的酶溶液，除了將細胞改為由「Z-緩衝液」(含有10毫摩爾濃度KCl，1毫摩爾濃度MgSO4,270微克/100毫摩爾濃度2-ME和NaPi,pH7.5)的緩衝溶液清洗及懸浮之。LacZ的活性測定如下Z-緩衝液與粗製的酶溶液混合。將ONPG溶於Z-緩衝液中至最終濃度為0.8毫克/毫升加入到反應混合物中，以Hitachi分光光度計U-3210於30℃測量在420nm的增加吸光度。所得值即為LacZ的活性。粗製的酶溶液中的蛋白質濃度以Protein Assay(BIO-RAD)測定。使用半血清白蛋白作為標準蛋白質。結果顯示在表14中。結果確認具有icd啟動子突變的發現ICDH-LacZ融合蛋白質的菌株的LacZ活性高於表達野生型ICDH-LacZ融合蛋白質的菌株。
表14菌株 吸光度/分/毫克 相對活性BNEOL未測定 0.0BNEOLI 42 1.0BNEOLI-1 84 2.0BNEOLI-2 168 4.0BNEOLI-3 80 1.9BNEOLI-4 126 3.0BNEOLI-5 139 3.3BNEOLI-6 84 2.0BNEOLI-25 168 4.0BNEOLI-26 170 4.0(5)將突變株icd基因導入溫度敏感性質粒內在棒狀菌內質粒載體pSFKT2(特願平11-81693)是溫度敏感性的複製子。使用PstⅠ完全消化pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFICD25和pKFICD26,所得的片段使用作為突變的icd啟動子。然後將此片段與已使用PstⅠ完全消化的pSFKT2連接起來。完全連接之後將之轉化到大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態細胞內。將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些轉化菌株。從已轉化菌株中製備質粒。含有icd啟動子的溫度敏感性穿梭載體分別命名為pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKTI6,pSFKTI25和pSFKTI26。(6)將突變株icd啟動子導入染色體內使用電脈衝法將上述步驟(5)中構建的質粒個自導入乳酸發酵短桿菌GB 02菌株中。此轉化產物的篩選是在25℃,使用含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基(含有10克/升bactotryptone，10克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升瓊脂，pH7.0)。導入之後，將培養在CM2B液態培養基中所得的菌株塗到含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板上，以每一平板稀釋為103到105cfu的濃度於34℃培養。如此，則具有溫度敏感性的質粒的菌株由於在此溫度之下質粒複製受到抑制而變成對卡那黴素敏感，所以不會形成菌落。另一方面，質粒DNA整合插入到染色體菌株者因可形成菌落而能被篩選出來而取得單個分開的菌落。從此菌株中提取染色體DNA作為模板，序列號13和15為引物進行PCR。之後確認約3kb的擴增片段。如此則證明此菌株已經由同源性重組作用將衍生自溫度敏感性質粒的突變icd基因整合插入到宿主染色體icd基因的鄰近位點。(7)icd啟動子取代菌株的取得首先，從如步驟(6)中的敘述通過同源性重組作用將突變icd基因整合插入到染色體的菌株中得到卡那黴素敏感性菌株。將此質粒整合插入的菌株稀釋後塗於CM2B平板上並於34℃培養。形成菌落之後於含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板上培養。如此則得到卡那黴素敏感性菌株。
從卡那黴素敏感性菌株中提取染色體作為模板，序列號14和15為引物進行PCR以製備icd基因片段。然後使用SUPRECO2(Takara ShuzoCo.,Ltd.)純化後以序列號22為引物進行測序反應測定其中的啟動子區域的序列。結果，具有衍生自pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKT16,pSFKT125和pSFKT126的icd啟動子序列者分別命名為GC01,GC02,GC03,GC04,GC05,GC06,GC25和GC26。當質粒及複製的icd基因從染色體被移除時，原先位於染色體上的野生型icd基因也一起與載體質粒被移除，然而通過質粒導入的突變icd基因仍留在染色體上。(8)icd啟動子突變株的異檸檬酸脫氫酶的活性測定使用上述步驟(7)中所得的8個菌株及GB02菌株應用實施例3(7)中相同方法製備ICDH粗製的酶溶液。ICDH活性的測定如下將粗製的酶溶液加到含有35毫摩爾濃度Tris HCl(pH7.5)，1.5濃度MnSO40.1毫摩爾濃度NADP和1.3毫摩爾濃度異檸檬酸的反應溶液中，在30℃使用Hitachi分光光度計U-3210測定340nm時的吸光度增加情形。使用Protein Assay(BIO-RAD)測定粗製的酶溶液中的蛋白質濃度。結果顯示在表15中。結果確認icd啟動子取代菌株的異檸檬酸脫氫酶的活性高於親代菌株。
表15菌株 吸光度/分/毫克 相對活性GB 02 3.91.0GC 01 8.21GC 02 19.1 4.9GC 03 7.01.8GC 04 12.5 3.2GC 05 19.1 4.9GC 06 10.5 2.7GC 025 30.4 7.8GC 026 24.2 6.2(9)icd啟動子取代菌株的培養結果如實施例3中步驟(9)的相同方法培養上述步驟(7)中的8個菌株。結果確認使用菌株GC02,GC04,GC05,GC25和GC26時其L-穀氨酸產量有改善，如表16中所顯示。結果發現導入突變到icd啟動子中所得的菌株的ICDH活性至少增加3倍。
表16菌株 L-穀氨酸(g/l)GB02 9.2GC01 9.0GC02 9.5GC03 9.1GC04 9.4GC05 9.6GC06 9.2GC25 9.9GC26 9.8實施例5在棒狀菌穀氨酸產生細菌的PDH基因啟動子區域導入突變(1)從棒狀菌中克隆pdhA基因合成的引物序列號25和26，是篩選自大腸桿菌，綠膿桿菌和結核桿菌的丙酮酸脫氫酶(PDH)的E1亞單位中具有高同源性的區域。使用細菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)從乳酸發酵短桿菌ATCC 13869中製備染色體DNA作為模板，在PCRTechnology(H.Erlich編輯，Stockton Press發行，1989)第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR。然後將反應液載入瓊脂凝膠中進行電泳以確定約1.3 kb的DNA片段被擴增。使用合成性的序列號25和26的DNA從兩末端測定所得的鹼基序列。以Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]利用DNA測序試劑盒(Applied Biosystems Co.)測定鹼基序列。將測定的鹼基序列翻譯為胺基酸，並與大腸桿菌，綠膿桿菌和結核桿菌的丙酮酸脫氫酶的E1亞單位比較，因發現其中的同源性區域高。結果判斷認為PCR擴增的DNA片段是編碼乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的丙酮酸脫氫酶E1亞單位的pdhA基因的一部分。因此進一步克隆此基因的上遊及下遊。克隆方法如下使用限制酶EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XbaⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)消化乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體以得到DNA片段。序列表中的引物序列號27和28使用於克隆上遊部分，引物序列號29和30使用於克隆下遊部分。利用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)進行克隆。使用該試劑盒進行PCR的結果，以EcoRⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XabⅠ分解從上遊位點分別擴增出0.5,2.5,3.0,1.5和1.8 kb的DNA片段；以及使用BamHⅠ,HindⅢ和PstⅠ分解從下遊位點分別擴增出1.5,3.5和1.0kb的DNA片段。DNA片段的鹼基序列以上述的相同方法測定。結果發現此擴增的DNA片段更進一步包含一約920個胺基酸的開放讀碼相及一位於上遊的假設啟動子區域。由於此開放讀碼相的鹼基序列的胺基酸產物與已知的大腸桿菌丙酸酸脫氫酶的E1亞單位具高度同源性，因此顯然此開放讀碼相是編碼乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的丙酸酸脫氫酶E1亞單位的pdhA基因。此開放讀碼相的鹼基序列顯示在序列表中的序列號31。序列表中的序列31，也顯示從鹼基序列所預測的胺基酸產物的序列。由於位於蛋白質N端的甲硫氨酸殘基是衍生自起始密碼ATG，此胺基酸通常不是蛋白質的功能所必需，因此目前已知此甲硫氨酸殘基在翻譯之後會通過胜肽酶作用而被移除。上述的蛋白質其N端的甲硫氨酸殘基可能已被移除。然而，在序列表中序列號31的ATG上遊6個鹼基存在的GTG序列，可能從這兒胺基酸被翻譯。其它微生物譬如大腸桿菌的丙酮酸脫氫酶是由三個次單元E1，E2和E3所組成，且他們的編碼基因通常是操縱子。然而在pdhA基因3kb下遊中並沒有可能是丙酮酸脫氫酶E2和E3亞單元的開放讀碼相。但很清楚的是，位於開放讀碼相下遊存在一終止子。從這些事實推測，乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的丙酮酸脫氫酶E2和E3亞單元是位於染色體的另一位點上。(2)構建一質粒用以擴增pdhA目前已有一菌株是將編碼大腸桿菌的PDH三個亞單位的基因導入乳酸發酵短桿菌ATCC 13869中，而得到一穀氨酸產量增強的菌株(特願平10-360619)。然而，乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的PDH中只有編碼E1亞單位的pdhA基因被克隆到，且不知單獨擴增此基因是否能改善胺基酸的產量。在此情形下，因此想單獨擴增pdhA基因看看是否可有效改善胺基酸的產量。
以已克隆的鹼基序列為基礎合成顯示在序列號33和34的引物。使用細菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)製備乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板，依據PCR Technology(H.Erlich編輯，Stockton Press發行，1989)第8頁上敘述的標準反應條件進行PCR以擴增pdhA基因。序列號33的合成引物是對應到序列表中序列號32中的pdhA基因第1397鹼基到1416鹼基。序列號34則是一其鹼基為序列表中序列號32中的第5355到5374鹼基負鏈的引物，從5′位點表示。
利用常用方法純化PCR產物，然後與限制酶SalⅠ和EcoT221作用。將此片段與已用SalⅠ和PstⅠ切割的pSFK(特願平11-69896)經由連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)連接在一起。之後轉化到大腸桿菌JM109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受態細胞內，將轉化產物塗於含有10微克/毫升IPTG(異丙基-β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基(含有10克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養之後，挑起白色菌落並單個培養這些被轉化的菌落菌株。
以鹼性方法(由日本生物工學會編輯和培風館發行的實驗工學實驗書，p.105,1992)從已轉化菌株製備質粒。測定插入到載體中DNA片段的限制酶圖譜，並與序列表中序列號32所發表的pdhA基因的限制酶圖譜作比較，含有DNA片段的質粒若其插入段有相同限制酶圖譜者命名為pSFKBPDHA。(3)將pSFKBPDHA導入到乳酸發酵短桿菌ATCC 13869和GC25中並評價其發酵實驗使用電脈衝法(特開平2-207791)將質粒pSFKBPDHA轉化到乳酸發酵短桿菌ATCC 13869和GC25內而得到已轉化菌株。通過導入質粒pSFKBPDHA到乳酸發酵短桿菌ATCC 13869和GC25而得的產生L-穀氨酸轉化菌株ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培養如下將所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培養如下將所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA細胞培養在含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基之後，所得的細胞接種到一培養基中(每1公升包括80克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4·7H2O,0.01克MnSO4·7H2O,15毫升黃豆蛋白質水解物，200微克鹽酸硫胺素，60微克生物素，25毫克卡那黴素和50克CaCO3；使用KOH調整pH到8.0)。於31.5℃搖動培養至培養基中的糖分消耗完。所得產物再接種到上述的相同成分的培養基(用於GC25/pSFK6和GC25/pSFKBPDHA)，或刪除生物素的相同成分培養基(用於ATCC 13869/pSF6和ATCC 13869/pSFKBPDHA)，以5％的量於37℃搖動培養至糖分被消耗完。對照組是使用電脈衝法(參考特開平2-207791公報)將質粒pSFK6轉化到乳酸發酵短桿菌ATCC 13869和GC25中所得的菌株，pSFK6是得自棒狀桿菌的可以自動複製的質粒，然後如上述的相同方法培養。完全培養之後，使用Biotic Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)測定培養基中L-穀氨酸累積的量。結果如表17中所示。
表17菌株 L-穀氨酸生成率(％)ATCC 13869/pSFK6 3.6ATCC 13869/pSFKBPDHA 3.8GC25/pSFK6 5.1GC25/pSFKBPDHA 5.3從這些結果顯示在乳酸發酵短桿菌ATCC 13869和GC25中單一擴增pdhA基因，能明顯有效改善穀氨酸的產量。(4)構建質粒用以測定突變的pdhA啟動子活性為製備丙酮酸脫氫酶(PDH)的突變啟動子，將乳酸發酵短桿菌ATCC 13869已克隆的pdhA基因先測定其啟動子區域，通過不同的啟動子區域修飾來測定表達量的差異，可利用β-半乳糖苷酶活性來測定。
從已克隆且證明的鹼基序列推算pdhA基因的啟動子位點，結果推測很有可能位於序列表中序列號32的第2252到22257及2279到2284的鹼基，分別是位於-35區域及-10區域。因此合成序列表中序列號35和36中的引物，以來自乳酸發酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA為模板進行PCR，擴增含有pdhA基因啟動子區域的DNA片段。合成的引物中，序列號35對應到序列號32中的鹼基2194到2221；但鹼基2198已用C取代，且鹼基2200和2202已用G取代，且限制酶SmaⅠ的識別序列已被插入。序列號36對應到序列號32中的鹼基2372到2398；但鹼基2393和2394已用G取代，且具有限制酶SmaⅠ的識別序列的反鏈，從5′位點表示。使用細菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)製備乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體作為模板，以PCR Technology(H.Erlich編輯，Stockton Press，1989)第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR來擴增pdhA基因的啟動子區域。利用常用的一般方法純化所得的PCR產物，然後使用限制酶SmaⅠ作用之。將此片段與已用限制酶SmaⅠ(實施例4(3))切割的pNEOL連接在一起，pNEOL能在缺乏LacZ基因啟動子區域的棒狀菌中複製(使用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.))。之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞內(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，然後將轉化產物塗於含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基上(含有10克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉化菌株。使用鹼性方法(日本生物工學會編輯，以及培風館發行的生物工學實驗書，p.105，1992)從已轉化菌株中製備質粒。通過一般方法測定插入到載體的DNA片段的序列之後，含有此插入段DNA片段的質粒命名為pNEOLBPDHAprol。
更進一步，為構建質粒而合成的位於序列表中的序列號37,38和39的引物，其中假設是啟動子位點的區域已改變為棒狀菌啟動子的共有序列。使用乳酸發酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA為模板，各引物及序列號36的引物進行PCR，所擴增的DNA片段中的pdhA基因啟動子區域已改變為共有序列。在合成的引物中，序列號37對應到序列號32中的鹼基2244到2273；而鹼基2255已被C取代，和鹼基2257已被A取代；且只有-35區域已被改為棒狀菌的共有序列。序列號38對應到序列號32中的鹼基2249到2288；鹼基2279和2281已被T取代；且只有-10區域已被改為棒狀菌的共有序列。序列號39對應到序列號32的鹼基2249到2288；鹼基2255已被C取代，鹼基2257已被A取代；以及鹼基2279和2281已被T取代；且-35區域和-10區域皆改為棒狀菌的共有序列。使用細菌基因組純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)製備乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體作為模板，以PCR Technology(H.Erilich編輯，Stockton Press發行，1989)第8頁所述的標準反應條件下進行PCR，利用這些引物擴增pdhA基因的啟動子區域，其中的啟動子區域改為共有序列。所得的PCR產物以常用方法純化，然後以限制酶SmaⅠ作用之。將此片段與已用限制酶SmaⅠ切割的pNEOL利用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)連接起來，其中的pNEOL能在缺乏啟動子區域的lacZ基因的棒狀菌中複製。之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內，將轉化產物塗於含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那黴素的L-培養基(包含10克/升bactotryptone，5克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養之後，挑起藍色菌落並分別培養這些轉化菌株。使用鹼性方法(日本生物工學會編輯，以及培風館發行的生物工學實驗書，p.105,1992)從已轉化菌株中製備質粒。通過一般方法測定插入到載體的DNA片段的序列，其中只有-35區域已改為共有序列的質粒命名為pNEOLBPDHApro35；所含的DNA片段中的序列只有-10區域已改為共有序列的質粒則命名為pNEOLBPDHApro10；且若質粒所含的DNA片段的-35區域及-10區域皆改為共有序列者則命名為pNEOLBPDHApro3510 。(5)突變株pdhA啟動子活性的估計使用電脈衝法(特開平2-207791)將這裡構建的質粒pNEOLBPDHApro1，pNEOLBPDHApro10和pNEOLBPDHApro3510和命名的質粒轉化到乳酸發酵短桿菌ATCC 13869中而取得被轉化菌株。以實施例4(4)中所敘述的方法測定所得的轉化產物的β-半乳糖苷酶活性。啟動子區域的序列改為共有序列之後的β-半乳糖苷酶活性顯示在表18中，其中將具有pdhA基因啟動子區域的β-半乳糖苷酶酶活性定為1。
表18菌株 β-半乳糖苷酶活性(相對值)ATCC 13869/pNEOLBPDHAprol 1ATCC 13869/pNEOLBPDHApro106ATCC 13869/pNEOLBPDHApro3510 7.5這些結果指出假設的啟動子位點為pdhA基因的啟動子，且可通過改變此區域的序列為共有序列而改變pdhA的表達(增加)。此事實表示通過改變PdhA基因的啟動子區域，就能不需使用質粒而改變表達量。(6)構建質粒用以製備啟動子突變的菌株由於已證明可通過在啟動子導入突變而改變PdhA的表達，因此構建質粒用以製備PdhA基因啟動子變化的菌株。為構建啟動子變化的菌株，因此構建三種質粒。此三質粒分別是其中的-35區域，-10區域和兩區域皆改為共有序列。
以已被克隆的鹼基序列為基礎，新合成序列號40和41中的引物。在合成的引物中，序列號40是一反鏈，其鹼基序列對應於序列號32中的鹼基2491到2521的反鏈，其表示法是從5′開始，且在5′末端附著上3個A和4個T。序列號33是一反鏈，對應於序列號32中的pdhA基因的鹼基5020到5039的反鏈，其表示法是從5′開始。使用序列號33和40為引物，以細菌基因組DNA純化試劑盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)所製備的乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板，在PCR Technology(H.Erilich編輯，Stockton Press發行，1989)第8頁所敘述的標準反應條件下進行PCR。更進一步使用序列號15和17為引物，乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的染色體為模板進行PCR。使用常用方法純化所得到的PCR產物。然後使用通過序列號9和16為引物進行PCR，以及使用序列號39和41的PCR產物及序列號33和41為引物進行PCR。PCR條件如下在反應液中此四個DNA濃度為10微摩爾濃度，沒有使用模板，並使用La tag(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。使用一般常用方法純化PCR產物後與限制酶SalⅠ和XhoⅠ作用。所得片段利用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)與已用限制性酶SolⅠ切割的溫度敏感性質粒pSFKT2連接在一起，而pSFKT2能在棒狀菌中複製。之後轉化到大腸桿菌JM 109感受態細胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)內，轉化產物塗有含有10微克/毫升1PTG(異丙基-β-半乳糖苷)，25微克/毫升卡那黴素和40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的L-培養基(包含10克/升bactotryptone，5克/升細菌酶母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升瓊脂，pH7.2)。過夜培養之後，挑起白色菌落並分別培養這些被轉化的菌落菌株。使用鹼性方法(由日本生物工學會編輯，培負館發行的生物工學實驗書，p.105,1992)從已轉化菌株中製備質粒。之後測序插入到載體的DNA片段，然後與序列號32中所發表的pdhA基因的鹼基序列作比較。含有DNA片段的質粒，其中的DNA片段序列只有啟動子的-35區域和-10區域改為棒狀菌的共有序列，將此質粒命名為pSFKTPDHApro3510。
質粒中的pdhA基因啟動子-35區域改為棒狀菌的共有序列，和pdhA基因啟動子-10區域改為棒狀菌共有序列的質粒，除了分別以序列表中的序列號37和39取代序列號39以外，皆是以上述相同方法構建的。這些質粒分別命名為pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10。(7)啟動子突變菌株的製備pdhA基因啟動子突變菌株的製備是通過同源性重組作用，利用上述步驟(6)中用於製備啟動子突變菌株所構建的質粒來進行。
首先，通過電脈衝法(特開平2-207791)將質粒pSFKTPDHApro3510轉化到GC 25用以製備啟動子突變菌株。之後轉化產物塗於CM2B平板培養基(包括10克/升聚蛋白腖，10克/升細菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl，10微克/毫升生物素和15克/升瓊脂，pH7.2)並在25℃培養以獲取被轉化菌株。將此產物於含有CM2B液態培養基的試管中培養過夜。然後塗於含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基，在34℃培養以獲取含有通過同源性重組作用將質粒pSFKTPDHApro 3510插入到染色體中的一次轉化菌株。分離出單一菌落之後，溼塗於CM2B平板培養基在31.5℃培養。菌落開始出現之後，此產物能在含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板培養基中複製而得到卡那黴素敏感性菌株。由於有兩種菌株，亦即具有野生型pdhA基因啟動子位點的菌株，和另一具有突變導入的菌株，因此測序此部分。如此可獲得將突變導入pdhA基因啟動子位點的啟動子突變菌株。在此菌株中，pdhA基因的啟動子-35區域和-10區域已改為棒狀菌的共有序列。此菌株命名為GD 3510。
除了以質粒pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10取代質粒pSFKTPDHApro3510用以製備啟動子突變菌株之外，使用上述的相同方法獲取pdhA基因啟動子的-35區域和-10區域已改為棒狀菌共有序列的菌株。它們分別命名為GD 35和GD 10。(8)pdhA基因啟動子突變菌株的錐形瓶培養結果的評估將上述所得的三種pdhA基因啟動子突變菌株在錐形瓶中培養以產生L-穀氨酸。將培養於CM2B平板培養基中的啟動子突變菌株GD3510,GD 35,GD 10和GC 25細胞接種於培養基中(每公升水含有30克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4.7H2O,0.01克MnSO4.7H2O,15毫升黃豆水解物，200微克鹽酸硫胺素，60微克生物素和50克CaCO3；使用KOH調整pH到8.0)。然後在31.5℃搖動培養到培養基中的糖分消耗為止。所得的產物接種到上述相同成分的培養基中，以5％的量於37℃搖動培養到培養基中的糖分消耗為止。培養完全之後，使用Biotic Analyzer AS-210(AsahiChemical Industry Co.,Ltd.)測定液態培養基中所累積的L-穀氨酸數量。結果顯示於表19中。
表19菌株 L-穀氨酸(克/100毫升)GC 25 1.9GD 35 2.0GD 10 2.0GD 35102.1從這些結果得知所獲得的啟動子突變菌株可提供增強的穀氨酸產量。實施例6導入突變到棒狀菌精氨醯琥珀酸合成酶基因的啟動子區域內(1)argG基因上遊的鹼基序列的測定為了以PCR擴增黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)的argG基因，因此需測定此ORF上遊及下遊區域的鹼基序列。以已知的穀氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicom)argG的ORF鹼基序列(GenBank登記號AF 030520)為基礎合成引物，並使用體外LA PCR克隆試劑盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)依據其說明書進行鹼基序列的測定。這些引物特別使用具有位於序列號42和43中的鹼基序列的寡核苷酸(引物1和2)用於上遊區域，以及具有位於序列號44和45中的鹼基序列的寡核苷酸(引物3和4)用於下遊區域。將野生型菌株的黃色短桿菌2247菌株(ATCC 14067)的染色體DNA，以限制酶EcoRⅠ完全消化，使用引物2或3進行第1次PCR，和使用引物1或4進行第2次PCR來測定argG上遊及下遊的鹼基序列。(2)啟動子位點的預測將上述序列以購買的軟體(GENETYX)預測argG基因ORF的上遊區域中類似啟動子的序列。將突變導入最高分數(約第一個ATG的上遊120bp)的位點。然後測量此啟動子的活性。(3)導入突變到啟動子序列中，並測定突變株啟動子的活性使用突變導入引物9，10,11,12或13和7(具有序列號50,51,52,53,54或58)用於最高分數的位點，以AJ 12092菌株的染色體DNA為模板進行第一次PCR。使用PCR產物作為3′位點的引物，以及具有序列號49的引物8作為5′位點的引物，相同的染色體DNA作為模板進行第二次PCR，在可能是啟動子的部分獲得具有突變導入其中的DNA片段。為測定此突變株啟動子的活性，將這些DNA片段插入到啟動子探針載體pNEOL的SmaⅠ位點，而能得到與LacZ報告基因相同方向的質粒pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7。使用引物7和8,AJ 12092菌株染色體DNA為模板進行PCR所得的DNA片段同樣插入質粒pNEOL的LacZ報告基因的上遊而獲得對照組質粒pNEOL-0。
將pNEOL-0,pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7導入AJ 12092菌株內。使用電脈衝法(特開平2-207791)將質粒導入。把每一轉化產物塗於含有4微克/毫升氯黴素的CM2G平板培養(每1公升純水包含10克聚蛋白腖，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)，並篩選氯黴素抗性菌株。
將這些菌株——塗於瓊脂培養基(含有0.5克/100毫升)葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白腖，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5克/100毫升NaCl和5微克/升氯黴素)，在31.5℃培養20小時。取所得的其中一細胞接種到一培養基中[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨，01克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮角度而言)的黃豆水解物]。於31.5℃培養18小時，所得細胞以實施例4(4)中所敘述的方法測定β-半乳糖苷酶活性。
AJ 12092/pNEOL-0所檢測的β-半乳糖苷酶活性顯示在表20中，結果發現插入到lacZ基因結構上遊的DNA片段扮演啟動子的功能。此外，每一質粒導入的菌株皆比AJ 12092/pNEOL-0具有較高的β-半乳糖苷酶活性。因此發現通過導入突變到可能是啟動子序列的菌株，其轉錄作用活性增加，結果顯示在表20中。
表20相對活性(AJ 12092/pNEOL-0=1)AJ 12092 未檢測AJ 12092/pNEOL-01.0AJ 12092/pNEOL-12.8AJ 12092/pNEOL-22.7AJ 12092/pNEOL-31.8AJ 12092/pNEOL-40.8AJ 12092/pNEOL-73.0(4)用於導入突變的質粒的構建以AJ 12092菌株的染色體DNA為模板，使用引物14和15(具有序列號55和56)進行PCR。所得的DNA片段插入克隆用載體pHSG 398(TaKaRa產品)的多克隆位點中的SmaⅠ位點以構建質粒p0。然後使用限制酶EcoRⅤ和BspHⅠ消化p0，同樣也使用限制酶EcoRⅤ和BsplⅠ消化pNEOL-3和pNEOL-7。所得的DNA片段連接在一起而獲得導入突變的質粒p3(衍生自導入突變的引物11的突變株)和p7(衍生自導入突變的引物13的突變株)。(5)將突變導入性質粒導入到產生精氨酸的細菌內使用電脈衝法(特開平2-207791)將所得質粒導入產生精氨酸的乳酸發酵短桿菌AJ 12092菌株內。由於這些質粒的自動複製功能在短桿菌內無效，因此唯有通過同源性重組作用將主要質粒插入整合到染色體的菌株才能被篩選為Cm抗性菌株。將突變導入性質粒插入整合到染色體者，在含有5微克/毫升氯黴素的CM2G平板培養基(每1公升純水包含10克聚蛋白腖，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)篩選氯黴素抗性菌株。然後再進行一次同源性重組作用從Cm敏感性菌株篩選出將指定的變化序列置換argG基因的啟動子部分的菌株。
因此得到以P3序列取代的菌株(AJ 12092-P3)和P7序列取代的菌株(AJ 12092-P7)。(6)argG基因的克隆以(1)中所測定的鹼基序列為基礎，合成具有位於序列號46和47的寡核苷酸(引物5和6)，及黃色短桿菌的染色體DNA為模板進行PCR。PCR反應進行25次循環，每一循環包括94℃30秒，55℃1秒，72℃2分鐘及30秒。如此所得的DNA片段克隆到克隆用載體pSTV 29(Takara Shuzo Co.,Ltd.)中多克隆位點的SmaⅠ位點。更進一步，將實施例1中的pSAK4以SalⅠ處理所得的複製起點片段插入pSTⅤargG的SalⅠ位點而製備pargG。(7)將pargG導入到短桿菌內使用電脈衝法(特開平2-207791)將質粒pargG導入乳酸發酵短桿菌AJ 12092菌株內。然後將轉化產物於含有4微克/毫升氯黴素的CM2G平板培養基(每1公升純水包括10克聚蛋白腖，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克瓊脂，pH7.2)篩選氯黴素抗性菌株。(8)啟動子突變菌株的argG活性上述的兩種argG啟動子突變菌株和使用質粒通過擴增argG所得的菌株(AJ 12092/pargG)測定其argG活性。將這些菌株——塗於瓊脂培養基(含有0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白腖，1克/100毫升酵母提取物，0.5克/毫升NaCl和5微克/升氯黴素)，在31.5℃培養20小時。然後將所得的每一細胞接種到培養基內[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸銨，0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4,0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮而言)的黃豆水解物]。在31.5℃培養18小時後，使用已述方法[Journal ofGeneral Microbiology(1990)]測定所得細胞的ArgG活性。上述兩種ArgG啟動子突變菌株和使用質粒通過擴增argG所得菌株的ArgG活性顯示在表21中。從表21顯然得知，將突變導入啟動子的AJ 12092-P3的ArgG活性比親代品約高兩倍，而AJ 12092-P7比親代菌株高約3倍。AJ 12092/pargG的ArgG活性比親代菌株高約4.5倍。
表21相對活性(AJ 12092=1)AJ 120921.0AJ 12092 - P3 2.1AJ 12092 - P7 2.9AJ 12092/pargG 4.4(9)由啟動子突變菌株產生精氨酸在錐形瓶內培養每一argG啟動子變化的菌株。為對照用，也同樣培養親代菌株AJ 12092和AJ 12092/pargG。將這些菌株各別接種到培養基上(含有0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45克/100毫升(以氮而言)的黃豆水解物)。然後再塗於瓊脂培養基(包含0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白腖，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5/克/100毫升NaCl和5微克/升氯黴素)，於31.5℃培養20小時。然後取這些細胞培養在含有4克/100毫升葡萄糖和6.5克/100毫升硫酸銨的錐形瓶中，於31.5℃培養到葡萄糖完全消耗為止。使用0.2當量濃度的HCl溶液將此培養液稀釋到1/51的濃度測其吸光度(CD 620)，精氨酸的生成量(濃度克/100毫升)及培養時間顯示在表22中。
從表22顯然得知使用argG啟動子突變菌株時，精氨酸的產量增加程度相當於使用質粒擴增argG。啟動子突變菌株AJ 12092-P3和AJ12092-P7的培養時間與親代菌株相同，但質粒擴增菌株的培養時間較長。由此得知精氨酸產生力高於質粒擴增菌株。
表22OD 精氨酸 培養 生產力(克/100 時間 (克/100毫毫升) (小時) 升/小時)AJ 12092 0.5021.25 48 0.026AJ 12092-P3 0.5101.47 48 0.031AJ 12092-P7 0.5141.43 48 0.030A.J 12092/pargG 0.5201.47 52 0.028實施例7將突變導入產生穀氨酸的棒狀菌的GDH基因啟動子區域內(1)突變株gdh質粒的構建使用定位突變法來構建具有實施例2中所敘述的FGR1菌株和FGR2菌株的GDH啟動子序列的質粒。為取得FGR1菌株的GDH啟動子序列，使用序列號57和60的合成DNA為引物及ATCC 13869的染色體DNA為模板進行PCR；另一方面也使用序列號58和59的合成DNA及ATCC 13869的染色體DNA為模板進行PCR。更進一步，以這些PCR產物作為模板，使用序列號57和58的合成DNA為引物進行PCR。將所得的PCR產物插入pSFKT 2(特願平11-69896)的SmaⅠ位點而構建出pSFKTG11。為取得FGR2菌株的GDH啟動子序列，使用序列號57和62的合成DNA為引物及ATCC 13869的染色體DNA為模板進行PCR；另一方面也使用序列號58和61的合成DNA為引物，及ATCC13869的染色體DNA為模板進行PCR。更進一步，以這些PCR產物為模板，使用序列號57和58的合成DNA為引物進行PCR。所得的PCR產物插入pSFKT2(特願平11-69896)的SmaⅠ位點而構建出pSFKTG07。插入pSFKTG11和pSFKTG07 SmaⅠ位點的DNA片段必需測定其鹼基序列，以確認除了啟動子區域以外沒有突變導入GDH內。(2)gdh啟動子突變菌株的構建使用電脈衝法將pSFKTG 11和pSFKTG 07導入AJ 13092菌株內，然後將轉化產物生長於含有25微克/毫升卡那黴素的CM2B平板上，於25℃進行篩選。將轉化產物在34℃培養，以篩選可在34℃對卡那黴素具抗性的菌株。事實上有一菌株在34℃對卡那黴素具抗性，表示pSFKTG11或pSFKTG 07整合插入到AJ 13029菌株的染色體中。因此卡那黴素敏感性菌株則從那些質粒插入整合到染色體中的菌株中獲得。測定這些菌株的GDH啟動子序列，具有相同於pSFKTG 11和pSFKTG 07的gdh啟動子序列的菌株分別命名為GA01和GA02。(3)gdh啟動子突變菌株的L-穀氨酸產生力的確認使用上述實施例2(2)中的相同方法確認菌株GA01和GA02和其親代菌株的穀氨酸產生力。結果得知GA01和GA02顯著增加穀氨酸的累積，結果顯示在表23。
表23菌株穀氨酸(克/100毫升)GDH的比活性相對值AJ 13029 2.6 7.7 1.0GA01 3.0 22.3 2.9GA02 2.9 27.0 3.5(4)自行克隆(self-cloning)型式的gdh質粒的構建首先，構建自行克隆載體pAJ 220。使用EcoRⅤ和PatⅠ處理pAJ 226(特開昭61-152289)，以製備含有可在棒狀菌內自動複製的區域的片段。將此片段與約0.7kb的DNA片段連接起來而得到質粒AJ 220，而0.7 kb的DNA片段是以EcoRV和PstⅠ處理pAJ 224(J P.KOKAI No.Sho 61-152289)所得到。此質粒能在棒狀菌內自動複製，且可使宿主對抗生素-甲氧苄啶具抗性。
使用序列號63和64的合成DNA為引物，野生型棒狀菌ATCC 13869的染色體DNA為模板進行PCR。將所得的gdh基因片段插入pAJ 220的BalⅠ位點而構建pAJ 220G。啟動子位於靠近pAJ 220的BalⅠ位點，且表達的增加視基因插入到BalⅠ位點的方向而定。使用電脈衝法將pAJ220G和pGDH導入ATCC 13869內。如此構建的菌株的GDH活性測定，可通過上述(1)中的方法進行。結果顯示於表24中，導入pAJ 220G的菌株的GDH活性比導入dGDH的菌株高約1.5倍。
表24菌株 GDH比活性相對值ATCC 13869 7.7 1.0ATCC 13869/pGDH82.710.7ATCC 13869/pAJ 220G120.1 15.6(5)gdh活性對產量及副產物天冬氨酸的影響的研究利用電脈衝法將pGDH和pAJ 220G導入AJ 13029內。將這些菌株及上述步驟(2)中所得的菌株一一接種到具有表25中所示成分的接種培養基內，於31.5℃搖動培養24小時以獲取這些接種物。取300毫升的主要培養基於500毫升的玻璃發酵瓶內，主要培養基成分如表25中所示，然後加熱滅菌。將40毫升的上述的接種培養基內的菌株接種到主要培養基內，在31.5℃開始培養並伴隨800到1300rpm的轉動及1/2到1/1vvm的通氣量。使用氣態氨維持1/1 pH7.5。開始培養8小時後將溫度移到37℃。約20到40小時內葡萄糖完全耗盡時就終止培養，測定所形成及累積在液態培養基中的L-穀氨酸數量(表26)。GDH的活性最高可得到約3倍高的產量。當GDH活性更進一步再提高時，則產量的增強程度就會降低。當GDH活性提高到16倍時，產量會稍微減少。使用日立胺基酸分析儀L-8500來分析副產物胺基酸的形成，結果發現GDH活性提高時，天冬氨酸和丙氨酸的累積量增加。這些結果證明下列事實要增加穀氨酸的產量必需適當增加GDH的活性，才不致導致天冬氨酸和丙氨酸的顯著增加。其中一有效方法就是將各種gdh啟動子的突變導入以調控GDH活性至3倍的親代菌株即可。
表25濃度成分 接種培養主要培養葡萄糖 50克/升150克/升KH2PO41克/升 2克/升MgSO4·7H2O0.4/克/升 1.5克/升FeSO4·7H2O10毫克/升 15毫克/升MnSO4·4H2O10毫克/升 15毫克/升黃豆蛋白質水解物20毫升/升 50毫升/升生物素 0.5毫克/升 2毫克/升鹽酸硫胺素 2毫克/升 3毫克/升表26菌株 穀氨酸天冬氨酸 丙氨酸 GDH 相對值(克/100(毫克/ (毫克/比活性毫升) 100毫升)100毫升)AJ 13029 8.3 49 607.71.0GA01 9.0 145 152 22.3 2.9GA02 8.9 153 155 27.0 3.5AJ 13029/pGDH8.8 201 190 82.7 10.7AJ 13029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6
序列表110Ajinomoto Co.Inc.120構建產生胺基酸的細菌的方法，及通過發酵該經構建的產生胺基酸的細菌以製備胺基酸的方法130YIG-0426160＞6210121146212核酸4001ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt210221146212核酸4002ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt210321146212核酸4003ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt210421146212核酸4004ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt210521146212核酸4005ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt210621146212核酸4006ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt210721130212核酸220用於克隆乳酸發酵短桿菌的gltA的引物A4007gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg210821130212核酸220用於克隆乳酸發酵短桿菌的gltA的引物B4008aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt210921120212核酸220用於導入突變到gltA啟動子的引物14009atcgtataa cgtgttaacc2101021120212核酸220用於導入突變到gltA啟動子的引物240010atcggtataa tgtgttaacc2101121140212核酸220用於導入突變到gltA啟動子的引物440011gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc2101221128212核酸220gltA啟動子序列引物44012agggatccgt ccagtctcag acagcatc2101321117212核酸220通用引物M13RV40013caggaaacag ctatgac2101421120212核酸220用於克隆ICDH的引物A40014gaattcgctc ccggtgcagc2101521120212核酸220用於克隆ICDH的引物B40015gatgcagaat tccttgtcgg2101621128212核酸220用於導入突變到ICDH的引物140016tggattgctg gctataatgg tgtcgtga2101721153212核酸220用於導入突變到ICDH啟動子的引物240017caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga2101821153212核酸220用於導入突變到ICDH啟動子的引物340018caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga2101921128212核酸220用於導入突變到ICDH啟動子的引物440019ggctgaaact gctataatag gcgccagc2102021151212核酸220用於導入突變到ICDH啟動子的引物540020ggaaacacgg cgttgccatg cggggctaa actgctataa taggcgccag c2102121151212核酸220用於導入突變到ICDH啟動子的引物640021ggaaaca cgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c2102221122212核酸220ICDH啟動子序列引物40022
gtgcgggtcc agatgatctt ag2102321120212核酸220用於擴增nptⅡ的引物A40023gggatcccgg atgaatgtca2102421123212核酸220用於擴增nptⅡ的引物B40024gcccggggtg ggcgaagaac tcc2102521123212核酸220用於擴增乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物44025aci gti tci atg ggi cti ggi cc2102621123212核酸220用於擴增乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物40026cct tct ccg tti agi gti gti cg2102721130212核酸220用於體外克隆乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物40027ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc21028211302l2核酸220用於體外克隆乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物40028tgg atg aga cca cgt gat tct ggc tcg tcc2102921130212核酸220用於體外克隆乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物40029aca gat cct gca cga agg cat caa cga ggc2103021130212核酸220用於體外克隆乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA的引物40030tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc210312112766212核酸213乳酸發酵短桿菌ATCC 13869220乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的pdhA基因LA40031atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc tcg gat gac tct aac 48Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp ser Asa1 5 10 15ttc gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tca gat 96Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp20 25 30ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc gac gga tta ctc cag 144gro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp G1y Leu Leu Gln35 40 45gag tct tct cca gaa cgt gct cgt tac ctc atg ctt cgt ttg ctt gag 192Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Lau Glu50 55 50cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca atg acg tca acc gac 240Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp65 70 75 80tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct gaa ttc cca ggc gat 288Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp85 90 95gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att cgc tgg aac gca gcc 336Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala100 105 110atc atg gtt cac cgc gct cag cga cca ggc atc ggc gtc ggc gga cac 384Ile Met Val His Arg Ala Gla Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His115 120 125att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac gaa gtt ggc ttc aac 432Ile ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn130 135 140cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc ggc gac cag atc ttc 480His Phe Phe Arg G1y Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe145 150 155 160ttc cag ggc cac gca tca cca ggt atg tac gca cgt gca ttc atg gag 528Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu165 170 175ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc cgt cag gaa gtt tcc 576Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser180 185 190cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac cca cac ggt atg aag 624Arg Glu Gln Gly Gly Ila pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Mat Lys195 200 205gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt ctt ggc cca atg gat 672Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp210 215 220gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc gaa aac cgt ggc atc 720Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile225 230 235 240aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc ctt ggc gac ggc gaa 768Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu245 250 255atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag cag gct gca ctg aac 816Met Asp Glu Pro Glu Set Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn260 265 270aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc aac ctg cag cgt ctc 864Asn Leu Asp ASn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu275 280 285gac gga cct gtc cgc ggt aac acc aag atc atc cag gaa ctc gag tcc 912Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser290 295 300ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tct gtg atc aag gtt gtt tgg ggt cgc 960Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg305 310 315 320gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat ggt gca ctt gtt gag 1008Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu325 330 335atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag acc ttc aag gct aac 1056Ile Met Asa Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn340 345 350gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga cgt gac cca cgc acc 1104Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr355 360 365gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa atc tgg aag ctg cca 1152Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro370 375 380cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca gcc tac aag cga gct 1200Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala385 390 395 400ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc atc ctt gct cac acc att aag 1248Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys405 410 415ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt aac gca acc cac cag 1296Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln420 425 430atg aag aag ctg acg crt gat gat ctg aag ttg ttc cgc gac aag cag 1344Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln435 440 445ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag gat cct tac ctt cct 1392Gly Ile Pro Ila Thr Asp Glu Gln Lau Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro450 455 460cct tac tac cac cca ggt gaa gac gct cct gaa atc aag tac atg aag 1440Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys465 470 475 480gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca gag cgt cgt gag aac 1488Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn485 490 495TAC GAT CCA ATT CAG GTT CCA CCA CTG GAT AAG CTT CGC TCT GTC CGT 1536Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Set Val Arg500 505 510aag ggc tcc ggc aag cag cag atc gct acc act atg gcg act gtt cgt 1584Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg515 520 525acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg gct gat cgc ctt gtc 1632Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val530 535 540cca atc att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt ctt gac tct tgg ttc 1680Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe545 550 555 560cca acc ttg aag atc tac aac ccg cac ggt cag aac tac gtg cct gtt 1728Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln Asa Tyr Val Pro Val565 570 575gac cac gac ctg atg ctc tcc tac cgt gag gca cct gaa gga cag atc 1776Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gln Ile580 585590ctg cac gaa ggc atc aac gag gct ggt tcc gtg gca tcg ttc atc gct 1824Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Sar Val Ala Ser Phe Ile Ala595 600 605gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc atg att ccg ctg tac 1872Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr610 615 620atc ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag cgc acc ggt gac tcc atc tgg 1920Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp625 630 635 640gca gca gcc gat cag atg gca cgt ggc ttc ctc ttg ggc gct acc gca 1968Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala645650 655ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc ctc cag cac atg gat gga cac 2016Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His660 665 670tcc cct gtc ttg gct tcc acc aac gag ggt gtc gag acc tac gac cca 2064Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Ash Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro675 680 685tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac cgt ggc atc gac cgc 2112Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg690 695 700atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt atc tac tac atc acc atc 2160Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile705 710 715 720tac aac gag cca acc cca cag cca gct gag cca gaa gga ctg gac gta 2208Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val725 730 735gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac crc tac tcc cgc ggt gaa ggc acc 2256Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr740 745 750ggc cat gag gca aac arc ttg gct tcc ggt gtt ggt atg cag tgg gct 2304Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala755 760 765ctc aag gct gca tcc atc ctt gag gct gac tac gga gtt cgt gcc aac 2352Leu Lys Ala Ala Ser lle Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn770 775 780att tac tcc gct act tct tgg gtt aac ttg gct cgc gat ggc gct gct 2400Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala785 790 795 800cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca gat gct ggc gag gca 2448Arg Asn Lys Ala Gla Leu Arg Asu Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala805 810 815ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc cca tac gtt gca gtg 2496Phe Val Thr Thr Gln Lau Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val820 825 830tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc cgt gaa tgg gtc cca 2544Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro835 840 845ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc ggt ttc tct gat acc 2592Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly phe Sar Asp Thr850 855 860cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac atc gac gct gag tcc att gtt 2640Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val865 870 875 880gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc aag atc gac gtc tcc 2688Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asn Val Ser885 890 895gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg gat gat cct acg agt 2736Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser900 905 910gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa 2766Val SerValAsp Pro Asn A la Pro Glu Glu210322118556212核酸213乳酸發酵短桿菌ATCC 1386940032tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120tcatgccact atcttggggt tctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180ttgcgctaga cactaattac ggccccgcct aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540tcaaagagac cttgattgat gggctgttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600atcctcgtca gcgatttcgc aacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780tccttggggt gttttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840caacgcaacg atgcagagaa gccttggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900aggttctgac gaggtgcgaa gcaagttgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960taatttcgaa gtgctgggtt ttctcgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg ccgtcttcta tatttgtgcg 1080ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040aactacccga taattctttg caaaactttg caaagggtaa tgaacatgca gctagtttcc 2100gtagaaatgt tctttaaaaa atccacaaca attgccagga agcacaccga ttgatggata 2160cctgaaatcc cagtgagcgc accactcccc ttacgtcaca gtctgtaaaa caaatcttcg 2220gtgttgcgta tccttgttaa taacttatgc gttgacccat tcgtgcactt cggtgtgcca 2280caattaggta cgaccaagaa tgggaccggg aaaccgggac gtataaacga aataaaacat 2340tccaacagga ggtgtggaa atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc 2392Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro5 10tcg gat gac tct aac ttc gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat 2440Ser Asp Asp Ser ASn Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr15 20 25ttg aac gac tca gat ccg gag gag acc aac gag tgg atg gat tca ctc 2488Leu Asn Asp Ser Asp Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Sar Leu30 35 40gac gga tta ctc cag gag tct tct cea gaa cgt gct cgt tac ctc atg 2536Asp Gly Leu Leu Gln Glu Ser Sar Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met45 50 55ctt cgt ttg ctt gag cgt gca tct gca aag cgc gta tct ctt ccc cca 2584Leu Mrg Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro60 65 70 75atg acg rca acc gac tac gtc aac acc att cca acc tct atg gaa cct 2632Met Thr Ser Thr Asp Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro80 85 90gaa ttc cca ggc gat gag gaa atg gag aag cgt tac cgt cgt tgg att 2680Gll Phe Pro Gly Asp Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile95 100 105cgc tgg aac gca gcc atc atg gtt cac cgc gct cag cga cca ggc atc 2728Arg Trp Asn Ala Ala Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile110 115 120ggc gtc ggc gga cac att tcc act tac gca ggc gca gcc cct ctg tac 2776Gly Val Gly Gly His Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr125 130 135gaa gtt ggc ttc aac cac ttc ttc cgc ggc aag gat cac cca ggc ggc2824Glu Val Gly Phe Asn His Phe Phe Arg G1y Lys Asp His Pro Gly Gly140 145 150 155ggc gac cag atc ttc ttc cag ggc cac gca tca cca ggt atg tac gca 2872Gly Asp Gln Ile phe Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala160 165 170cgt gca ttc atg gag ggt cgc ctt tct gaa gac gat ctc gat ggc ttc 2920Arg Ala Phe Met Glu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe175 180 185cgt cag gaa gtt tcc cgt gag cag ggt ggc att ccg tcc tac cct cac 2968Arg Gln Glu Val Ser Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His190 195 200cca cac ggt atg aag gac ttc tgg gag ttc cca act gtg tcc atg ggt 3016Pro His Gly Met Lys Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Mt Gly205 210 215ctt ggc cca atg gat gcc att tac cag gca cgt ttc aac cgc tac ctc 3064Leu Gly Pro Met Asp Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu220 225 230 235gaa aac cgt ggc atc aag gac acc tct gac cag cac gtc tgg gcc ttc 3112Glu ASh Arg Gly Ile Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe240 245 250ctt ggc gac ggc gaa atg gac gag cca gaa tca cgt ggt ctc atc cag 3160Leu Gly Asp Gly Glu Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln255 260 265cag gct gca ctg aac aac ctg gac aac ctg acc ttc gtg gtt aac tgc 3208Gln Ala Ala Leu ASn Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys270 275 280aac ctg cag cgt crc gac gga ccc gtc cgc ggt aac acc aag atc atc 3256Asn Leu Gln Arg Leu Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile285 290 295cag gaa ctc gag tcc ttc ttc cgt ggc gca ggc tgg tct gtg atc aag 3304Gln Glu Leu Glu Ser Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys300 305 310 315gtt gtt tgg ggt cgc gag tgg gat gaa ctt ctg gag aag gac cag gat 3352Val Val Trp Gly Arg Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp320 325 330ggt gca ctt gtt gag atc atg aac aac acc tcc gat ggt gac tac cag 3400Gly Ala Leu Val Glu Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln335 340 345acc ttc aag gct aac gac ggc gca tat gtt cgt gag cac ttc ttc gga 3448Thr Phe Lys Ala Asn Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly350 355 360cgt gac cca cgc acc gca aag ctc gtt gag aac atg acc gac gaa gaa 3496Arg Asp Pro Arg Thr Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu365 370 375atc tgg aag ctg cca cgt ggc ggc cac gat tac cgc aag gtt tac gca 3544Ile Trp Lys Lau Pro Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala380 385 390 395gcc tac aag cga gct ctt gag acc aag gat cgc cca acc gtc atc ctt 3592Ala Tyr Lys Arg Ala Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu400 405 410gct cac acc att aag ggc tac gga ctc ggc cac aac ttc gaa ggc cgt 3640Ala His Thr Ile Lys Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg415 420 425aac gca acc cac cag atg aag aag ctg acg ctt gat gat ctg aag ttg 3688Asn Ala Thr His GLu Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu430 435 440ttc cgc gac aag cag ggc atc cca atc acc gat gag cag ctg gag aag 3736Phe Arg Asp Lys Gln Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys445 450 455gat cct tac ctt cct cct tac tac cac cca ggt gaa gac gct cct gaa 3784Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu460465 470 475atc aag tac atg aag gaa cgt cgc gca gcg ctc ggt ggc tac ctg cca 3832Ile Lys Tyr Met Lys Glu Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro480 485 490gag cgt cgt gag aac tac gat cca att cag gtt cca cca ctg gat aag 3880Glu Arg Arg Glu Asn Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys495 500 505ctt cgc tct gtc cgt aag ggc tcc ggc aag cag cag atc gct acc act 3928Leu Arg Ser Val Arg Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Tha Thr Thr510 515 520atg gcg act gtt cgt acc ttc aag gaa ctg atg cgc gat aag ggc ttg 3976Met Ala Thr Val Arg Thr Phs Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu525 530 535gct gat cgc ctt gtc cca atc att cct gat gag gca cgt acc ttc ggt 4024Ala Asp Arg Leu Val Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly540 545 550 555ctt gac tct tgg ttc cca acc ttg aag atc tac aac ccg cac ggt cag 4072Leu Asp Ser Trp Phe Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln560 565 570aac tac gtg cct gtt gac cac gac ctg atg ctc tcc tac cgt gag gca 4120Asn Tyr Val Pro Val Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala575 580 585cct gaa gga cag atc ctg cac gaa ggc atc aac gag gct ggt tcc gtg 4168Pro Glu Gly Gln Ile Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Val590 595 600gca tcg tcc atc gct gcg ggt acc tcc tac gcc acc cac ggc aag gcc 4216Ala Ser Phe Ile Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala605 610 615atg att ccg ctg tac atc ttc tac tcg atg ttc gga ttc cag cgc acc 4264Met Ile Pro Leu Tyr Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr620 625 630 635ggt gac tcc atc tgg gca gca gcc gat cag arg gca cgt ggc ttc ctc 4312Gly Asp Ser Ile Trp Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu640 645 650ttg ggc gct acc gca ggt cgc acc acc ctg acc ggt gaa ggc crc cag 4360Leu Gly Ala Thr Ala Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln655 660 665cac atg gat gga cac tcc cct gtc ttg gct tcc acc aac gag ggt gtc 4408His Met Asp Gly His Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val670 675 680gag acc tac gac cca tcc ttt gcg tac gag atc gca cac ctg gtt cac 4456Glu Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His685 690 695cgt ggc atc gac cgc atg tac ggc cca ggc aag ggt gaa gat gtt atc 4504Arg Gly Ile Asp Arg Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile700 705 710715tac tac atc acc atc tac aac gag cca acc cca cag cca gct gag cca 4552Tyr Tyr Ile Thr Ile Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro720 725 730gaa gga ctg gac gta gaa ggc ctg cac aag ggc atc tac ctc tac tcc 4600Glu Gly Leu Asp Val Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser735 740 745cgc ggt gaa ggc acc ggc cat gag gca aac atc ttg gct tcc ggt gtt 4648Arg Gly Glu Gly Thr Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Sar Gly Val750 755 760ggt atg cag tgg gct crc aag gct gca tcc atc ctt gag gct gac tac 4696Gly Met Gln Trp Ala Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr765 770 775gga gtt cgt gcc aac att tac tcc gct act tct tgg gtt aac ttg gct 4744Gly Val Arg Ala Asn Ile Tlr Set Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala780 785 790 795cgc gat ggc gct gct cgt aac aag gca cag ctg cgc aac cca ggt gca 4792Arg Asp Gly Ala Ala Arg Asn Lys Ala Gln Lau Arg Asn Pro Gly Ala800 805 810gat gct ggc gag gca ttc gta acc acc cag ctg aag cag acc tcc ggc 4840Asp Ala Gly Glu Ala Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly815 820 825cca tac gtt gca gtg tct gac ttc tcc act gat ctg cca aac cag atc 4888Pro Tyr Val Ala Val Ser Asp Phe Sar Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile830 835 840cgt gaa tgg gtc cca ggc gac tac acc gtt ctc ggt gca gat ggc ttc 4936Arg Glu Trp Val Pro Gly Aap Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe845 850 855gct ttc tct gat acc cgc cca gct gct cgt cgc ttc ttc aac atc gac 4984Gly Phe Ser Asp Thr Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp860 865 870 875gct gag tcc att gtt gtt gca gtg ctg aac tcc ctg gca cgc gaa ggc 5032Ala Glu Ser Ile Val Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly880 885 890aag atc gac gtc tcc gtt gct gct cag gct gct gag aag ttc aag ttg 5080Lys Ile Asp Val Ser Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu895 900 905gat gat cct acg agt gtt tcc gta gat cca aac gct cct gag gaa taaat 5130Asp Asp Pro Thr Ser Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu910 915 920cacctcaagg gacagataaa tcccgccgcc agacgttagt ctggcggcgg gattcgtcgt 5190aaagcaagct ctttttagcc gagaaacgcc ttgtcagaca atgttgcgcc cttgatattg 5250gcgaactcct gcagcaaatc gcgcacagtc aacttcgact tggtagcctg atctgcctgg 5310tagacaatct ggccttcatg catcatgatc aggcgattgc ccaggcgaat tgcctgttcc 5370atgttgtgcg tgaccataag cgtagtcaga gttccatctg ccacgatctt ttcggtcaag 5430gtggtcacaa gctctgcacg ctgtggatca agcgctgcgg tgtgctcatc caacagcatg 5490attttaggtt gagtaaaacc agccatcagc agggacaatg cctgacgctg accgccagag 5550agcaaaccaa ctttggcagt gagcctgttt tccagaccca gctcaaggcg ctcaagttcc 5610tgcttgaatt gctcacggcg cttcgaggtc agtgcaaagc ccaatccacg gcgcttgccg 5670cgcagcaacg cgatggccag attctcttca atggtgagat tcggcgcggt gcctgccaaa 5730ggatcctgaa aaacgcggcc gatgtagcgg gcacgcttgt gctctgacat cttgtttacc 5790ttgttgccgt cgatggaaat ctcgccggaa tcaacaagca aacggccaga aacagcgttg 5650agcagggtgg atttacccgc accgttagaa ccgatgacgg tgacaaaatc gccctcagcc 5910atatcgagtt tgagctgctg caacgcgcgg cgctcattca cagtgccggg gaagaaggtt 5970ttggaaattc cgttgatgga taacatgtct taagcctcca ctgctactgg ttgcttaggc 6030ttcggtgcct tggagaactt cgcacgccac ctcggcagca gcatggcgac aaccaccaag 6090atcgcagaaa ttgcctccat accgttgggg tcaaggccaa cgcgcagtgc tgcgadaatg 6150atcaggcggt acgcgatggc accgacgatg acagccaaca cagccaacca cacgcgacgc 6210tgaccgaaga tggcctggcc ccaaaataac cgacgcgaga ccgatcacga tgaggccaat 6270acccatcgaa atatctgcga agccctggta ctgagcgatg agtgcaccgg caagaccaac6330agaaccattg gacagggaga tggtgaggat tttggtgaaa tccgttgaaa caccaaagga6390ctgcaccatc ggcccgttgt cgccggtgga tcgcagcgac agtccgatat cagtgttgag6450gaaccagatg acgatgagtc ccaaaaatcc cactgcaacg gcgaggatcg ccgggcctgc6510ccatgtgccg aggaggccgg cgtcgcgaag cggggtgaag aggttatcgg tgcgcaacaa6570tggcacgttc gcgccaccca tgatgcgcaa gttaaccgac cacaacgcaa tcatggtcaa6630aatacctgcg agcaaaccat cgatcttgcc cttggtgtgc agcaaaccgg tgatcatgcc6690agcgataaag ccagcaacga aaccagcggc agtagccata agaggaggcc agccagacat6750aagagctgtc gcagctgttg ccgcgccagt ggtcaggctg ccgtcaacgg tgaggtcggg6810aaagttgagc acacggaacg tcaaatagac gcccaatgcg acaactccgt acaacaatcc6870gaactcaaaa gcgccgatca tacgcgttcg gccttatcca aaatctcttg agggatctcc6930acgccctggc gctctgctgc atcttcgttg atcacgtagg tgaactcagt tgcagtctcc6990acaggcatgg ttcctgggtc ttccccgtcc tgcagaatac gcaacgccat ctcgccagtc7050tggcggccaa gctcggtgta atcgataccc agggttgcca gtgcgccacc ctcaacagtg7110ccggactcag caccgatcac agggatctgc ttctgctcag caacctgaac cagagaagaa7170ataccggaaa caaccatgtt gtcagttgga acgtagatga catcaacatc gccgagagct7230tcaacagcct gctgaatctc gttcacggta gtgacagtct gagtattaac ggacagcccc7290agtggctcag cagccttggt gacctcatcg acctgcacct gagagttgac ctcaccagac7350gcgtagacga tgccgatgca ctttgcgtca ggaaccagct gctgcaaaag ctccaactgc7410tgctcaatcg gtgcgatatc agaagtaccg gtgacgtttc cgccaggtgc ttcattagaa7470tccaccagct ctgccgacac tgcatcggta actgcggtga acaggactgg gatatcagtg7530atattctgcg cagttgcctg tgctgctgga gttgcaacag ccaacacgag atccaaattg7590tcagaagcga actgctgaga aatagtcagt gcagtgccct gctcgccgtt agcgttttgc7650tcatcaaagg tgacgtcaac gcctgcctct tcaaaagctt ccttgaaacc agtggtcgct7710gcatcaagtg cagggtgctg aacaagctgg ttgatgccaa ctcggtaaga gtcgccacct7770gcagcatcag tggaggtgga gctgtcactg gaatcgcttg agcacgaagc caacgccaag7830gcgccaacag taaagatgct tgcgagcacc ttcgaacggg aagaaaacat agcacacctc7890cttaaagtgt tattttcaaa aaggggcaga cagcgtcaac acatgtctcg cgataaagaac 7950catatgtgaa atgtctcatg atttaaacta cttgttctac cagtcatatg cgcaattccc 8010cctggatatc ccgcaggaca tggacaaaat gggtggatag cgggtgcacc aattcaatct 8070tttaaaggcc ctagacaccg cgatttcctt aatcgatcat taaagaggga tcctctcccc 8130taacaaacct ccaaagacta gagtggggaa caccatgaac gtttcctcaa ataaacccag 8190tgactctgac cgcgaatatc ttcaatcaga actcacccgg ctcgttggcc aggggcgact 8250cgatctagat acttaccaag acgtggttga taccgtttgg tctactgatg atctaggcga 8310gttgatgagg atccgtgccc gcttcctggg agggccgcag gtttcgcagc agcggcccca 8370gcagccgcag caaccacatc agcggccgca acagcaaccg ccacagcatt atggacaacc 8430cggctacggc caatcacctc aatatccacc gcagcagcct ccgcataatc agcccggcta 8490ttaccccgat cccggccctg gccagcagca accaccgatg caccagccac caacgcgtcc 8550aaatca2103321120212核酸220用於構建乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA擴增質粒的引物40033aat gcc agg agt caa cac cc2103421120212核酸220用於構建乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA擴增質粒的引物40034aca tgg aac agg caa ttc gc2103521128212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物400 35cgt ccc ggg ctg taa aac aaa tct tcg g2103621127212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40036atc cccggg ctt acc acc aag ttt tgc2103721130212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40037ctt atg cgt tgc cac att cgt gca ctt cgg2103821140212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40038gcg ttg acc cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g2103921140212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40039gcg ttg cca cat tcg tgc act tcg gtg tgc tat aat tag g2104021138212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40040ttt taa aac gtt ctg gag aag act cct gga gta atc cg2104121120212核酸220用於導入突變到乳酸發酵短桿菌pdhA基因LA啟動子的引物40041cga tct tgc ctt cgc gtg cc2104221130212核酸40042agaccgccgg agtatgcaag aacgatgcgg2104321130212核酸40043gacttcacca tcaatcatct tcttcaggta2104421130212核酸40044
accttcgacc agaccctggc taagggcttt2104521130212核酸40045gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac2104621125212核酸40046gcgatgacac cgttttgtt ctcgc2104721125212核酸40047ggcgacatcc ttgcccagat gatca2104821125212核酸40048gacttcacca tcaatcatct tcttc2104921124212核酸40049gccaggtaca actgtctgaa ttgc2105021140212核酸40050gttaatcgct tgccaatgca ggcaggtaag gtataacccg2105121140212核酸40051gttaatcgct tgctaatgca ggcaggtaag gtataacccg2105221140212核酸40052gttaatcgct tgtcaatgca ggcaggtaag gtataacccg2105321140212核酸40053gttaatcgct tgttaatgca ggcaggtaag gtataatccg2105421140212核酸40054gttaatcgct tgtcaatgca ggc aggtaag gtataatccg2105521130212核酸40055gggttccagc ctcgtgcgga attcgtggag2105621125212核酸40056gcgttaccca gagctggatc ctcgg2105721116212核酸40057cagttgtggc tgatcg2105821117212核酸40058ctttcccaga ctctggc2105921121212核酸40059gctataattt gacgtgagca t2106021125212核酸40060gctcacgtca aattatagca gtgtc2106121154212核酸40061ttgttgtcat tcttgcgac actgctataa tttgaacgtg agcagttaac agcc2106221163212核酸40062gttaactgct cacgttcaaa ttatagcaft gtcgcacaga atgacaacaaagaattaaaa ttg2106321125212核酸40063gctagcctcg ggagctctct aggag2106421125212核酸40064gatctttccc agactctggc cacgc
權利要求
1．胺基酸或核酸生產力增強的棒狀菌的製備方法，其特徵在於，該方法包括在一棒狀菌染色體上的胺基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中發生突變而使其接近共有序列，或以基因重組作用在一棒狀菌染色體上的胺基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中導入一個變化而使其接近共有序列，進而取得此產生胺基酸或核苷酸的棒狀菌的突變株，培養這些突變株並篩選能大量產生胺基酸或核苷酸的突變株。
2．權利要求1的方法，其中的胺基酸選自穀氨酸，賴氨酸，精氨酸，絲氨酸，苯丙氨酸，核酸是選肌苷，鳥苷，腺苷和核苷酸。
3．權利要求1的方法，其中的胺基酸是穀氨酸，其啟動子選自穀氨酸脫氫酶(GDH)，檸檬酸合成酶(CS)，異檸檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脫氫酶(PDH)和烏頭酸酶(ACO)產生基因的啟動子。
4．權利要求3的方法，其中穀氨酸脫氫酶(GDH)基因的啟動子是選自位於-35區域的CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一種DNA序列和/或-10區域TATAAT序列或ATAAT已被其它鹼基取代且不會抑制啟動子的序列。
5．權利要求4的方法，其中GDH的啟動子具有位於-35區域的TGGTCA，和位於-10區域的TATAAT；或位於-35區域的TTGTCA，和位於-10區域的TATAAT。
6．權利要求3的方法，其中CS的啟動子具有位於-35區域的TTGTCA序列和/或位於-10區域的TATAAT序列，且此序列不會抑制啟動子功能。
7．權利要求3的方法，其中ICDH啟動子具有-35區域的第一或第二啟動子(位點)的TTGCCA序列及TTGACA序列中的任意一個和/或-10區域第一或第二啟動子(位點)的TATAAT，且此序列不會抑制啟動子功能。
8．權利要求3的方法，其中PDH的啟動子具有位於-35區域的TTGCCA序列和/或位於-10區域的TATAAT，且此序列不會抑制啟動子功能。
9．權利要求1的方法，其中的胺基酸是精氨酸，其啟動子是精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子。
10．權利要求9的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子具有選自位於-35區域的TTGCCA,TTGCTA和TTGTCA中至少一種的DNA序列和/或-10區域TATAAT序列或ATAAC已被其它鹼基取代的序列，且此序列不抑制啟動子功能。
11．權利要求10的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的啟動子具有位於-35區域的TTGTCA序列和/或位於-10區域的TATAAT序列。
12．一種穀氨酸合成基因，它具有權利要求第4項到第8項中所敘述的啟動子。
13．一種精氨酸合成基因，它具有權利要求第10項中所敘述的啟動子。
14．一種產生穀氨酸的棒狀菌，它具有權利要求第12項中所陳述的穀氨酸合成基因。
15．一種產生精氨酸的棒狀菌，它具有權利要求第13項中所陳述的精氨酸合成基因。
16．經由發酵作用產生胺基酸或核酸的方法，其特徵在於，該方法包括培養一具有增強的胺基酸或核苷酸生產力的棒狀菌，而該棒狀菌是通過權利要求第1項到第11項中所陳述的方法所構建的，或在培養基中培養權利要求第14項或第15項的棒狀菌，於培養基中形成並累積指定的胺基酸或核苷酸，並從培養基中收集之。
17．一種經由發酵作用產生L-穀氨酸的方法，其特徵在於，該方法包括在液體培養基中培養對4-氟穀氨酸具抗性的產生L-穀氨酸的棒狀菌，在培養液中形成並累積L-穀氨酸，並從培養基中收集之。
全文摘要
一種製備具有增強的胺基酸或核酸生產能力的棒狀桿菌的方法,包括在一棒狀菌染色體上的胺基酸或核酸生物合成基因的啟動子序列中發生突變而使其接近共有序列,或以基因重組作用在一棒狀菌染色體上的胺基酸和核酸生物合成基因的啟動於序列中導入一個變化而使其接近共有序列,進而取得此產生胺基酸或核苷酸的棒狀桿菌的突變株,培養這些突變株並篩選能大量產生胺基酸或核酸的突變株。這些方法可構建一突變株,不需要利用質粒就能適當加強或控制目的基因的表達;且能經由重組作用或突變作用產生高產量的胺基酸。
文檔編號C12N1/21GK1289368SQ99802380
公開日2001年3月28日 申請日期1999年9月22日 優先權日1998年9月25日
發明者朝倉陽子, 中村純, 菅野壯平, 菅美喜子, 木村英一郎, 伊藤久生, 松井和彥, 中松亙, 倉橋修, 大住剛 申請人:味之素株式會社