人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法

2023-10-21 04:31:02

專利名稱：人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物檢測醫學體外診斷技術，尤其涉及一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(即Human papilloma virus，以下簡稱HPV)的分型研究一直受到國內外學者的高度重視，HPV各型在標本中的確認，取決於所用方法。目前，對HPV感染的診斷主要依賴分子生物學技術對病毒核苷酸序列進行基因檢測，包括基因測序、雜交捕獲、斑點雜交、狹線雜交和特異型探針等方法已應用於HPV研究，但由於各自的局限性及特殊要求，無法滿足在臨床檢測中短時間內、高通量獲得患者感染的HPV病毒基因型。

發明內容
本發明的主要目的在於解決上述檢測HPV病毒基因存在的問題，提供一種利用基因晶片技術快速、可靠、敏感、特異及簡單的人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法。
人乳頭瘤病毒(即Human papilloma virus，以下簡稱HPV)是一種在人群中極易傳播擴散的DNA病毒，可通過直接或間接接觸交叉傳染，其感染部位隱蔽，發病隱匿，不易早期發現。據有關統計顯示，近20％的人群攜帶著HPV病毒，而且超過半數的人在感染HPV後不會有任何症狀，因此，實際攜帶HPV的人口比例可能遠不止於此。HPV各基因型與其生物學行為存在著高度相關性，不同基因型的HPV可導致人體不同部位的不同反應及疾病，有不同的致病危害性。HPV感染人的皮膚和黏膜上皮細胞誘發細胞增生，產生乳頭樣病變，不同基因型引起的感染具有不同的臨床表現。
依據HPV在生殖系統腫瘤形成中所發揮作用的差異，將HPV分為高危組、中危組和低危組三個組。臨床統計表明，高危組的HPV感染是宮頸癌的主要病因，與95％以上的宮頸癌發病有關。如能及早發現HPV，用藥物加以間接治療，可以大大減少患宮頸癌的機會。即使不幸發現患有宮頸癌，只要能於宮頸癌病發的第一至第二期發現並進行治療，五年內存活率達70至90％；但如果遲於第三至第四期發現，其五年內存活率只有7-30％。因此及早進行HPV基因分型，對女性健康十分必要。另外，最近文獻表明HPV在生殖系統以外區域的鱗狀細胞黏膜腫瘤中也存在，如口腔、鼻咽、食道和男性尿道等。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，至少5個以上坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上。每個HPV探針點樣1個以上，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數至少18點以上。
PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

在帶正電荷的晶片基質上固定HPV各基因型探針，探針在膜上呈雙點微陣列排列。
5個坐標點(黑色圓圈)控制晶片的點樣區域和點樣方向，左下角的雙坐標點為點樣起始點。每個HPV探針可重複點樣2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56代表15種基因型，「+」代表陽性質控點。
HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58等共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，

15個HPV型特異探針指的是區分15種HPV基因型的型特異探針，每一個探針對應特定的一種基因型。1個共有探針指的是15種HPV基因型的通用探針，該探針可以和15種HPV基因型出現雜交信號，甚至包括其他基因型。
在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在晶片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個HPV特異探針的3』末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。將點好的晶片放在紫外交聯儀內進行照射5分鐘，使探針完全固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把構成的檢測診斷晶片置於2-8℃條件下存放。
根據美國國家生物信息中心基因庫(GenBank)公布的HPV各基因型序列，選取HPV序列中相對保守而又存在型間差異的ORF L1區，結合HPV各基因型在我國的流行狀況和致病性設計所檢測基因型的PCR引物和晶片探針，探針合成時在3』末端加一段特定的聚核苷酸尾巴。
在晶片基質上設置探針，用微孔板放置點樣探針和坐標標記，探針在晶片上矩形微陣列排列，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58、58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，至少5個以上坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點標示控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上。每個HPV探針可重複點樣2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數至少18點以上。
PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、5HPV6、HPV58共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，

用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，即20個寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能夠固化在晶片上，在DNA合成儀採用固相亞磷醯胺三酯法在每個HPV特異探針的3′末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc點樣儀按照預先設定好的順序在帶有正電荷的晶片進行點樣。
使用羅氏公司生產的帶有正電荷的晶片，使用Nunc點樣儀按預先設定好的順序進行點樣。
將點好的晶片放在UVP紫外交聯儀內照射固定5分鐘，使點樣探針固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把製作成的檢測診斷晶片置於2-8℃條件下存放待用。
由於設計的探針比較短，很難固化在晶片上，因此在探針序列的3′末端加一個尾巴，即20個寡聚胸腺嘧啶核苷酸，使其能夠固化在晶片上。
設計HPV特異性引物和探針為有效擴增各基因型HPV和提高靈敏度，採用2對24條鏈的組合套式引物設計。設計探針16個，包括HPV共用探針1個，區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共計15種基因型。
取出獲得雜交信號的晶片，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色，特異雜交點與非特異雜交點之間的差別明顯，通過點樣區域模式圖，比對查出HPV基因分型。
按照臨床標本處理、套式PCR擴增、晶片雜交、晶片洗滌、晶片顯色和晶片雜交信號的判讀進行檢測；進行臨床標本處理採用活檢組織或石蠟標本或拭子標本。
套式PCR擴增分為兩次進行，第一次PCR擴增包括標本處理上清液5微升、一次PCR反應混合液(含組合式上遊外引物或下遊外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計50微升均勻混合。PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘。
第二次PCR擴增是將第一次PCR產物5微升、二次PCR反應混合液(含組合式上遊內引物和DIG-dUTP或者下遊內引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合。
PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘，經過二次PCR擴增的PCR產物即製作成DIG標記的雜交探針。
將預先製作好的晶片裝入雜交袋中，並在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進行0.5-1小時的預雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內，再進行3-6小時的雜交，雜交箱溫度為45℃。
在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌晶片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的晶片兩次，每次2min，然後用TNT溶液洗滌晶片5min。
將洗滌乾淨的晶片裝入乾淨的塑膠袋中，在塑膠袋內加入10％封阻液100μl或TN900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min。
加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將晶片從塑膠袋中取出用TNT漂洗晶片2次，每次3min。
將晶片放入乾淨的塑膠袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻後立即加到塑膠袋中，待顯色達到理想程度後(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應，獲得晶片雜交結果，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色。
臨床標本處理採用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻後進行研磨，研磨後進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
臨床標本處理採用石蠟標本，取3-5個石蠟標本切片進行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
臨床標本處理採用拭子標本，拭子標本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細胞沉澱，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
本發明在天津市第三中心醫院對收集的95例臨床樣本進行分析表明，其中25例為HPV陽性感染，分型結果如下HPV6型9例、HPV11型5例、HPV16型4例、HPV33型3例、HPV52型2例、HPV16與HPV33的混合型1例、HPV16與HPV52的混合型1例，晶片雜交結果見圖2。將其中的25例的PCR產物進行進一步的克隆測序，均證實晶片的準確性。實驗證明HPV基因分型診斷晶片具有診斷準確、特異性強、操作簡單、信息量大的特點。
本發明是人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法。具有診斷準確、快速、診斷方法簡單、特異性強、信息量高和易於推廣使用的特點，探針檢測通量大，可同時檢測15種常見的HPV基因型；操作簡便、快速，不需要昂貴的儀器設備和嚴格的操作環境，從樣本處理開始僅用兩個工作日內即可獲得檢測結果；組合式引物設計提高了PCR擴增的效率和陽性檢出率；合理的探針設計減少了非特異性雜交反應的發生，特異性強；檢測結果易於判斷，可直接通過肉眼進行判斷，也可由計算機控制的晶片閱讀儀自動收集和分析數據。臨床應用的市場潛力巨大，具有極大的經濟效益和社會效益。
以下結合附圖和實施例對本發明詳細說明。


圖1 晶片微陣列探針點樣模式圖(A)7×4微陣列模式(B)9×3微陣列模式(C)5×6微陣列模式(D)4×7微陣列模式(E)3×12微陣列模式圖2 部分HPV基因型的晶片雜交結果(A)HPV6型(B)HPV11型(C)HPV16型(D)HPV33型(E)HPV16、33混合型(F)HPV16、52混合型(注圖中鉛筆字為標本號)具體實施方式
實施例1晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，5個坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列為4列，微陣列的橫行為7行。每個HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數18點。
PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58等共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，

在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在晶片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個HPV特異探針的3』末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。將點好的晶片放在紫外交聯儀內進行照射5分鐘，使探針完全固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把構成的檢測診斷晶片至於2-8℃條件下存放，如圖1(A)、圖2所示。
實施例2晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，5個坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列為3列，微陣列的橫行為9行。每個HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數18點以上，如圖1(B)、圖2所示。
實施例3晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，5個坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列為6列，微陣列的橫行為5行。每個HPV35、HPPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數18點以上，如圖1(C)、圖2所示。
實施例4晶片基質上設置探針，包括識別所有HV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，5個坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列為7列，微陣列的橫行為4行。每個HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數18點以上，如圖1(D)、圖2所示。
實施例5晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，5個坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列為12列，微陣列的橫行為3行以上。每個HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數18點以上，如圖1(E)、圖2所示。
實施例6在晶片基質上設置探針，用微孔板放置點樣探針和坐標標記，探針在晶片上矩形微陣列排列，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，至少5個以上坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點標示控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個HPV35、HPV42、HPV43、HPV45、HPV56、HPV58探針點為1個，通用探針、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV44、HPV52探針點為2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數至少18點以上。
PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，

HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，

用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在晶片上，在DNA合成儀採用固相亞磷醯胺三酯法在每個HPV特異探針的3′末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子。使用Nunc點樣儀按照預先設定好的順序在帶有正電荷的晶片進行點樣。
使用羅氏公司生產的帶有正電荷的晶片，使用Nunc點樣儀按預先設定好的順序進行點樣，如圖1、圖2所示。
將點好的晶片放在UVP紫外交聯儀內照射固定5分鐘，使點樣探針固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把製作成的檢測診斷晶片至於2-8℃條件下存放待用，如圖1、圖2所示。
設計HPV特異性引物和探針為有效擴增各基因型HPV和提高靈敏度，採用2對24條鏈的組合套式引物設計。設計探針16個，包括HPV共用探針1個，區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56和HPV58共計15種基因型，如圖1、圖2所示。
實施例7取出獲得雜交信號的晶片，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色，特異雜交點與非特異雜交點之間的差別明顯，通過點樣區域模式圖，比對查出HPV基因分型，如圖2所示。
按照臨床標本處理、套式PCR擴增、晶片雜交、晶片洗滌、晶片顯色和晶片雜交信號的判讀進行檢測。進行臨床標本處理採用活檢組織或石蠟標本或拭子標本。
套式PCR擴增分為兩次進行，第一次PCR擴增包括標本處理上清液5微升、一次PCR反應混合液(含組合式上遊外引物或下遊外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計50微升均勻混合。PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘。
第二次PCR擴增是將第一次PCR產物5微升、二次PCR反應混合液(含組合式上遊內引物和DIG-dUTP或者下遊內引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合。
PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘，經過二次PCR擴增的PCR產物即製作成DIG標記的雜交探針。
將預先製作好的晶片裝入雜交袋中，並在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進行0.5--1小時的預雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內，再進行3-6小時的雜交，雜交箱溫度為45℃。
在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌晶片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的晶片兩次，每次2min，然後用TNT溶液洗滌晶片5min。
將洗滌乾淨的晶片裝入乾淨的塑膠袋中，在塑膠袋內加入10％封阻液100μl或TN900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min。
加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將晶片從塑膠袋中取出用TNT漂洗晶片2次，每次3min。
將晶片放入乾淨的塑膠袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻後立即加到塑膠袋中，待顯色達到理想程度後(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應，獲得晶片雜交結果，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色，如圖1、圖2所示。
實施例8臨床標本處理採用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻後進行研磨，研磨後進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板，如圖1、圖2所示。
實施例9臨床標本處理採用石蠟標本，取3-5個石蠟標本切片進行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板，如圖1、圖2所示。
實施例10臨床標本處理採用拭子標本，拭子標本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細胞沉澱，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板，如圖1、圖2所示。
權利要求
1.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片，其特徵是晶片基質上設置探針，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，至少5個以上坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個HPV探針點樣1個以上，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數至少18點以上；PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，
在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在晶片上，特定的聚核苷酸尾巴是在每個HPV特異探針的3′末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子；將點好的晶片放在紫外交聯儀內進行照射5分鐘，使探針完全固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把構成的檢測診斷晶片置於2-8℃條件下存放。
2.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片的製作方法，其特徵是在晶片基質上設置探針，用微孔板放置點樣探針和坐標標記，探針在晶片上矩形微陣列排列，包括識別所有HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，用於區分HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，探針在晶片上微陣列排列，至少5個以上坐標點控制晶片的矩形點樣區域，以坐標點標示控制晶片的矩形點樣區域和點樣方向，微陣列中一個角設置2個坐標點，為點樣起始點，指示探針排列方向，微陣列的其他3個角上為1個坐標點，微陣列的縱列至少3列以上，微陣列的橫行至少3行以上；每個HPV探針重複點樣2個，通用探針是所有HPV的共有序列，HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58代表15種基因型，「+」代表陽性質控點，排列方式由通用探針到各型探針由小數到大數依次排列，再加上陰性和陽性質控點，點陣數至少18點以上；PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合，其核苷酸序列如下表所示，
HPV基因型的通用探針1個，HPV基因型特異探針15個，包括HPV基因型HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV52、HPV56、HPV58共計15種基因型，各型探針序列如下表所示，
用DNA合成儀合成探針，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，使其能夠固化在晶片上，在DNA合成儀採用固相亞磷醯胺三酯法在每個HPV特異探針的3′末端加入20個脫氧胸腺嘧啶核苷酸分子；使用Nunc點樣儀按照預先設定好的順序在帶有正電荷的晶片進行點樣；將點好的晶片放在UVP紫外交聯儀內照射固定5分鐘，使點樣探針固定在晶片上，構成檢測診斷晶片，把製作成的檢測診斷晶片置於2-8℃條件下存放待用。
3.一種人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片的檢測方法，其特徵是取出獲得雜交信號的晶片，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色，特異雜交點與非特異雜交點之間的差別明顯，通過點樣區域模式圖，比對查出HPV基因分型；按照臨床標本處理、套式PCR擴增、晶片雜交、晶片洗滌、晶片顯色和晶片雜交信號的判讀進行檢測；進行臨床標本處理採用活檢組織或石蠟標本或拭子標本；套式PCR擴增分為兩次進行，第一次PCR擴增包括標本處理上清液5微升、一次PCR反應混合液(含組合式上遊外引物或下遊外引物)44微升和Taq聚合酶1微升，總計50微升均勻混合；PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘；第二次PCR擴增是將第一次PCR產物5微升、二次PCR反應混合液(含組合式上遊內引物和DIG-dUTP或者下遊內引物和DIG-dUTP)44微升和Taq聚合酶1微升均勻混合；PCR循環條件為94℃預變性2分鐘，94℃45秒、55℃45秒、72℃45秒，進行35個循環，保持72℃延伸5分鐘，經過二次PCR擴增的PCR產物即製作成DIG標記的雜交探針；將預先製作好的晶片裝入雜交袋中，並在雜交袋中加入適量雜交液，把雜交袋封好，進行0.5--1小時的預雜交，加入5-20微升的變性探針，放入雜交箱內，再進行3-6小時的雜交，雜交箱溫度為45℃；在室溫條件下用2×SSC/0.1％SDS洗滌晶片兩次，每次2min，在46℃條件下用0.2×SSC/0.1％SDS洗的晶片兩次，每次2min，然後用TNT溶液洗滌晶片5min；將洗滌乾淨的晶片裝入乾淨的塑膠袋中，在塑膠袋內加入10％封阻液100μl或TN 900μl，混合均勻，在37℃的條件下放置30min；加入POD抗體1μl，輕輕混合均勻，在37℃的條件下放置30min；將晶片從塑膠袋中取出用TNT漂洗晶片2次，每次3min；將晶片放入乾淨的塑膠袋中，取DAB顯色液10μl、DAB稀釋液10μl和滅菌水480μl，混合均勻後立即加到塑膠袋中，待顯色達到理想程度後(一般顯色5-30分鐘左右)，用1×PBS終止反應，獲得晶片雜交結果，整張晶片背景不著色，雜交信號呈棕黃色。
4.根據權利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片的製作方法，其特徵是所述的臨床標本處理採用活檢組織，取50毫克活檢組織加入DNA裂解液100微升混合均勻後進行研磨，研磨後進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
5.根據權利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片的製作方法，其特徵是所述的臨床標本處理採用石蠟標本，取3-5個石蠟標本切片進行脫蠟，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm的離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
6.根據權利要求3所述的人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片的製作方法，其特徵是所述的臨床標本處理採用拭子標本，拭子標本用生理鹽水浸泡，用離心的方式收集細胞沉澱，加入DNA裂解液50微升，進行55℃溫浴1-3小時，再進行100℃煮沸10分鐘，用12000rpm離心機離心10分鐘，取5微升上清液用做PCR擴增模板。
全文摘要
本發明是人乳頭瘤病毒基因分型檢測診斷晶片和製作方法及檢測方法。在晶片基質上設置16種探針，探針在晶片上微陣列排列，包括通用探針1個，HPV型特異探針有15個，用於區分HPV基因型6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、52、56、58等共計15種基因型，在特異探針末端加一段特定的聚核苷酸尾巴，將點好的晶片放在紫外交聯儀內進行照射5分鐘，使探針完全固定在晶片上，構成檢測診斷晶片。PCR引物採用2對24條鏈的套式引物組合。本發明具有診斷準確、快速、診斷方法簡單、特異性強、信息量高和易於推廣使用的特點，臨床應用具有極大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12Q1/68GK1687451SQ200510013318
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月13日 優先權日2005年4月13日
發明者高英堂, 方淑昌, 杜智 申請人:天津市紫波高科技有限公司