全局轉錄機器的改造的製作方法

2023-10-20 11:29:47

專利名稱：：全局轉錄機器的改造的製作方法
技術領域：
：本發明涉及^tit全局轉錄機器以產生具有改進表型的^tit細胞。
背景技術：
：現在公認，許多重要細胞表型(從疾病狀態到代謝物過量產生)受到許多基因的影響。然而，由於載體構建和轉化效率的實驗限制，多數細胞及代謝改造方法幾乎完全依賴單基因的缺失或過表達。這些限制排除了同時研究多基因修飾，並將基因修飾研究局限在一次修飾一個基因的限制性順次方法中。美國專利5，686，283描述了由r/w^編碼的cr因子用於激活在細菌細胞中休眠或低水平表達的其他細菌基因表達的用途。然而，該專利未描述誘變cj因子以全局式地改變基因轉錄。美國專利5,200,341提供了鑑定為溫度敏感型r/w"基因抑制子的突變r"H基因，所述鑑定通iti^擇包含溫度敏感性基因的溫度抗性突變體菌林來實現。未進行細菌誘變，也未針對除溫度抗性以外的表型對抑制子菌林進行選擇。當在經修飾而表達異源蛋白質的其他細菌中加入突變體r/wH基因時，該異源蛋白質以更高的7jC平在該細菌中積累。美國專利6,156,532描述了通過引入編碼熱休克蛋白的基因和編碼CT因子的基因(f"H)來進行修飾的微生物，所述a因子特異性作用於熱休克蛋白基因，從而增強細胞中熱休克蛋白的表達量。該經修飾的微生物可用於產生發酵產物，如胺基酸。該微生物中使用的ct因子未突變。已通過改組細菌基因組而對微生物應用定向進化，用於鏈黴菌的抗生素(泰樂菌素)產生(Zhang等，A^"m，415，644-646(2002))以及乳桿菌的酸耐性(Patnaik等，說VtecA.20，707-712(2002))。這些方法不靶向任何特定基因的突變，而是使用原生質體融合來非重組地改組具有期望表型的菌林的基因組，然後選擇改進了期望表型的菌林。
發明內容本發明應用全局轉錄機器(globaltranscriptionmachinery)^it來產生具有改i^型的改造細胞。特別地，本發明涉及產生在整個基因組水平上具有不同啟動子偏好的突變細菌CT因子。通過引入突變CT因子得到的細胞具有快速且顯著的表型改進，如對有害培養條件的耐性或者改進的代謝物產生。結合定向進化的方法和概念，將突變體轉錄機器《1入細胞允許人們以高通量方式研究大大擴展的研究領域，這通過評估同時發生的多基因改變從而改進複雜的細胞表型來實現。特性(W.P.Stemmer,7Vfl似"370，389-91(1994))。最近，這些概念已在對啟動子活性文庫的檢索中延伸和應用到DNA的非編碼功能區，所述文庫跨越以不同度量衡量的寬強度動力學範圍(H.Alper,C.Fischer,E.Nevoigt，GStephanopoulos,iVarfSd102,12678-12683(2005))。然而，還沒有基於進化的方法涉及將系統性修飾全局轉錄機器作為改進細胞表型的手段。然而，詳盡的生物化學研究提示，給定啟動子序列的轉錄速率和體外偏好均可通過修飾細菌a因子上的關鍵瓶基來改變(D.A.Siegele，J.C.Hu，W.A.Walter,C.A.Gross,/Mo/5,》/206，591-603(1989);T.Garddla,H.Moyle,M.M.Susskind,/Mo/必,V/206，579-5卯(1989))。這些修飾的轉錄機器單元提供引入同時發生的全局轉錄水平變化的獨特機會，所述全局轉錄水平變化可能以非常複雜的方式影響細胞特性。根據本發明的一個方面，提供了用於改變細胞表型的方法。該方法包括突變編碼全局轉錄機器的核酸以及任選的其啟動子；在細胞中表達所述核酸以提供包含突變體全局轉錄機器的改造細胞；以及培養該^tit細胞。在某些實施方案中，所述方法還包括確定改造細胞的表型或者將改造細胞的表型與改造前細胞的表型進行比較。在另外的實施方案中，所述方法還包括重複誘變核酸以產生第n代改造細胞。在另一些實施方案中，該方法還包括確定第n代改造細胞的表型或者將第n代改造細胞的表型與任意先前世代^it細胞的表型或與改造前細胞的表型進行比較。在一些優選的實施方案中，重複誘變全局轉錄機器的步驟包括從^tit細胞中分離編碼突變全局轉錄機器的核酸以及任選的其啟動子、突變所述核酸以及將突變核酸引入另一細胞中。在某些實施方案中，所述細胞是原核細胞，優選細菌細胞或古細菌細胞。在這些實施方案中，所述全局轉錄機器優選為CT因子或抗CT因子。編碼a因子的核酸分子包括(ct7"基因、r/^F(o28)基因、wM(o38)基因、/7^H(0^)基因、r"7V(0"4)基因、r"五(一4)基因和/"/(ct19)基因。所述ct因子或抗(t因子可表達自表達載體。在另一些實施方案中，所述細胞是真核細胞。優選的真核細胞包括酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、幹細胞和真菌細胞。在某些實施方案中，一種或多種真核細胞包含在多細胞生物中或者形成多細胞生物。在一些實施方案中，所述核酸由組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子或細胞器特異性啟動子在細胞中表達。在另一些真核實施方案中，所述全局轉錄機器結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的啟動子。優選的全局轉錄機器包括TFIID或其亞基，如TATA結合蛋白(TBP)或TBP相關因子(TAF)(如TAF25)。編碼全局轉錄機器的核酸分子包括GAL11基因、SIN4基因、RGR1基因、HRS1基因、PAF1基因、MED2基因、SNF6基因、SNF2基因和SWI1基因。在另一些實施方案中，所述全局轉錄機器為核酸甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙醯化酶或組蛋白脫乙醯基酶。在某些實施方案中，所述全局轉錄機器表達自表達載體。一些實施方案中的所述核^1真核細胞的細胞器(優選線粒體或葉綠體)的核酸。所述核酸任選地為表達載體的一部分。某些實施方案中的所述核i^lL核酸集合(例如文庫)中的成員。因此，在一些實施方案中，本發明的方法包括將所述集合引入細胞。在另一些實施方案中，表達所述核酸的步驟包括將所述核酸整合i^因組，或者替換編碼內源全局轉錄機器的核酸。在某些實施方案中，所述核酸的突變包括核酸的定向進化，如通過易錯PCR進行的突變或者通過基因改組進行的突變。在另一些實施方案中，所述核酸的突變包括合成具有一個或多個突變的核酸。本發明中的核酸突變可包括一種或多種點突變和/或一種或多種截短和/或缺失。在本發明的一些實施方案中，所述一種或多種截短或缺失不會破壞或除去全局轉錄機器的啟動子結合區。在另一些實施方案中，所述突變全局轉錄機器表現出相對於未突變的全局轉錄機器來說提高的基因轉錄、相對於未突變的全局轉錄機器來說降低的基因轉錄、相對於未突變的全局轉錄機器來說提高的基因轉錄抑制和/或相對於未突變的全局轉錄機器來說降低的基因轉錄抑制。在另一些實施方案中，所述方法還包括對改造細胞選擇預定的表型。優選地，該選擇步驟包括在選擇條件下培養改造細胞和/或高通量測定個體細胞的表型。可根據本發明選擇多種表型。在一些優選的實施方案中，所i^型為對有害培養條件的耐性提高。這樣的表型包括溶劑耐性或有害廢物耐性，例如乙醇、己烷或環己烷；對工業培養基的耐性；對高糖濃度的耐性；對高鹽濃度的耐性；對高溫的耐性；對極端pH的耐性；對表面活性劑的耐性，對滲透脅迫的耐性以及對多種有害條件的耐性。在另一些優選的實施方案中，所W型為代謝物生產的提高。代謝物包括番茄紅素、乙醇、聚羥基丁酸酯(PHB)和治療性蛋白質，如抗體或抗體片段。在另一些優選的實施方案中，所W型為對有毒底物、代謝中間體或產物的耐性。有毒代謝物包括有機溶劑、乙酸鹽/酯、對羥基苯曱酸(pHBA)和it^達蛋白質。其他表型包括抗生素抗性和提高的凋亡抗性。在一些實施方案中，所述細胞包含在多細胞生物中。在這些實施方案中，優選的表型包括一種或多種生長特徵、世代時間、對一種或多種害蟲或疾病的抗性、植物中果實或其它部分的產生、一種或多種發育變化、一種或多種壽命變化、功能的獲得或喪失和/或更為健壯。所述方法中使用的細胞可在突變全局轉a器前對表型進行優化。在某些實施方案中，本發明的方法還包括鑑定改造細胞中基因表達的變化。優選使用核酸微陣列來測定基因表達的變化。才艮據本發明的另一方面，提供了用於改變細胞表型的方法。所述方法包括改變第一細胞中一種或多種基因產物的表達，所述基因產物是通過在第二細胞中檢測基因表達變化而鑑定的，其中第二細胞中基因表達的變化通過突變該第二細胞的全局轉^器而產生。在某些實施方案中，改變第一細胞中一種或多種基因產物的表達包括提高在第二細胞中提高的一種或多種基因產物的表達。在一些優選的實施方案中，通過向第一細胞引入一種或多種表達載體來提高所述一種或多種基因產物的表達，該表達載體表達所述一種或多種基因產物；或者通過提高一種或多種內源基因的轉錄來實現所述提高，該內源基因編碼所述一種或多種基因產物。在下文實施方案中，提高一種或多種內源基因的轉錄包括突變該一種或多種基因的轉錄控制(例如啟動子/增強子)序列。在另一些實施方案中，改變第一細胞中一種或多種基因產物的表達包括降低在改造細胞中降低的一種或多種基因產物的表達。優選地，通過向第一細胞中引入降低一種或多種基因產物表達的核酸分子(如siRNA分子或表達siRNA分子的核酸分子)來降低所述一種或多種基因產物的表達。在另一些實施方案中，通過突變編碼所述一種或多種基因產物的一種或多種基因或所述一種或多種基因的轉錄控制(例如啟動子/增強子)序列來降低一種或多種基因產物的表達。所述第二細胞中基因表達的變化優選使用核酸微陣列進行測定。在另一些實施方案中，所述第二細胞中基因表達的變化用於構建基因或蛋白質網絡的模型，該模型用於選擇所述網絡中一種或多種基因產物中的哪一種進行改變。一些實施方案中的全局轉錄機器包括多於一種核酸和/或多肽，或者由多於一種核酸編碼。本發明還提供通過前述方法產生的細胞。才艮據本發明的另一方面，提供了用於改變代謝物產生的方法。該方法包括根據前述任意方法突變產生所選代謝物的細胞中的全局轉g器，從而得到改造細胞，並分離所選代謝物的產量提高或降低的改造細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括培養所述分離的細胞，並從細胞或細胞培養物中回收所述代謝物。優選的代謝物包括番茄紅素、乙醇、聚羥基丁酸酯(PHB)和治療性蛋白質，如重組蛋白、抗體或抗體片段。在一些實施方案中，所述細胞為原核細胞，包括細菌細胞或古細菌細胞。在另一些實施方案中，所述細胞為真核細胞，包括酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、幹細胞和真菌細胞。下述某些實施方案中的全局轉錄機器由真核細胞細胞器(優選線粒體或葉綠體)的核酸編碼。根據本發明的另一方面，提供了包含多種不同核酸分子的集合(例如，文庫)，其中優選每個核酸分子種類編碼包含不同突變的全局轉錄機器。在一些優選的實施方案中，所述全局轉錄機器為a因子或抗CT因子。優選地，編碼cr因子的核酸為(cj7Q)基因、17wF(o38)基因、(o38)基因、^w及(o^)基因、r/wTV(o54)基因、(o24)基因或fecl(a19)基因。在另一些優選的實施方案中，所述全局轉錄機器結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III,或者結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的啟動子。優選地，所述全局轉錄機器為TFIID或其亞基，如TATA結合蛋白(TBP)或TBP相關因子(TAF),如TAF25。在另一些實施方案中，所述全局轉錄機器為核酸甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙醯化酶或組蛋白脫乙醯基酶。在某些實施方案中，所述核酸分子種類包含在表達載體中，優選由組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子或細胞器特異性啟動子表達。所W達載體優選包含多種不同的核酸分子種類，其中每種核酸分子編碼不同的全局轉錄機器。在另一些實施方案中，所述全局轉錄機器通過定向進化來進行突變，優選使用易錯PCR和/或使用基因改組來進行。全局轉錄機器中優選的突變為一種或多種點突變和/或一種或多種截短和/或缺失。在一些實施方案中，所述截短不包括全局轉錄機器的啟動子結合區。在另一些實施方案中，根據前述任意方法對所述細胞全局轉錄機器進行突變。在本發明的另一方面中，提供了包含前述核酸分子集合的細胞集合(例如，文庫)。在一些實施方案中，所述集合包括多種細胞，所述多種細胞中的每一種包含一種或多種所述核酸分子。所述細胞優選為原核細胞如細菌細胞或古細菌細胞或者真核細胞如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、幹細胞或真菌細胞。在另一些實施方案中，所述核酸分子整合進細胞的基因組，或者替換編碼內源全局轉錄機器的核酸。根據本發明的另一方面，提供了通過多輪突變產生的編碼全局轉錄機器的核酸。所述多輪突變優選包括定向進化，如通過易錯PCR進行的突變和/或通過基因改組進行的突變來實現的定向進化。在一些實施方案中，所述核酸編碼多種不同的全局轉錄機器種類。所述核酸優選編碼相同類型全局轉錄機器種類的多種不同形式。本發明還提供了由前述核酸編碼的全局轉錄機器。在本發明的另一方面，提供了包含(g端)區域4的截短的ct因子蛋白。根據本發明的另一方面，提供了用於對選定的廢品進行生物除汙(bioremediation)的方法。該方法包括才艮據前述任意方法突變細胞的全局轉錄機器以得到改造細胞；分離與未改造細JI^目比代謝更多量所選廢品的改造細胞；培養所分離的細胞；以及使所述改造細胞接觸所選廢品，從而提供對所選廢品的生物除汙。參照附圖和本發明的詳細說明，本發明的這些和另一些方面及其多個實施方案將更為明顯。圖l描繪了全局轉錄機器改造的基本方法。通過將改造的全局轉錄機器引入細胞而改變了轉錄組(transcriptome),並以全局方式改變基因表達水平。在本研究中，對細菌的cj因子70(由r/wD編碼)進行易錯PCR,以產生多種突變體。然後將所述突變體克隆進低拷貝表達載體中，在此期間由於存在近乎完整的內部限制酶位點而可能出現截短形式的CT因子。然後將該載體轉化進大腸桿菌中並基於期望的表型進行篩選。然後將分離的突變體進行後續輪次的誘變和選擇，以進一步改i^型。圖2顯示乙醇耐性(t因子突變體的分離。分離包含突變體ct因子的菌林,所述突變體(t因子對乙醇的耐性提高。圖2A:突變體因子的多輪定向進化對表型的總體增強。在乙醇濃度為0、20、40、50、60、70和80g/L時，通過計算與對照相比突變體倍增時間減少倍數的總和來評估總體增強(y軸)。至第三輪時，生長速率的改善似乎增量很小。圖2B:相對於先前鑑定的關鍵功能區，標出o70蛋白上突變的位置。第二輪餘變導致鑑定到了截短的因子，其僅包含該區域中先前兩個突變中的一個。圖2C:展示了第三輪突變體(紅色)和對照(藍色)菌林的生長曲線。第三輪突變體在所有測試的乙醇濃度下具有顯著提高的生長速率。圖2D:乙醇耐性突變體(t因子(天然的，SEQIDNO:17;第一輪，SEQIDNO:18;第二輪，SEQIDNO:19;第三輪，SEQIDNO:20)的^J^酸序列比對。圖3顯示針對另外表型的cr因子序列分析。圖3A:相對於先前鑑定的關鍵功能區域，標出o70蛋白區域乙酸鹽和pHBA突變體中的突變位置。絕大多數乙酸鹽突變體是全長a因子。所鑑定的pHBA突變體是截短的因子，預計其作為特定基因轉錄的抑制劑。圖3B:乙酸鹽耐性突變體a因子(天然的，SEQIDNO:17;Acl,SEQIDNO:21;Ac2,SEQIDNO:22;Ac3,SEQIDNO:23;Ac4，SEQIDNO:24;Ac5，SEQIDNO:25)的^J^^f列比對。圖3C:pHBA耐性突變體cr因子(天然的，SEQIDNO:17;pHBAl,SEQIDNO:26)的^i^,列比對。圖4描繪了具有己烷耐性ct因子突變體的分離菌林培養物的細胞密度。圖4還顯示最佳己烷耐性突變體Hex-12和Hex-18的序列。圖5顯示具有環己烷耐性ci因子突變體的分離菌,養物的細胞密度。圖6描繪了在逐漸提高的萘咬酸濃度下，抗生素抗性cj因子突變體的分離菌林培養物的細胞密度。圖7A-7D顯示培養所選菌林並測定其在15和24小時時的番茄紅素產生的結果，以及來自最優菌林的a因子突變體的序列。圖8是描繪在發酵期間與對照相比番茄紅素產生的最大增加倍數的點圖。圓的大小與增加倍數成比例。圖9舉例說明15小時後幾種目的菌林的番茄紅素含量。該圖將通過全局轉錄機器改造提供的改進與通過依次基因敲除的傳統菌林改進方法進行比較。在該實例中，全局轉^器^tit法在提高表型方面比一系列多基因敲除更加有效。另外，在預先改造菌林中實現了改進。圖10顯示了在葡萄糖基M養基中選擇PHB指數期提高的菌林。圖7A展示使用cj因子^IJ^得的多種菌林(紅色和黃色柱代表對照)的結果。圖7B展示從使用轉座子誘變獲得的隨機敲除文庫中所選菌林的結果。圖11描繪了在逐漸提高的SDS濃度下，SDS耐性cr因子突變體的分離菌林培養物的細胞密度，以及來自最優菌抹的CT因子突變體的序列。圖12顯示酵母中LiClgTME突變體的生長分析。通it^合成基^"養基中升高的LiCl水平下進行連續傳代培養來分離包含突變體r/25或化"5的菌林。顯示了16小時後突變體和對照菌林的生長量(以OD600來衡量)。在較低濃度LiCl下rfl/25突變體優於對照，而所述5^25突變體在較高濃度下更有效。圖13描繪了酵母中LiClgTME突變體的序列分析。突變顯示在顯示每個因子的關鍵功能組分的示意圖上。每種突變體僅具有單個胺基酸替換。圖14顯示酵母中葡萄糖gTME突變體的生長分析。通it^合成基本培養基中提高的葡萄糖水平下進行連續傳代培養來分離包含突變體r《/25或5^"5的菌株。此時，兩種蛋白質均在相似的濃度範圍內顯示出改進，其中SPT15顯示出最大的改進。圖15描繪了酵母中葡萄糖gTME突變體的序列分析。突變顯示在顯示各個因子的關鍵功能組分的示意圖上。每種突變體僅具有單個^酸替換，然而分離了若干另外的SPT15蛋白，其中一些包含許多突變。圖16顯示酵母中乙醇-葡萄糖gTME突變體的生長分析。通it^合成基本培養基中提高的乙醇和葡萄糖水平下進行連續傳代培養來分離包含突變體r《/25或5^5的菌林，並測定20小時時的生長。此時，SPT15蛋白遠遠超過TAF25突變體的影響。圖17描繪了酵母中乙醇-葡萄糖gTME突變體的序列分析。突變顯示在顯示各個因子的關鍵功能組分的示意圖上。發現每種突變體在DNA或蛋白質接觸的關鍵區域中包含若干單Jl^酸替換。發明詳述在所有的細胞系統(原核的和真核的)中，全局轉錄機器均負責控制轉錄組。在細菌系統中，cr因子在全局轉錄的組織中發揮關鍵作用，這通過致力於RNA聚合酶全酶的啟動子偏好來實現(R.R.Burgess,L.Anthony,Oor.O/wVi.Micn^/o/4,126-131(2001))。大腸桿菌(五sc/^nc似flco//)包含6種可替代的cj因子和一種主要因子ci7。(由基因r/wD編碼)。在蛋白質水平上，已在殘基區中對與啟動子位點及全酶的接觸進行了分析(J.T.Owens等，/WAS95，6021-6026(1998))。晶體結構分析以及大腸桿菌和另一些細菌中07(>的位點特異性誘變已證明了改變RNA聚合酶全酶的體外啟動子偏好的能力，其證據為報告基因轉錄的提高或降低(A.Malhotra，E.Severinova，S.A.Darst，CW/87,127-36(1996))。本發明開拓了產生在整個基因組水平上具有不同啟動子偏好的突變體a因子的能力。傳統的菌林改進範例主要依賴於依次產生單個基因修飾，並且常常不能達到全局的最高點。其原因是代謝情況是複雜的(H.Alper，K.Miyaoku，CiStephanopoulos,7V"f5/W"Aif23，612-616(2005);H.Alper,Y.-S.Jin,J.F.Moxley，Gf^ephanopoulos，M^"6五wg7,155-164(2005)),並且增量式或貪婪搜索算法(greedysearchalgorithm)無法揭示僅在所有突變同時引入時才有益處的合成突變體。另一方面，通過隨機誘變和選擇增強的抗體親合力、酶特異性或催化活性，蛋白質工程可迅速地改進適合性(E.T.Boder,K.S.Midelfort,K.D.Wittrup，戶/w胸/顛""75^91，10701-5(2000);A.Glieder，E.T.Farinas,F.H.Arnold,胸飾tecto/20,1135-9(2002)5N.Varadarajan,J.Gam,M.J.Olsen,GGeorgiou,B.L.Iverson,/Vw7V^/爿c^w/5W102,6855-60(2005))。這些實例中獲得顯著增強的重要原因是，這些方法能夠通過評估許多同時發生的突變來探測巨大的胺基酸組合空間。使用本發明，我們開拓了(17因子的全局調節功能，從而類似地引入多個同時的基因表達改變，並因此通過選擇負責改進的細胞表型的突變體來促進全細胞改造。本發明提供了用於改變細胞表型的方法。該方法包括突變編碼全局轉錄機器蛋白的核酸以及任選的其啟動子；在細胞中表達所述核酸，以提供包含突變的全局轉錄機器蛋白的改造細胞；以及培養所述改造細胞。本文使用的"全局轉錄機器"是調節多種基因轉錄的一種或多種分子。所述全局轉錄機器可以是通過與RNA聚合酶分子相互作用以及調節其活性來影響基因轉錄的蛋白質。所述全局轉錄機器還可以是改變細胞基因組轉錄能力的蛋白質(例如，甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙醯化酶和脫乙g酶)。另外，全局轉錄機器可以是改變多種基因轉錄的非蛋白質分子(例如小RNA(microRNA))。可用於本發明的全局轉錄機器包括細菌的CT因子和抗CT因子。編碼CT因子的基因的實例包括(編碼cr")、(編碼o28)、(編碼o38)、(編碼o32)、r/^7V(編碼a54)、r/w五(編碼CT24)和/"/(編碼cr19)。抗CT因子與C7因子結合，並控制其可用性，因此控制轉錄。在大腸桿菌中，抗a因子由(針對(j因子70)或^gM等編碼。可突變抗cr因子從而控制它們對正常細胞轉錄的影響。另外，可創造突變體CT因子與突變體抗CT因子新的配對，從而獲得細胞中對轉錄的其他控制。例如，可使用可誘導的啟動子表達抗CT因子，所述啟動子使得可調節地控制突變體CT因子所傳遞的表型。全局轉錄機器還包括結合真核RNA聚合酶(如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III)或者RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的啟動子，並且調節其活性的多肽。這樣的真核全局轉錄機器的實例包括TFIID或其亞基，如TATA結合蛋白(TBP)或TBP相關因子(TAF)如TAF25，以;SJl伸因子。來自酵母的其它實例包括GALll、SIN4、RGR1、HRS1、PAF1、MED2、SNF6、SNF2和SWI1。全局轉錄機器還包括改變染色體DNA轉錄能力的多肽，如核酸甲基轉移酶(例如DamMT、DNMT1、Dnmt3a)、組蛋白甲基轉移酶(例如Setl、MLL1)、組蛋白乙醯化酶(例如PCAF、GCN5、Sas2p以及其他MYST型組蛋白乙醯化酶、TIP60)和組蛋白脫乙醯基酶(例如HDAC1、HDA1、HDAC2、HDAC3、RPD3、HDAC8、Sir2p)，以;M目關因子(例如HDAC家族與mSin3A、Mi-2/NRD、CoREST/kiaa0071、N畫CoR和SMRT有關)。另一些全局轉錄機器由真核細胞細胞器(如線粒體或葉綠體)的核酸分子編碼。在許多情況下，對全局轉錄機器進行突變的過程將包括反覆產生多種全局轉錄機器突變，但這並不是必需的，因為甚至全局轉錄機器中的單個突變也能導致顯著的表型變化，如本文中所述。儘管本發明的方法通常通iW"全局轉錄機器進行突變以及之後將突變的全局轉錄機器引入細胞以產生^it細胞來進行，但也有可能突變內源全局轉錄機器基因，例如通過用突變體全局轉錄機器進#^換或者對內源全局轉錄機器進行原位突變來實現。本文使用的"內源"指對細胞而言是天然的；在對全局轉錄機器進行突變的情況下，"內源，，是指細胞中的全局轉^器基因。相反地，更典型的方法包括在細胞外突變全局轉錄機器基因，然後將該突變基因引入細胞中。所述全局轉錄機器基因可以屬於與所引入細J^目同的或不同的物種。例如，如本文所示，突變大腸桿菌cr因子70並引入大腸桿菌中，以改變大腸桿菌細胞的表型。也可以以同樣的模式應用大腸桿菌的其它全局轉錄機器。類似地，可以突變特定酵母物種(例如釀酒酵母(&"^v/wW)或裂殖酵母(X/mwi^))的全局轉錄機器並引入同樣的酵母物種中。同樣，可以使用標準重組遺傳技術以類似於本文所提供具體實施例的方式突變線蟲(例如秀麗隱杆線蟲(Cle/^"朋))或者哺乳動物(例如小鼠(M附wstw/msO、褐家鼠(J,fi(n^g/cws)或人(Esw//ms))的全局轉錄機器並引入同樣的物種中。或者，可以使用來自不同物種的全局轉錄機器，以提供基因轉錄控制中的其它變化。例如，可以突變鏈黴菌屬(5^印towj;c")細菌的全局轉錄機器並引入大腸桿菌中。不同的全局轉錄機器還可以來自生物的不同界或門。取決於所使用的突變方法，可以將相同的和不同的全局轉錄機器組合，以用於本發明的方法，例如通過基因改組來組合。任選地，可以誘變全局轉錄機器的轉錄控制序列，而非編碼序列本身。轉錄控制序列包括啟動子和增強子序列。然後，可將與全局轉錄機器編碼序列連接的突變啟動子和/或增強子序列引入細胞中。將突變體全局轉錄機器引入細胞產生改造細胞後，接著確定/測定改造細胞的表型。這可以通it^"改造細胞選擇具有(或不具有)特定表型來實現。以下有表型實例的詳細描述。還可通過將^b造細胞的表型與^tit前細胞的表型進行比較來確定表型。在一些優選的實施方案中，將全局轉錄機器的突變和突變體全局轉錄機器的引入重複進行一次或多次，從而得到"第n代"改造細胞，其中"n"是突變和引入全局轉^器的重複次數。例如，重複突變並引入全局轉錄機器一次(在全局轉錄機器最初的突變和引入之後)得到第二代改造細胞。再一次的重複得到第三代^tit細胞，依此類推。然後，對包含反覆突變的全局轉錄機器的細胞確定表型(或者與包含未突變的全局轉錄機器或之前重複的突變體全局轉泉機器的細胞進行比較)，如本文中別處的描述。反覆突變全局轉錄機器佳束型在連續突變步驟後得以改進，每個步驟可引起全局轉錄機器的多個突變。反覆誘變也有可能引起全局轉錄機器中的特定胺基酸殘基突變在反覆過程中"出現"或"消失"。在工作實施例中提供了此類突變的實例。在所述方法的典型用途中，通過突變編碼全局轉錄機器的核酸分子對全局轉錄機器進行定向進化。突變核酸分子的一個優選方法^1對編碼序列進##變，然後插入載體(例如質粒)中。儘管優選在插入載體之前突變編碼序列，但必要時該過程也可顛倒，即首先將核酸分子插入載體中，然後對序列進^fti秀變。當重複進行全局轉錄機器定向進化時(即在本發明的反覆過程中)，一種優選的方法包括從改造細胞中分離編碼突變體全局轉錄機器的核酸以及任選地其啟動子。然後突變所分離的核酸分子(產生編碼第二代突變體全局轉錄機器的核酸)，隨後引入另一細胞中。在突變時，所述分離的核酸分子形成包含不同突變或突變組的突變核酸分子集合。例如，當核酸分子在隨機突變時可包含沿核酸分子長度上一個或多個位置突變的突變組。因此，該組的第一成員可包^^核苷酸"7處的一個突變(其中"x代a示核酸分子的核普酸序列號，x是從分子的第一個至最後一個核苷酸的核苷酸位置)。該組的第二成員可包含核苷酸w2處的一個突變。該組的第三成員可包含核苷酸fL和W處的兩個突變。該組的第四成員可包含"4和"5位置上的兩個突變。該組的第五成員可包含三個突變核普酸W和fi5的兩個點突變以及核苷酸w6-"7的缺失。該組的第六成員可包含核苷酸w/、/i5和"S的點突變，以及3，端的核苷酸截短。該組的第七成員中核苷酸/i9-"M可能與核香酸w"-""發生了交換。本領域的普通技術人員可以容易地預期多種其它組合，包括隨機和定向突變的組合。所述核酸分子的集合可以是核酸文庫，如插入載體中的許多不同的突變核酸分子。這樣的文庫可根據分子生物學的標準方法貯存、複製、等分和/或引入細胞以產生^Ut細胞。用於定向進化的全局轉錄機器突變優選是隨機的。然而，也可以限制全局轉泉^器中所引入突變的隨機性，以產生全局轉^器的非隨機或部分隨機突變或者這些突變的某種組合。例如，對於部分隨機突變，突變可局限在編碼全局轉錄機器的核酸分子中的某個部分。可基於期望的突變類型來選擇突變方法。例如，對於隨機突變，可4吏用諸如核酸分子的易錯PCR擴增的方法。可使用定點誘變在核酸分子的特定核苷酸處引入特定突變。可使用合成核酸分子來引入特定的突變和/或隨機突變，後者位於一個或多個特定核香酸處，或者跨越整個核酸分子的長度。合成核酸的方法在本領域是公知的(例如，Tian等，A^i似^432:1050-1053(2004))。可使用DNA改組(也叫作基因改組)通過交換核酸分子區段來引入其它突變。參見如美國專利6,518,065、相關專利及其引用的參考文獻。用作改組源材料的核酸分子可以是編碼單一類型的全局轉錄機器(例如a")或者多於一種類型的全局轉錄機器的核酸分子。例如，可以改組編碼不同全局轉錄機器的核酸分子，如單一物種的不同a因子(例如，大腸桿菌的ct"和o28)，或者來自不同物種的d因子。同樣地，可以改組編碼不同類型全局轉錄機器(例如a因子70和TFIID)的核酸分子。突變核酸分子(以隨機或非隨機的方式)的多種其它方法是本領域普通技術人員公知的。可以組合地使用一種或多種不同方法，以在編碼全局轉錄機器的核酸分子中產生突變。在這方面，"組合地"指不同類型的突變組合在單個核酸分子中，並且分配到核酸分子組中。不同類型的突變包括點突變、核苷酸截短、核苷酸缺失、核普酸添加、核苷酸替換和核苷酸區段的改組(例如，再分配)。因此，任何單個核酸分子可包含一種或多種類型的突變，並且它們可以隨機地或非隨機地分配到核酸分子組中。例如，核酸分子組可以包含該組中每個核酸分子共有的突變，以及不為該組中每個核酸分子共有的數量可變的突變。例如，所述共有的突變可以AiC現對細胞的期望^ut^型有利的突變。優選地，所述一種或多種截短或缺失不破壞或除去全局轉錄機器的啟動子結合區域。相對於未突變的全局轉錄機器，所述突變的全局轉錄機器可表現出提高或降低的基因轉錄。另外，相對於未突變的全局轉錄機器，所述突變的全局轉錄機器可表現出提高或降低的基因轉錄抑制。本文使用的"載體，，可以是許多核酸中的任意一種，所述核酸中可通過限制性處理和連接而插入期望序列，用於在不同的遺傳環境之間進行運輸或者用於在宿主細胞中表達。載體通常由DNA組成，然而RNA載體也是可用的。載體包括但不限於質粒、噬菌粒、病毒基因組和人工染色體。克隆載體是能夠自主複製或整合進宿主細胞基因組的載體，並且其特徵還在於一個或多個核酸內切酶限制性位點，該載體可在所述位點處以可確定的方式切割，並且目標DNA序列可連接進所述位點處，從而新的重組載體保持其在宿主細胞中複製的能力。對於質粒而言，由於質粒在宿主細菌中拷貝數增加，所以目的序列可發生多次複製，或者在每個宿主中僅在宿主通過有絲分裂複製前發生一次。對於噬菌體而言，複製可在溶胞階段期間主動發生，或者在溶原階段期間被動發生。表達載體是這樣的載體，其中可通過限制性處理和連接插入期望DNA序列，從而其與調節序列有效連接，並可表達為RNA轉錄物。載體還可包含一個或多個標記序列，其適於鑑定被或未被該載體轉化或轉染的細胞。標記包括如編碼提高或降低對抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白質的基因、編碼活性可通過本領域已知的標準測定進行檢測的酶(例如，P-半乳糖普酶、螢光素酶或鹼性磷酸酶)的基因以及以可見方式影響轉化或轉染的細胞、宿主、菌落或菌斑的表型的基因(例如，綠色螢光蛋白)。優選的載體是能夠自主複製和表達結構基因產物的載體，所述結構基因產物存在於與載體有效連接的DNA區段中。如本文使用的，當以將編碼序列的表達或轉錄置於調節序列的影響或控制之下的方式共價連接時，編碼序列和調節序列稱為"有效"連接。如果期望編碼序列翻譯為功能蛋白，那麼如果誘導5，調節序列中的啟動子導致編碼序列轉錄，並且如果兩個DNA序列間連接的性質不會(1)導致引入移碼突變、(2)幹擾啟動子區域指導編碼序列轉錄的能力或者(3)幹4^f目應的RNA轉錄物翻譯成蛋白質的能力，則兩DNA序列稱為有效連接。因此，如果啟動子區域能夠影響DNA序列的轉錄從而得到的轉錄物可翻譯成期望的蛋白質或多肽，則所述啟動子區將是與編碼序列有效連接的。序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特別地，這樣的5'非轉錄調節序列將包括啟動子區，所述啟動子區^^有控制有效連接基因轉錄的啟動子序列。如有必要，調節序列還可包括增強子序列或上遊激活子序列。本發明的載體可任選地包括5，前導或信號序列。選擇和設計合適的載體在本領域普通技術人員的能力和判斷力之內。包含所有表達必要元件的表達載體是市售的，並為本領域技術人員所公知。參見如Sambrook等，Mo/ecu/"rC7ow/"g.'J1fl^mto/jMflww"/,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989。通過向細胞中引入編碼CT抗原多肽或其片段或變體的異源DNA(RNA)來遺傳^tit所述細胞。所述異源DNA(RNA)置於轉錄元件的有效控制下，從而允許該異源DNA在宿主細胞中表達。用於在哺乳動物細胞中表達mRNA的優選系統為例如pRc/CMV或pcDNA3.1(可從Invitrogen，Carlsbad,CA獲得)，其包^l^擇標記如G418抗性基因(便於選#^、定轉染細胞系)以^A巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子序列。另外，適於在靈長類或犬類細胞系中表達的載體是包含EB病毒(EBV)複製起點的pCEP4載體(Invitrogen)，其有助於維持質粒作為多拷貝染色體外元件。當編碼突變全局轉錄機器的核酸分子在細胞中表達時，可使用多種轉錄控制序列(例如啟動子/增強子序列)指導全局轉錄機器的表達。所述啟動子可以是天然啟動子，即該全局轉錄機器的啟動子，其提供對全局轉錄機器表達的正常調節。所述啟動子還可以是廣^^達的啟動子，如P-肌動蛋白、泛素B、噬菌體的啟動子或者巨細胞病毒啟動子。本發明有用的啟動子還可以是不廣a達全局轉錄機器的啟動子。例如，可以使用組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子或細胞器特異性啟動子在細胞中表達全局轉錄機器。還可使用多種條件啟動子，如受分子存在與否控制的啟動子，如四環素應答啟動子(M.Gossen和H.Bujard，7V#5W(75^4,89，5547-5551(1992))。可使用本領域標準的方法和技術將編碼突變全局轉錄機器的核酸分子引入細胞或多種細胞中。例如，可通過多種轉染方法引入核酸分子轉導、電穿孔、粒子轟擊、注射(包括細胞的顯微注射以及向多細胞生物注射)、脂轉染、用於YAC(酵母人工染色體)的酵母原生質球/細胞融合物、用於植物細胞的農桿菌介導的轉化等。表達編碼突變全局轉錄機器的核酸分子還可通過將該核酸分子整合進基因組或者通過替換編碼內源全局轉錄機器的核酸序列來實現。通過突變全局轉錄機器提供了新的組合物，包括通過多輪突變產生的編碼全局轉錄機器的核酸分子。多輪突變可包括定向進化，其中每輪突變之後是選擇過程，以選擇具有期望表型的突變全局轉錄機器。突變和選擇突變全局轉錄機器的方法在本文中其他處描述。還提供了利用這些核酸分子得到的全局轉錄機器。在某些情況下，已發現突變的全局轉錄機器是截短形式的未突變全局轉錄機器。特別地，對於cy因子70來說，已發現僅保留a"蛋白羧基端的a"氨基端截短為所引入的細菌提供了有利的表型。因此，提供了全局轉錄機器的片段，尤其是保持啟動子結合特性的未突變全局轉錄機器片段，更優選包含區域4的a70片段。還提供了編碼截短的全局轉錄機器的核酸分子，包括包含在載體和/或細胞中的核酸分子。用於本發明的細胞包括原核細胞和真核細胞。原核細胞包括細菌細胞和古細菌細胞。真核細胞包括酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、幹細胞和真菌細胞。真核細胞可包含在例如多細胞生物的一部分或整體中。多細胞生物包括哺乳動物、線蟲如秀麗隱杆線蟲(C^"w/m^//^e/egflws)、植物:i口4以南芥(y4ni6iV/o/7s/s^A//flfifl)、家蠶(fio附^vx附on')、非洲爪蟾(/"ev/s)、斑馬魚(Daw,VrenV)、海膽和果竭(Dwsc^A//"細菌的實例包括埃希氏菌(五sc/^n'c似"spp.)、鏈黴菌(^repto附^cesspp.)、發酵單胞菌(Z戸卵flsspp.)、醋桿菌(^4c"Mfl"wspp.)、杼檬酸桿菌(C/加6"cterspp.)、集胞藍細菌(S"ec/^);對/sspp.)、根瘤菌(及/wio6/M附spp.)、梭菌(C7os/nVZ/w附spp.)、^"軒菌(C^OTie6flcten'M/fispp.)、鏈球菌(iS^ptococcMSspp.)、黃單胞菌(X"w幼o附卵flsspp.)、孝L桿菌(lac似6""7/"sspp.)、專L球菌(spp.)、芽孢桿菌(5""7/"sspp.)、產械菌(spp.)、假單胞菌(/^"柳owttsspp.)、氣單胞菌(^4柳腳wasspp.)、固氮菌(Jz幽6fl"erspp.)、從毛單胞菌(CV附fl附wi"sspp.)、分枝軒菌(T^;a^flcter/w附spp.)、紅球菌(及/w^cocciwspp.)、葡糖桿菌(G7"cowo6flcterspp.)、雷爾氏菌(及fl/stow/"spp.)、JciV/iY/wV^a"'/^spp.、小月菌(M/cro/MWfl似sspp.)、G^6""erspp.、G^6fl"7/wsspp.、節桿菌(Jw/in^"c^spp.)、黃軒菌(F/flw6fl"m'M/fispp.)、沙雷氏菌(iS^mift'"spp.)、糖單抱菌(5ViccAflro(/7o/"/wmspp.)、棲熱菌(T7re簡wsspp.)、寡養單胞菌(5te朋加//r柳o/iflSspp.)、色軒菌(Orro附o6flcten'"附spp.)、中華才艮瘤菌(5iViw/i/zo6/"附spp.)、糖多孢菌(5ViccAflro/wfys/wnispp.)、農軒菌(v4gn^flcter/"/wspp.)和泛菌(spp.)。古菌(也稱為古細菌)的實例包括甲基單胞菌(AfW/^/wiKmflsspp.)、石克^ffc葉菌(spp.)、曱《&#菌(M^/^/^fl"w'"附spp.)、鹽桿菌(好(a/MflcteW"附spp.)、甲烷桿菌(M^/umo^ctenV/附spp.)、曱烷球菌(臉幼朋0cwc/spp.)、甲烷嗜熱菌(臉幼做o/;jT/spp.)、古生球菌(v4fr/rfl^^/"6usspp.)、鐵球菌(jFemg/o6wsspp.)、熱原體(T7re環o/;/fl柳她spp.)和熱球菌(7Zre簡c^c"'spp.)。酵母的實例包括酵母菌(5Vicc/iflnwij;c^spp.)、裂殖酵母(iSc/i/zasflcc/iflfw^cesspp.)、畢赤酵母(iVcAiVispp.)、法夫酵母(Pflj^"spp.)、克魯維酵母(f/wj;vmii^cesspp.)、假絲酵母(CVmrf,V/"spp.)、r"/flfwwj^"spp.和德巴利酵母(De6flf^o附j;cesspp.)。真菌的實例包括麴黴(Jsp^g///Msspp.)、青黴菌(spp.)、錄刀菌(Fmsw"'w附spp.)、根黴(i/r/^Y7MSspp.)、頂抱黴(JcmM卵/w挑spp.)、脈孢菌(7Vew簡/wnispp.)、糞殼菌(5Wn/肌Vispp.)、稻痘菌(Mag""/wr幼espp.)、異水黴(^4//wiy;cesspp.)、黑粉菌(C/幼7吸ospp.)、葡萄孢菌(必0外他spp.)和木黴(7Wc/wflfe簡flspp.)。昆蟲細胞的實例包括草地貪夜蛾(S/w^/^m/n^i》ento)細胞系如Sf9和Sf21、果蠅細胞系如Kc、Ca、311、DH14、DH15、DH33P1、P2、P4和SCHNEIDER-2(D.Mel-S2)和舞毒蛾(Zj;附"w加Virf/sp""細胞系如652Y。哺乳動物細胞的實例包括原代細胞如幹細胞和樹突細胞，以及哺乳動物細胞系如Vero、HEK293、Sp2/0、P3UI、CHO、COS、HeLa、BAE-1、MRC-5、NIH3T3、L929、HEPG2、謂、U937、HL60、YAC1、BHK、ROS、Y79、Neuro2a、NRK、MCF國IO、RAW264.7和TBY-2。幹細胞系包括hESCBGOl、hESCBG01V、ES-C57BL/6、ES國D3GL、Jl、Rl、RW.4、7AC5/EYFP和Rl/E。另外的人類幹細胞系包括(NIH命名)CHOl、CH02、GEOl、GE07、GE09、GE13、GE14、GE91、GE92、SA19、MBOl、MB02、MB03、NCOl、NC02、NC03、RL05、RL07、RLIO、RL13、RL15、RL20和RL21。全局轉泉機器的定向進化產生^tit細胞，其中一些具有改變的表型。因此，本發明還包括選擇具有預定表型的改造細胞。可通it^選擇條件下培養所述改造細胞來選擇預定表型。還可通過高通量測定個體細胞的表型來選,定表型。例如，可在細胞中對有害條件的耐性和/或代謝物產生的提高進行選擇。耐性表型包括耐受溶劑如乙醇、有機溶劑如己烷或環己烷；耐受有毒代謝物如乙酸鹽/酯、對羥基苯曱酸(pHBA)、對羥基肉桂酸、羥基丙醛、M達的蛋白質、有機溶劑和免疫抑制分子；耐受表面活性劑；耐受滲透脅迫；耐受高糖濃度；耐受高溫；耐受極端pH條件(高或低)；抗凋亡；耐受有毒底物如有害廢物；耐受工業培養基；提高抗生素抗性等。實施例中示例了對乙醇耐性、有機溶劑耐性、乙酸鹽/酯耐性、對羥基苯甲酸耐性、SDS耐性和抗生素抗性的選擇。在其它一些實施例中，示例了對提高的番茄紅素和聚羥基丁酸酯產生的選擇。在酵母細胞的實施例中，示例了對高糖(葡萄糖)耐性、滲透脅迫(LiCl)耐性和對高葡萄糖和乙醇濃度的多重耐性的選擇。還任選擇多細胞生物所表現另一些表型。可將全局轉錄機器的突變體引入哺乳動物或其它真核細胞系中，或者甚至引入完整生物中(例如，通過引入生殖細胞系或注射進卵母細胞中)，以允許篩選表型。這些表型可以在生物的單細胞中表現或不在生物的單細胞中表現，並包括一種或多種生長特徵、世代時間、對一種或多種害蟲或疾病的抗性、果實或其他植物部分的產生、一種或多種發育變化、一種或多種壽命變化、功能的獲得或喪失、健壯性提高等。涉及包含突變全局轉錄機器的改造細胞時，本文使用的"耐性"指與未改造細胞或先前^tit的細船目比，所述^tit細胞能夠承受有害程度更高的務fr。例如，所述未^tii或先前改造的細胞是"子代，，&造細胞的"親本"，或者與被測細胞(第n代)相比，所述未改造或先前改造的細胞是第(n-l)代。"承受有害的條件"指與未改造或先前^t的細船目比，所述gtit細胞具有提高的生長和/或存活。該概念還包括對細胞有毒的代謝物產生的提高。關於對高糖濃度的耐性，這樣的濃度可以《之100g/L、二120g/L2140g/L、^160g/L、^180g/L、^200g/L、$250g/L、$300g/L、^350g/L、^400g/L、^450g/L、^500g/L等。關於對高鹽濃度的耐性，這樣的濃度可以是M、^2M、SM、^4M、25M等。關於對高溫的耐性，所述溫度可以是例如對細菌細胞為^42。C、^44。C、^46。C、^48。C、$50'C。可根據所使用細胞類型選擇其它的溫度範圍。關於對極端pH的耐性，示例性pH截止值為例如^pH10、^pH11、^pH12、^pH13，或^"5pH4.0、^pH3.0、:SpH2.0、SpHl.O。關於對表面活性劑的耐性，示例性表面活性劑濃度為^5%(重量/體積)、$6%(重量/體積)、27%(重量/體積)、^8%(重量/體積)、29%(重量/體積)、^10%(重量/體積)、^12%(重量/體積)、$15%(重量/體積)等。關於對乙醇的耐性，示例性乙醇濃度為^4%(體積/體積)、25%(體積/體積)、$6%(體積/體積)、^7%(體積/體積)、3%(體積/體積)、3%(體積/體積)、$10%(體積/體積)等。關於對滲透脅迫的耐性，誘導滲透脅迫的示例性濃度(例如LiCl濃度)為aOOmM、$150mM、$200mM、250mM、SOOmM、S50mM、^400mM等。本發明包括獲得細胞中提高的代謝物產生。本文使用的"代謝物"是在或能在細胞中產生的任何分子。代謝物包括代謝中間體或終產物，任何所述產物均可對細胞具有毒性，在這些情況下提高的產生可涉及對該有毒代謝物的耐性。因此，代謝物包括小分子、肽、大的蛋白質、脂質、糖等。示例性代謝物包括實施例中展示的代謝物(番茄紅素、聚羥基丁酸鹽和乙醇)；治療性蛋白質(如抗體或抗體片段)。本發明還提供了對多種表型的選擇，如對多種有害條件的耐性、多種代謝物產生的提高，或者其組合。一個實例是實施例中展示的酵母對高葡萄糖和乙醇濃度的多重耐性。使用在引入突變全局轉錄機器之前預先為預定表型進行優化的細胞可能是有利的。因此，例如在番茄紅素的產生中，優選使用產生較多量番茄紅素(更優選最佳量的番茄紅素)的細胞，而不^1>^僅產生少量番茄紅素的細菌細胞開始。在這些情況下，突變全局轉泉^器用於進一步改進已有改進的表型。通過所述突變全局轉錄機器的作用，所述改造細胞將具有改變的基因表達。在某些方面，本發明的方法可包括鑑定^t細胞中基因表達的變化。可使用多種本領域公知的方法鑑定基因表達的變化。優選地，使用核酸微陣列測U因表達的變化。在本發明的一些方面，細胞中通過突變全局轉錄機器產生的一種或多種基因表達變化可以在另一細胞中再現，從而產生相同的(或相似的)表型。可以如上所述鑑定突變全局轉錄機器產生的基因表達變化。然後，可通過重組基因表達或其它手段將調控靶向個體基因。例如，突變的全局轉^器可提高基因A、B、C、D和E的表達，並降^J^因F、G和H的表達。本發明包括調節一種或多種上述基因的表達，以再現突變全局轉錄機器所產生的表型。為了再現預定的表型，可提高或降l良基因A、B、C、D、E、F、G和H中的一種或多種，所述提高例如通過向細胞中引入包含該基因序列的表達載體來實現；通過提高編碼所述一種或多種基因產物的一種或多種內源基因的轉錄來實現，或者通過突變該一種或多種基因的轉錄控制(例如，啟動子/增強子)序列來實現；所述降低例如通過向第一細胞中引入降低所述一種或多種基因產物表達的核酸分子(如siRNA核酸分子或表達siRNA分子的核酸分子)來實現，或者通過突變編碼所述一種或多種基因產物的一種或多種基因或者所述一種或多種基因的轉錄控制(例如，啟動子/增強子)序列來實現。任選地，包含突變全局轉錄機器的細胞中的基因表達變化用於構建基因或蛋白質網絡的模型，然後使用所^型選擇改變網絡中一種或多種基因產物中的哪一種。可以通過Ideker及其同事的方法(參見，例如Kelley等,7VrfJcW5Wty^4100(20)，11394-11399(2003);Yeang等Ge朋附e醜/o/o^v6(7)，ArticleR62(2005);Ideker等，醜iVwVi/w附flftcs.18Suppl1:S233-40(2002))或Liao及其同事的方法(參見，例如Liao等，iVoc7VW/Jc^/5Wf/5L4100(26),15522-15527(2003);Yang等，5AfC6，卯(2005))產生基因或蛋白質網絡的模型。本發明還包括通過本文所述的任何方法得到的細胞，以及包含所述細胞的多細胞生物。所述細胞可用於多種目的，包括分子的工業生產(例如，許多耐性表型和代謝物產生提高的表型)；生物除汙(例如，有害廢物耐性表型)；鑑定在癌症病因中有活性的基因(例如，抗凋亡表型)；鑑定細菌及其它原核生物對抗生素的抗性中有活性的基因；鑑定害蟲對殺蟲劑的抗性中有活性的基因等。在另一方面，本發明提供用於改變代謝物產生的方法。所述方法包括根據本文別處描述的方法突變全局轉#器以產生&造細胞。所述細胞優選為產生所選代謝物的細胞，並且如上所述，優選對代謝物產生預先進行優化。然後，可分離所選代謝物的產生提高或降低的細胞。該方法還可包括培養分離細胞以及從該細胞或細胞培養物中回收代謝物。可使用本領域公知的方法進行培養細胞以及回收代謝物的步驟。本文別處提供了多種優選的細胞類型、全局轉錄機器和代謝物。本發明提供的另一方法是用於對選定的廢品進行生物除汙的方法。本文使用的"生物除汙"是利用微生物(如細菌和其它原核生物)增強環境中有毒化合物的清除。生物除汙中的困難之一是基於位點處存在的特定毒素而獲得對該位點進行有效除汙的細菌菌林或其它微生物。本文所述的用於改變細胞表型的方法提供了得到這樣的細菌菌林的理想方法。例如，可通過突變細胞的全局轉錄機器以產生本發明的&造細胞，並分離與未改造細胞相比代謝更多量的所選廢品的改造細胞，從而實現生物除汙。然後，可培養所分離的改造細胞，並使其接觸所選廢品，由此提供對所選廢品的生物除汙。或者，需要除汙的有毒廢品位置處的材料樣品可作為選擇培養基，從而獲得特異性針對特定有毒廢品處特定毒素混合物的微生物。本發明還提供核酸分子的集合，使用分子生物學的標準命名法，所述集合在本領域可理解為核酸分子"文庫"。這樣的集合/文庫包括多種不同的核酸分子，其中每種核酸分子編碼具有不同突變的全局轉泉K器，如本文別處所述。本發明的其它集合/文庫是包含含有上述核酸分子集合/文庫的細胞的集合/文庫。所述集合/文庫包含多種細胞，其中每種細胞包含一種或多種所述核酸分子。所述集合中存在的細胞類型在本文別處有所描述，並包括單細胞和包含一種或多種這些細胞的多細胞生物。在所述細胞文庫中，所述核酸分子可以以染色體外核酸(例如在質粒上)存在、可以整合到細胞基因組中，並可以替換編碼內源全局轉a器的核酸。可以向使用者提供核酸或細胞的集合/文庫用於多種用途。例如，可在細胞集合中篩選使用者期望的表型。同樣地，使用者可將核酸分子集合引入細胞中，以產生改造細胞，然後在所述改造細胞中篩選特定的目的表型。例如，為了使用本文所述的表型，尋求番茄紅素產生的提高並且擁有產生一定量番茄紅素的菌林的使用者可以將突變全局轉錄因子引入所述菌林，然後篩選提高的番茄紅素產生。隨後，還可實施通過突變和再次引入全局轉錄機器進行的後續輪次的定向進化，從而獲得番茄紅素產生的進一步提高。可以將集合/文庫貯存在本領域普遍使用的容器中，如管、微孔板等。實施例材料和方法菌林和培養基如實驗方案所述，將大腸桿菌DH5a(Invitrogen，Carlsbad,CA)用於常規轉化以及本實驗中的所有表型分析。在37。C下以225RPM軌道振蕩在包含5g/LD-葡萄糖並補充有lmM維生素Bi的LB-Miller培養基或M9-基本培養基中培養菌林(Maniatis，等,Molecularcloning:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1982)。必要時，向培養基中補充34嗎/ml氯黴素用於增殖低拷貝質粒以及68嗎/ml氯黴素、20|Ug/ml卡那黴素和100嗎/ml氨千青黴素用於維持高拷貝質粒。使用分光光度法在600nm處監測細胞密度。M9低鹽培養J^USBiological(Swampscott，MA)處購得，X-gal從AmericanBioanalytical(Natick，MA)處購得，其它的所有化學品來自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。引物從Invitrogen處購得。構建文庫使用pUC19(Yanisch-Perron,等，Gene33:103-119，1985)作為宿主背景菌林來構建低拷貝宿主質粒(pHACM)，使用pACYC184中的CAT基因(Chang,等，/5""enV/134:1141-1156,1978)和來自pSC101的pSC101複製起點(Bernardi，等,7V"c/e/c爿ciVfe及^12:9415-9426，1984)用氯黴素替換氨節青黴素抗性。使用以下引物將來自pACYC184的氯黴素基因擴增為具有AatII和Ahdl限制酶切位點突出端CM一有義_AhdI:GTTGCCTGACTCCCCGTCGCCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAAC(SEQmNO:l)和CM一反義一AatII:CAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAACTGCAGT(SEQIDNO:2)。將該片段與pUC19骨架消化並連接到一起從而形成pUC19-Cm。使用以下引物將來自pSClOl的pSClOl片段擴增為具有AflIII和Notl限制酶切位點突出端PSC_有義_AflIII:GCCACATGTCCTAGACCTAGCTGCAGGTCGAGGA(SBQIDNO:3)和反義該片段與pUC19-Cm構建體進行消化並連接到一起從而形成pHACM。使用HindIII和Sacl限制性突出端從大腸桿菌基因組DNA中擴增r/wD基因(EcoGene登記號EG10896;B國編碼b3067;SEQIDNO:27)，從而靶向pHACM中的^cZ基因以允許進行藍/白篩選，其中使用引物rpoD一有義一SacI:aacctaggagctctgatttaacggcttaagtgccgaagagc(Seqidno:5)和rpoD—反:5C一HindlII:tggaagctttaacgcctgatccggcctaccgattaat(seqidno:6)。使用GenemorphII隨機謙變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)以及多種濃度的初始模^J"進行片段誘變，從而獲得低、中和高突變率，如產品方案中所述。PCR後，使用QiagenPCR回收試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)對這些片段進行純化，用HindIII和Sacl消化過夜，過夜連接入經消化的pHACM骨架中，並轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞中。將細胞鋪到LB瓊脂平板上並刮下，以產生液體文庫。白色菌落文庫的總規^莫大約為105~106。表型選擇將來自液體文庫的樣品置於攻擊環境中從而選#^存活的突變體。對乙醇耐性來說，將菌林置於含有50g/L乙醇的經過濾LB中。在37。C下在SOxllSmm加蓋密閉的離心管中振蕩培養。20小時後將菌林鋪板，並選擇個體菌落進行測試。對於乙酸鹽/酯耐性來說，在含有濃度逐漸提高的乙酸鹽/酯(起始濃度為加g/L並增加到30g/L)的M9基>^養基中將菌林連續傳代培養兩次。然後，將細胞鋪在LB平板上，並選擇若干菌落用於單菌落測定。對於對羥基苯甲酸(pHBA)耐性來i兌，將菌林培養在含有20g/LpHBA的M9基本培養基中，並在20小時後鋪板以選擇存活的細胞。回收來自所有鑑定為具有改i^型的菌林的質粒，並再次轉化進新一批感受態細胞中。從每個平板選擇若干菌落進行生物學再現，從而^^E表型。序列分析使用以下引物組合對突變體cr因子的序列進行測序51525354AlA2A3A4A5A6CCATATGCGGTGTGAAATACCGC(SEQEDN0:7)，CACAGCTGAAACTTCTTGTCACCC(SEQIDNO:8)，TTGTTGACCCGAACGCAGAAGA(SEQH)NO:9)，AGAAACCGGCCTGACCA丁CG(SEQIDNO:IO)，GOTCGATCTGACGGATACGTTCG(SEQIDNO:l1)，CAGGTTGCGTAGGTGGAGAACTTG(SEQIDNO:12)，GTGACTGCGACCTTTCGCTTTG卿IDNO:13)，CATCAGATCATCGGCATCCG,IDNO:14)，GCTTCGGCAGCATCTTCGT(SEQIDNO:15)和CGGAAGCGATCACCTATCTGC(SBQIDNO:16)。使用ClustalW版本1.82對序列進行比對和比較。實施例1:在大腸桿菌中對主要cj因子(CT7C)進行定向進化，以尋找提高的耐性表型。選擇所述主要cr因子的前提是，突變將改變啟動子的偏好和轉錄速率，因此在全局水平調節轉錄組。對f"/)基因和天然啟動子區進行易錯PCR，並克隆入低拷貝表達載體中(圖1)。首先構建包含近105106個活力突變體的文庫並轉化入菌林中。通過在高乙醇濃度、高乙酸鹽/酯濃度和高對羥基苯甲酸(pHBA)濃度的極端條件下培養來選擇所述文庫。之所以選擇這些條件是因為它們具有工業相關性乙酸鹽是大腸桿菌的副產物，其抑制細胞生長，然而預期可通過&造出乙醇耐性提高的菌林來加強生物乙醇生產，因此可能提高產率(L.O.Ingram等，5"tec/mo/58，204-14(1998年4月5日))。另外，生產作為電塗層前體的pHBA具有相當大的工業意義，然而其對細胞毒性極大(T.K.VanDyk，L.J.Templeton，K.A.Cantera，P.L.Sharpe,F.S.Sariaslani，/5"ctenV/186,7196-204(2004年11月)；J.L.Barker,J.W.Frost,51》tec/i朋/5/M"g76,376-90(2001年12月))。已通過隨機細胞誘變、基因互補和敲除研究以及微陣列分析的傳統方法對這些耐性表型中的每一種進行了研究(R.T.Gill,S.Wildt，Y.T.Yang，S.Ziesman，GStephanopoulos,/Voc7V^/爿oiflf5WCAS^99,7033-8(2002年5月14日))，至今僅^^得有限的成功。乙醇耐性首先，基於LB複合培養基中存在高濃度乙醇時的生長能力來選擇cr因子突變體文庫(L.P.Yomano,S.W.York,L.O.Ingram,/7/K/Micra6^/必,V^cA朋/20，I32-8(l"8年2月))。對於該選擇來說，在50g/L乙醇中將菌林連續過夜傳代培養兩次，然後塗板以選擇耐性突變體。選擇並測定了總共20個生長在不同乙醇濃度中的菌落。在分離並mi改進菌林後，將最優的突變體a因子進行連續的多輪進化。連續兩次反覆後，選擇濃度提高到70和80g/L乙醇。在這些富集實驗中，由於使用強選"^壓力，細胞在孵育4小時和8小時後塗板。從每輪分離的突變體顯示出多種乙醇濃度中整體生長的提高(圖2A)。圖2B鑑定了從每,變中分離的最優突變體的序列。圖2D提供了乙醇耐性CJ因子的序列對比。令人感興趣地，第二輪誘變導致形成截短的因子，其明顯有利於增加整體的乙醇適應性。該截短來自於限制酶消化的人工產物，並包含所述蛋白質中區域3的一部分和完整的區域4。區域4負責結合啟動子區，先前已表明與全長蛋白質相比，截短形式提高結合親合力(U.K.Sharma，S.Ravishankar，R.K.Shandil,P.V.K.Praveen,T.S.Balganesh,/.5"ctenV/.181，5855-5859(1999))。因此，該截短突變體可能通過結合優選的啟動子區並阻止轉錄來作為特異性強轉錄抑制劑，因為其餘的ct因子機器已被去除。在截短形式的第二輪突變體中，第一輪的I511V突變回復成異亮氨酸，僅剩下一個突變。將所述截短形式進行第三輪秀變和選擇，以獲得包含另外8種突變的因子。在這最後一輪中，前兩輪中發現的R603C突變回復成原始殘基，並且發生了許多新的突變，僅剩截短作為第二輪和第三輪之間僅有的可見相似性。這些輪誘變以及所得序列提示與定向進化的蛋白質相比存在差異。在後一種情況中，提高蛋白質功能的突變在自然界通常是加成的。另一方面，改變轉錄機器的突變沒有必要是加成的，因為這些因子發揮轉錄組中間渠道(conduit)的作用。在這方面，由於存在可導致改i^型的多種基因變化亞組，序列空間中可能存在許多局部最大值(maxima)。所有包含突變體cj因子的分離菌林均在提高的乙醇濃度下表現出與對照相比提高的生長速率。另外，不存在乙醇時突變菌林的生M型不受影響(表l)。tableseeoriginaldocumentpage36表l:乙醇耐性(j因子的定向進化。對於三輪定向進化，對逐漸增加的乙醇濃度顯示了倍增時間減少倍數的改進。第二輪和第三輪中的突變體在高濃度乙醇下顯示生長速率顯著增加。在所有定向進化輪次中，觀察到了可持續細胞最高濃度的持續提高。第二輪中分離的截短突變體在高乙醇濃度下表現出增加的生長速率；然而，與第一輪突變體相比，在低乙醇濃度下其生長速率降低。從第三輪分離的突變體在2050g/L乙醇中表現出恢復的生長速率，類似於第一輪的生長速率。最重要的是，每一後續輪次均提高了最高乙醇濃度，在該濃度下細胞能夠維持生長超過8小時，而不死於乙醇的毒性，也沒有伴隨細胞密度的下降。通過本方法獲得的顯著提高的乙醇耐性通過(圖2C)所示的第三輪菌林生長曲線以及野生型對照的生長曲線來舉例說明。cj因子&造(sigmafactorengineering,SFE)能夠提高乙醇耐性至超過使用更傳統方法的先前文獻所報導的水平。另外，舉例說明了應用反覆多輪SFE能夠進一步改進細胞表型。乙酸鹽/酯和pHBA耐性作為另一實例，在含有20g/L和其後為30g/L乙酸鹽的M9-基本培養基中將原始的ct因子突變體文庫連續傳代培養兩次。從該混合物中分離單菌落，再次轉化以排除任何基於染色體的生長適應，並測定在不同乙酸鹽濃度下的生長。所分離的菌林顯示在高水平乙酸鹽存在的耐性顯著提高。另夕卜，在不存在乙酸鹽時，生長速率仍不受顯著影響(表2)。在30g/L乙酸鹽中，所分離菌林的倍增時間為10.5-12.5小時，約為嚴重受抑制對照的倍增時間的1/5(56小時倍增時間)。g倍增時間的比值(td，對照/td,經改造的突變體)tableseeoriginaldocumentpage37表2:應用轉錄機器^tit得到其它表型。分離在升高的乙酸鹽水平或高水平pHBA存在下表現出耐性增加的突變體。在升高的化學品7jc平下觀察到耐性的提高，然而，不存在這些化學品時未觀察到生M率或產率的不利影響。圖3總結了通過按照所分離(T因子中引發細胞乙酸鹽耐性提高的區域進行分類的多種突變。圖3B提供了乙酸鹽耐性(T因子的序列對比。5個分離突變體中僅有一個是截短的。在兩個乙酸鹽突變體中出現M567V突變，並且大多數突變似乎分布在CT因子的功能結構域中。4艮有意思地注意到，即使菌林具有相似的耐性鐠，其內在突變也可能不同，這提示存在影響轉錄鐠的不同分子機制。作為另一實例，在20g/LpHBA存在下培養突變體文庫，以在高pHBA濃度下的生長和生存力方面選擇對該化合物耐性提高的菌林。分離了一個與對照相比在13小時生長量顯著提高並且在pHBA不存在時基本不改變生長表型的菌林(表2)。突變體HBAl顯示為截短形式的cr因子，其總共具有6個突變(圖3A)，其中6個泉基中的4個變為纈氨酸。圖3C提供了pHBA耐性(j因子的序列對比。這些實施例舉例說明了CT因子改造用於引入全局轉錄組改變的潛力，所述改變使生物獲得新的細胞表型。最近，我們已成功地將全局轉錄機器改造的概念M耐性表型，而延伸至選擇代謝物過度產生速率增加的突變體(見下文)。另外，已使用包含真核轉錄機器組分的其它宿主系統對這一概念進行了探索。在每一個這些實例中，通過隨機突變在轉錄調節機器的組分中引起的全局變化已顯示改進了細胞表型，其改進水平超過了通過推理性^tit或通過隨機誘變進行的傳統菌林改進所得到的水平。我們第一次證明了應用定向進化來改變全局轉錄機器。與典型的連續逐個基因策略相反，本策略允許同時定向修飾多個基因的遺傳控制。另外，我們發現定向進化的範例是可以應用的，因為它能夠通過深入探測轉錄因子^tit的巨大序列空間而依次進行表型改進。因此，現在有可能解密多基因調節的複雜表型，這是非常不可能通it^目對低效的反覆搜索策略而實現的。值得注意的是，所述方法還可以反過來應用於揭示基因型與表型之間複雜的相互作用。在這些應用中，人們將使用許多高通量的細胞和分子測定來評估改造細胞的狀態，並最終推導出這些突變體中隱藏在所觀察表型下的系統作用機理。本文所M全局轉錄機器進行定向進化的應用是用於鑑定遺傳靶標、引發期望的表型和實現全細胞改造目標的範式轉換(paradigmshifting)方法。實施例2:有機溶劑耐性全局轉錄機器改造的應用已延伸至包括另外的耐性表型。細菌菌林對有機溶劑的耐性可用於以下幾種情況中(l)有害廢物的生物除汙，(2)從細菌中生物產生有機溶劑，以及(3)需要兩相^^應器的生物處理應用(即提取發酵物以連續除去疏水產物的操作)。為了研究在大腸桿菌中提高溶劑耐性的潛力，培養原始的rpoD(a7"突變體文庫，在指數期收穫並轉移至含有LB培養基和己烷(10%體積/體積)的兩相系統中。在己烷存在下培養18小時後分離菌林。將這些個體菌落再次培養至指數期，然後在己烷存在下進行培養。17小時後測量細胞密度。包含己烷的培養物的細胞密度顯示於圖4。圖4所示菌林為在生物學副本中再次轉化的菌林。所有所選菌林細胞密度的增加均超過包含未突變rpoD基因的對照菌林。另外，PCR分析表明，突變林Hex畫3、Hex-8、Hex-ll、Hex-12、Hex-13、Hex-17和Hex-19具有完整形式的cj因子，而菌林Hex-2、Hex-6、Hex-9、Hex-lO和Hex-18具有截短的形式。圖4還顯示兩個最佳性能突變體(Hex-12和Hex-18)的序列(突變的位置)。另外，測試這些窗林在環己烷存在下的生長，已知與己烷相比，環己烷是對微生物毒性更高的有機溶劑。圖5顯示來自環己烷培養物的細胞密度。從己烷選擇中分離的幾個菌林也顯示了超過對照的細胞密度提高。實施例3:抗生素抗性全局轉錄機器改造的應用已延伸至包括抗生素抗性。微生物中的抗生素抗性已變為重要的問題，這迫使衛生保健和藥物公司尋找對抗感染的替代方法。已知許多抗性菌林包含編碼抗性的特定基因。然而，在微生物能夠進化出這樣的基因之前，它們必須首先獲得最初的抗性，以努力在於抗生素存在下持續。儘管在基因組中發生隨機突變是一種備選方案，但細胞還可以應答於這些抗生素而改變其基因表達。測試了全局轉錄機器改造用於鑑定獲得抗生素抗性菌林可能性的用途。該表型最終將受到經&造的轉錄組表達的控制，所述改變的表達由突變體轉^器來介導。對這些菌林基因表達的分析可鑑定控制菌林抗性的新的基因靶標和酶。然後，這些靶標可導致開發出抑制或增強所鑑定酶活性的小分子藥物。通過在250照/ml萘咬酸、會若酮(與環丙沙星為同一藥物家族)存在下培養突變體cr因子文庫來測試抗生素抗性，所述濃度超過了約為80ng/ml的對照最4氐抑制濃度。圖6顯示逐漸提高的萘啶酸濃度下多種分離菌林的細胞密度(OD600)。幾種分離菌林表現出高濃度萘咬酸存在下的顯著生長。在將質粒轉化入新的宿主菌林後測試這些菌林，以進行驗證。另外，將這些突變體測序；PCR分析表明突變林NdA-7和NdA-15是全長a因子，而NdA-lO、NdA-ll、NdA-12和NdA-13為截短形式。實施例4:代謝物過量產生的表型全局轉錄機器改造的基本意義是產生多重和同時的基因表達改變的能力。該方法先前已成功用於鑑定耐性表型提高的突變體。在隨後的這些實施例中，對主要CT因子(由r/^Z)編碼)突變體文庫檢查其增強代謝物過量產生表型至^單遺傳修飾所實現水平的能力。番茄紅素的產生我們先前已鑑定了許多單基因及多基因敲除耙標，其在預先改造菌林的背景中表現出番茄紅素產生的提高(Alper等，A^AVtec/i朋/2005和Alper等，Meto6五wg2005)。在本研究中，我們設法應用全局轉錄機器^tit技術來增強番茄紅素的產生。應用若干先前改造的可用菌林背景和親本菌林，有可能獨立地在每個背景中搜尋導致番茄紅素產生提高的突變體因子。對於本研究而言，選擇了親本菌林以及兩個經鑑定的全局最大菌林(globalmaximumstrain)Agflf/L4A"ce五4/i/AF和A^//L4Aflce￡"A/^/D。然後，將來自四個被測遺傳背景中每一個的最優突變體進行交換，以研究將4種菌林與4種已鑑定cj因子混合所產生的情況。鑑定突變體a因子將突變體CT因子文庫轉化入四種菌林中的每一種，並基於在補充有5g/L葡萄糖的基^養基平板上的番茄紅素產生來進行選擇。然後，使用M9培養基培養所選菌林並測定番茄紅素在15和24小時時的產量。圖7A-7D展示了這些搜索的結果以及來自最優菌林的cj因子突變體序列。標出了帶有或不帶有對照質粒的菌林的番茄紅素產生。對於某些背景來i兌，這種對照質粒導致番茄紅素產生大大下降，超過缺乏該質粒的菌林。值得注意的是，所有這些經鑑定的因子都是截短的。另外，來自A"r敲除背景的經鑑定突變體僅簡單地為截短形式，不包含突變。由於所推測的該截短物作用模式，有可能該突變體因子顯著抑制在控制下表達的所有正常基因。在突變體中，穩態水平較高的穩定期a因子(o3)可接手其餘的轉錄。另外，在該背景中笫二高的突變體得到包含若干突變的全長CT因子。菌抹與所鑑定突變體因子的組合然後，將具有不同遺傳背景的4種菌林與4種獨立鑑定的突變體cr因子組合，以檢查所得的16種菌林的情況。首先值得注意的是，圖7A-7D中對給定遺傳背景進行測序的所有已鑑定突變體均不與另一遺傳背景中鑑定的突變體重疊。因此，最初推測情況將是對角優勢，表明突變體因子引發的影響對遺傳背景具有特異性。將這16種菌林以及對照培養在2xM9培養基中並分段添加葡萄糖。測定在15、24、39和48小時時間點的番茄紅素水平。圖8顯示描述在發酵期間實現的番茄紅素產生與對照相比的最大提高倍數的點圖。圓的大小與提高倍數成比例。與推測一致，該模式為明顯的對角優勢，其中突變體因子主要在鑑定它們的菌抹背景中發揮作用。圖9舉例說明15小時後幾個目的菌林的番茄紅素含量。在親本菌林和/mr敲除中均進行的單輪誘變能夠得到與預先通過引入3個不同基因敲除而改造的菌林類似的結果。然而，在這些背景中，引入另外的突變體CJ因子能夠進一步提高番茄紅素水平。這些結果表明，(1)全局轉錄機器改造(globaltranscriptionmachinaryengineering,gTME)能夠引發代謝表型，更重要的是(2)使用gTME進行單輪選擇比單個敲除或it^達修飾更有效。另外，所鑑定的突變體通常不會在菌林背景之間轉移，這提示在每個菌林中可能存在不同的番茄紅素產生方式。作為這些模式的實例，野生型菌林中的最大差異倍數在僅僅15小時後就得以實現，然後與對照菌林在發酵結束之前逐漸接近。反言之，對於逐漸提高的時間點，A^Z/L4A"ce五A/;vy/"菌林中突變體因子的番茄紅素含量與對照相比逐漸增加。儘管如此，最高的番茄紅素產生來自在預先改造菌林背景中使用gTME，這表明如果只進行一l^擇，則從優化菌林開始是比較好的。然而，乙醇耐性的結果提示，有可能通過應用定向進化來實現連續的適合性改進，表明有可能進一步增加番茄紅素的產量。聚羥基丁酸酯(PHB)的生物生產全局轉錄機器改造的應用已延伸至包括代謝物過量生產的其他實例。使用轉錄機器改造研究了另一代謝表型(除產生番茄紅素外)一聚羥基丁酸酯(PHB)的生物生產。PHB從乙醯輔酶A前體分子產生。材料/方法在37'C下，在含有20g/L葡萄糖和25照/mL卡那黴素的Luria-Bertani(LB)培養基中培養轉化了經修飾的pJOE7質粒(LA.Ci，J.Choi,C.Rha，J.Stubbe，和A.J.Sinskey.2005.5iVwjflcnwwo/ecw/es6:2113-2119)的;U^桿菌(XL-1Blue,Stratagene，LaJolla，Calif.)。經修飾的pJOE7由AnthonySinskey博士(MIT,Cambridge,MA)惠贈，其包含來自板口線蟲(CI)的/7/1"ylB和來自^4//oc/in挑她'"挑v/wow/附的/7/lBC，並編碼卡那黴素抗性。作為無PHB的對照，還培養了不含/;Afl基因的同一質粒。4吏用Ultraspec2100pro(AmershamBiosciences,Uppsala，Sweden)使用吸光度追蹤細胞生長。染色和流式細胞術除非另有註明，通過溶解至1mg/mL二甲基亞碸中來配製尼羅紅(Sigma-Aldrich,St.Louis，MO)原液。如染色優化中所指出的，將3母^>至1mL染色緩沖液中。利用FACScan(BectonDickinson,MountainView,CA)進行流式細胞術，使用如下i殳置集胞藍細菌(5);"^/i10mg的細胞。用冷的去離子水洗滌所得沉澱一次，並在80。C乾燥過夜。將乾燥的沉澱在lml濃H2S04中煮沸60分鐘，用4ml的0.014MH2S04進##釋。離心樣品(15分鐘，18,000xg)以除去細胞碎片，使用AminexHPX-87H離子排斥柱(300x7.8mm;Bio國Rad,Hercules,Calif.)利用HPLC分析液體(Karr，D.B.,J.K.Waters,和D.W.Emerich.1983.￡>iv/r(w/ffe/ito/46:1339-1344)。使用與樣品進行平行處理的市售PHB(Sigma-Aldrich,St.Louis，Mo.)作為才示準品。大腸桿菌染色優化如前述培養包含經〗務飾的pJOE的大腸桿菌XLl-blue和無PHB對照。刺激(shock)優化將培養物培養至穩定期。在刺激後測試多種不同透化方法的解析度和生存力。如前所述(Vazquez-Laslop,N.,H.Lee，R.Hu和A.A.Neyfakh.2001./5flcteri》/.183:2399-2404)ii行蔗糖刺激。將1mL細胞冷卻至4'C10分鐘。然後將細胞離心(3分鐘，3000xg，4'C)並在1mL冰冷的TSE緩衝液(10mMTris-Cl[pH=7.5，20%蔗糖，2.5mMNa-EDTA)中重懸。細胞在水上孵育10分鐘，然後用包含3pL尼羅紅原液的lmL去離子水重懸(3分鐘，3000xg，4°C)。細胞在黑暗中染色30分鐘，並利用FACScan進行分析。將異丙醇刺激的細胞離心(3分鐘，3000xg)並重懸在70%異丙醇中15分鐘。然後，離心細胞(3分鐘，3000xg)並重懸於包含3pL尼羅紅原液的去離子水中。細胞在黑暗中孵育30分鐘並利用FACScan進行分析。通過離心(3分鐘，3000xg)lmL細胞培養物進行DMSO刺激。將50尼羅紅原液直接添加至沉澱。迅速將沉澱渦旋並在孵育30s後稀釋在1mL水中。在黑暗中孵育細胞30分鐘並利用FACScan進行分析。傳-感受態細胞製備(Sambrook，J"E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress)中那樣進行熱激。將1mL細胞冷卻10分鐘。然後，離心細胞(3分鐘，3000xg，4'C)，並重懸在lmL冷的80mMMgCl2/20mMCaCl2中。離心細胞(3分鐘，3000xg，4'C)並重懸在包含3尼羅紅原液的1mL0.1MCaCl2中。在42'C熱激細胞90秒。在黑暗中孵育細胞30分鐘然後利用FACScan進行分析。濃度優化通過使用3nL不同的尼羅紅溶液至終濃度為30-30,000ng/mL進行蔗糖刺激來製備細胞。蔗糖濃度優化通過使用具有不同蔗糖濃度(0、5、10、15、20%)的TSE緩衝液的蔗糖刺激來製備細胞。如上所述，將突變體cy因子文庫引入大腸桿菌。在葡萄糖基M養基中選擇指數期PHB增加的菌林。另外，還測試使用轉座子誘變產生的隨機敲除文庫，以比較轉錄機器改造與傳統菌林改進方法的效率。圖10A顯示使用cr因子改造獲得的多種菌林的數據(紅色和黃色柱代表對照)。作為比較，圖10B顯示從隨機敲除文庫中選擇的菌林的結果。使用(j因子改造獲得的幾個突變體產生了接近25%dew(drycellweight,細胞乾重)的PHB。在一輪cj因子改造中獲得的最優菌林比使用隨機敲除獲得的最優菌林M秀得多。如上述在所述最優突變體背景下進行第二輪秀變從而得到進一步改進的PHB表型。實施例5:文庫的多樣性和構建以一種或多種以下方式提高CT因子文庫的大小和寬度。(1)所述文庫不僅包括大腸桿菌的主要CT因子(ct7°，由編碼)，還包括一種或多種替代形式,例如r/w51、r/wF、r/w/T、r/;a/V、r/w五和/或風有可能通過同時引入轉錄機器單元的多種突變體形式來進一步改進表型並尋找最優菌林。使用例如共表達兩個或更多這些基因的表達盒來表達突變的ct因子基因(或其它全局轉錄機器)。所述兩個或更多基因可以是兩種或更多相同類型的轉錄機器(例如r/wD的兩種形式)，或者可以是兩種或更多不同的轉錄機器(例如r/w/)和^ftS)。同樣地，超過一種不同的全局轉錄機器突變體形式可能對表型的適當優化有利。例如，可共表達多種突變的o70(rpoD)。(2)除了通過如上述的易錯PCR引入隨機突變以外，所述文庫包括從C端和N端所有可能的截短及其組合。(3)另外，所述文庫包括多個cr因子區的替代嵌合體，其通itA工融合這些區域得到。例如，使用(T因子70的區域l替換a因子38的區域l。通過使用DNA改組產生多樣性的類似方法是本領域公知的(例如，W.Stemmer等的基因改組專利，轉讓給Maxygen;參見maxygen.com/science-patents的歹'J表)。(4)文庫中包括來自其它細菌與上文對大腸桿菌cj因子70所述構型(例如隨機突變、截短、嵌合體、改組)相同的cj因子。這些因子可具有獨特的DNA結合特性並可有助於產生多種轉錄組改變。實施例6:真核細胞中的全局轉錄機器^LJt對酵母和哺乳動物系統(例如CHO、HeLa、Hek細胞系)應用全局轉錄機器的定向進化，以在誘導條件下增強重組蛋白質的產生和產生凋亡抗性。對編碼全局轉錄機器(例如TFIID)的基因進行易錯PCR、截短和/或DNA改組，從而得到全局轉錄機器突變體的多樣性文庫。將所述文庫引入酵母或哺乳動物細胞中，並在一個實驗中檢測細胞產生的重組蛋白。這些實驗中優選易於測定的蛋白質，如SEAP或螢光蛋白(例如GFP)。對於螢光蛋白的情況，可使用激發螢光細胞分選儀選擇細胞，或者如果在多孔平板中培養，則可使用螢光平板讀數器測定蛋白質產生的增強。在另一個實驗中，在酵母或哺乳動物細胞中檢測抗凋亡表型。實施例7:SDS耐性將全局轉錄機器的定向進化應用於細胞對十二烷1^L酸鈉(SDS)的耐性這一問題。將突變體r/wi)文庫轉化入大腸桿菌DH5a中，然後將其在包含量逐漸增加的SDS(5重量％，然後15重量％SDS)的LB培養基中傳代培養。在菌林中對在SDS中耐性的提高進行選擇。選擇菌林SDS-2並再次轉化以驗證其表型。然後在5-20重量。/。SDS中測試菌林SDS-2。發現該突變體在升高的SDS水平下生長增加，不存在SDS時對生長沒有任何不利影響。圖11顯示在逐漸提高的SDS濃度下，SDS耐性d因子突變體分離菌林培養物的細胞密度，以及來自最優菌林的CT因子突變體的序列。實施例8:改造出多種表型將全局轉錄機器改造用於在大腸桿菌中傳遞多耐性表型的問題。為了同時獲得乙醇和SDS耐性，在一個實驗中，遵循三種替代策略分離菌林(i)在用乙醇和SDS中均進行處理/選^^後分離突變體，(ii)首先分離具有乙醇耐性的突變體，然後使用乙醇/SDS混合物進行另一輪-秀變和選擇，以及(iii)首先分離具有SDS耐性的突變體，然後使用乙醇/SDS混合物進行另一輪秀變和選擇。測試這些菌林在多種乙醇和SDS濃度存在下的生長，從而獲得生長曲線並評估這些方案的有效性。使用在上述其它實施例中所述的方案進行實驗。在另一組實驗中，從乙醇耐性菌林中分離突變體cr因子，並與分離自SDS耐性菌林的突變體CJ因子共表達。使用在上述其它實施例中所述的方案進行實驗。實施例9:將全局轉錄機器改造(gTME)擴展至酵母系統在任何類型的細胞系統中，一組蛋白質負責協調全局的基因表達。這樣，這些蛋白質提供多種轉錄組修飾的進入點，所述修飾廣泛地影響高等生物的表型。本實施例展示將gTME應用於酵母(釀酒酵母(5Wc/^wwiij^^c^^v/wVie))真核模型系統中。與原核系統的轉錄機器完全不同的是，就與啟動子特異性的調節相關的組分和因子數而言，真核轉錄機器更為複雜。首先，在真核系統中存在具有不同功能的3種RNA聚合酶，而原核生物中僅存在一種。另外，這種複雜性的實例可通過劃分為通用轉錄因子或RNA聚合酶II系統共激活子的近75種組分來示例(Hahn，Mo/及W,11(5)，394-403,2004)。通用因子TFIID的組分包括TATA結合蛋白(5>7"5)和14種另外的相關因子(TAF)，並被認為是調節啟動子特異性的主要DNA結合蛋白(Hahn,2004)。而且，已顯示TATA結合蛋白突變體改變3種聚合酶的偏好性，提示其在組織酵母蒼沐轉錄中的關鍵作用(Schultz，Reeder,&Hahn，CW/，69(4)，697-702，1992)。本研究著眼於兩種主要的轉錄蛋白TATA結合蛋白(S/7"5)和TAF。TATA結合蛋白的晶體結構是已有的，並清楚地顯示出與DNA直接結合的蛋白質部分以及與TAF和聚合酶部分發生蛋白質結合的其他部分(Bewley,Gronenborn,&Clore,j/i/iw及ev醜/o//^s^B/oiwo/5^w"，27，105-131，1998;Chasman等，iVarf5W90(17),8174-8178，1993;J.L.Kim,Nikolov,&Burley,7V"似m,365(6446),520-527,1993)。所述結構由與DNA相互作用的兩個重複區和與蛋白質相互作用的兩個螺旋組成。測定和突變分析提示，TATA結合蛋白在啟動子特異性和全局轉錄中發揮重要作用。另外，已經提出了DNA接觸點和蛋白質相互作用點的重要殘基(Arndt等，Mo/CW/B"/，12(5)，2372-2382,1992;J.Kim&Iyer，A^/CW/說V/,24(18),8104-8112,2004;Kou等，Mo/CW/所o/，23(9),3186-3201，2003;Schultz,Reeder，&Hahn,1992;Spencer&Arndt,編O//歷o/,22(24)，8744-8755,2002)。TAF家族蛋白也已得到不同程度的關注。使用序列對比並通過突變分析對4^研究的對象TAF25蛋白進行分析，其顯示出影響許多基因的轉錄(Kirchner等，A/o/CW/21(19),6668-6680，2001)。發現該蛋白質包含一系列對蛋白質相互作用至關重要的螺旋和接頭。使用gTME方法研究這些蛋白質已產生3種目的表型(1)對模型滲透脅迫的LiCl耐性，(2)高葡萄糖耐性，和(3)對高乙醇和高葡萄糖均具耐性。方法本研究中使用的釀酒酵母菌林BY4741(AWra;MWA/;few2A0;附e"5A0;wm3A得自EUROSCARF,Frankfurt,Germany。其在YPD培養基(10g酵母提取物/升，20gBacto蛋白腖/升以及20g葡萄糖/升)中培養。對於酵母轉化，使用Frozen-EZ酵母轉化II(ZYMORESEARCH)。為了選擇和培養帶有以作為選擇標記的質粒的酵母轉化體，使用包含6.7g酵母氮源(Difco)/升、20g葡萄糖/升和適當的核苷酸和胺基酸混合物(CSM-URA,Qbiogene)的酵母合成完全(YSC)培養基(本文中稱為YSClira—)。對於固體培養基，在該培養基中補充1.5%瓊脂。產生文庫並將其克隆至tef-mut2啟動子之後，所述tef-mut2啟動子先前作為酵母啟動子文庫的一部分產生(Alper等，/VmA^/爿cm/^/C/5^，102(36)，12678-12683,2005)。使用以下引物>^&因組DNA中克隆Taf25基因TAF25有義tcgagtgctagcaaaatggattttgaggaagattacgat(seQIDNO:28)和TAF25反義ctagcggtcgacctaacgataaaagtctgggcgacct(seqID:29)。使用以下"物^&因組DNA中克隆Sptl5基因SPT15—有義TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG(SEOIDNO:30)和SPT15反義CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA(SEQIDNO:31)。使用GeneMorphII誘變試劑盒突變基因，並使用Nhel和Sail消化產物並連接到用Xbal和Sail消化的質粒骨架中。將質粒轉化入;U^桿菌DH5a中，使用質粒MiniPrepSpin試劑盒分離並轉化入酵母中。使用以下引物對質粒進行測序Se[正向TCACTCAGTAGAACGGGAGC(SEQIDNO:32)和Seq反向AATAGGGACCTAGACTTCAG(SEQIDNO:33)。通過在200至400mMLiCl、200至300g/L葡萄糖以及適當時5%乙醇/100g/L葡萄糖至6。/。乙醇/120g/L葡萄糖中連續傳代培養來分離菌林。通過塗在選擇培養基平板上來分離細胞並測定性能。分離質粒並再次轉化，以驗汪生物學複本的表型。LiCl耐性滲透脅迫應答和耐性是細胞中複雜的多效應答。對於酵母來說，已經顯示提高的LiCl濃度(濃度約為100mM)可誘導滲透脅迫(Haro，Garciadeblas，&Rodriguez-Navarro，i^R5291(2)，189-191,1991;Lee,VanMontagu,&Verbruggen，/Vw胸/爿ow/5Wt/5L4,96(10)，5873誦5877，1999;Park等，A^5,Vtec/i朋/，21(10),1208-1214,2003)。將攜帶突變體形式TBP或TAF25的酵母細胞文庫在200~400mMLiCl中連續傳代培養。分離菌林並再次轉化，以IHE表型是突變體因子的結果。令人感興趣的是，來自每個文庫的最優菌林顯示針對LiCl的不同改進。在較低LiCl濃度時TAF25優於各自的TAF25未突變對照，而在濃度高於約200mM時沒有效果。相反，在150400mM升高水平下，SPT15突變體能夠優於對照。在每種情況下，無LiCl時的生長表型均不受突變體因子存在的影響。圖12提供了生長量改善的總結。序列分析(圖13)表明，LiCl耐性的改進受每個蛋白質中單個突變的控制，SPT15突變發生在非保守區。高葡萄糖耐性已經研究了高葡萄糖濃度發酵，用於從酵母批量培養物中提高乙醇產生。然而，這些"極高重力發酵"常對細胞生長具有相當的抑制作用，並通常通過改變培養基組成來處理，而非改變細胞(Bafrncov^等，倫tec/i朋/柳Z欲ers,21(4),337-341,1999;Bai等,/5/她c/i朋/，110(3)，287-293，2004;Thatipamala,Rohani，&Hill，所她cA朋/柳fl/irf說V^"^Vi^nVig，40(2),289-297,1992)。為了使用gTME研究這一問題，將攜帶突變體形式TBP或TAF25的酵母細胞文庫在200至400g/L葡萄糖中連續傳代培養。分離菌林並再次轉化，以驗證所述表型是突變體因子的結果。菌林在培養16小時之後顯示細胞密度提高2至2.5倍。與LiCl的情形不同，TAF25和SPT15蛋白均對升高的葡萄糖顯示類似的應答，超過對照的最大改近發生在150至250g/L之間。然而，SPT15突變體表現出超過TAF25的更大改進。圖14顯示這些突變體的生長改進，圖15顯示其序列。在該情形中，兩種蛋白質均僅具有單個突變，然而分離了幾種SPT15蛋白的次優突變體，其中一些具有多達7個突變。本文顯示的兩個突變均位於已知的蛋白質接觸區，尤其是TAF25蛋白中的1143殘基(Schultz，Reeder，&Hahn,1992)。乙醇和葡萄糖多重耐性成功的酵母生物乙醇發酵需要對高葡萄糖和乙醇濃度均有耐性。為此，通過用升高的乙醇和葡萄糖水平(5V。和100g/L)同時處理兩種突變體文庫來測試多重耐性表型。將分離的菌林再次轉化，並在5和6%乙醇存在下在一系列葡萄糖濃度中進行測定。令人感興趣的是，SPT15突變體在所有測試濃度下均優於對照，在一些濃度下改進高達13倍。這一改進大大地超過不能在6%乙醇存在下生長的TAF25突變體的M改進。圖16突出顯示這些最優菌林的生長分析，圖17提供其序列。通過引入突變體轉錄機器實現的改進大大地超過通過其它改進細胞表型的方法所獲得的改進。另外，這些結果提高了使用酵母作為使用高重力發酵進行高乙醇產生的活來源的潛力。本領域的技術人員僅使用常規實驗就會認識到或者能夠確定本發明具體實施方案的許多等價方案。這樣的等價方案旨在包括於以下權利要求中。本文公開的所有參考文獻均通過參考整體引入本文。權利要求1.用於改變細胞表型的方法，該方法包括突變編碼全局轉錄機器的核酸並任選地突變其啟動子，在細胞中表達所述核酸，以提供包含突變的全局轉錄機器的改造細胞，以及培養所述改造細胞。2.權利要求l的方法，其還包括確定所述改造細胞的表型。3.權利要求l的方法，其還包括重複突變所述核酸，以產生第n代改造細胞。4.權利要求l的方法，其還包括確定所述第n代改造細胞的表型。5.權利要求3的方法，其中所述重複突變全局轉錄機器的步驟包括從所述改造細胞中分離編碼突變全局轉錄機器的核酸以及任選地其啟動子、突變所述核酸以及將所述突變核酸引入另一細胞。6.權利要求l的方法，其中所述細胞為原核細胞。7.權利要求6的方法，其中所述原核細胞是細菌細胞或古細菌細胞。8.權利要求7的方法，其中所述全局轉錄機器為cj因子或抗ct因子。9.權利要求8的方法，其中編碼cr因子的核酸為r/w2)(cr7°)基因、f/^F(,)基因、^M(o^)基因、r"H(o^)基因、f"7V((j54)基因、r"五(ct24)基因和(ct19)基因。10.權利要求8的方法，其中所述CT因子或抗CT因子4達載體中表達。11.權利要求l的方法，其中所述細胞為真核細胞。12.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為酵母細胞。13.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。14.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為植物細胞。15.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為昆蟲細胞。16.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為幹細胞。17.權利要求ll的方法，其中所述真核細胞為真菌細胞。18.權利要求11-17中任一項的方法，其中所述真核細胞包含於多細胞生物中。19.權利要求ll的方法，其中所述核酸在細胞中由組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子或細胞器特異性啟動子表達。20.權利要求ll的方法，其中所述全局轉錄機器結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的啟動子。21.權利要求20的方法，其中所述全局轉錄機器為TFIID或其亞基。22.權利要求21的方法，其中所述亞基為TATA結合蛋白(TBP)或TBP相關因子(TAF),如TAF25。23.權利要求20的方法，其中編碼所述全局轉錄機器的核酸為GAL11基因、SIN4基因、RGR1基因、HRS1基因、PAF1基因、MED2基因、SNF6基因、SNF2基因或SWI1基因。24.權利要求20的方法，其中所述全局轉錄機器為核酸甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙醯化酶或組蛋白脫乙S^酶。25.權利要求20或權利要求24的方法，其中所述全局轉錄機器M達載體中表達。26.權利要求ll的方法，其中所述核酸為真核細胞細胞器的核酸。27.權利要求26的方法，其中所述細胞器為線粒體或葉綠體。28.權利要求l的方法，其中所述核酸為表達栽體的一部分。29.權利要求l的方法，其中所述核^A核酸集合的成員。30.權利要求29的方法，還包括將所述集合引入細胞中。31.權利要求l的方法，其中表達所述核酸的步驟包括將所述核酸整合進基因組，或者替換編碼內源全局轉錄機器的核酸。32.權利要求l的方法，其中所述核酸的突變包括所述核酸的定向進化。33.權利要求32的方法，其中所述定向進化包括通過易錯PCR進行的突變。34.權利要求32的方法，其中所述定向進化包括通過基因改組進行的突變。35.權利要求l的方法，其中所述核酸的突變包括合成具有一個或多個突變的核酸。36.權利要求l的方法，其中所述核酸突變是一種或多種點突變。37.權利要求l的方法，其中所述核酸突變是一種或多種截短或缺失。38.權利要求37的方法，其中所述一種或多種截短或缺失不破壞或除去所述全局轉錄機器的啟動子結合區。39.權利要求l的方法，其中所述突變的全局轉錄機器與未突變的全局轉錄機器相比表現出基因轉錄的提高。40.權利要求l的方法，其中所述突變的全局轉錄機器與未突變的全局轉錄機器相比表現出基因轉錄的降低。41.權利要求l的方法，其中所述突變的全局轉錄機器與未突變的全局轉錄機器相比表現出基因轉錄抑制的提高。42.權利要求l的方法，其中所述突變的全局轉錄機器與未突變的全局轉錄機器相比表現出基因轉錄抑制的降低。43.權利要求1的方法，其還包括對所述改造細胞選擇預定的表型。44.權利要求43的方法，其中所述選擇步驟包括在選擇條件下培養所述改造細胞。45.權利要求43的方法，其中所述選擇步驟包括高通量測定個體細胞的表型。46.權利要求43的方法，其中所述表型為對有害培養條件的耐性提兩。47.權利要求46的方法，其中所述表型為溶劑耐性或有害廢物耐性。48.權利要求47的方法，其中所述溶劑為乙醇、己烷或環己烷。49.權利要求46的方法，其中所述表型為對工業培養基的耐性。50.權利要求46的方法，其中所述表型為對高糖濃度的耐性。51.權利要求46的方法，其中所述表型為對高鹽濃度或滲透脅迫的耐性。52.權利要求46的方法，其中所述表型為對高溫的耐性。53.權利要求46的方法，其中所述表型為對極端pH的耐性。54.權利要求46的方法，其中所述表型為對表面活性劑的耐性。55.權利要求46的方法，其中所述表型為對多種有害條件的耐性，如對高糖及乙醇濃度的耐性。56.權利要求43的方法，其中所述表型為代謝物產生的提高。57.權利要求56的方法，其中所述代謝物為番茄紅素或乙醇。58.權利要求56的方法，其中所述代謝物為聚羥基丁酸酯(PHB)。59.權利要求56的方法，其中所述代謝物為治療性蛋白質。60.權利要求59的方法，其中所述治療性蛋白質為抗體或抗體片段。61.權利要求43的方法，其中所述表型為對有毒底物、代謝中間體或產物的耐性。62.權利要求61的方法，其中所述有毒代謝物為有機溶劑。63.權利要求62的方法，其中所述有毒代謝物為乙酸鹽/酯或對羥基苯甲酸(pHBA)。64.權利要求62的方法，其中所述有^R謝物為過表達的蛋白質。65.權利要求43的方法，其中所a型為抗生素抗性。66.權利要求43的方法，其中所述表型為對凋亡的抗性提高。67.權利要求43-45中任一項的方法，其中所述細胞包含在多細胞生物中。68.權利要求67的方法，其中所述表型為一種或多種生長特徵、世代時間、對一種或多種害蟲或疾病的抗性、果實或植物其它部分的產生、一種或多種發育變化、一種或多種壽命變化、功能的獲得或喪失和/或健壯性的提高。69.權利要求l的方法，其中該方法中使用的細胞在突變全局轉錄機器之前對表型進行優化。70.權利要求l的方法，還包括鑑定所述改造細胞中基因表達的變化。71.權利要求70的方法，其中所述基因表達的變化使用核酸微陣列來測定。72.用於改變細胞表型的方法，該方法包括改變第一細胞中一種或多種基因產物的表達，所M因產物通it^第二細胞中檢測基因表達變化來鑑定，其中所述第二細胞中基因表達的變化通過誘變該第二細胞的全局轉錄機器而得到。73.權利要求72的方法，其中改變第一細胞中一種或多種基因產物的表達包括提高一種或多種在第二細胞中提高的基因產物的表達。74.權利要求73的方法，其中通過向第一細胞中引X^達所述一種或多種基因產物的一種或多種表達載體來提高所述一種或多種基因產物的表達。75.權利要求73的方法，其中通過提高編碼所述一種或多種基因產物的一種或多種內源基因的轉錄來提高所述一種或多種基因產物的表達。76.權利要求75的方法，其中提高所述一種或多種內源基因的轉錄包括誘變所述一種或多種基因的轉錄控制序列。77.權利要求72的方法，其中在第一細胞中改變所述一種或多種基因產物的表達包括降低在所述改造細胞中降低的一種或多種基因產物的表達。78.權利要求77的方法，其中通過向第一細胞中引入降低所述一種或多種基因產物的表達的核酸分子來降低所述一種或多種基因產物的表達。79.權利要求78的方法，其中所述核酸分子是siRNA分子，或者表達siRNA分子。80.權利要求77的方法，其中通過突變編碼所述一種或多種基因產物的一種或多種基因或者所述一種或多種基因的轉錄控制序列來降低所述一種或多種基因產物的表達。81.權利要求72的方法，其中所述第二細胞中的基因表達的變化使用核酸微陣列來測定。82.權利要求72的方法，其中所述第二細胞中基因表達的變化用於構建基因或蛋白質網絡的模型，並且其中該模型用於選擇改變所述網絡中一種或多種基因產物中的哪一種。83.權利要求1-82中任一項的方法，其中所述全局轉錄機器包含多於一種核酸和/或多肽，或者由多於一種核酸編碼。84.通過權利要求1-83中任一項的方法產生的細胞。85.用於改變代謝物產生的方法，該方法包括根據權利要求1-83中的任一項突變產生選定代謝物的細胞的全局轉錄機器，以得到^Ut細胞，以及分離所選代謝物產生量提高或降低的改造細胞。86.權利要求85的方法，其中所述方法還包括培養所述分離的細胞，以及從細胞或細胞培養物中回收所述代謝物。87.權利要求85的方法，其中所述代謝物為番茄紅素或乙醇。88.權利要求85的方法，其中所述代謝物為聚羥基丁酸酯(PHB)。89.權利要求85的方法，其中所述代謝物為治療性蛋白質。90.權利要求85的方法，其中所述治療性蛋白質為重組蛋白。91.權利要求89的方法，其中所述治療性蛋白質為抗體或抗體片段。92.權利要求85的方法，其中所述細胞為原核細胞。93.權利要求92的方法，其中所述原核細胞為細菌細胞或古細菌細胞。94.權利要求85的方法，其中所述細胞為真核細胞。95.權利要求85的方法，其中所述真核細胞為酵母細胞。96.權利要求94的方法，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。97.權利要求94的方法，其中所述真核細胞為植物細胞。98.權利要求94的方法，其中所述真核細胞為昆蟲細胞。99.權利要求94的方法，其中所述真核細胞為幹細胞。100.權利要求94的方法，其中所述真核細胞為真菌細胞。101.權利要求85的方法，其中所述全局轉錄機器由真核細胞細胞器的核酸編碼。102.權利要求101的方法，其中所述細胞器為線粒體或葉綠體。103.包含多種不同核酸分子種類的集合，其中每種核酸分子種類編碼包含不同突變的全局轉錄機器。104.權利要求103的集合，其中所述全局轉錄機器為cj因子或抗ct因子。105.權利要求104的集合，其中編碼cj因子的核酸是/7^2)(ct")基因、r"F(c^)基因、^M(o^)基因、r"H(o^)基因、r/w7V(^4)基因、r"五(o24)基因或fecl(cj19)基因。106.權利要求C1的集合，其中所述全局轉錄機器結合RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，或者RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的啟動子。107.權利要求106的集合，其中所述全局轉錄機器為TFIID或其亞基。108.權利要求107的集合，其中所述亞基為TATA結合蛋白(TBP)或TBP相關因子(TAF)，如TAF25。109.權利要求103的集合，其中所述全局轉錄機器為核酸甲基轉移酶、組蛋白甲基轉移酶、組蛋白乙醯化酶或組蛋白脫乙醯基酶。110.權利要求103的集合，其中所述核酸分子種類包含在表達載體中。111.權利要求110的集合，其中所述核酸由組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子或細胞器特異性啟動子表達。112.權利要求110的集合，其中所述表達載體包含多種不同的核酸分子種類，其中每種核酸分子種類編碼不同的全局轉錄機器。113.權利要求103的集合，其中所述全局轉錄機器通過定向進化進行突變。114.權利要求113的集合，其中所述定向進化使用易錯PCR來進行。115.權利要求113的集合，其中定向進化使用基因改組來進行。116.權利要求103的集合，其中所述全局轉錄機器中的突變為一個或多個點突變。117.權利要求103的集合，其中所述全局轉錄機器中的突變為一種或多種截短或缺失。118.權利要求117的集合，其中所述截短不包括所述全局轉錄機器的啟動子結合區。119.權利要求103的集合，其中根據權利要求1-83中任一項來突變細胞的全局轉錄機器。120.包含權利要求103-119中任一項的核酸分子集合的細胞集合。121.權利要求120的集合，其包含多種細胞，其中每種細胞包含一種或多種所述核酸分子。122.權利要求120的集合，其中所述細胞為原核細胞。123.權利要求122的集合，其中所述原核細胞為細菌細胞或古細菌細胞。124.權利要求120的集合，其中所述細胞為真核細胞。125.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為酵母細胞。126.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為哺乳動物細胞。127.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為植物細胞。128.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為昆蟲細胞。129.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為幹細胞。130.權利要求124的集合，其中所述真核細胞為真菌細胞。131.權利要求120的集合，其中所述核酸分子整合進細胞的基因組，或者替換編碼內源全局轉錄機器的核酸。132.編碼由多輪突變產生的全局轉錄機器的核酸。133.權利要求132的核酸，其中所述多輪突變包括定向進化。134.權利要求133的核酸，其中所述定向進化包括通過易錯PCR進行的突變。135.權利要求133的核酸，其中所述定向進化包括通過基因改組進行的突變。136.權利要求132的核酸，其中所述核酸編碼多種不同的全局轉錄機器種類。137.權利要求132的核酸，其中所述核酸編碼多種不同形式的同一類型全局轉錄機器種類。138.權利要求132-136中任一項的核酸所編碼的全局轉錄機器。139.包含(羧基端)區域4的截短的cr因子蛋白。140.用於對所選廢品進行生物除汙的方法，該方法包括根據權利要求l-83中任一項突變細胞的全局轉錄機器，以產生&造細分離與未^tit細J^目比代謝所選廢品的量提高的^Lit細胞，培養所述分離的細胞，以及使所述&造細胞接觸所選廢品，從而提供對所選廢品的生物除汙。全文摘要本發明涉及改造全局轉錄機器以產生具有改進表型的改造細胞。文檔編號C07K14/47GK101356273SQ200680044278公開日2009年1月28日申請日期2006年9月28日優先權日2005年9月28日發明者哈爾·S·阿爾珀,格裡戈裡·斯特凡諾普洛斯申請人:麻省理工學院