垂體腺苷酸環化酶激活肽(pacap)受體(vpac2)激動劑及其藥物使用方法

2023-10-05 00:34:04

專利名稱：垂體腺苷酸環化酶激活肽(pacap)受體(vpac2)激動劑及其藥物使用方法
垂體腺普酸環化酶激活肽(PACAP) 受體(VPAC2)激動劑及其藥物使用方法本申請要求享受於2002年7月12曰申請的美國臨時申請 No.60/395，738的優先權，其內容被全部引入作為參考。發明領域本發明涉及新鑑定的多肽以及此多肽用於治療目的的用途。更具 體地，本發明的多肽可以以依賴於葡萄糖的方式刺激胰腺P -細胞釋放 胰烏素，從而為受代謝失調諸如糖尿病或削弱的葡萄糖耐量-一種前糖 尿病狀態的病症困擾的個體提供一種治療的選擇方案。發明背景糖尿病的特徵是具有削弱的葡萄糖代謝作用，其在高糖尿病患者 中顯示為血糖水平升高.依據下述的缺陷將糖尿病分為兩個主要的 組I型糖尿病，或胰烏素依賴型糖尿病(1DDM)，當患者的胰腺缺 少生產胰烏素的P-細胞時產生，以及H型糖尿病，或非胰島素依賴型 糖尿病(NIDDM)，其患者具有削弱的P-細胞功能和改變的胰島素作 用。目前l型糖尿病患者用胰烏素來進行治療，而大多數的II型糖尿 病患者用刺激P-細胞功能的藥物或增強病人對胰島素的組織敏感性的 藥物進行治療。幾乎一半的II型糖尿病患者受試者隨著時間喪失了對 這些藥物的應答，然後必須寄予胰烏素療法。目前用於治療II型糖尿 病的藥物描述在下文中.a-葡糖苷酶抑制劑(例如Precose⑧、VogliboseTM和Miglitol )其 通過延遲內臟對葡萄糖的吸收而降低餐後葡萄糖的移動，這些藥物是 安全的並且為輕度糖尿病患者提供了治療，然而，文獻中已經報導了 對胃腸道的副作用。胰島素敏化刑是增強身體對胰烏素應答的藥物.噻唑烷二稱類化 合物諸如AvandiaTM ( rosiglitazone)和ActosTM激活過氧化物酶體增 殖劑-激活的受體(PPAR) Y亞型並調節尚沒有被較好描述的一組基因的活性。RezulinTM (troglitazone)是此類型中的第一個藥物，其因 為增加了肝臟的酶水平和藥物誘導的肝臟毒性而被人們所摒棄了。對 肝的這些影響在使用AvandiaTM和ActosTM的患者中沒有成為顯著的 問題，即使如此，建議在治療的第一年每兩個月進行一次肝臟酶測定 且此後定期地進行.AvandiaTM和ActosTM好像與水腫和浮肺相關聯。 AvandiaTM不與胰烏素一起使用，因為這樣會導致充血性心力衰竭。另 一種可能的副作用是體重增加.胰烏素促泌劑(例如，磺醯脲類(SFlIs)及其它通過ATP-依賴型 K+通道起作用的藥物)是目前另一種類型用於治療II型糖尿病的藥 物.SFUs是用於具有輕中度禁食糖血症的II型糖尿病患者的標準療 法.SFUs具有包括可能誘導低血糖、體重增加和高的初級和次級失敗 在內的局限性。10 ~ 20°/。的最初被治療的患者未能顯示顯著的治療效 果(初級失敗)。次級失敗表現為另外的20-30%的患者在使用6個月 後對SFU喪失了治療效果，在治療5-7年後具有50。/。SFU應答者的胰 烏素療法是人們所需要的(Scheen等，Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533國543，1989 )。GlucophageTM ( metformin HC1)是一種通過減少肝葡萄糖排出量 並增加外圍葡萄糖吸收和利用來降低血糖的雙縮胍，該藥物對於降低輕度和中度受影響的受試者的血糖是有效的並且不具有體重增加或可 能誘導低血糖的副作用。然而，GlucophageTM具有大量的副作用包括 胃腸道紊亂和乳酸酸中毒。GlucophageTM被禁忌用於年齡超過70歲的 糖尿病患者並且損傷受試者的腎的或肝的功能.最後，GhicophageTM 具有與SFUs相同的初級和次級失敗率'胰島素冶療在餐後和鍛鍊後進行，並且內服不能充分地控制血 糖。這些治療具有如下的缺點，即其是可注射的，其可能產生低血糖， 並且其導致體重增加.由於目前治療方法具有的問題，需要新的治療II型糖尿病的治療 方法。尤其是，維持正常(依賴於葡萄糖的)胰島素分泌的治療方法 是需要的，這些新藥應該具有以下特性依賴於葡萄糖來促進胰島素 的分泌(即，僅僅在增加血糖的情況下產生胰島素分泌)；低的初級 和次級失敗率；以及保持小島細胞功能.此處公開的開發新治療方法 的策略基於環腺苷一磷酸(eAMP )信號機制以及其對胰島素分泌的影響。環化AMP是胰烏素分泌過程的主要調節因子.此信號分子的增加 促進了激活蛋白激酶A途徑後k+通道的閉合，K+通道的閉合導致細胞 去極化以及隨後的Ca—通道的打開，其反過來導致胰島素顆粒的胞吐 作用。其在缺少低葡萄糖濃度的情況下對胰島素分泌的發生基本上沒 有任何影響(Weinhaus等,Diabetes 47:1426-1435,1998),促泌劑類 垂體腺苷酸環化酶激活肽("PACAP")以及GLP-1 (胰高血糖素樣 肽1)以依賴於葡萄糖的方式利用cAMP系統來調節胰烏素的分泌(Komatsu等，Diabetes 46:1928國1938，1997; Filipsson等，Diabetes 50:1959-1969,2001; Drucker， Endocrinology 142:521-527,2001 )。通 過增加cAMP進行作用的胰鳥素促泌劑諸如GLP-1和PACAP除了增 強胰島素釋放外也能夠增強胰島素的合成(Skoglund等，Diabetes 49:1156-1164,2000; Borboni等，Endocrinology 140:5530-5537,1999 )。 PACAP是一種由胰腺P-細胞進行葡萄糖-依賴性胰島素分泌的有 效刺激物，三種不同的PACAP受體類型(PAC1， VPAC1和VPAC2) 已被描述(Harmar等，Pharmacol. Reviews 50:265-270,1998; Vaudry 等，Pharmacol. Reviews 52:269-324,2000) ft PACAP沒有受體選擇性， 三種受體具有類似的活性和效力。PAC1主要在CNS中，而VPAC1 和VPAC2則更廣泛地分布.VPAC1位於CNS以及肝臟、肺臟和腸中。 VPAC2位於CNS、胰腺、骨骼肌、心臟、腎臟、脂肪組織、睪丸以及 胃中.最近的研究表明VPAC2負責由P-細胞分泌胰烏素(Inagaki等， Proc， Natl. Acad. Sci. USA 91:2679-2683,1994; Tsutsumi等，Diabetes 51:1453-1460,2002) 。 PACAP的促胰烏素作用是受CTP結合蛋白Gs 調節的.胞內cAMP的累積隨後激活了增加
的P-細胞中的非選 擇性陽離子通道，以及促進了含有胰烏素的分泌顆粒的胞吐作用.PACAP是那些通過cAMP-介導的信號轉導途徑發揮作用的新陳 代謝、神經內分泌以及神經介質肽類激素的超家族的新成員(Arimura， Regul. Peptides 37:287-303,1992 )。生物學活性肽由生物 合成前體釋放為兩種分子形式，具有醯胺化的羧基末端的38-胺基酸肽(PACAP-38 )和/或27-胺基酸肽(PACAP-27) ( Arimura,如上文所 述).兩種形式肽的最高濃度被發現存在於腦和睪丸中(Arimura，如上文所述)。肽的較短形式PACAP-27顯示出與腸血管活性肽(VIP)具 有68%的結構同源性'然而，PACAP和VIP在中樞神經系統中的分布 表明這些結構相關的肽具有不同的神經遞質功能(Koves等， Neuroendocrinology 54:159-169,1991 ).最近的研究證明了 PACAP-38的各種生物學功能，從在繁殖中的 作用(McArdle， Endocrinology 135:815-817,1994 )到刺激胰烏素分泌 的能力(Yada等，J. Biol. Chem. 269:1290-1293,1994)。此外，PACAP 似乎在脂類和碳水化合物代謝的激素調節(Gray等，Mol. Endrocrinol. 15:1739-47,2001 );生理節奏功能(Harmar等，Cell 109:497-508,2002 ); 和免疫系統、生長、能量穩態以及男性生殖功能(Asnicar等， Endrocrinol. 143:3994-4006,2002 );食慾的調節(Tachibana等，Neurosci. Lett. 339:203-206,2003 );以及急性的和慢性炎症性疾病、膿毒性休克 和自身免疫疾病(例如，系統性紅斑狼掩)(Pozo， Trends Mol. Med. 9:211-217,2003)中起作用'血管活性腸肽(VIP)是具有28個胺基酸的肽，其首先分離自豬 的上部小腸(Said和Mutt, Science 169:1217-1218,1970;美國專利No, 3,879,371 )。此肽屬於包括毒晰皮肽、分泌素、抑生長素和胰高血糖 素的結構相關的小的多肽家族。通過與胞內cAMP信號系統偶聯的膜 結合受體蛋白的激活調節VIP的生物學功能。這些受體最初被稱為 VIP-R1和VIP-R2，然而，隨後發現它們是與VPAC1和VPAC2相同 的受體.VIP顯示出與VPAC1和VPAC2類似的活性和效力。為了改善人肺液中VIP的穩定性，Bolin等(Biopolymers 37:57-66，1995)製備了一系列VIP變體來增強這些肽的螺旋傾向和降低蛋白 水解的降解，取代集中在位置8、 12、 17和25-28處，這些已被證明對 於受體結合是不重要的，此外，"GGT"序列被標記到VIP突變蛋白 的C-末端上，期望其更有效地覆蓋螺旋。最後，為了進一步穩定螺旋， 合成了一些環狀的變體(專利US5，677，419)。儘管這些努力沒有指向 受體的選擇性，但是它們產生了兩個具有大於100倍的VPAC2選擇性 的類似物(Gourlet等，Peptides 18:403-408,1997; Xia等，J. Pharmacol. Exp.Ther.， 281:629-633,1997).GLP-1是由腸L-細胞在進餐後釋放的並且具有與腸胰烏素激素相 同的功能(即其增強從胰腺P-細胞釋放葡萄糖-誘導的胰島素)。它是一種37-胺基酸肽，其通過依賴於組織類型的胰高血糖素基因而差異表 達。關於GLP-1的支持增加P-細胞中cAMP水平的有益作用的臨床資 料已被收集，向缺乏調控的II型糖尿病患者注入GLP-l來使他們的空 腹血糖水平正常化(Gutniak等，New Eng. J. Med. 326:1316-1322,1992 )並且通過持續的注入來改善0 -細胞功能而達到正常受試者 的水平(Harmar等，Diabetes 45:1524-1530,1996).最近的報告表明 GLP-1提高了具有削弱的葡萄糖耐量的受試者中p-細胞對葡萄糖應答 的能力(Byrne等.,Diabetes 47:1259-1265,1998)'然而所有的這些作 用由於肽的短的半衰期而是短暫的.糊精藥物被用Exendin 4TM ( AC2993 )進行III期試驗，其中的 Exendin 4TM ( AC2993 )是一種最初在毒晰中鑑定的39個胺基酸的肽. 臨床研究報導證明糊精提高了用Exendin 4"^治療的II型糖尿病患者 中的改善的糖血控制.然而，噁心和嘔吐的發生是顯著的。申請人在WO 01/23420中公開了在體內具有VPAC2受體激動劑作 用的新的多肽，WO 01/23420的說明書在此處被整體引入，並且尤其 是，申請人公開了一種確定為R3P66的VPAC2激動劑。然而其中描 述的多肽，包括R3P66,並非合適的商用候選物，因為其引發的與制 劑中的多肽有關的穩定性問題以及與多肽的短半衰期有關的問題。人們需要一種具有PACAP、GLP-1或Exendin 4TM的依賴於葡萄 糖的胰烏素促分泌活性，但具有較少的副作用，並且優選地在製劑中 是穩定的並具有長的血漿半衰期的改進的肽。此外，嚴格控制血漿的 葡萄糖水平可防止長期糖尿病患者的併發症。因此，新的糖尿病藥物 應該為患者提供改進的生活質量。發明概迷本發明提供了新的多肽，其在體內具有VPAC2受體(下文稱 VPAC2 )激動劑的作用並且在可通過具有VPAC2激動劑活性的藥物來 改善疾病和病症的治療中是有效的，優選地，本發明的多肽是選擇性 的VPAC2激動劑，具有比VPAC1和PAC1更大的VPAC2效力。例 如，然而並非作為對其的限制，這些多肽刺激胰島素合成和胰腺P-細 胞以葡萄糖依賴性的方式進行的釋放以及隨後的血漿葡萄糖減少，這 些促分泌的多肽被顯示降低體內血糖超過當葡萄糖攻擊時的栽體對照。更優選地，本發明的多肽在製劑中是穩定的，並且具有長的血漿 半衰期以及當釋放時在體內持續長時間的作用.本發明的多肽對於具有例如代謝失調，諸如那些因降低的內源胰 島素分泌而產生的，尤其是II型糖尿病的患者，或對於具有削弱的葡 萄糖耐量-具有輕度胰島素分泌改變的前糖尿病狀態的患者，提供了一 種新的治療方案.此外，本發明的多肽可用於預防和/或治療I型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成熟期發病型糖尿病(MODY)、成人隱 匿性自身免疫糖尿病(LADA)以及相關聯的糖尿病血脂紊亂及其它糖 尿病併發症，以及高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡菊糖耐量、削弱 的空腹血糖、血脂紊亂、高甘油三酯血症、綜合症X和胰烏素抗性.本發明的多肽也可被用於預防和/或治療肥胖症(例如，食慾和食 物攝入的調節)、動脈粥樣硬化疾病、高脂質血、高膽固醇血症、低 HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、冠心病、冠狀 動脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾病；以及用於預防和/或 治療狼瘡、多囊印巢綜合症、致癌作用和細胞增生、哮喘、男性生殖 問題、潰瘍、睡眠障礙、脂類和碳水化合物代謝的紊亂、生理節奏的 機能障礙、生長障礙、能量穩態平衡的紊亂、免疫疾病包括自身免疫 疾病(例如，系統性紅斑狼瘡)，以及急性和慢性炎症性疾病、膿毒 性休克及其它此處確定的病症，或其它在下面描述的功能。具體地，本發明的一個方面為多肽，其選自SEQIDNOs:l至152， 以及其顯示至少一種生物學功能與列舉的SEQ ID NOs基本上相同的 片段、衍生物和變體(總稱，"本發明的多肽")，包括其功能等價 物。本發明的一個優選的實施方案為一種多肽，其選自SEQIDNOs:l 至38和SEQ ID NOs:115至152，以及其顯示出至少一種生物學功能與 列舉的SEQIDNOs基本上相同的片段、衍生物和變體。本發明的一個 更優選的實施方案為選自SEQ ID NOs:l至5和SEQ ID NOs:115至 119，以及其顯示出至少一種生物學功能與列舉的SEQIDNOs基本上 相同的片段、衍生物和變體的多肽.本發明的一個更為優選的實施方 案為選自SEQIDNOs:l、 2、 115和116以及顯示出至少一種生物學功 能與列舉的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和變體的組的多 肽。本發明的另一個實施方案為一種編碼本發明的多肽、重組表達本發明多肽所必需的栽體和宿主細胞.這些多核苷酸序列包括SEQ ID NOs: 154-264。本發明也提供了那些選擇性地結合本發明多肽的抗體和抗體片 段.這些抗體在本發明多肽的檢測中是有用的，並且可通過本領域公 知的方法來鑑定和製備。 一種多克隆的N-末端IgG抗體和一種單克隆 的C-末端Fab抗體已被製備，其識別本發明的多肽。本發明的另一個目的是提供治療哺乳動物中的糖尿病、與糖尿病-相關的紊亂疾病和/或其它受本發明的多肽影響，優選地受本發明多肽 的VPAC2激動劑功能作用的疾病或病症的方法，包括將治療有效量的 任意的本發明的多肽或在VPAC2諸如SEQ ID NOs:l至152處具有活 性的任意多肽給藥所述哺乳動物。本發明也公開了製備本發明的多肽，包括重組的和合成的多肽的 方法。附圖的簡要說明圖la-Id描述了 SEQIDNOs:l至152的多肽的胺基酸序列。SEQ ID NOs:115-152為通過順丁烯二醯亞胺鍵在C-末端半胱氨酸處加入了 聚乙二醇的肽.PEG可以是22 kD的線性PEG或43 kD的分支PEG,圖2描述了克隆到pGEX-6P-l中產生SEQ IDNO:l胺基酸序列的 DNA序列(SEQ ID NO:153).加下劃線的限制性酶位點BamHI和 Xhol允許框內克隆到pGEX-6P-l表達栽體中。編碼FactorXa識別位 點的12merDNA序列和兩個終止密碼子被用粗體突出標註。中間的非 突出標註的序列編碼SEQIDNO:l (胺基酸序列)，來自VIP的突變密碼子用小寫核苷酸表述.圖3a-3h描述了核酸序列SEQ ID NOs:154至264。這些核酸序列編碼本發明的多肽.圖4是說明分散的大鼠胰烏細胞在暴露於本發明的聚乙二醇化的 肽之後胰烏素分泌的直方困.圖5是顯示通過皮下給藥途徑給藥本發明的聚乙二醇化的肽的大 鼠的增強的葡萄糖處理的直方圖.圖6描述了三種VPAC2類似物(P5、P7和對照R3P66 )在1 mg/mL 含有150mMNaCl和加mM磷酸鹽的水溶液中在pH8.0， 4010溫育過程中的穩定性傾向。通過毛細管電泳分析來測定樣品中肽的純度.用最初的百分比純度校正在2-和4-周時間點時的純度.圖7描述了三種VPAC2類似物(P7、P8和對照R3P66 )在2 mg/mL 二甲基亞碸(DMSO)於40TC溫育過程中的穩定性傾向。通過毛細管 電泳分析測定樣品中肽的純度.通過最初的百分比純度校正在2-和4-周時間點時的純度。圖8說明了全長的聚乙二醇化的肽對在N-末端具有單個胺基酸缺 失的類似的聚乙二醇化的肽的選擇性識別.發明詳述本發明提供了新的多肽，及其與附圖la-ID (總稱為本發明的多 肽)的多肽顯示出具有至少一個基本上相同的生物學功能的片段、衍 生物和變體。本發明的多肽在體內起VPAC2激動劑的作用或在這些疾 病或病症如糖尿病包括I型和II型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成 熟期發病型成人糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 ); 成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA ) ( Zim邁et等，Diabetes Med.lh299，1994);以及相關聯的糖尿病血脂紊亂及其它糖尿病並發 症，以及高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹血 糖、血脂紊亂、高甘油三酯血症、綜合症X和胰島素抗性的預防和/或 治療中起作用。此外，本發明的多肽也可用於預防和/或治療肥胖症(例如食慾和 食物攝入的調節)、動脈粥樣硬化疾病、高脂質血、高膽固醇血症、 低HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、冠心病、冠 狀動脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾病；以及用於預防和/ 或治療狼瘡、多囊卵巢綜合症、致癌作用和超常增生、哞喘、男性生 殖問題包括人精子活力、潰瘍、睡眠障礙及其它此處確定的病症，或 具有其它在下文描述的功能.優選地，本發明的多肽以葡萄糖-依賴性的方式刺激胰腺P -細胞的 胰烏素釋放。更優選地，本發明的多肽在含水的和無水的兩種製劑中 是穩定的並且具有大於一個小時的血漿半衰期.本發明的多肽為VPAC2激動劑。優選地，它們是選擇性的VPAC2 激動劑，相對於VPAC1和/或PAC1對VPAC2具有至少10倍的選擇性'更優選地，它們是相對於VPAC1和/或PAC1對VPAC2具有至少 100倍的選擇性的選擇性VPAC2激動劑。最優選地，它們以葡萄糖-依賴性的方式刺激胰島素釋放到血漿中，而不誘導對例如II型糖尿病 的治療起相反作用的血漿葡萄糖水平的鬱積或增加，另外，本發明多 肽優選地是VPAC2受體的選擇性激動劑，由此當選擇性地抵抗其它產 生不愉快或危險的副作用如胃腸道水分保留和/或有害的心血管作用諸 如增加心率的受體時，導致例如釋放到血漿中的胰島素的增加.本發明的多肽在含水和無水的製劑中也是穩定的.優選地，本發 明的多肽當溶於水(pH值在7-8之間)或無水的有機溶劑時，於37-40 x:在一周的時間內具有小於10%的降解。更優選地，本發明的多肽當 溶於水(pH值在7-8之間)或無水的有機溶劑時，在37-40"C—周的時 間內具有小於5%的降解.此外，本發明的組合物和製劑可包括本年明 的多肽和大約2%到大約30%的DMSO。在本發明的另一個實施方案 中，組合物和製劑可選擇性地包括大約0.2%到大約3% ( w/v)的其它 溶劑諸如丙二醇、二甲基甲跣胺、碳酸亞丙基酯、聚乙二醇和甘油三 酯。最後，優選地，本發明的衍生化多肽在靜脈注射後的大鼠中具有至少一個小時的血漿半衰期；更優選的，血漿半衰期為至少兩個小時，並且進一步優選地，血漿半衰期為至少3個小時。本發明的多肽為具有降低的內源胰島素分泌或削弱的葡萄糖耐量，尤其是n型糖尿病的患者提供了一種新的治療方案.也就是說，本發明的多肽是長效的VPAC2激動劑，可被用於維持、提高和修復葡 萄糖-刺激的胰島素分泌。此外， 一種VPAC2受體的選擇性肽激動劑 能增強胰腺中的葡萄糖-依賴性胰島素分泌，而不引起與另一 PACAP 受體的非選擇性激活有關的副作用。現在定義本說明書中的特定的術語，並且其它的將被定義為如同 所引用的.特定胺基酸的單字母縮寫、其相應的胺基酸以及三字母縮 寫如下A，丙氨酸(ala); C，半胱氨酸(cys); D，天冬氨酸(asp); E，穀氨酸(glu) ; F，苯丙氨酸(phe) ; G，甘氨酸(gly) ; H，組 氨酸(his ) ; I，異亮氨酸(ile ) ; K，賴氨酸(lys ) ; L，亮氨酸(leu ); M，甲硫氨酸(met) ; N,天冬醯胺(asn) ; P，脯氨酸(pro) ; Q 穀氨醯胺(gin) ; R，精氨酸(arg) ; S，絲氨酸(ser) ; T，蘇氨酸(thr ) ; V，纈氨酸(val) ; W，色氨酸(trp ) ; Y，酪氨酸(tyr)。 術語"編碼多肽的多核苷酸"包括其僅僅包含多肽的編碼序列的 多核苷酸，以及其包括其它的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明進一步涉及了與上文所述的序列雜交的多核苷酸，這些序列之間具 有至少大約70%，優選至少具有大約卯°/。，並且更優選地至少具有大 約95%的同一性。本發明尤其涉及了在嚴格條件下與上述多核苷酸雜 交的編碼多肽的多核苷酸.此處所用的"嚴格條件"是指"嚴格的雜 交條件"。優選地，雜交僅在至少具有大約90%,並且優選地具有大 約95%至97。/。同一性的序列之間發生'在一個優選的實施方案中，與 上述所述的多核香酸雜交的多核苷酸編碼基本上保留與cDNAs編碼的 成熟多肽相同的生物學功能或活性的多肽。"功能性等價物，'與"基本上相同的生物學功能或活性"各自是 指生物活性的程度在大約30%到大約100%以內，或該多肽顯示的生物 活性當與通過相同方法測定的各多肽的生物活性比較時更多.例如，

圖1多肽的功能性等價物當通過實施例7的環化AMP (cAMP)閃爍 親近檢測進行測定時，其在表達人VPAC2受體的CHO細胞系中顯示 出cAMP的累積.本發明的多肽也即VPAC2激動劑是一種當在實施例7的方案中測 定時顯示出30%到大約100%或更多的最大PACAP-27 VPAC2激動劑 活性的多肽'本發明優選的多肽，即相對於PACAP、 VPAC1和PAC1 受體的VPAC2的選擇性激動劑為那些多肽，其顯示VPAC2激動劑活 性與VPAC1活性的比率為大約10:1或更大，並且更優選地，大約100:1 或更大，和/或顯示出VPAC2激動劑活性與PAC1受體活性的比率為 大約10:1或更大，並且更優選地，當在實施例7的方案中利用表達合 適的受體的細胞測定該多肽時該比率為大約100:1或更大。"嚴格的雜交條件"是指兩個多核苷酸(或片段)在42TC在溶液 中過夜溫育雜交，該溶液包括50%甲醯胺、5xSSC (750mMNaCl， 75 mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6) 、 5x Denhardt溶液、10% 葡聚糖硫酸酯、和20 fig/mL變性的、剪切的鮭精DNA，然後在大約 65TC在O.lxSSC中洗滌過濾器.術語"片段"，"衍生物"和"變體"，當涉及圖1的多肽時， 是指維持與這些多肽基本上相同生物學功能或活性的多肽的片段、衍生物和變體，如下所述.類似物包括含有本發明多肽的胺基酸序列在內的前-多肽。本發明 的活性多肽可通過天然的、體內作用或通過本領域公知的方法諸如通 過酶切或化學裂解技術裂解自完全的前多肽分子的其它胺基酸.例如，28-胺基酸的天然肽VIP被天然表達為大量較大的多肽，其然後被 體內加工來釋放28-胺基酸的活性的成熟肽。片段是多肽的一部分，其保留基本上類似的功能性活性，如此處 公開的體內模型所述的.衍生物包括所有對多肽的修飾，其基本上保持此處公開的功能並 且包含其它的結構和伴隨的功能(例如，具有較大半衰期的聚乙二醇 化多肽)，賦予了靶特異性或其它的活性諸如對預定目標的毒性的融 合多肽，如下文所述。本發明的多肽可以是重組的多肽、天然純化的多肽或合成的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或變體可以是(i)其中一個或多個氨 基酸殘基被保守的或非-保守的胺基酸殘基取代(優選地為保守的氨基 酸殘基)，並且此取代的胺基酸殘基可以是或可以不是通過遣傳密碼 編碼的胺基酸殘基，或(ii)其中胺基酸殘基的一個或多個包括取代基 的，或(m)其中成熟多肽與另一個化合物，諸如一種增加多肽半衰期 的化合物(例如，聚乙二醇)熔合的，或(iv) —種其中其它的胺基酸 被融合到成熟多肽上的，諸如前導或分泌的序列或被用於成熟多肽的 純化的序列或前多肽序列，或(v) —種其多肽序列與較大的多肽熔合 的(例如，人白蛋白、抗體或Fc，用於增加作用持續時間)。本領域 的技術人員從此處的教導可以理解這些片段、衍生物和變體以及類似 物在本發明的範圍內。優選地，本發明的衍生物將在一或多個推定的，優選非必需氨基 酸殘基處含有保守的胺基酸取代(在下面定義的)。"非必需胺基酸，， 殘基是一種可改變自蛋白質的野生型序列而沒有改變生物活性的殘 基，而"必需"胺基酸殘基是生物活性所需要的."保守的胺基酸取 代"是指其中胺基酸殘基被用具有類似側鏈的胺基酸殘基替換.具有 類似側鏈的胺基酸殘基的家族在現有技術中已被定義，本家族包括具 有鹼性側鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬醜胺、 穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性的側鏈(例 如，丙氨酸、翔氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫 氨酸色氨酸)、P-分支的側鏈(例如，蘇氨酸、翔氨酸、異亮氨酸) 以及芳香族側鏈(例如，輅氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨 基酸，非-保守取代不能用於保守的胺基酸殘基或用於保守的蛋白功能區內的胺基酸殘基，諸如殘基19和27，其中這些殘基是蛋白質活性諸 如VPAC2活性和/或VPAC2選擇性所必不可少的.片段或生物學活性 部分包括適於用作藥物來產生抗體，以及用作研究試劑等的多肽片 段。片段包括含有充分類似於或來源於本發明多肽氳基酸序列的氨基 酸序列並且具有那些多肽的至少一種活性，但其包含比此處公開的全 長多肽更少的胺基酸的肽.典型地，生物學活性部分包括具有多肽的 至少一種活性的功能區或基序。多肽的生物學活性部分可以是例如五 個或更多胺基酸長的肽。這些生物學活性部分可以合成或通過重組技 術來製備，並且可以通過此處公開的和/或本領域公知的方法來評價本 發明多肽的一或多種功能性活性.此外，本發明優選的衍生物包含已經與另一個化合物熔合的成熟 多肽，諸如一種增加多肽半衰期和/或減少多肽的潛在免疫原性的化合 物(例如，聚乙二醇，"PEG")。就聚乙二醇化而言，可通過本領 域技術人員公知的任意方法來進行多肽與PEG的融合.例如，聚乙二 醇化可通過首先引入一個半胱氨酸突變到多肽中來提供一個接頭來連 接PEG，然後與PEG-馬來醯亞胺進行位點特異性的衍生作用。半胱氨 酸可被添加到肽的C-末端，並且其中C-末端是本發明中優選的位點。 (參見，例如，Tsutsumi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15 ):8548-53，2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417,2001; Goodsoon &Katre， Bio/Technology 8:343-346,1990),本發明多肽的變體包括具 有充分類似於圖1中SEQ ID NOs胺基酸序列的胺基酸序列的多肽或其 功能區。術語"充分地相似"是指第一胺基酸序列相對於第二胺基酸 序列含有足夠的或最小數目的相同或等價的胺基酸殘基，使得第一和 第二胺基酸序列具有一個共同的結構域和/或共同的功能活性。例如， 含有至少大約45%,優選大約75%至98%同一性的共同結構域的氨基 酸序列在此處被定義為充分地相似。優選地，變體應充分類似於本發明的優選多肽的胺基酸序列。變體包括由與本發明的多核苷酸雜交或 其在嚴格條件下互補的多核苷酸編碼的多肽的變體。這些變體通常保 持本發明多肽的功能活性。多核苷酸片段的文庫可用於產生用於篩選 和隨後選擇的多樣化群體。例如，片段的文庫可通過在其中每一分子僅僅發生大約一次切口的條件下用核酸酶處理多核苷酸的雙鏈PCR片 段，退火雙鏈DNA,復性DNA來從不同的切口產物形成包括正義/反 義對的雙鏈DNA，通過用Sl核酸酶處理除去重組雙鏈體的單鏈部分， 以及將產生的片段文庫連接到表達栽體中而產生。通過此方法，可以 荻得編碼本發明多肽的N-末端以及不同大小的內部片段.變體包括由於突變而導致的胺基酸序列不同的多肽.用作VPAC2 激動劑的變體可通過篩選突變體的組合文庫而被鑑定，例如用於 VPAC2激動劑活性的本發明多肽的平截突變體.在一個實施方案中，類似物的多樣化文庫通過在核酸水平上組合 的突變來產生並且被多樣化的基因文庫所編碼。變體的多樣化文庫可 通過，例如將合成的寡核苷酸的混合物酶促連接到基因序列中，使得 潛在變體胺基酸序列的簡併組被表達為單獨的多肽，或可選擇地，被 表達為其中含有該序列組的更大的融合蛋白組(例如，用於噬菌體展 示)，有許多方法可用於從簡併寡核苷酸序列產生可能變體的文庫。 可在DNA自動合成儀中進行簡併基因序列的化學合成，並且然後將合 成基因連接到合適的表達載體中。基因簡併組的使用使得有可能在一 種混合物中提供編碼可能的變體序列的目的組的所有序列，合成筒並 寡核苷酸的方法是本領域已知的(參見，例如，Narang， Tetrahedron 39:3,1983j Itakura，等，Aimu. Rev, Biochem. 53:323,1984; Itakura 等，Science 198:1056,1984; Ike等，Nucleic Acid Res. 11:477,1983 ),篩選組合文庫的基因產物的一些技術是本領域公知的，其中組合 文庫是通過點突變或平截產生的並且用於篩選具有選擇特性的基因產 物cDNA文庫。這些技術適用於通過R-激動劑多肽的組合突變來對產 生的基因文庫進行快速篩選.最廣泛使用的技術，其用於篩選大基因 文庫的高通量分析典型地包括克隆基因文庫到可複製的表達載體中， 用產生的栽體的文庫轉化合適的細胞並在檢測目的活性促進編碼其產 物被檢測的基因栽體分離的條件下表達組合基因.遞推集團突變形成 (REM)， 一種增強文庫中功能性突變頻率的技術，可用於與篩選試驗組合來鑑定目的變體。本發明也提供了嵌合的或融合的多肽。設計目的序列來用於定位 傳遞多肽到胰腺來使可能的副作用最小化。本發明的多肽可由彼此通 過肽鍵或修飾的肽鍵連接的胺基酸組成(即，肽的電子等排物)，並且可含有除了 20個基因-編碼的胺基酸之外的胺基酸。多肽可通過自然 過程，諸如轉譯後的作用，或者通過本領域公知的化學修飾技術被修 飾，這些修飾被廣泛描述在基本的教科書中和更具體的專著中，以及 在長篇的研究文獻中.修飾可發生在多肽的任意位置，包括肽主鏈、 胺基酸側鏈和氨基或羧基末端.可以理解相同類型的修飾可以相同或 不同的程度存在於給定的多肽的一些位點處。同樣地，給定的多肽可 含有很多類型的修飾.多肽可以是分支的，例如，作為遍在蛋白化的 結果，並且它們可以是環狀的，有或者沒有分支。環狀的、分支的和 分支環狀的多肽可產生於轉譯後的自然過程或通過合成方法來產生。 修飾包括乙醯化、醯化作用、ADP-核糖基化、醜胺化、核黃素的共價 連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、 脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化 作用、二疏鍵形成、脫甲基作用、共價交連的形成、半胱氨酸的形成、 焦穀氨酸的形成、曱醯化作用、Y-羧基化、糖基化作用、GPI錨形成、 羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、十四碳醯化、氧化、聚乙醇化、 蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒醯化、酸酯化 作用、轉運RNA介導的胺基酸添加到蛋白質上，諸如精氨醯化、以及 遍在蛋白4匕(參見，例如，Proteins ， Structure and Molecular Properties. 第二版，T. E. Creighton， W, H. Freeman and Company, 紐約(1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins. B.C.Johnson, ed"學院出版社，紐約，pgs.1-12 ( 1983 ) ; Seifter，等.， Meth. Enzymol 182:626-646,1990; Rattan等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 663:48-62,1992).本發明的多肽包括圖1的多肽(SEQ ID NOs:l至152 )，以及那 些在序列上具有非實質變化的序列."非實質性變4匕"包括實質上保持本發明多肽的至少一個生物學功能的任意的序列添加、取代或缺失 的變體，優選的生物學功能為VPAC2激動劑活性，並且更優選地為選 擇性的VPAC2激動劑活性，並且最優選地，為在此處顯示的胰島素分泌活性。這些功能性等價物可優選地包括與圖1的多肽具有至少大約90%同一性的多肽，並且更優選地至少與圖1的多肽具有95%同一性， 並且更優選地與閨1的多肽具有至少97%的同一性，也包括這些具有 大體上相同生物活性的多肽。然而，在此處進一步描述的來自圖1多 肽在胺基酸序列中具有非實質性變化的顯示出功能性等價的任意多肽 被包含在本發明的描述中。本領域公知的兩個多肽之間的"相似性"被通過胺基酸序列及其 多肽的保守胺基酸取代物與第二多肽的序列之間的比較來測定，這些 保守的取代包括如上所述的和Dayhoff所描述的(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，1978 ),和Argos所述的(EMBO J. 8:779-785,1989),例如，屬於下組之一的胺基酸表示保守的變化-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、絲氨酸、蘇氨酸；-半胱氨酸、絲氨酸、輅氨酸、蘇氨酸；-翔氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；-苯丙氨酸、輅氨酸、色氨酸、組氨酸；和-天冬氨酸、穀氨酸。本發明同樣涉及編碼本發明多肽的多核苷酸以及包含這些多核苷 酸的栽體、用本發明栽體遺傳改造的宿主細胞，以及通過重組技術產 生本發明多肽的方法。可用本發明的栽體進行遣傳改造對宿主細胞(傳導、轉化或轉 染)，其中栽體可以是例如克隆栽體或表達栽體.栽體可以是，例如 質粒、病毒粒子、噬菌體的形式等。工程改造的宿主細胞可培養在被 改變成適於激活啟動子或選擇轉化體的常規培養基中.培養條件，諸 如溫度、pH值等，為以前選擇用於表達的宿主細胞所使用的，並且對 於普通的技術人員是顯而易見的。本發明的多核苷酸可用於通過重組 技術來產生多肽.因此，例如，多核苷酸序列可包含在各種任意的表 達栽體中，尤其是用於表達多肽的栽體或質粒中.這些栽體包括染色 體的、非染色體的以及合成的DNA序列(例如，SV40的衍生物)； 細菌質粒；噬菌體DNA;酵母質粒；獲自質粒和噬菌體的DNA組合 的栽體；病毒DNA諸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及偽狂犬病病毒。 然而，任意其它的栽體或質粒可被使用，只要它們在宿主中是可複製的和有活力的。可通過各種方法將合適的DNA序列插入到載體中。通常，通過本 領域已知的方法將DNA序列插入到合適的限制性核酸內切酶位點中。 認為這些以及其它的方法在本領域技術人員的知識範圍內。表達栽體 中的DNA序列可操作地連接於合適的表達調控序列(啟動子)來直接 合成mRNA。這些啟動子的典型實例包括但不限於，LTR或SV40啟 動子、大腸桿菌lae或trp、噬菌體X PL啟動子，及其它已知調控基 因在原核或真核細胞或他們的病毒中表達的啟動子。表達栽體也可含 有用於翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子.栽體也可包括用於擴增表達的合適的序列.此外，表達栽體優選地含有一種基因來提供 用於選擇轉化的宿主細胞的表型特性，諸如用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或諸如在大腸桿菌中的四環素或氨節音黴 素抗性。含有在此處描述的合適DNA序列，以及合適啟動子或調控序 列的載體可被利用來轉化合適的宿主來允許宿主表達蛋白質。合適宿 主的典型實例包括但不限於細菌細胞，諸如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏 菌、鏈黴菌屬；真菌細胞，諸如酵母；昆蟲細胞，諸如果蠅S2和 Spodoptera Sf9;動物細胞諸如CHO、 COS或Bowes黑色素瘤；腺病 毒；植物細胞等。本領域的技術人員從此處的教導可以理解如何進行 合適宿主的選擇。本發明也包括含有一個或多個如上所述的序列的重組構建體.構 建體包括一個栽體，諸如質粒或病毒栽體，其中以正向或反向插入了 本發明的序列，在這些實施方案的一個優選的方面，構建體進一步含 有調節序列，包括，例如與該序列可操作地相連的啟動子.大量的合 適的栽體和啟動子是本領域的普通技術人員所公知的，並且是市售 的。下面的栽體以實例的方式來提供'細菌pQE70、 pQE卯、pQE-9、 pBS、 phagescript、 psiX174、 pBluescript SK、 pBsKS、 pNH8a、 pNH16a、 pNH18a、 pNH46a、 pTRC99A、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540 和PRIT5。真核生物的pWLneo、 pSV2cat、 pOG44、 pXTl、 pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG和PSVL。然而，任意其它的栽體或栽體可被使用，只 要它們在宿主中是可複製和有活力的.啟動子區域可選自任意的使用 CAT (氯黴素轉移酶)載體或其它具有選擇性標記的栽體的目的基因。 兩個合適的栽體為pkk232-8和pCM7,特定命名的細菌啟動子包括lad、 lacZ、 T3、 T7、 gpt、入PR、 PL和trp.真核細胞的啟動子包括 CMV的立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、來自逆病毒的 LTRs和老鼠金屬硫蛋白-I。對合適栽體和啟動子的選擇在本領域普通 技術人員可理解的範圍內。本發明也涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等 的真核細胞，諸如哺乳動物細胞或低等的真核細胞，諸如酵母細胞， 或宿主細胞可以是原核細胞，諸如細菌細胞。將構建體導入到宿主細 胞中可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或電穿孔法(Davis 等，Basic Methods in Molecular Biology, 1986)來進行。宿主細胞中 的構建體可通過常規的方式用於產生由重組序列編碼的基因產物。可選擇地，本發明的多肽可以通過常規的肽合成儀來合成製備，成熟的蛋白可在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中合適啟 動子的調控下表達。也可以使用無細胞翻譯系統利用獲自本發明DNA 構建體的RNAs來產生這些蛋白質，用於原核生物和真核生物宿主的 合適克隆和表達栽體被Sambrook等描迷於Molecular Cloning:實驗室 指南，第二版，(Cold Spring Harbor, N.Y， 1989)，其內容通過引 用在此作為參考.由更高等的真核生物編碼本發明多肽的DNA轉錄被通過插入一個 增強子到序列中而增強。增強子為DNA的順式作用元件，通常為從大 約10到大約300bp，其作用於啟動子來增強其轉錄。實例包括在複製 起點的晚期一側的SV40增強子(bp 100到270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在複製起點晚期一側的多形瘤增強子以及腺病毒增強 子.通常，重組表達栽體包括允許宿主細胞轉化的複製起點以及選擇 性標記(例如，大腸桿菌的氨爺青黴素抗性基因或畔酒八疊球菌 (S.cerevisiae) TRP1基因)，以及指導下遊結構序列轉錄的獲自高度 表達基因的啟動子。這些啟動子可獲自編碼糖酵解酶諸如3磷酸甘油 酸激酶(PGK) 、 a因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白等的操縱子，異源的 結構序列在合適的階段被裝配了翻譯、起始和終止序列，以及優選地， 裝配了能夠指導分泌翻譯的蛋白到周質間隙或胞外介質中的前導序 列。選擇性地，異源序列可編碼包括賦予目的特性(例如，表達的重 組產物的穩定化或簡單化的純化)的N-末端鑑定肽的融合蛋白。用於細菌的有益表達栽體可以通過插入一個編碼目的蛋白的結構DNA序列以及在可操作的閱讀階段插入合適的翻譯、起始以及終止信 號與功能性的啟動子來構建。栽體可包括一個或多個表型的選擇性標 記以及一個複製起點來確保栽體的維持以及如果希望，在宿主內提供 擴增。用於轉化的合適的原核生物宿主包括，例如大腸桿菌、枯草芽 胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬中 的不同的種，儘管其它的也可被使用作為一種選擇，用於細菌的有益 表達栽體可包括獲自含有眾所周知的克隆栽體pBR322 (ATCC 37017)的遺傳元件的市售質粒的選擇性標記和細菌複製起點.這些商 用栽體包括例如，pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden和GEM1 (Promega， Madison, Wis" USA)。這些pBR322 "主鏈"部分可與合適的啟動子和結構序列相結合而被表達，在合適的宿主菌林的轉化和宿主菌林生長到合適的細胞密度後， 將選擇的啟動子通過適當手段去阻遏(例如，溫度變化或化學誘導) 並且將細胞培養另外一段時間。典型地通過離心收集細胞，通過物理 的或化學的方法裂解，並且保留產生的粗提物用於進一步的純化。用 於蛋白質表達的微生物細胞可通過任意方便的方法來破壞，包括凍融 循環、超聲波處理、機械破壞或使用細胞裂解試劑。不同的哺乳動物細胞培養系統也可用於表達重組蛋白質.哺乳動 物表達系統的實例包括猴腎臟成纖維細胞的COS-7細胞系，描述於 Gluzman， Cell 23:175,1981 )，及其它能夠表達相容性栽體的細胞系， 例如，C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達栽體 可以包括一個複製起點、 一個合適的啟動子和增強子，以及任意必需 的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終 止序列和5，側接非轉錄序列。獲自SV40病毒基因組的DNA序列，例 如SV40起點、早期啟動子、增強子、接頭和聚腺苷酸化位點可被用來 提供需要的非轉錄遣傳元件.本發明的多肽可被回收並通過目前使用的方法從重組的細胞培養 物中純化，包括硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取、陰離子或陽離子交換 層析、磷酸纖維素色譜層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石 層析和凝集素色謙層析。可根據需要在完成成熟蛋白的構型中使用蛋 白質重摺疊步驟.最後，可以將高效液相色鐠(HPLC)用於最後的純 化步驟。本發明的多肽可以是化學合成方法的產物，或由原核生物或真核 生物宿主(例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)通過 重組技術來生產。取決於在重組生產方法中使用的宿主，本發明的多 肽可以用哺乳動物或其它真核生物的碳水化合物糖基化或可以是非糖 基化的。本發明的多肽也可以包括最初的甲硫氨酸胺基酸殘基.本發 明的分離或純化的多肽或其生物學活性部分，當通過重組技術產生時 大體上不含有其它的細胞物質或培養基，或當化學合成時大體上不含 有化學前體或其它化合物。優選地，本發明的分離多肽大體上不含有細胞物質並且具有小於大約30% (乾重)的非多肽或汙染物質。當本 發明的多肽或其生物學活性部分被重組產生時，優選地培養基佔多肽 製品的30%以下的體積。當本發明通過化學合成生產時，優選地該制 品含有小於大約30%乾重的化合物前體或非發明的化合物。本發明的多肽可通過下面所述的特定的實施例被很方便地分離。 純化的多肽製品為至少大約70%純；優選地，該製品為大約85%至大約99°/。純，本製品的純度可通過本領域已知的任意方法進行評估，諸 如SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和質謙/液相色譜.可以利用本領域眾所周知的化學方法完全地或部分地合成編碼本 發明多肽的多核苷酸序列(參見，例如，Camthers等，Nucl. Acids Res. Symp, Ser, 215-223，1980; Horn等，Nucl Acids Res. Symp. Ser. 225-232,1980).然後可以將編碼多肽的多核苷酸克隆到表達栽體中來表達 多狀，本領域的技術人員應能理解，產生具有非天然存在的密碼子的編 碼多肽的核苷酸序列也許是有益的。例如，可選擇特定的原核生物或 真核生物宿主的優選的密碼子來增加多肽表達的速率或來產生具有目 的特性的RNA轉錄本，諸如比由天然存在的序列產生的轉錄本的半衰期更長的半衰期。由於種種原因，可以利用本領域已知的常規方法對此處公開的核 苷酸序列進行改造來改變多編碼肽的序列，包括但不限於修飾多肽或 mRNA產物的封閉、加工和/或表達的改變。可通過隨機斷裂來重組 DNA和基因片段以及合成寡核苷酸的PCR重裝配來改造核苷酸序 列.例如，定點誘變可被用來插入新的限制性位點，改變糖基化模式， 改變密碼子偏愛性，產生接頭變體，引入突變等.也提供在本領域的技術人員可以理解的範閨內的相關的化合物， 諸如化學模擬物、有機模擬物或肽模擬物。此處使用的術語"模擬物"、"肽模擬物"、"多肽模擬物，'、"有機模擬物"和"化學模擬物" 包括肽衍生物、肽類似物以及與本發明的肽等價的在三維方向具有原 子排列的化合物。可以理解此處所用的術語"等價於，，是指包含在所 述肽中的具有特定原子或化學部分的取代的化合物，具有鍵長，鍵角，合物的排列，從而i有本發明肽的生"學功A。在本i明二肽模擬物 中，化學組分的三維排列在結構和/或功能上等價於肽主鏈和肽的組分 胺基酸側鏈的三維排列，使得本發明肽的這些肽模擬物，有機模擬物 和化學模擬物具有實質上的生物活性。這些術語被依照本領域的理解來使用，例如，Fauchere ( Adv, Drug Res. 15:29,1986) ; Veber & Freidinger， (TINS p.392，1985 );和Evans等，(J, Med. Chem. 30:1229,1987)所詳細闡述的，在此引作參考。可以理解本發明的各種肽存在生物活性的藥效基團。在本領域中 藥效基團被理解為包括生物活性所需的理想化的，三維的結構定義. 肽模擬物、有機模擬物和化學模擬物可被設計來適合各自的藥效基團 與當前的計算機模擬軟體(計算機輔助藥物設計)。所述模擬物可通 過結構-功能分析，基於本發明肽中取代基原子的位置信息來產生.本發明提供的肽可通過本領域任意已知的化學合成技術，尤其是 固相合成技術方便地合成，例如，利用商業-獲得的自動肽合成儀。本 發明的模擬物可通過通常用於肽合成的固相或液相方法來合成。(參 見，例如，Merrifield, J. Amer, Chem. Soc. 85:2149-54,1963; Carpino， Acc. Chem. Res. 6:191-98， 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vols. 1, 2， 3，和5， ( Gross & Meinhofer， eds.)， 學院出版社紐約，1979; Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版，Pierce Chem. Co.: Rockford， 111" 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89,1988;和Gregg等，Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214,1990，其在此全部引入作為參考)。優選使用固相方法。簡要地，N-保護的C-末端胺基酸殘基被連接 於不溶解的載體諸如二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯、聚丙烯跣胺樹脂、硅藻土/聚醯胺(p印syn K)、可控的微孔玻璃、纖維素、聚丙烯膜、 丙烯酸-塗層的聚乙烯棒，等.去保護、中和和相繼的保護性胺基酸衍 生物的偶聯的循環被用於從C-末端依照胺基酸序列來連接胺基酸.對 一些合成肽而言，可以使用利用酸敏感性樹脂的FMOC策略。優選的 固相栽體為二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯樹脂，其是以各種功能化的形 式市售的，包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、對乙醯胺基曱基樹脂、二 苯甲基胺(BHA)樹脂、4-甲基二苯曱基胺(MBHA)樹脂、肟樹脂、 4-烷氧基苯曱醇樹脂(Waiig樹脂)、4- U，，4，-二甲氧基苯基氨基曱基 (MBHA)樹脂-苯氧基甲基樹脂、2，4-二甲氧基二苯甲基-胺樹脂和4-(2，，4，-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基乙醯胺基正亮氨醯基 MBHA樹脂(Rink醯胺MBHA樹脂)。此外，酸-敏感的樹脂也提供 了C-末端酸類，如果希望的話。尤其優選的a-胺基酸的保護基是鹼不 穩定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC).本領域眾所周知的是，胺基酸側鏈功能團的合適保護基在化學上 與BOC (叔-丁氧基羰基)和FMOC基團是相容的.當利用FMOC化 學作用時，下列的保護性胺基酸衍生物是優選的FMOC-Cys ( Trit)、 FMOC-Ser (But) 、 FMOC-Asn ( Trit) 、 FMOC垂Leu、 FMOC-Thr (Trit) 、 FMOC-Val、 FMOC-Gly、 FMOC-Lys (Boc) 、 FMOC-Gln (Trit) 、 FMOC誦Glu ( OBut) 、 FMOC-His ( Trit) 、 FMOC-Tyr ( But)、 FMOC-Arg (PMC ( 2，2，5，7，8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺跣基))、 FMOC-Arg (BOC) 2、 FMOC-Pro和FMOC-Trp ( BOC )。胺基酸殘基可通過利用各種偶聯劑和本領域已知的化學作用被偶聯，諸如直接 與DIC (二異丙基-碳二亞胺)、DCC(二環己基碳二亞胺)、BOP(苯 並三唑基-N-氧基三(二甲氨基)膦錯六氟褲酸)、PyBOP (苯並三唑 -l-基-羥基-三-吡咯烷基膦六氟-磷酸酯)、PyBrOP (溴代-三-吡咯烷基 膦錯六氟磷酸酯偶聯；通過對稱的酸酐偶聯；通過活性酯諸如五氯苯 基酯偶聯；或通過進行的HOBt (1-羥基苯並三唑)活性酯或通過利用 FMOC-胺基酸氟化物和氯化物或通過利用FMOC-胺基酸-N-羧基肝偶 聯。在HOBt或HOAt( 7-氮雜羥基苯並三唑)存在下用HBTU( 2-( 1H-苯並三唑-l-基)、1，1，3，3-四甲基脲錙六氟磷酸酯)或HATU ( 2- (1H-7-氮雜-苯並三唑-l-基)、1，1，3，3-四曱基脲鏡六氟磷酸酯)激活是優選的。 儘管優選在市售的肽合成儀(例如，Applied Biosystems 431A等；Applied Biosysteras， Foster City, CA)上自動合成，但固相方法可以 人工進行。在一個代表性的合成方案中，第一個(C-末端)胺基酸被 加載到氯代三苯甲基樹脂上.依照ABI FastMoc方案(A卯lied Biosystems )的相繼的去保護(用20。/。哌啶/NMP ( N-甲基吡咯烷酮)) 和偶聯循環可用於產生序列。通過用乙酸肝加帽的雙倍和三倍偶聯， 也可被4吏用。可以從樹脂上裂解合成的模擬肽並通過用含有合適淨化劑的TFA (三氟乙酸)去保護.許多這樣的裂解試劑，諸如試劑K(0."g結晶 酚、0.25 mL乙硫醇、0.5mL苯甲碗鍵、0.5mL去離子水、10mLTFA) 以及其它可以被使用。通過過濾從樹脂中分離肽並通過瞇沉澱進行分 離。通過傳統的方法，諸如凝膠過濾和反相HPLC(高效液相色鐠) 進行進一步的純化。本發明合成的模擬物可以是藥用鹽的形式，特別 是鹼加成鹽包括有機鹼和無機鹼的鹽。依照本領域技術人員公知的方 法，通過用合適的鹼或無機鹼處理肽來製備酸性胺基酸殘基的鹼加成 鹽，或可通過冷凍乾燥合適的鹼而直接獲得目的鹽.通常，本領域的技術人員可以理解可通過各種化學技術修飾此處 所述的肽來產生與未修飾的肽具有基本上相同活性，並且選擇性地具 有其它的目的特性的肽'例如，肽的羧酸基團可以是以藥學上可接受 的陽離子的鹽形式來提供。舦內的氨基可以是藥學上可接受的酸加成 鹽的形式，諸如HC1、 HBr、醋酸、安息香酸、甲苯磺酸基、馬來酸、 酒石酸的鹽及其它的有機鹽，或可被轉變為醯胺。通過任一大量的熟 知的保護基諸如乙醯胺基團來保護硫醇。本領域的技術人員也將能夠 確定引入環狀結構到本發明肽中使得天然結合構象進一步幾乎接近的 方法。例如，羧基末端或氨基末端半胱氨酸殘基可被添加到肽上，使 得當氧化肽時將含有一個二硫鍵，由此產生一個環肽。其它的肽環化 方法包括硪酸和羧基-和氨基-末端醯胺和癍的形成。特定地，各種不同的方法被有效地用於構建具有與相應的肽化合 物相同的或類似的目的生物活性的肽衍生物和類似物，所述的肽衍生 物和類似物具有更有利的關於溶解性、穩定性和對水解和蛋白酶解的 敏感性的活性。此類衍生物和類似物包括在N-末端氨基、C-末端羧基修飾，和/或改變肽中的一個或多個醯胺鍵為非-醯胺鍵的肽。可以理解 兩種或多種這樣的修飾可偶合在一種肽模擬物結構中(例如，在C-末端羧基上進行修飾並且在肽的兩個胺基酸之間包含-CHr氨基甲酸醋 鍵)。氨基末端修飾包括烷基化、乙醯化、加入一個羧苯甲醯，以及形 成一個琥珀醯亞胺基團。特定地，可使N-末端氨基反應來形式一個通 式RC (O) NH—的醯胺基，其中R是烷基，優選為低級烷基，並且通 過與醯卣、RC (O) Cl或酸fff反應而被加入。典型地，反應可通過在 惰性稀釋刑(例如，二氯甲烷)中使大約當量克分子的或過量(例如， 大約5當量)的卣化醯基與肽接觸來進行，優選地惰性稀釋劑含有過 量(例如，大約10當量)的叔胺，諸如二異丙基乙胺，來清除反應過 程中產生的酸。反應條件是常規的(例如，室溫30分鐘)，使末端氨 基烷基化來提供低級烷基的N-取代，然後如上所述與醯卣反應將提供 通式RC (O) NR-的N-烷基醯胺基團.可選擇地，氨基末端可通過與 琥珀酸酐反應而共價連接於琥珀醯亞胺基團上。使用大約當量克分子 的量或過量的琥珀酸酐(例如，大約5當量)且末端氨基通過本領域 公知的方法在合適的惰性溶劑(例如，二氯曱烷)中被轉變為叔胺， 描述在WoUenberg等(美國專利No. 4，612，132 )中，其全部引入作為 參考。可以理解琥珀酸基團可用例如，CV至CV烷基或-SR取代基取 代，其被以常規的方式製備來提供肽N-末端的取代的琥珀醯亞胺.此 烷基取代基可通過低級烯烴(Cr至Q-烷基)與馬來酐以Wollenberg 等如上文所述的方式反應來製備，並且-SR取代基可通過使RSH與馬 來酐反應來製備，其中R如上述所定義。在另一個有益的實施方案中， 氨基末端可被衍生化來形成節氣基羰基-NH—或取代的節氣基羰基-NH-基團. 此衍生物可通過與大約一當量的或過量的節氧基羰基氯化 物(CBZ-C1)或取代的CBZ-C1在合適的惰性稀釋刑(例如，二氯甲 烷)中反應來製備，惰性稀釋劑優選地含有叔胺來清除反應過程中產 生的酸。在另一個衍生物中，通過與當量數或過量(例如5當量)的 R--S (O) 2C1在合適的惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應來將末端胺轉 變為氨磺跣使得N-末端包括一個氨磺醯基團，其中R是烷基並且優選 地為低級烷基，優選地，惰性稀釋液含有過量叔胺(例如，IO當量)， 諸如二異丙基乙胺來清除反應過程中產生的酸.反應條件是常規的(例 如，室溫30分鐘).通過與一當量或過量(例如5當量)的R—OC(O) Cl或R—OC ( O ) OC6H4--p—N02在合適的惰性稀釋液(例如，二氯甲烷)中反應來將末端胺轉變為氨基曱酸酯，使得在N-末端產生氨基曱 酸酯基團，其中R是烷基，優選地為低級烷基.優選地，情性稀釋液 含有過量叔胺(例如，10當量)，諸如二異丙基乙胺來清除反應過程 中產生的任意酸。反應條件是常規的(例如，室溫30分鐘).通過與 一當量數或過量(例如5當量)的R-N=00在合適的惰性稀釋液(例 如，二氯曱烷)中反應將末端胺轉變為脲(即，RNHC(O)NH--)基 團，使得在N-末端形成脲基團，其中R如上文所定義的.優選地，惰 性稀釋液含有過量叔胺(例如，10當量)，諸如二異丙基乙胺.反應 條件是常規的(例如，室溫30分鐘).在肽模擬物的製備中，其中C-末端羧基可被酯替代(例如，-C( O ) OR，其中R是烷基，優選地為低級烷基)，使用用於製備舦酸的樹脂， 並且側鏈保護的肽可用鹼基和合適的醇(例如，曱醇)裂解.以常規 方式通過用氟化氫處理除去側鏈保護基來荻得目的酯.在製備肽模擬 物中，其中C-末端羧基被醯胺—C (O) NR3R4替代，二苯甲基胺樹脂被用作肽合成的固相栽體。當合成完成時，用氟化氫處理來從栽體肽 釋放肽，直接產生游離的肽醯胺(即，C末端為—C (O) NH2),可選 擇地，在肽合成過程中，將氯曱基化樹脂的使用與氨反應偶合來由栽 體裂解側鏈保護肽而產生游離的肽醯胺，並且與烷基胺或二烴基胺反 應來產生側鏈保護的烷基醯胺或二烷基醯胺(即，C-末端為-C (O) NRRh其中R和Ri是烷基，優選地為低級烷基)'以常規方式用氟 化氫處理除去側鏈保護來產生游離的醯胺、烷基醯胺或二烷基醯胺。在另一個可選擇的實施方案中，通過分別用N-末端氨基分別置換 羧基或酯的—OH或酯—OR)來誘導C-末端羧基或C-末端酯環化而形 成環肽。例如，合成和裂解產生肽酸後，通過合適的羧基活化劑諸如 二環己基碳二亞胺(DCC)在溶液中，例如，在二氯曱烷(CH2C12)、 二曱基甲醯胺(DMF)或其混合物中將游離酸轉變為激活的酯.然後 用N-末端胺置換激活的酯而形成環肽。環化作用，而不是聚合作用， 可通過使用合適的稀釋溶液依照本領域公知的方法被增強。可以理解，本發明提供的肽模擬物在結構上類似於本發明的肽， 但具有一或多個選擇性地被選自下組的鍵替代的肽鍵-CH2NH--， 一 CH2S—， —CH2CH2—， —CH-CH-(在順式和反式構象異構體中)，— COCH2—， —CH(OH)CH2—，和-曙CH2SO—，通過本領域已知的和在下面參考文獻中進一步描述的方法進^f亍Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein， ed,) ， Marcel Dekker:紐約，p. 267,1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1:3，1983; Morley， Trends Pharm. Sci. pp. 463-468,1980; Hudson等，Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185,1979; Spatola等，Life Sci. 38:1243-1249,1986; Hann， J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314,1982; Almquist等，J. Med, Chem. 23:1392-1398,1980; Jennings-White,等， Tetrahedron Lett. 23:2533,1982; Szelke等，EP045665A; Holladay等， Tetrahedron Lett. 24:4401-4404,1983;和Hruby， Life Sci. 31:189-199,1982;分別在此引入作為參考。此種肽模擬物與多肽實施方案相比 具有顯著的優點，包括例如，生產更經濟，具有更大的化學穩定性或 增強的藥理學特性(諸如半衰期、吸收、效力、效果等)，降低的抗 原性，及其它特性.本發明肽的模擬類似物也可利用常規的或合理的藥物設計的原則 來獲得(參見，例如，Andrews等，Proc. Alfred Benzon Symp. 28:145-165,1990; McPherson， Eur. J. Biochem. 189:1-24，19卯;Hol等， in Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems ， (Roberts, ed.) : Royal Society of Chemistry, pp.84-93，1989a; Hol， Arzneim誦Forsch. 39:1016-1018，1989b; Hol， Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778,1986;其內容在此引入作為參考)。根據常規的藥物設計方法，通過隨機測定分子而獲得目的模擬物 分子，其結構具有與"天然的"肽相同的結構特徵.由結合分子的特定基團的改變產生的定量的作用可通過測定推斷的模擬物與肽活性比 較的生物活性來測定。在一個優選的合理藥物設計的實施方案中，模 擬物被設計成共有肽的最穩定的三位構象的特徵，因此，例如，模擬 物可被設計成以類似於本發明肽具有的足以引起離子的、疏水性的、 或範德華相互作用的方式具有化學基團，如此處公開的。優選的設計合理模擬物的方法採用能夠形成肽三維結構的模型的 計算機系統，諸如Hol 1989a; Hol， 1989b;和Hol， 1986例證的那些。 本發明肽的肽-、有機-和化學-模擬物的分子結構可利用市售的計算機 輔助設計程序來產生。此程序的實例包括sybyl 6.5 , hqsarTM，和 alchemy 2000TM ( Tripos) ; galaxyTM和am 2000TM ( AM Technologies,Inc., San Antonio, TX); catalystTM和ceriusTM( Molecular Simulations, Inc., SanDiego， CA ); cACHE PRODUCTS窗，TSARTM， AMBERTM, 以及CHEM-XTM ( Oxford Molecular Products ， Oxford ， CA )和 CHEMBUIU)ER3DTM( Interactive Simulations, Inc., San Diego， CA)。 利用例如人工-識別的分子模型建立程序以及利用此處公開的肽通 過常規的化學合成技術來製備產生的肽-、有機-和化學-模擬物，最優 選地設計成能適應高通量篩選，包括組合的化學作用方法。對產生本 發明的肽-，有機-和化學-模擬物有用的組合方法包括噬菌體展示陣 列、固相合成和組合的化學陣列，可提供，例如通過SIDDCO(Tuscon， Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochera.( San Diego ， CA); Symyx Technologies, Inc. ( Santa Clara, CA ) ; Mediche邁Research, Inc. ( Lemont， IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. ( Bethlehem, PA); 或N.V.Organoii (Oss， Netherlands )提供.本發明的肽-，有機-和化學-模擬物的組合化學生產可依照本領域已知的方法來進行，包括但不 P艮於，公開於Terrett， ( Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, London, 1998) ; Gallop等，J. Med. Chem. 37:1233-51,1994; Gordon等，J. Med. Chera. 37:1385-1401,1994; Look等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12，1996; Ruhland等，J. Amer. Chem. Soc. 118:253-4,1996; Gordon等，Acc. Chem. Res. 29:144-54,1996; Thompson & Ellman， Chem. Rev. 96:555-600,1996; Fmchtel & Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42,1996; Pavia， "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org， 1995; Adnan等,"Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization, "Id,， 1995; Davies和Briant， "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity, "Id., 1995; Pavia ， "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future, "Id" 1996;以及專利U.S. Nos. 5,880,972; 5,463,564; 5，331573; 和5，573，卯5中 通過初步的高效液相色譜法大體上純化新合成的多肽(參見，例 如，Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman和Co"紐約，N.Y.， 1983).本發明的合成多肽的組成可通 過胺基酸分析或通過，例如，Edman降解法(Creighton,如上文所述)測序來證實。另外，可在直接合成中和/或利用化學方法與來自其它蛋 白的序列結合來改變多肽胺基酸序列的任意部分而產生變體多肽或融 合多肽。也可根據本發明通過此多肽的體內表達來使用本發明的多肽，其 通常被稱為"基因治療"。因此，例如，可用一個編碼先體外後體內的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)來改造細胞，改造的細胞被提供給患者來用多肽進行治療.這樣的方法是本領域公知的。例如，細胞可 被通過本領域已知的方法利用含有編碼本發明多肽的RNA的逆轉錄病毒進行改造.利用基因治療的胰島素促泌劑的局部輸送可將治療劑提供到目的 區域(例如，胰腺)。例如胰腺-特異性啟動子被用來產生p-細胞胰腺 腫瘤小鼠模型(Hanahan， Nature 315 (6015) :115-22,1985)'體外和體內兩種基因治療方法被關注a —些將潛在的治療基因轉運到細胞群體的方法是已知的(參見，例如，Mulligan, Science 260:926-31,1993),這些方法包括，例如1) 直接的基因傳遞(參見，例如，Wolff等，Science 247:1465-68,1990);2) 脂質體-介導的DNA傳遞(參見，例如，Caplen等，NatureMed. 3:39-46,1995; Crystal, Nature Med. 1:15-17，1995; Gao和Huang， Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85 1991 );3 )逆轉錄酶病毒-介導的DNA傳遞(參見，例如Kay等，Science 262:117-19,1993; Anderson, Science 256:808-13,1992 ),4) DNA病毒-介導的DNA傳遞.此類DNA病毒包括，例如，腺 病毒(優選地基於栽體的Ad-2或Ad-5 )、皰疹病毒(優選地基於單純 皰療病毒的栽體)和細小病毒(優選地基於"缺陷的"或非-自主的細 小病毒的栽體，更優選地為基於與腺病毒相關的病毒的栽體，最優選 地為基於AAV-2的栽體)(參見，例如，Ali等，Gene Therapy 1:367-84， 1994;美國專利No.4，797，368;美國專利No. 5,139,941;在此引入作為參考.傳遞目的基因的特定栽體系統的選擇取決於各種因素。 一個重要 的因素是靶細胞群體的特性，儘管逆轉錄病毒栽體已被廣泛地研究並 使用在大量的基因治療應用中，但是該栽體通常不適合於侵染非分裂的細胞.此外，逆轉錄酶病毒具有致癌的可能。然而，有關豆病毒栽體方面的最新進展可繞過這樣的一些局限性(參見，例如，Naldini等， Science 272:263-67,1996)。可從中獲得逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄酶病毒包括但不限 於，莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉錄酶病毒諸如勞氏 肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病毒、人 類免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髄及外骨髄增殖的肉瘤病毒、以及 乳腺瘤病毒。腺病毒具有下列優點，它們具有廣泛的宿主範圍，可侵染靜止的 或在末端分化的細胞，諸如神經元或肝細胞並且基本上呈現非致瘤性 (參見，例如，Ali等，1994)。腺病毒看來似乎沒有被整合到宿主基 因組中。因為它們存在於染色體外，插入突變的危險被大大地降低了. Ali等，1994.與腺病毒相關的病毒具有類似的優點，如基於腺病毒的栽體.然 而，AAVs顯示出位點特異性整合在人的染色體19上(參見，例如， Ali等，1994)。在一個優選的實施方案中，編碼本發明的多肽胰烏素促泌劑的 DNA被用於疾病諸如糖尿病和與糖尿病-相關的疾病的基因治療中.依照這些實施方案，用編碼本發明的多肽胰島素促泌刑或突變蛋 白的DNA進行的基因治療在診斷的同時或診斷後立即被提供給有需求 的患者。技術人員應能理解任意合適的含有多肽胰為素促泌劑、DNA或 DNA片段、衍生物、或多肽胰烏素促泌劑的變體的基因治療栽體可根 據此實施方案來使用。構建此栽體的技術是本領域公知的(參見，例 如，Anderson, Nature 392:25-30,1998; Verma等，Nature 389:239-242,1998)。可利用已知的技術完成將含有多肽胰島素促泌劑DNA的 栽體導入到目的位點。栽體可包括一或多個啟動子。合適的啟動子包括但不限於，逆轉 錄病毒LTR， SV40啟動子；和人巨細胞病毒(CMV )啟動子(Miller 等，Biotechniques 7 (9) :980-9卯，1989)，或任意其它的啟動子(例 如，細胞啟動子，諸如真核生物的細胞啟動子包括但不限於組蛋白、 polIII和(-肌動蛋白啟動子)。其它可被使用的病毒啟動子包括但不限於腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。 合適啟動子的選擇對於本領域的技術人員結合此處的教導而言是顯而 易見的.編碼本發明多肽的核酸序列處於合適的啟動子的調控下.合適的 啟動子包括但不限於，啟動子諸如腺病毒主要晚期啟動子；或異源的 啟動子諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟 動子；誘導型啟動子諸如MMT (金屬硫蛋白)啟動子；熱激啟動子； 白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸腺嘧啶核苷 激酶啟動子諸如單純性皰疹胸苷激醉啟動子；逆轉錄病毒LTRs (包括 在上文描述的修飾的逆轉錄病毒LTRs) ; P-肌動蛋白啟動子；和人 生長激素啟動子。啟動子也可以是天然的調控編碼多肽的基因的啟動 子.逆轉錄病毒質粒栽體可被用於傳導包裝細胞系而形成生產細胞 系.可被轉染的包裝細胞的實例包括但不限於，PE501、 PA317、 c|)-2、 (J;-AM、 PA12、 T19-14X、 VT-19-17-、少-CRE、 t|)-CRIP、 GP+E-86、 GP+envAml2和DAN細胞系如描述在Miller (Hum. Gene Ther.l:5-14，19卯)，其整體引入在此作為參考。通過本領域已知的任意方法， 栽體可傳導包裝細胞。這樣的方法包括但不限於，電穿孔法、脂質體 的使用和CaP04沉澱。可替代地，逆轉錄病毒質粒栽體可被裝入到脂 質體中或與脂類偶合，然後給藥於宿主。生產細胞系產生傳染性的包 括編碼多肽的核酸序列的逆轉錄病毒栽體粒子。此逆轉錄病毒栽體粒 子然後可用於在體外或體內傳導真核細胞。傳導的真核細胞將表達編 碼多肽的核酸序列。可被傳導的真核細胞包括但不限於胚胎幹細胞、 胚胎的惡性腫瘤細胞以及造血千細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細 胞、角質細胞、內皮細胞和支氣管的上皮細胞。與基因治療不同的方法為"轉有核細胞治療"，其中在再導入到 患者之後在體內胞外處理患者的細胞來誘導靜止的染色體基因而產生 目的蛋白。轉有核細胞治療假定個體具有激活所必需的正常的基因互 補。轉有核細胞治療涉及引入一個啟動子或其它能夠激活新生基因的 外源調節序列，到患者細胞的來自體內的染色體DNA中，培養物和篩 選產生活性蛋白的細胞，然後再將激活的細胞導入到患者中來意欲使 得它們變得完全地接受。"基因激活的"細胞然後持續特定的一段時間產生目的蛋白，也許持續至患者的生命之久(參見，例如，美國專利Nos. 5，641，670和5，733，761且通過引入在此作為參考).本發明也包括那些選擇性地結合本發明多肽的抗體和抗體片段。 本領域已知的任意類型的抗體可利用本領域眾所周知的方法來產生。 例如，抗體可被產生來特異性地結合到本發明多肽的抗原表位上。此 處使用的"抗體"包括完整的免疫球蛋白分子及其片段，諸如Fab、 F (ab，)2和Fv，其能夠結合本發明多肽的抗原表位。典型地，抗原表 位的形成要求至少6、 8、 10或12個連續的胺基酸。然而，涉及非-連 續胺基酸的抗原表位可以需要更多的胺基酸，例如至少15、 25 .或50 個胺基酸。特異性地結合於本發明多肽的抗原表位的抗體可被應用在治療以 及在免疫化學試驗中，諸如Western印跡、酶聯免疫吸附，放射免疫 測定，免疫組織化學測定，免疫沉澱反應，或其它的本領域已知的免 疫化學試驗中。不同的免疫測定可用於鑑定具有目的特異性的抗體。 許多的竟爭性結合或免疫放射測定的方案是本領域公知的.這樣的免 疫測定典型地涉及免疫原和特異性地結合於該免疫原的抗體之間形成 複合物的測定。典型地，當應用免疫化學測定時，特異性地結合於本發明多肽的 抗體形成了比其它蛋白質產生的檢測信號至少高5-、10-或20倍的檢測 信號.優選地，在免疫化學測定中，特異性地結合於本發明多肽的抗 體沒有檢測到其它的蛋白質並且可從溶液中免疫沉澱本發明的多肽.本發明的多肽可被用來免疫哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、豚 鼠、猴或人，來產生多克隆的抗體。如果希望，本發明的多肽可共軛 結合於栽體蛋白，諸如牛血清清蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血蘭素上。 取決於宿主種類，不同的助劑可用於增強免疫學的應答.這樣的助劑 包括但不限於，Freund，s佐劑、礦物膠(例如，氫氧化鋁)和表面活 性物質(例如，溶血卵磷脂、複合多元醇、多聚陰離子、肽油乳化液、 鑰孔血蘭素和二硝基苯盼)。在應用的助劑中，BCG (卡介苗)和小 棒狀桿菌是特別有用的。可利用產生抗體分子的任意技術，通過在培養物中連續傳代細胞 系來製備特異性地結合於本發明多肽的單克隆抗體.這些技術包括但 不限於雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術和EBV雜交瘤技術(Kohler等，Nature 256:495-97,1985; Kozbor等，J. Immunol. Methods 81:3142,1985; Cote等，Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-30,1983; Cole 等，Mol. Cell Biol. 62:109-20,1984),此外，對此技術進行了改進來產生"嵌合的抗體"，可拼接小鼠抗體基因與人抗體基因來獲得具有合適的抗原特異性和生物活性的分 子(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55,1984; Neuberger 等，Nature 312:604畫08，1984; Takeda等，Nature 314;452誦54，1985)。單克隆及其它抗體也可被"人源化"來防止當患者被治療時設置免疫 應答抵抗抗體。這樣的抗體可充分地類似於直接在治療中使用的人抗 體的序列或可能需要改變一些關鍵殘基。齧齒動物抗體和人序列之間 的序列差異可通過個體殘基的位點定向誘變或通過對全部互補測定區 域進行評分來置換那些不同於人序列的殘基而被最小化.可選擇地， 利用重組方法來產生人源化抗體(參見，例如，GB21886MB).特異 性地結合於本發明多肽的抗體可含有部分或完全人源化的抗原結合部 位，如美國專利No. 5,565,332所公開的。可選擇地，利用本領域已知的方法改進單鏈抗體產生的技術來產 生特異性結合於本發明多肽的單鏈抗體。具有相關特異性的抗體，除 了具有顯著獨特型成的抗體外，可通過鏈重整由隨機組合的免疫球蛋 白文庫來產生(Burton, Proc. Na". Acad. Sci. 88:11120-23,1991 )'也可利用DNA擴增方法對單-鏈抗體進行構建，諸如PCR，利用 雜交瘤cDNA作為模板(Thirion等，Eur. J. Cancer Prev, 5:507-11,1996)。單鏈抗體可以是單-或雙特異性的，並且可是二價的或四價 的.四價的雙特異性的單鏈抗體被教導在，例如，Coloma & Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63,1997) ' 二價的雙特異性的單鏈抗體的構 建被教導在Mallender & Voss (J. Biol. Chem, 269:199-206,1994 )中。如下所述，利用手工的或自動的核苷酸合成來構建編碼羊鏈抗體 的核苷酸序列，通過標準的重組DNA方法克隆到表達構建體中，並導 入到細胞中來表達編碼序列。可選擇地，可以直接利用例如絲狀噬菌 體技術來產生單-鏈抗體(Verhaar等，Int. J. Cancer 61:497-501,1995; Nicholls等，J. Immunol. Meth. 165:81-91,1993 ),通過在淋巴細胞群體中活體內誘導產生，或通過篩選免疫球蛋白 文庫或在文獻中公開的高度特異性結合試劑的組來產生特異性結合於本發明多肽的抗體(Orlandi等，Proc. Natl, Acad. Sci. 86:38333-37，1989; Winter等，Nature 349:293-99,1991)。其它類型的抗體可被構建和治療性地使用在本發明的方法中 例 如，嵌合抗體的構建如WO 93/03151所公開的，獲自免疫球蛋白並且 其是多價的和多特異性的結合蛋白，諸如"二價的二聚抗體"也可被 製備(參見，例如WO94/13804),具有結合於本發明多肽的能力的人抗體也可由MorphoSys HuCAL⑧文庫鑑定如下。本發明的多肽可被塗敷在微量滴定板上並與 MorphoSys HuCAL Fab噬菌體文庫一起溫育。那些不結合於本發明 多肽的噬菌體-連接的Fabs可從平板上被衝洗掉，僅留下緊緊結合於本 發明的多肽上的噬菌體。結合的噬菌體可被洗脫，例如通過改變pH植 或通過與大腸桿菌一起洗脫並通過大腸桿菌宿主的轉染被擴增.這些 處理過程可重複一次或兩次來富集緊緊地結合於本發明多肽上的抗體 群體.來自富集池的Fabs然後被表達，純化，並通過ELISA測定進行 篩選。可通過本領域眾所周知的方法來純化本發明的抗體.例如，可通 過讓抗體流經本發明的多肽將被結合的柱而進行親合性純化。可因此 利用具有高鹽濃度的緩衝液從柱上洗脫結合的抗體.本發明的多肽由於具有刺激郎格罕氏島細胞體外分泌胰島素的能 力，並引起體內血糖的下降，可被用於治療糖尿病，包括I型糖尿病和 II型糖尿病(非胰烏素依賴型糖尿病)兩種。此治療也可延遲糖尿病 和糖尿病併發症的發病.多肽可被用來防止具有削弱的葡萄糖耐量的 受試者發展為H型糖尿病.可在本發明方法中利用本發明的化合物治 療或預防的其它疾病和病症包括青年人成熟期發病型糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 );潛在的成人隱匿性 自身免疫糖尿病(LADA) (Zimmet等，Diabetes Med. 11:299,1994 ); 削弱的葡萄糖耐量(IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care 22 (增刊1) :S5，1999;削弱的空腹葡 萄糖(IFG) (Charles等，Diabetes 40:796,1991 );妊娠期糖尿病(Metzger， Diabetes, 40:197,1991 );以及新陳代謝綜合症X.本發明的多肽也可用於肥胖症、動脈粥樣硬化疾病、高脂質血、 高膽固醇血症、低HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、冠心病、冠狀動脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾病的治療中；以及用於狼瘡、多囊卵巢綜合症、致癌作用和細胞增生、哞 喘、男性生殖問題、潰瘍、睡眠陣礙、脂類和碳水化合物代謝的素亂、 生理節奏的機能障礙、生長陣礙、能量動態平衡的紊亂、包括自身免 疫疾病(例如，系統性紅斑狼瘡)的免疫疾病，以及急性和慢性炎症 性疾病、膿毒性休克的治療中也是有效的.本發明的化合物也可用於治療與生理失調相關的，例如，生產脂 類累積細胞的細胞分化、胰島素敏感性和血糖水平的調節，其涉及， 例如異常的胰腺0 -細胞功能、胰島素分泌腫瘤和/或由於胰島素的自身 抗體、胰烏素受體的自身抗體或自身抗體，也即刺激胰腺P-細胞的而 產生的自身免疫低血糖，導致動脈粥樣硬化噬斑形成的巨噬細胞分 化、炎症性應答、致癌作用、細胞增生、脂肪細胞基因表達、脂肪細 胞分化、胰腺P-細胞量的減少、胰島素分泌、對胰烏素的組織敏感性、 脂肪肉瘤細胞發育、多囊卵巢疾病、慢性排卵停止、雄激素過多症、 黃體嗣產生、類固醇生成、細胞中的氧化還原電勢和氧化壓力、氧化 氮合酶(NOS)產生、增加的Y-穀氨醯基轉肽酶、過氧化氫酶、血漿 甘油三酯、HDL以及LDL膽固醇水平等.本發明的化合物也可用於本發明的方法中來治療糖尿病的次級起 因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care22 (增刊1) :S5，1"9).這樣的次級起因包括糖皮質激素過量、 生長激素過量、腎上腺髄質瘤和藥物誘導的糖尿病。可誘導糖尿病 的藥物包括但不限於樸鼠脲、煙酸、糖皮質激素、二苯乙內醯脲、 甲狀腺激素、P-腎上腺素試刑、a-幹擾素和用於治療HIV傳染病 的藥物.此外，本發明的多肽可用於治療哮喘(Bolin等，Biopolymer 37:57-66，1995;美國專利No. 5,677,419;表明多肽R3P0在松馳的豚鼠 氣管平滑肌中是活化的)；血壓過低誘導(VIP誘導血壓過低，心動 過速，以及哞喘患者的面部潮紅(Morice等，Peptides 7:279-280，1986; Morice等，Lancet 2:1225-1227,1983 );男性生殖問題(Siow等，Arch. Androl. 43 ( 1 ) :67-71，1999 );作為抗細胞程序死亡/神經保護藥物 (Brenneman等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 865:207-12,1998 );缺血期間 的心臟保護(Kalfm等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268 ( 2 ) :952-8,1994;Das等,Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308,1998，控制晝夜節律鍾及其 關聯的棄亂(Hamar等，Cell 109:497-508,2002; Shen等，Proc. Natl. Acad. Sci, 97:11575-80,2000)，最後作為抗潰瘍藥物(Timcel等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22,1998 )。本發明的多肽可單獨使用或與其它本領域技術人員公知的治療和/ 或化合物組合應用於糖尿病和相關失調的治療中.可選擇地，此處描 述的方法和化合物可被部分或完全地應用於組合治療中.本發明的多肽也可與其它已知的治療組合共同給藥用於糖尿病的 治療，包括PPAR激動劑、磺醯脲藥物、非-磺醯脲促泌劑、cc-葡糖苷 酶抑制劑、胰烏素敏化劑、胰烏素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化 合物、胰烏素和抗肥胖症藥物.此治療可以是在本發明的多肽給藥之 前、同時或之後給藥.胰島素包括長的和短的兩種作用形式和胰烏素 的製劑.PPAR激動劑可包括任意PPAR亞基或其組合的激動刑。例 如，PPAR激動劑可包括PPAR-a、 PPAR-y、 PPAR-5或兩個或三 個PPAR亞基的組合。PPAR激動劑包括，例如，rosiglitazone和 piogUtazone。磺醯脲類藥物包括，例如，優降糖、格列美脲、氯磺丙 脲和格列甲溱.當與本發明的多肽一起給藥時對治療糖尿病有用的a -葡糖苦酶抑制劑包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖.對治療糖尿 病有用的胰烏素敏化劑包括噻唑烷二鑭和非-噱唑烷二胡。當與本發明 多肽一起給藥對糖尿病治療有用的降低肝葡萄糖排出量化合物包括二 甲雙胍，諸如Glucophage和Ghic叩hage XR。當與本發明多肽一起對 治療糖尿病有用的胰島素促泌劑包括磺醯脲和非-磺醯脲藥物GLP-1、 GIP、 分泌素、nateglinide、 meglitinide、 repaglinide、優降糖、 glim印iride、氯磺丙脲、格列曱漆。GLP-1包括具有比天然的GLP-1 更長半衰期的GLP-1的衍生物，諸如，例如，脂肪酸衍生化的GLP-1 和exendin。在本發明的一個實施方案中，本發明的多肽與胰烏素促泌劑結合使用來增強胰腺e-細胞對胰島素促分泌素的敏感性。本發明的多肽也可與抗肥胖症藥物結合用於本發明的方法中。抗 肥胖症藥物包括p-3激動劑、CB-1拮抗劑、食慾抑制劑，諸如，例如， sibutramine ( Meridia )， 和脂肪酶抑制劑，諸如，例如，orlistat (Xenical)。本發明的多肽可與通常用於治療糖尿病病人的脂類紊亂的藥物結合用於本發明的方法中。此類藥物包括但不限於HMG-CoA還原酶抑 製劑、煙酸、膽汁酸螯合劑和纖維酸衍生物.本發明的多肽也可與抗 高血壓的藥物結合使用，諸如，例如，P-阻斷劑和ACE抑制劑。此種共-治療可以以兩種或多種藥物(例如，本發明的化合物與胰 島素敏化劑和抗肥胖症藥物結合)的任意組合給藥.此種共-治療可以 以如上所述藥物組合物的形式給藥。此處使用的不同的術語定義如下a當介紹本發明或其優選的實施方案的元件時，冠詞"一個""一 種""該"和"所述的"是指有一個或多個元素。術語"包含"、"包 括"和"具有"是指包括在內的，除了所列元素之外可能還有其它元素。此處使用的術語"受試者"包括哺乳動物(例如，人和動物).術語"治療"包括提供以直接或間接地改善受試者病症為目的醫 療救護，或減緩受試者的病症或紊亂的任意方法、作用、應用、治療 等，其中受試者包括人。術語"組合治療"或"共-治療"是指給藥兩種或多種治療藥物來 治療糖尿病病症和/或紊亂。此種給藥包括兩種或多種治療藥物以大體 上同時的方式共同-給藥，諸如在具有固定比率的活性成分的單個膠囊 中或在多個分離的各個抑制劑藥物的膠囊中。此外，這樣的給藥包括 以連續的方式使用每種類型的治療藥物.術語"治療有效的"是指每種藥物的給藥量，它將達到改善糖尿 病病症或紊亂嚴重程度的目標，而避免或最小化與所用治療方法相關 聯的不良副作用.術語"藥學上可接受的，，是指受試項目適於用在藥物產品中。基於公知的測定方法來測定哺乳動物中病症的治療效果，並且比 較這些結果與用於治療這些病症的已知藥物的結果，本發明多肽的有 效劑量可容易地被測定來用於每一目的適應症的治療。在這些病症之 一的治療中給藥活性成分(例如，多肽)的量可根據特定化合物的因 素和所使用的劑量單位、給藥的方式、療程、被治療患者的年齡且性 別、以及治療的病症的特性和程度而在很大程度上進行變化。給藥活性成分的總量通常可在大約0.0001 mg/kg到大約200 mg/kg 的範圍，並且優選地為0.01 mg/kg到大約200 mg/kg體重每天.單位劑量可包含從大約0.05 mg到大約1500毫克的活性成分，可以每天給藥 一或多次。通過注射，包括靜脈注射、肌內注射、皮下注射和非腸道 注射以及使用輸注技術給藥的每日劑量可以是從大約0.01到大約200 mg/kg。每天直腸給藥方案可以是從0.01到200 mg/kg總體重'透過皮 膚起作用的濃度可被要求保持日劑量從0,01到200 mg/kg.當然，每一患者的特異性的最初和連續的給藥方案依據診斷醫生 確定的病症的特性和嚴重程度、所用特異性多肽的活性、患者的年齡、 患者的飲食、給藥的時間、給藥途徑、藥物的排洩速度、藥物組合等 進行變化。本領域的技術人員可利用常規處理測試來確定所要的本發 明多肽的治療方式和劑量.本發明多肽可以在適當配製的藥物組合物中通過給藥於需要的患 者而實現所希望的藥理學作用。為了實現本發明的目的，患者為需要 進行特定的病症或疾病治療的哺乳動物，包括人。因此，本發明包括 包含藥學上可接受的栽體和治療有效量的多肽的藥物組合物。藥學上 可接受的載體是在活性成分的有效活性的濃度對患者相對無毒和無害 的，使得栽體的任何副作用不損害活性成分的有益作用的任意栽體。 多肽的治療有效量是對特定被治療的病症產生效果或影響的量.此處 描述的可與藥學上可接受的栽體一起給藥的多肽可被利用任何有效的 常規劑量單位形式給藥，包括，例如，立即釋放和定時釋放制刑、口 服、非腸道、局部地等等.為了用於口服，多肽可被配製到固體或液體制刑中諸如，例如， 膠囊、藥丸、片劑、錠劑、糖錠、熔化物、粉末、溶液、懸浮液或乳 濁液中，並且可按照本領域公知的生產藥物組合物的方法進行製備。 固體單位劑型可以是膠囊，其可以是普通的硬殼的或軟殼的凝膠類型包括，例如，表面活性劑、潤滑劑和惰性填料諸如乳糖、蔗糖、磷酸 鈣和玉米澱粉.在另一個實施方案中，本發明的多肽可以是具有常規片劑基質諸 如乳糖、蔗糖和玉米澱粉，與粘合劑諸如金合歡膠、玉米澱粉或凝膠 結合的片劑；在給藥後用於輔助片劑破裂和溶解的崩解劑諸如馬鈴薯 澱粉、藻酸、玉米澱粉和瓜耳豆膠；意欲提高片劑顆粒流動性和防止 片劑物質粘著到片劑塑模和壓力機表面的潤滑劑，例如，滑石粉、硬 脂酸或鎂、鈣或硬脂酸鋅；色素；著色劑；和意欲增強片劑美感特性使得它們更為患者接受的增味劑，用於口服液體劑型的合適的賦形 劑，包括稀釋劑諸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或 者不添加藥學上可接受的表面活性劑、懸浮劑或乳化劑。不同的其它 物質可以作為塗層或修飾劑量單元的外觀而存在。例如片劑、丸劑或 膠嚢可以塗有蟲膠、糖或兩者.
可分散性粉劑和顆粒適用於水懸浮液的製備。它們在混合物中提 供了活性成分與擴展劑或潤溼劑、懸浮劑和一或多種防腐劑。合適的 分散劑或潤溼劑和懸浮劑已在上文中舉例說明。也可存在其它的賦形 劑，例如，那些如上所述的甜味劑、調味品和著色劑。
本發明的藥物組合物也可為水包油乳化劑的形式，油相可以是有 機油，諸如液體石蠟或有機油的混合物。合適的乳化劑可以是(1)天
然存在的樹膠，諸如阿拉伯樹膠和黃蓍樹膠，(2)天然存在的礴脂， 諸如大豆和印碑脂，(3)獲自脂肪酸和己糖醇酸酐的醋或偏醋，例如， 單油酸山梨醇酐酯，和(4)所述偏酯與環氧乙烷，例如，聚環氧乙烷 單油酸山梨醇酐酯的縮合物。乳濁液也包括甜味劑和調味劑。
含油的懸浮液可以通過在植物油諸如，例如諸如，例如花生油、 橄欖油、芝麻油或椰子油中或在礦物油，諸如液體石蠟中懸浮活性成 分來配製.含油的懸浮液可包括增稠劑諸如，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨 蠟醇.懸浮液也可包括一或多種防腐劑，例如，乙基或正-丙基對鞋基 苯甲酸鹽； 一或多種著色劑； 一或多種調味劑；和一或多種甜味劑諸 如蔗糖或糖精。
糖漿和酏劑可以與甜味劑諸如，例如丙三醇、丙二醇、山梨糖醇 或蔗糖一起配製.這樣的製劑也可以包括緩和劑、防腐劑、調味劑和 著色劑。
本發明的多肽也可以以非腸道方式給藥，也即皮下地、靜脈內、 肌內注射或腹腔內，作為在生理可接受的稀釋液中化合物的可注射制 劑帶有一種藥物栽體，其可以是無菌液體或液體諸如水、鹽、含水葡 萄糖和相關糖液的混合物；醇諸如乙醇、異丙醇或十六醇；二醇諸如 丙二醇或聚乙二醇；甘醇縮酮，諸如2，2-二甲基一1，1-二氧戊環-4-甲醇， 酸諸如聚(乙二醇)400;油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油酯；或乙醯化 脂肪酸甘油酯，添加或者沒有添加藥學上可接受的表面活性劑諸如皂 或去垢劑、懸浮劑，諸如果膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素或乳化劑及其它的藥物助劑。
可用於本發明的非腸道製劑的油類的實例為石油，動物的、植物 或合成來源的，例如，花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉米油、橄 欖油、礦脂礦物油。合適的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。合 適的脂肪酸酯為，例如油酸乙酯和十四碳烷酸異丙酯。合適的皂包括 脂肪鹼金屬、銨和三乙醇胺鹽，合適的洗滌劑包括陽離子的洗滌劑，
例如，二甲基二烴基銨基離化物、烷基吡啶鹵化物和烷基胺乙酸鹽； 陰離子的洗滌劑，例如，烷基、芳基和烯屬磺酸酯，烷基、烯烴、醚 和單酸甘油醋硫酸鹽和己醋；非離子的洗滌劑，例如，脂肪胺氧化物、 脂肪酸鏈烷醇醯胺，和聚環氧乙烷聚丙烯共聚物；以及兩性的洗滌劑， 例如，烷基-P-氨基丙酸鹽和2-烷基咪唑啉季胺鹽，以及混合物.
本發明的非腸道組合物典型地可包括在溶液中的按重量計從大約 0.5%到大約25%的活性成分。防腐劑和緩衝液也可被方便地使用.為 了減少或消除對注射位點的刺激，此組合物可包括一種具有從大約12 到大約17的親水親油平衡(HLB)非離子型表面活性劑。此製劑中的 表面活性劑的量按重量計為從大約5%到大約15%的範圍。表面活性劑 可以是具有上述HLB的單一組分或可以是兩種或多種具有目的HLB 的組分的混合物.
在非腸道製劑中使用的表面活性劑的實例為聚乙烯山梨糖醇酐脂 肪酸醋，例如，單油酸山梨醇酐酯和環氧乙烷與疏水性基質的髙分子 量加合物，通過環氧丙烷與丙二醇縮合來形成，
藥物組合物可以是可注射的無菌的含水懸浮液的形式.此懸浮液 可以按照已知的方法配製，利用合適的分散劑或潤溼劑和懸浮劑諸 如，例如，羧甲基纖維素鈉、甲纖維素、羥丙基甲基-纖維素、海藻酸 鈉、聚乙烯吡咯烷嗣、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤溼劑，其 可以是天然存在的磷脂，諸如卵磷脂、烯化氧與脂肪酸的縮合物，例 如，聚環氧乙烷硬脂酸酯、環氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合物，例如， 十七亞乙基氧基十六碳烷醇、環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏 酯的縮合物，諸如聚環氧乙烷山梨糖醇一油酸，或環氧乙烷與獲自脂 肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的縮合物，例如聚環氧乙烷單油酸山梨醇酐 酯。
無菌的注射製劑也可以是一種在無毒的非腸道可接受的稀釋液或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液。可以使用的稀釋劑和溶劑為，例如，
水、Ringer，s溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌不揮髮油通常用作 溶劑或懸浮介質。為了實現這些目的，任何溫和的、不揮髮油可以被 使用，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸諸如油酸可以 使用在注射的製劑中.
本發明的組合物也可以用藥物直腸給藥的栓劑形式給藥.這些組 合物可以通過混合藥物(例如，多肽)與合適的非刺激賦形劑來製備， 其中的賦形劑在一般溫度下是固體，但在直腸溫度時是液體，並且因 此在直腸中融化來釋放藥物。此類物質是，例如，可可脂和聚乙二醇.
另一種用於本發明方法的製劑利用透過皮膚輸送裝置("貼")， 此種透過皮膚的貼可被用來以可控制的量提供持續的或不連續的本發 明化合物的浸入.用於輸送藥物的透過皮膚的貼的構建和使用是本領 域公知的(參見，例如，美國專利No, 5，023，252，引入在此作為參考). 此貼可以被構建來持續地、脈動地或在需要時輸送藥物.
通過機械輸送裝置將藥物組合物輸入給患者是希望的或必需的. 輸送藥物的機械輸送裝置的構建和使用是本領域公知的。例如，直接 給藥藥物到腦的直接技術通常涉及放置施藥導管到患者的腦室系統來 繞過血腦屏陣.這樣的植入輸送系統，用於輸送藥物到身體的特異性 解剖學區域，被描述在美國專利No.5，011，472中，引入在此作為參考。
根據需要或目的，本發明的組合物可包括其它常規的藥學上可接 受的配料成分，通常指栽體或稀釋劑。本發明的任意組合物可通過添 加抗氧化劑，諸如抗壞血酸或通過其它合適的防腐劑來防腐.以合適 的劑型製備此類組合物的常規方法可以被使用。
通常使用的可依據給藥途徑配製組合物藥物的組分包括酸化 劑，例如但不限於，乙酸、檸檬酸、延胡索酸、鹽酸、硝酸；和鹼化 劑諸如，但不限於，氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、單乙醇胺、氫氧化 鉀、硼酸鈉、碳酸鈉、氬氧化鈉、三羥乙基胺、三乙醇胺.
其它的藥物組分包括，例如但不限於，吸附劑(例如，粉末狀的 纖維素和活性炭)；氣霧劑推進劑(例如，二氧化碳、CC12F2、 F2C1C-CC1F2和CaF3);空氣置換劑(例如，氮氣和氬氣)；抗真菌 的防腐劑(例如，苯甲酸、對羥基苯甲酸丁醋、對鞋基苯甲酸乙酯、 對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉)；抗菌的防腐劑(例如，殺藻銨、氯化節乙氧銨、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁
醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化劑(例如，抗壞血 酸、抗壞血醯棕櫚酸酯、丁羥基大茴香醚、2，6-二叔丁基對甲苯酚、次 磷酸、單2-硫基乙醇、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、甲 搭合次硫酸氬鈉、焦亞硫酸鈉)；粘結材料(例如，嵌段聚合物、天 然和合成橡膠、聚丙烯酸酯、聚氨酯、矽樹脂和苯乙烯-丁二烯共聚物)； 緩衝劑(例如偏磷酸鍾、鱗酸二氫鉀、乙酸鈉、無水檸檬酸鈉和檸檬 酸鈉二水合物)；栽體(例如，阿拉伯膠糖漿、芳香族糖漿、芳香醯
劑、櫻桃糖漿、可可粉糖漿、橙皮糖漿、糖漿、玉米油、礦物油、花 生油、芝麻油、抑菌的氯化鈉注射液和抑菌的注射用水)；螯合劑(例 如乙二胺四乙酸二鈉鹽和乙二胺四乙酸)；著色劑(例如，FD&CRed No. 3， FD&CRedNo. 20， FD & C Yellow No. 6， FD & C Blue No. 2 ， D&CGreenNo.5， D & C Orange No. 5， D&CRedNo.8，焦糖和氧 化鐵紅)；澄清劑(例如，膨潤土)；乳化劑(但不限於，阿拉伯膠、 cetomacrogol、十六烷醇、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單油酸山梨醇酐 酯、聚乙烯50硬脂酸酯)；包被劑(例如，凝膠和鄰苯二甲酸醋酸纖 維素)；香料(例如，茴香油、肉桂油、可可粉、薄荷醇、橙油、薄 荷油和香草醛)；潤溼劑(例如，甘油、丙二醇和山梨糖醇)；研磨 劑(例如，礦物油和甘油)；油類(例如，花生油、礦物油、橄欖油、 花生油、芝麻油和植物油)；軟貪基質(例如，羊毛脂、親水性軟骨、 聚乙二醇油骨、礦脂、親水性的礦脂、白色油骨、黃色油奮和玫瑰水 油奮)；穿透增強劑(透過皮膚的輸送)(例如， 一羥基或多羥基醇、 飽和或不飽和的脂肪醇、飽和或不飽和的脂肪酸酯、飽和或不飽和的 二羧基的酸類、基本的油類、磷脂醯基衍生物、腦褲脂、硨烯、醯胺、 酸、酮和脲)；增塑劑(例如，鄰苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶劑(例 如，醇、玉米油、棉子油、甘油、異丙醇、礦物油、油酸、花生油、 淨化水、注射用水、無菌注射水和用於衝洗的無菌水)；增稠劑(例 如，十六烷醇、十六烷基醋蠟、微晶石蠟、石蠟、十八烷醇、白蠟； 栓劑基質(例如，可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活性劑(例 如，殺藻銨，nonoxynoU0、 oxtoxyno19、聚山梨酸酯80、十二烷基碗 酸鈉和聚山梨糖甘油一棕櫚酸酯)；懸浮劑(例如，瓊脂、膨潤土、 carbomers、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、高吟土、甲基纖維素、黃蓍膠和veegiim );甜味劑(例 如，天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露糖醇、丙二醇、糖精鈉、山梨糖 醇和蔗糖)；片劑防粘劑(例如，硬脂酸鎂和滑石粉)；片刑粘合劑 (例如，阿拉伯膠、海藻酸、羧甲基纖維素鈉、可壓縮的糖、乙基纖 維素、凝膠、液體葡萄糖、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷明和預膠凝 的澱粉)；片劑和膠囊稀釋劑(例如，二元的磷酸鈣、高嶺土、乳糖、 甘露糖醇、微晶纖維素、粉末狀的纖維素，碳酸鈣沉澱、碳酸鈉、砩 酸鈉、山梨糖醇和澱粉)；片劑包被劑(例如，液體狀葡萄糖、羥乙 基纖維素、羥基丙基纖維素、羥丙基曱基纖維素、曱基纖維素、乙基 纖維素、苯二甲酸醋酸纖維素和蟲膠)；片劑定向受壓賦形劑(例如， 二元的褲酸鈣)；片劑崩解劑(例如，海藻酸、羧甲基纖維素鈣、微 晶纖維素、polacriHin potassium、海藻酸鈉、澱粉乙醇酸鈉和澱粉)； 片劑助流劑(例如，膠態氧化矽、玉米澱粉和滑石粉)；片劑潤滑劑 (例如，硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、硬脂酸和硬脂酸鋅)；片劑/ 膠囊不透明劑(例如，二氧化鈦)；片劑拋光刑(例如，carnubawax 和白蠟)；增稠劑(例如，蜂蠟、十六烷醇和石蠟)；滲透劑(例如， 葡萄糖和氯化鈉)；增粘劑(例如，海藻酸、膨潤土、 carbomers、羧 曱基纖維素鈉、甲纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸鈉和黃蓍膠)； 以及潤溼刑(例如，十七亞乙基氧基十六碳烷醇、卵辨脂、聚乙烯山 梨糖醇一油酸、聚環氧乙烷山梨糖醇一油酸和聚環氧乙烷硬脂酸酯)。
此處描述的多肽可以作為單一藥物或與一或多種其它的藥物組合 給藥，其中組合用藥沒有產生不能接受的副作用。例如，本發明的多 肽可以與已知的抗肥胖症藥或已知的抗糖尿病藥或其它的指示劑等以 及其混合物和組合組合。
此處所述的多肽也可以以游離鹼形式或含在組合物中應用在研究 和診斷中，或作為分析參照的標準等。因此，本發明包括由惰性栽體 和有效量的通過在此描述的方法鑑定的化合物或其鹽或酯組成的組合 物。惰性栽體是不與化合物相互作用的傳送和提供栽體、運送方式、 主體、示蹤物質等到欲傳送的化合物的任何物質。化合物的有效量是 對進行的特定方法產生效果或影響的量。
已知多肽在舍水的和無水環境中發生水解、脫醯胺作用、氧化作 用、外消旋作用和異構化，降解諸如水解、脫醯胺作用或氧化作用可通過毛細管電泳容易地檢測.儘管有酶催降解，但是具有延長的血漿 半衰期或生物學駐留時間的多肽在水溶液中最少應該是穩定的.在體溫時， 一天時間內顯示出小於10%降解的多肽是必需的。在體溫時， 一天時間內顯示出小於5%降解的多肽是更優逸的。由於在慢性糖尿病 患者中的治療壽命，大量優選的這些藥物適宜於給藥，此外很少通過 非腸道路徑。在體溫時的一周期間內的穩定性(即小於較低的降解百 分比)將允許較少地頻繁給藥.在冷凍溫度時的在幾年中的穩定性將 允許製造商提供液體製劑，因此避免重建的麻煩.另外，在有機溶劑 中的穩定性將提供把多肽配製到新的刑型諸如植入物中，製劑適於皮下注射、靜脈注射、肌內注射等；合適的藥物栽體； 並且用於配製和給藥的技術是本領域公知的可用於製備的任意方法 (參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co" EastonPa"第20版，2000)。本發明將通過下文實施例進行進一步的說明，但其不應被理解為 以任何方式對本發明範圍的限制。膠嚢配方膠嚢製劑由下述物質製備而成本發明的多肽 澱粉 硬脂酸鎂10 mg 109 mg 1 mg將組分混合，通過合適的網篩，並填充到硬的膠囊中。 片劑配方片劑由下述物質製備而成:本發明的多肽微晶纖維素 膠體二氧化矽硬脂酸25 mg 200 mg 10 mg 5.0 mg47將組分混合併壓縮來形成片劑。可使用合適的含水和無水塗層以 增強適口性，提高雅潔性和穩定性或延遲吸收. 無菌的靜脲內注射溶液利用無菌的注射水製備本發明目的化合物的mg/mL溶液，並且如 果需要則調整pH值.將溶液用無菌的5%葡菊糖稀釋用於給藥，並且作為靜脈內注入給藥. 肌內注射懸浮液 製備下列的肌內注射懸浮液本發明的多肽 羧甲基纖維素鈉TWEEN 80氯化鈉苯甲醇懸浮液通過肌內注射給藥. 硬殼膠囊通過用150mg乳糖、50mg的纖維素和6mg的硬脂酸鎂的各種粉 末狀的活性成分填充標準的上下兩件的硬甘氨酸菌素膠囊來製備大量 的單位膠嚢。軟膠囊製備活性成分在可吸收的油諸如豆油、棉子油或橄欖油中的混合 物並通過正置換泵注射到熔化物凝膠中來形成包含活性成分的軟膠 襲。將膠囊洗滌並乾燥。可將活性成分溶於聚乙二醇、甘油和山梨糖 醇的混合物來製備水溶性的醫用混合物。立即釋放的片劑/膠嚢這些是通過常規的和新的方法製備的固體口服劑型。這些單位被 口服而不需水以用於藥物的快速溶解和輸送.將活性成分混合在包含 組分諸如糖、凝膠、果膠和甜味劑的液體中。通過冷凍乾燥和固態提 取技術將這些液體固化為固體片劑或錠劑。可以用粘彈性的和熱彈性 的糖和聚合物或發泡組分壓縮將藥物化合物來產生用於快速釋放而不 需水的多孔介質。50 pg/mL 5 mg/mL 4 mg/邁L 9 mg/mL 9 mg/m!v可以理解對本發明進行不脫離此處所述的本發明的精神或範圍的 改變和修飾對於本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。實施例為了使本發明能夠被更好地理解，下面對實施例進行了描述，這 些實施例僅僅用於解釋的目的，不應被理解為以任何方式對本發明範 圍進行限制.所有提及的出版物被整體引入作為參考。實施例1.肽合成方法設計本發明的多肽來提高這些肽的穩定性和延長其半衰期。特定地，這些肽的非突變形式(參見，例如，WO 01/23420,整體引入在此) 在水中和無水環境中顯示出N-末端水解、脫醯胺作用以及二聚化和三 聚化。為了提高穩定性和最小化水解作用、脫醯胺作用和二聚化/三聚 化，將天冬醯胺殘基(位置9和28)突變為穀氨跣胺殘基。此外，位 置17處的纈氨酸、位置19處的丙氨酸、位置29處的賴氨酸、位置30 處的精氨酸、位置31處的輅氨酸也被突變。此外，如下所述，本發明 的多肽也被聚乙二醇化來延長半衰期.下列的常規方法被用於合成本發明的一些多肽通過FMOC/叔丁基策略，在連續流動條件下利用Rapp-Polymere PEG-聚苯乙彿樹脂(Rapp-Polymere, Tubingen, Germany)進行肽的 合成(Pennington & Dunn, Peptide Synthesis Protocols, Volume 35,1994)。在合成完成後，從樹脂裂解肽並利用TFA/DTT/H20/三異 丙基矽烷(88/5/5/2)去保護。利用冷的二乙醚從裂解的混合物中沉澱 肽.將沉澱物用冷的醚沖洗三次，然後在冷凍乾燥之前溶於5%的乙 酸。通過反相色譜法在YMC-Pack ODS-AQ柱(YMC ， Inc., Wilmington, NC )上，利用具有3% TFA的水/乙腈作為從0%到100% 乙腈的梯度，和通過MALDI質譜法在VOYAGER DE (MALDI質譜 >|義，(5-2386-00型，PerSeptive BioSystems， Framingham， MA)來 校驗肽。以1/1比例將肽樣品被添加至基質援衝液(具有3% TFA的 50/50 (0320/乙腈)中，通過反相色錯法在Waters Delta Pr印4000 HPLC 系統(Waters Corporation, Milford， MA)上純化不滿足>95%的純度 標準的肽。實施例2,肽聚乙二醇化可通過將聚乙二醇(PEG)部分連接於肽由此降低肽被腎清除以 及減少肽的蛋白酵降解來增強肽在體內的半衰期。VPAC2受體激動劑 的應用受其非常短的體內半衰期的嚴重限制；然而，連接PEG部分與 肽(聚乙二醇化)延長了肽的半衰期，使其充分地允許一天一次至一 周一次的治療.聚乙二醇化可通過本領域公知的任何方法來進行.然而，在此實 施例中，通過將唯一的半胱氨酸突變引入到肽中，然後通過肽的巰基 和曱氧基-PEG-馬來酖亞胺試劑(Nektar (Inhale/Shearwater) ， San Carlos, CA)的巰基之間的穩定的硫醚鍵將半胱氨酸聚乙二醇化來聚 乙二醇化。優選地，在肽的C-末端導入唯一的半胱氨酸來最小化通過 聚乙二醇化導致的活性可能的減少。特定地，將兩倍摩爾的過量mPEGmal(MW22kD和43kD)試劑 添加給1毫克的肽(例如，在肽的C-末端具有半胱氨酸突變的SEQ ID NO:l)並在pH6溶於反應緩衝液中(0.1M磷酸鈉/0.1M NaCI/0.1M EDTA)。在室溫下0.5小時後，將反應用2倍摩爾的過量DTT對 mPEG-mal進行終止反應，肽-PEG-mal反應混合物被用於陽離子交換 柱來除去殘餘的PEG試劑，然後通過凝膠過濾柱來除去殘餘的游離 肽。通過SDS-PAGE和MALDI-TOF質譜法測定聚乙二醇化位點的純 度、質量和數目。當22kDPEG附著於本發明的舦時，有效的VPAC2 受體激活被保持.此外，VPAC2對VPAC1和PAC1的受體激活選擇 性也被保留。用較小PEG(例如，線性22 kD PEG)聚乙二醇化較小 地降低肽的活性是可能的，而大的PEG (例如，分支的43kD PEG) 將更可能地降低活性。然而，較大的PEG將進一步增強血漿半衰期， 4吏得一周一次的注射是可能的(Harris等，Clin. Pharmacokinet， 40:539-551,2001 ).實施例3.肽的克隆為了重組表達這些肽，將編碼肽的DNA序列在C-末端克隆到具有 分離單體的肽和GST的單因子Xa識別位點的穀胱甘肽S-轉移酶 (GST),通過雜交包含BamHI或XhoI限制性酶位點的兩個重疊的 單鏈DNA片段(70-90 mers )來合成編碼融合到肽的DNA序列的因子 Xa識別位點的基因，隨後克隆基因DNA序列的5'，然後通過DNA聚 合酶I (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)的大片段DNA合成相對的鏈。基於設計的各肽胺基酸序列的反向翻譯選擇各基因的DNA序列.在一些情況下，通過對上述方法製備的基因進行PCR突變 來產生編碼肽的基因(Picard等，Nucleic Acids Res 22:2587-91,1994; Sambrook等，Molecular Cloning:實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗 室出版社，紐約，1989).然後通過BamHI和XhoI降解雙鏈產物並 連接到也已用Bam HI和Xho I降解的pGEX-6P-l ( Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上。例如，為了表達作為與GST 的熔合物的SEQ ID NO:l，將設計的DNA序列(圖2 )克隆到pGEX-6P-l 中。實施例4.肽的重組表達和純化在371C培養用含質粒的GST-肽熔合物轉化的BL21細胞 (Stratagene， LaJoIla, CA)直至OD綱達到0.6至1.0，然後細胞用 ImM IPTG (Life Technologies, Carlsbad, CA )在37"C溫育兩小時。 在7700g離心細胞(2L) 15分鐘，稱重，並儲存在JOTC至少3小時， 將冷凍的細胞丸被重新懸浮在100 mL含有250 pL蛋白酶抑制劑混合 物(Sigma Chemical, St. Louis, MO) /克細胞的水冷PBS中，在3x 下超聲處理1分鐘15秒。然後在10,000 g離心細胞20分鐘.將上清液 與2 mL的50%穀胱甘肽瓊脂糖4B樹脂(Pharmacia )混合，在4TC振 蕩器上過夜。在1,500 g下離心上清液/樹脂15分鐘，填充到空的聚制 備性層析柱(Bio-Rad， Hercules, CA)中，用30mLPBS，然後用10 mL因子Xa緩衝液(1 mM CaC12, 100 mM NaCl，和50 mM Tris-HCl， pH8.0)衝洗。通過加入60單位的在1 mL因子Xa緩衝液中的因子Xa (Pharmacia)從柱裂解肽，在4TC溫育過夜，並通過C18 HPLC (Beckman System Gold)分離，利用2 mL環和2 mL/分4中的流速進行 下列的程序IO分鐘的緩衝液A (0.1%TFA/H20) ， 30分鐘的緩沖液 B (0.1%TFA/ACN)的梯度，10分鐘的緩衝液A， 10分鐘的梯度，和 10分鐘的緩衝液A。收集峰組分(每個1 mL)並通過10-20"/。 Tricine-SDS凝膠電泳篩選。收集含有閨1的肽的組分並乾燥。典型的 產量為幾百微克的游離肽/升大腸桿菌培養物。重組肽顯示與其合成形 式具有相同的活性.實施例5.從分散的大鼠小烏細胞分泌胰島素根據如下步驟測定由本發明的大量肽介導的分散的大鼠胰島的胰烏素分泌.利用膠原酶降解從SD大鼠(200-250g)分離的胰島。用胰 蛋白酶處理分散的胰烏細胞，接種到96孔V形底平板中，並進行粒狀 沉澱。然後在含有或者不含有本發明肽的培養基中過夜培養.對培養 基抽氣並在371C用含有3 mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES緩衝液 預培養細胞。除去預溫育緩衝液，並在37TC將細胞培養在含有或者不 含肽的合適葡萄糖濃度(例如，8 mM)的Krebs-Ringer-HEPES緩衝 液中達適當的時間。在某些研究中，也包括合適濃度的GLP-l.除去 一部分上清液並通過SPA測定其胰島素含量。結果用"對照的倍數" (FOC )來表示。在300 nM濃度時，具有SEQ ID NO:l+cys+PEG ( 43kD )的胺基酸序列的多肽使分散的胰烏細胞的胰島素分泌增加了大約 1.7倍(附困3)。在該分析中，分散的大鼠胰烏細胞分泌的胰烏素被確定為增加了 至少1.4倍.本發明多肽的VPAC2受體激動劑組分使分散的胰烏細胞 分泌的胰島素增加了至少1.4倍到約1.7倍 實施例6.聚乙二醇化肽對大鼠腹膜內葡萄糖耐量的作用通過對大鼠皮下給藥檢測本發明的聚乙二醇化肽的體內活性。給 禁食過夜的大鼠皮下注射對照或聚乙二醇化肽U-100網/kg) . 3小時 後，測定基礎血糖，並對大鼠腹膜內施用2 g/kg的葡萄糖.15、 30和 60分鐘後再次測定血糖。根據IPGTT (腹膜內葡萄糖耐量試驗)，本 發明的代表性聚乙二醇化肽相對於介質顯著地降低了血糖水平，葡萄 糖AUC減少了 17%-28% (附圖4)。這表明聚乙二醇化肽具有體內延 長的降低葡萄糖的活性。本發明的聚乙二醇化肽除了具有降低葡萄糖 的活性外，它也顯示出延長肽在體內的半衰期的活性。PACAP-27具有 非常短的體內半衰期(IO分鐘)。在肽給藥後3小時，本發明的聚乙 二醇化肽降低血糖的能力是在此時間點上在循環中存在所述肽的明顯 標誌並且由此相對於PACAP-27，具有延長的半衰期。實施例7, cAMP SPA將表達VPAC2肽的CHO細胞以8 x 104細胞/孔的濃度在96-孔平 板中塗板，並在37TC於aMEM、核苷、穀氨醯胺(Gibco/BRL， Rockville， MD) 、 5%FBS、 100 ( g/mL Pen/Strep， 0.4mg/mL潮黴素 和1.5mg/mL的遣傳黴素(Gibco/BRL)中生長24小時。除去培養基， 並用PBS清洗平板，用肽(於10 mM Hepes， 150 mM NaCl， 5 mM KC1，2.5mMCaCl2, 1.2 mM KH2P04， 1.2 mM MgS04， 25 mM NaHC03 ( pH 7.4 ) ， 1% BSA和100 !iM IBMX )在371C溫育細胞15分鐘，利用cAMP SPA直接篩選分析系統(Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Piscataway, NJ)測定細胞提取物中cAMP的量。按照試劑盒提供的 說明書確定裂解物中cAMP的量。利用Prizm軟體通過非線性回歸標 繪每個肽濃度產生的cAMP的量，並進行分析以確定每種肽的EC50。基於VIP設計本發明的多肽已經顯示出缺少在PAC1處的活性 (Vaudry等，Pharmacol. Rev, 52:269畫324，2000),因此，人們相信本 發明的多肽在PAC1處不具有明顯的活性。對本發明的代表性多肽的分析結果顯示於下表l中.確定為P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽都是VPAC2受體的有效激動劑，通過 內源肽PACAP-27激活受體來實現受體激活達到100%的最高水平。此 外，確定為P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽是選擇性的VPAC2受 體拮抗劑，具有對VPAC1非常弱的拮抗劑活性.PACAP-27是VPAC1 的有效拮抗劑.表l肽SEQ ID NO.VPAC2 EC50 ( nM)VPAC1 EC50 ( nM )PACAP-27SEQ ID NO:1160.090.35P5SEQ ID NO:l0.33232.5P7SEQ ID NO:57.81>1000P8SEQ ID NO:20.19130.5P12SEQ ID NO:l+ C-末端的Cys0.38>1000P12加22 kD PEG1.32>1000P12加43 kD PEG4.19>1000實施例8.藥物組合物-IV和SC製劑利用本領域公知的任一生產方法，用4mg的SEQIDNO:l的多肽 或具有4 mg多肽含量的當量的衍生的多肽和1L無菌鹽水製備無菌IV 注射製劑。高濃度的多肽可用於製備SC製劑。對於確定為SEQ ID NO:l的多肽或衍生的多肽而言，將4 mg的所述多肽溶於100 mL鹽水或 DMSO中，並在無菌小瓶無菌過濾後填充所述組合物. 實施例9.包括本發明肽的製劑的穩定性將實施例8描述的製劑放置於恆定穩定性小室中.定期取出樣品 通過毛細管電泳進行分析，所述毛細管電泳是檢測這些製劑中多肽降 解的最靈敏的方法。對多個峰面積求和，並用親本多肽的峰區域除以 峰面積總數(附圖5和6)。比值是純度％。因為新鮮多肽中存在雜質， 通過用不同時間點的純度除以初始純度來將純度改變標準化. 實施例IO.生成肽特異性抗體並通過EUSA測定肽 通過利用ABI433A肽合成儀合成本發明多肽的特異性片段而產生 本發明多肽的多克隆特異性抗體。然後從樹脂裂解肽，並在Beckman System Gold的分析和並製備性的HPLC體系上進行純化'透視MALDI質詳分光光度計系統用來鑑定正確的產物，利用冷凍乾燥器乾燥肽。 然後將肽(2 mg)通過Cys上的游離疏基基團結合到鑰孔血蘭素 (KLH)上。在第0、 14、 35、 56和77天免疫雌性紐西蘭白兔。在第0天用250 mg肽和完全的Feund佐劑皮下注射每隻兔子.隨後每隻兔子使用125 mg肽進行免疫，在第21天開始取血並在此後每隔21天連續取血。通 過將粗血清流過特異性肽親和純化柱進行抗肽抗體的純化。通過 ELISA測定抗體滴度。用特異於本發明肽的C-末端Morphosys F ( ab )抗體包被96-孔 Immulon4HBX平板並在41C溫育過夜，然後封閉平板防止非特異性結 合，然後將肽標準樣品(2500 ng/mL-160 pg/mL)稀釋在33%的血漿 中，並將樣品以l:3稀釋在緩衝液中，隨後在室溫下溫育1.5小時.清 洗後，將特異於本發明肽的多克隆N-末端抗體在平板上溫育1小時. 隨後添加辣根過氣化酶(HRP)-驢抗兔抗體，並將樣品和標準樣品溫 育1小時，用3，3，，5，5，-四甲基聯苯胺(TMB)溶液溫育後評估檢測並 在OD4S0處讀取平板(附圖7 )。可以通過本領域公知的體外、離體和體內分析完成本發明多肽的 活性檢測。例如，為了證明藥劑對治療糖尿病和相關紊亂，諸如X綜 合症、葡萄糖耐量削弱、禁食葡萄糖減少和血胰烏素增多；動脈粥樣 硬化病和相關紊亂，諸如高甘油三酯血症；以及肥胖症的效力，可以使用下列分析。測定血糖水平的方法對db/db小鼠(獲自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME )放 血(通過眼或者尾靜脈放血)並根據當量平均血糖水平進行分組。用 試驗多肽每日口服給藥(通過藥用栽體用填餵法) 一次，共14天.此 時，通過眼或尾角靜脈再次對動物放血並確定血糖水平。在所有情況 下，用GIucometer Elite XL ( Bayer Corporation, Elkhart, IN)測定葡萄糖水平.甘油三酯水平的測定方法對hApoAl小鼠(獲自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME ) 取血(通過眼或者尾靜脈取血)並根據當量平均血清甘油三酯水平進 行分組。用試驗多肽每日口服給藥(通過藥用栽體用填哏法) 一次， 共8天。然後經眼或尾角靜脈再次對動物取血並確定血清甘油三酯的 水平。在/斤有情〗兄下,矛J用Teclmicon Axon Autoanalyzer (Bayer Corporation, Tarrytown， NY)測定甘油三酯的水平，高密度脂蛋白膽固醇含量的測定方法為了確定血漿HDL-膽固醇含量，對hApoAl小鼠取血並根據當量 平均血漿HDL-膽固醇含量進行分組。給小鼠每日口服栽體或試驗多 肽，每日 一次，共7天，然後在第8天再次取血.利用Synchron Clinical System ( CX4 ) ( Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血漿的HDL陽 膽固醇。總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及葡萄糖水平的測定方法 在另一體內分析中，對肥胖猴取血，然後每日一次口服栽體或試驗多肽，歷時4周，然後再次取血'利用Synchron Clinical System (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血清的總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及葡菊糖。通過0 liver等，(Pr oc. Natl. Acad.Sci. USA 98:5306-5311,2001 )描述的核磁共振詳學分析脂蛋白亞類. 對心血管參數的影響的測定方法也進行心血管參數(例如，心率以及血壓)的評估。給SHR大鼠 每曰一次口服栽體或試驗多肽，歷時2周。利用Grinsell等，(Am.J. Hypertens. 13:370-375,2000)描述的尾-套箍方法測定血壓和心率。如 Shen等(J. Pharmacol, Exp, Therap. 278:1435-1443,1996)所述監控猴的血壓和心率。評估化合物對瘦弱過夜禁食的大鼠食物攝入減少(抑制食慾)的效果空腹-再餵養急性餵料分析本方案的目的是測定單劑量的未知化合物對瘦弱的過夜空腹大鼠 食物消耗的影響。空腹-再餵養大鼠模型常常用於肥胖症領域以鑑定可 能具有厭食作用的化合物.此動物模型已被成功用於鑑定和表徵正在 或者已被用於控制肥胖人體重的化合物的效果分布圖(參見，例如Balvet等，Gen. Pharmacol. 13:293-297,1982; Grignaschi等，Br. J, Pharmacol, 127:11卯-1194，1999; McTavish和Heel, Drug 43:713-733,1992; Rowland等，Life Sci. 36:2295-2300,1985 ),典型的研究包括平均體重約為280 g的60-80隻雄性大鼠(n=10/ 試驗組)，將大鼠關在控制溫度和溼度以及12/12光暗循環的標準動物 房內。將大鼠單獨飼養在具有網孔底板的懸挫籠中，連續給水和食物， 除非是研究空腹動物時。栽體試驗基於栽體試驗中大鼠的表現進行分組。在效果試驗前 的2和7天之間進行栽體試驗。黑暗期間(總共約16-18小時)對大鼠 過夜禁食.給動物0.5mL的去離子水，給藥後1小時，將預稱重的食 物瓶放回動物籠，允許大鼠進食l小時.l小時後，將灑落的物質放回 食物缸以確定消耗的食物量。將大鼠分配成組，使得1小時食物消耗 的平均值和平均值的標準誤差在組之間類似.效杲試驗在黑暗階段(總共約16-18小時)將大鼠禁食過夜。用 指定劑量的多肽處理動物。給藥後1小時，將預稱重的食物放回籠內。 返回食物後在30、 60、 90、 180和240分鐘時記錄食物攝入量。測定每個時間點的食物消耗量，將灑落的物質放回食物瓶，然後對食物瓶稱 重。測定每個時間點的食物消耗量.利用合適的統計分析確定處理組 之間的差異.評估化合物對肥胖Zucker fa/fa大鼠體重減少以及食物和耗水量 的效果長期餵料分析此方案的目的是測定未知化合物的長期給藥對肥胖Zucker fa/fa 大鼠體重以及食物和水耗量的影響，肥胖Zuckerfa/fa大鼠常常用於測定化合物在體重減少中的效果.這個動物模型已經成功地用於鑑定和 表徵正在或已經用於控制肥胖人體重的化合物效果分布圖(參見，例如，Al-Barazanji等,Obes Res. 8:317-323，2000; Assimacopoulos曙Jeannet 等，Am, J, Physiol. 260( 2 Pt 2 ):R278-283，1991; Dryden等，Horm. Metab. Res. 31:363-366,1999; Edwards和Stevens, Pharmacol. Biochem. Behav. 47:865-872,1994; Grinker等，Pharmacol. Biochem. Behav. 12:265-275,1980)。典型的研究包括平均體重約550 g的60-80隻雄性Zucker fa/fa (11=10/試驗組)。將大鼠關在控制溫度和溼度以及12/12光暗循環的 標準動物房內。連續進水和食物。將大鼠單獨飼養在具有格形地面的 大的大鼠鞋盒中。在記錄兩天體重的基線測定值和24-小時的食物和水 耗量前，使動物適應格形地面和用研究載體模仿劑量至少4天。基於 基線上他們的體重將大鼠歸於6-8個試驗組中的一個.設立分組使得平均體重的平均值和平均值的標準差類似.在LD/周期的黑暗階段前，每日通過填餵法給動物口服指定劑量的 多肽達預確定的天數(一般6-14天).在這時候測定體重、食物和水 耗量。在最後一天，通過吸入C02處死動物，並測定體重。可以通過利用這種長期的餵料分析來測定本發明的多肽對減輕或 控制體重的效果.所有上述說明書中提及的出版物和專利都在此處引作參考。對本 發明所述的組合物和方法的各種修飾和變化對本領域技術人員是顯而 易見的，只要不離開本發明的範圍和精神，雖然已經連同具體的優選 實施方案對本發明進行了描述，但是應該理解要求保護的所述的本發 明不應該受限於這種具體的實施方案，實際上，對於分子生物學或相 關領域技術人員而言顯而易見的實施本發明的上述方案的各種修飾應 在所附的權利要求的範圍之內，本領域技術人員僅僅利用常規實驗就 應該認識到或能夠確定本發明所述的具體實施方案的許多等價物。這 種等價物應該包括在下列權利要求中。
權利要求
1.一種選自SEQ ID NOs1至152及其功能性等價片段、衍生物和變體的多肽。
2. 編碼權利要求l的多肽序列的多核苷酸或其簡併變體。
3. —種含有權利要求2的多核苷酸的栽體.
4. 一種含有權利要求3的栽體的宿主細胞。
5. —種產生多肽的方法，包括a) 在適於所述多肽表達的條件下培養權利要求4的宿主細胞；和b) 從該宿主細胞培養物中回收所述的多肽-
6. —種純化的抗體，其特異性與權利要求l的多肽結合。
7. 根據權利要求l的多肽，其中所述的多肽選自SEQIDNOs:l、 2、 3、 4和5。
8. 根據權利要求1的多肽，其中所述的多肽選自SEQ ID NOs:115、 116、 117、 118和119。
9. 一種選自SEQIDNOs:154至264的多核苷酸.
10. —種藥物組合物，其包括治療有效量的權利要求1的多肽或其 功能性等價物片段、衍生物和變體以及藥學上可接受的栽體.
11. 根據權利要求10的藥物組合物，其中所述的組合物包括大約 2%到大約30%的DMSO和任選的選自丙二醇、二甲基甲醯胺、碳酸 亞丙基酯、聚乙二醇和甘油三酯的溶劑。
12. 根據權利要求10的藥物組合物，其中所述的多肽選自SEQID NOs:l、 2、 3、 4、 5、 115、 116、 117、 118和119。
13. —種藥物組合物，其包括治療有效量的權利要求l的多肽或其 功能性等價物片段、衍生物和變體以及藥學上可接受的栽體和一或多 種藥物。
14. 根據權利要求13的藥物組合物，其中所述的藥物選自PPAR 激動劑、磺醯脲藥物、非-磺醯脲促泌劑、oc-葡糖苷酶抑制劑、胰島素 敏化劑、胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰鳥素、抗 肥胖症藥物、HMG輔酵A還原酶抑制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑、纖維酸衍生物以及抗高血壓的藥物.
15. —種包括治療有效量的權利要求1的多肽或其功能性等價物 片段、衍生物和變體以及與其結合的惰性栽體的組合物。
16. —種治療糖尿病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
17. 根據權利要求16的方法，其中所述的糖尿病選自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期發病型糖尿病、成人隱匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
18. —種治療綜合症X的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權利要求1的多肽的步驟。
19. 一種治療與糖尿病相關的疾病的方法，包括給需要治療的受試 者給藥治療有效量的權利要求1的多肽的步驟。
20. 根據權利要求19的方法，其中所述的與糖尿病-相關的疾病選 自高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂紊亂、高甘油三酯血症和胰島素抗性'
21. —種治療糖尿病的方法，包括給需要治療的受試者給藥與一或 多種藥物組合的治療有效量的權利要求1的多肽的步驟.
22. 根據權利要求21的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動劑、 磺醯脲藥物、非-磺酖脲促泌劑、a-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化刑、 胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖症藥 物.
23. 根據權利要求22的方法，其中所述的糖尿病選自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期發病型糖尿病、成人隱匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
24. —種治療綜合症X的方法，包括給需要治療的受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
25. 根據權利要求24的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動劑、磺醯脲藥物、非-磺醯脲促泌劑、ot-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、 胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖症藥 物。
26. —種治療與糖尿病相關的疾病的方法，包括給需要治療的受試 者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權利要求1的多肽的步驟。
27. 根據權利要求26的方法，其中所述的與糖尿病相關的疾病選 自高血糖、血胰島素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊亂、高甘油三酯血症和胰島素抗性。
28. 根據要求27的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動刑、磺 醯脲藥物、非磺耽脲促泌劑、ot-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、胰 島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖症藥物。
29. —種治療糖尿病、綜合症X或與糖尿病相關的疾病的方法， 包括給需要治療的受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權 利要求l的多肽的步驟，其中藥物選自HMG輔酶A還原酶抑制劑、 煙酸、膽汁酸螯合劑、纖維酸衍生物和抗高血壓的藥物.
30. 根據權利要求29的方法，其中所述的與糖尿病相關的疾病選 自高血糖、血胰島素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂奮亂、高甘油三酯血症和胰島素抗性，
31. 根據權利要求21到30中任意一項的方法，其中將權利要求l 的多肽和一種或多種藥物作為單藥物劑量製劑給藥。
32. —種治療或預防糖尿病的次級起因的方法，包括給需要治療或 預防的受試者給藥治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
33. 根據權利要求32的方法，其中所述的次級起因選自糖皮質激 素過量、生長激素過量、嗜鉻細胞瘤和藥物誘導的糖尿病。
34. —種治療或預防糖尿病的次級起因的方法，包括給需要的治療 或預防受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權利要求1的 多肽的步驟.
35. 根據要求34的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動劑、磺 醯脲藥物、非-磺醯脲促泌劑、a-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、胰 島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰烏素和抗肥胖症藥物.
36. —種治療呼吸道疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
37. —種治療肥胖症的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有 效量的權利要求l的多肽的步驟。
38. —種調節食慾的方法，包括給需要調節食慾的受試者給藥治療 有效量的權利要求l的多肽的步驟.
39. —種治療心血管疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
40. —種治療或預防脂質和碳水化合物代謝疾病的方法，包括給需要治療或預防的受試者給藥治療有效量的權利要求1的多肽的步驟，
41. 一種治療睡眠障礙的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療 有效量的權利要求1的多肽的步驟.
42. —種治療男性生殖疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥 治療有效量的權利要求1的多肽的步驟.
43. —種治療生長疾病或能量穩態紊亂的方法，包括給需要治療的 受試者給藥治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
44. 一種治療免疫疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療 有效量的權利要求l的多肽的步驟。
45. —種治療自身免疫疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥 治療有效量的權利要求l的多肽的步驟.
46. —種治療急性和慢性炎症性疾病的方法，包括給需要治療的受 試者給藥治療有效量的權利要求l的多肽的步驟。
47. —種治療膿毒性休克的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權利要求l的多肽的步驟，
48. —種通過給受試者給藥權利要求1的多肽而以葡萄糖依賴性 的方式在受試者中刺激胰烏素釋放的方法.
49. 一種基因治療組合物，它包括與治療有效量的基因治療栽體組 合的權利要求2的多核苷酸.
50. 用於治療和/或預防糖尿病和與糖尿病-相關的疾病的權利要求 1的多肽。
51. 含有至少一種權利要求1的多肽以及至少一種藥學上可接受 的、藥學上安全的栽體或賦形劑的藥物。
52. 根據權利要求1的多肽在生產用於治療和/或預防糖尿病和與 糖尿病-相關的疾病的藥物中的應用.
53.用於治療和/或預防糖尿病的權利要求51的藥物.
全文摘要
本發明提供了新的在體內作為VPAC2受體激動劑的肽。這些胰島素促分泌的多肽顯示出當葡萄糖攻擊時比對照更為降低體內的血糖。本發明的多肽在製劑中也是穩定的並且具有長的半衰期。該本發明的肽為具有降低的內源胰島素分泌，尤其是II型糖尿病的患者提供了一種新的治療方案。具體地，本發明是一種選自VPAC2相關多肽或其功能性等價物的特異性組的多肽。本發明也提供了治療哺乳動物代謝疾病的方法，包括將治療有效量的胰島素促分泌肽給藥於所述哺乳動物。本發明也公開了製備本發明多肽的方法，包括重組的和合成的兩種。
文檔編號C07K14/705GK101405298SQ03816644
公開日2009年4月8日 申請日期2003年7月11日 優先權日2002年7月12日
發明者D·N·克爾納, J·惠蘭, M·L·杜馬斯, W·A·弗羅蘭德, 潘曉群, 煒 王, 王有章 申請人:拜爾藥品公司