Mn/ca9剪接變體的製作方法
2023-04-25 12:01:31
專利名稱：：Mn/ca9剪接變體的製作方法MN/CA9剪接變體發明領域本發明屬於醫學遺傳學、生物化學工程、免疫化學和腫瘤學領域。更具體地說，本發明涉及MN基因—被認為是癌基因的細胞基因，也稱為MN/CA9、CA9或碳酸酐酶9，該基因編碼現在也稱為MN蛋白的癌蛋白、MN/CAIX同功酶，MN/CAIX、碳酸酐酶IX、CAIX或MN/G250蛋白。更具體地說，本發明涉及一種以其他方式剪接的[AS形式的MN/CA9mRNA和用於檢測該mRNA的探針/引物。該ASMN/CA9mRNA主要在正常的細胞中於正常的血氧下表達，能夠幹擾檢測全長[FL]MN/CA9mRNA表達的試驗，尤其是RT-PCR試驗。本發明還涉及該AS形式的MN/CAIX以及利用對其(單獨或與FL形式的MNCAIX蛋白組合)進行檢測或檢測並定量的試驗來進行診斷/預後的方法。此外，本發明涉及利用MN/CA9旁路剪接(alternativesplicing)作為手段來靶向FLMN/CAIX蛋白的治療方法。作為本發明焦點的AS形式的MN/CA9/CAIX可以來自脊推動物，但優選來自哺乳動物，更優選來自人。
背景技術：
：如上所述，該MN基因和蛋白有很多可選名稱，這些名稱在本文中可互換使用。發現MN蛋白可結合鋅並具有碳酸酐酶(CA)活性，現在被認為是第九種碳酸酐酶同工酶-MN/CAIX或CAIX[Opavsky等(1996)見下文。按照碳酸酐#名法，人CA同工酶用大寫羅馬字母和數字表示，而它們的基因用斜體字母和阿拉伯數字表示。或者本文中^^I的"MN"指碳酸酐酶同工酶IX(CAIX)蛋白/多肽或碳酸酐酶同工酶9(CA9)基因、核酸、cDNA、mRNA等，如上下文所示。MN蛋白還已-皮鑑定為G250抗原。Uemura等"腫瘤相關抗原MN/G250在尿道癌中的表達:潛在治療性把標(ExpressionofTumor-AssociatedAntigenMN/G250inUrologicCarcinoma:PotentialTherapeuticTarget)"，"J.Urol"154(4增刊):377(摘要1475;1997)描述"序列分析和資料庫搜索顯示，G250抗原與MN(在宮頸癌中鑑定到的人腫瘤相關性抗原)相同(Pastorek等，1994)。CAIX是由ZavadaJ,Pastorekova，S.和Pastorek，J.利用首先由Pastorekova等Virologv187:620-626(1992)]描述的M75單克隆抗體鑑定到的癌相關性碳酸酐酶["zavada等"，參見，例如，美國專利5,387,676。該抗體用於克隆編碼CAIX的cDNA[Pastorek等，Oncogene,9:2788-2888(1994)，用於評價CAIX在腫瘤內和正常組織中的表達[Zavada等，IntJCancer,54:268-274，(1993)，以及很多其他的參考文獻]，用於研究細胞密度對CAIX的調控[Lieskovska等，Neoplasma,46:17-24,(1999),Kaluz等，CancerResearch,62:4469-4477,(2002)，還用於證明低氧對CAIX的誘導[Wykoff等，CancerResearch,60:7075-70832000),以及很多其他的參考文獻]。所有此類研究均支持Zavada等最初的觀點和工作[例如，Zavada等，美國專利5,387,676，即MN/CAIX/CA9可作為腫瘤發生前/腫瘤標記物用於診斷和/或預防性用途，以及可作為靶標用於治療性用途，Zavada等還表明M75單克隆抗體是一種有價值的CAIX特異性試劑，可用於不同的免疫檢測方法和免疫靶向方法。Zavada等，國際公開No.WO93/18152(1993年9月16日公開)和美國專利No.5,387,676(1995年2月7日授權)描述了MN基因和蛋白的發現及其生物學和分子特徵。發現MN基因存在於所有測試的脊推動物染色體DNA中，它的表達與腫瘤的發生強烈相關。最初在來源於人子宮頸癌的HeLa細胞中鑑定到MN蛋白。在多種人腫瘤中均發現了這種蛋白(其中特別是子宮頸、卵巢、子宮內膜、腎、膀胱、乳房、結腸直腸、肺、食管和前列腺的腫瘤)。在正常組織中幾乎沒有發現MN蛋白的任何顯著性表達。那些表達MN的正常組織包括人的胃黏膜和膽嚢上皮，以及消化道的一些其它正常組織。自相矛盾的是，在一些正常地表達MN基因的組織(例如胃黏膜)中，發生癌及其他腫瘤發生前(preneoplastic)/腫瘤性疾病(neoplasticdisease)時MN基因的表達缺失或減少。通常，MN蛋白的異常表達可能預示肺瘤生成。例如，以下現象可能預示腫瘤生成(1)在正常情況下不表達MN蛋白的組織中存在顯著水平的MN蛋白；(2)在正常情況下表達MN蛋白的組織中不存在MN蛋白；(3)組織中MN基因表達相對於正常表達水平顯著增加，或顯著減少;或(4)在細胞內的異常位點中表達MN蛋白。Zavada等，WO93/18152以及Zavada等，WO95/34650(1995年12月21日公開)公開了如何利用MN基因和蛋白以及MN基因表達與腫瘤發生學的強烈相關性的發現發明了診斷/預後以及治療癌症和癌症前期病症的方法。這些專利申請中提供了通過檢測或檢測並定量脊推動物中MN基因的異常表達從而鑑定肺瘤性疾病的發病和存在的方法和組合物。可通過多種常規試驗在脊推動物樣品中檢測或檢測並定量MN基因的異常表達，例如通過使用MN特異性抗體檢測或檢測並定量MN抗原的免疫測定方法，通過使用MN核酸(例如MNcDNA)檢測或檢測並定量MN核酸(例如MNmRNA)的雜交試驗或PCR試驗，例如RT-PCR。MN/CAIX首先在HeLa細胞中鑑定到，其既是一種質膜蛋白又是一種核蛋白，通過蛋白質印跡法評估的表觀分子量分別為58和54千道爾頓(kDa)。MN/CAIX單個3kDa碳水化合物鏈N-糖基化，在非還原狀態下形成S-S連接的寡聚物[Pastorekova等，Virology,187:620-626(1992);Pastorek等，Oncogene9:2788-2888(1994)卜MN/CAIX是一種位於細胞表面的跨膜蛋白，但有時候也在細胞核中檢測到該蛋白[Zavada等，Int.J,Cancer,54:268-274(1993);Pastorekova等，見上文l。MN以孿生蛋白p54/58N的形式存在於HeLa細胞中。使用與p54/58N反應的單克隆抗體(MAbM75)的免疫印跡顯示，在54kd和58kd處有兩個條帶。這兩個條帶可能對應於一種類型的蛋白，它們很可能由於翻譯後加工而不同。Zavada等，WO9318152和/或WO95/34650公開了MNcDNA序列(SEQIDNO:l)(示於本文的圖8A-8C中)，MN胺基酸順序(SEQIDNO:2)(也示於圖8A-8C中)，以及MN基因組序列(SEQIDNO:3)(示於本文的圖9A-9F中)。MN基因包括11個外顯子和IO個內含子。SEQIDNO:1的人MNcDNA序列含有1522個鹼基對(bp)。SEQIDNO:70的MNcDNA序列含有1552bp[EMBL登錄號X66839;Pastorek等(1994)J。示於圖8A-8C中的MN蛋白(SEQIDNO:2)的頭37個胺基酸構成了推定的MN信號肽[SEQIDNO:4。跨膜MN蛋白有胞外(EC)結構域[圖8A-8C(SEQIDNO:5)的胺基酸(aa)38-414)、跨膜(TM)結構域[aa415-434(SEQIDNO:6)j和胞內(IC)結構域taa435-459(SEQIDNO:7)。該胞外結構域在約胺基酸(aa)53-lll(SEQIDNO.8)或優選在約aa52-12510(SEQIDNO:81)處含有蛋白聚糖樣(PG)結構域，在約aa135-391(SEQIDNO:9)或優選在約aa121-397(SEQIDNO:82)處含有碳酸酐酶(CA)結構域。Zavada等WO93/18152和WO95/34650描述了MN-特異性抗體的製備。一種代表性且優選的MN特異性抗體，即單克隆抗體M75(MabM75)，其對應的雜交瘤(VU-M75)保藏在美國模式培養物保藏所(ATCC)(Manassas,VA,USA)，ATCC編號HB11128。M75抗體用來例如在新鮮、冷凍或經福馬林、酒精、丙酮或其他試劑固定的和/或經石蠟包埋和脫蠟的組織樣品中通過蛋白質印跡試驗、放射免疫測定和免疫組化學來發現和鑑定MN蛋白，也可用於容易地鑑定MN抗原。另一種代表性並優選的MN特異性抗體MabMN12由保藏在ATCC名為HB11647的雜交瘤MN12.2.2分泌。Zavada等的WO95/34650的實施例l提供了用MAbM75進行組織的免疫組織化學染色獲得的代表性結果，這些結果證明了MN基因的致癌性。位，包括針對M75mab的重複性表位，特別是胺基酸序列PGEEDLP(SEQIDNO:ll)，該序列是N末端PG區域的4X完全重複序列[Zavada等(2000),見下文l。針對MN12mab的表位也是免疫顯性的。Pastorekova等，Virology,187:620-626(1992)首先報導了M75mab,並在很多美國和外國專利(包括例如Zavada等美國專利No.5，981，711和EP0637336Bl)中具體要求保護，以及與MN/CAIX特異性抗體(多克隆和單克隆抗體及其片段)等一起要求保護。[也參見，Zavada等，美國專利No.5，387，676;5,955,075;5,972,353;5,989,838;6,004,535;6,051,226;6,069,242;6,093,548;6,204,370;6,204,887;6，297，041;和6,297,051;Zavada等，AU669694;CA2,131,826;DE69325577.3;和KR282284。Zavada等的那些美國專利和外國專利通過參考納入本文。CAIX是鋅金屬酶的oc碳酸酐酶家族中的一種高度活性成員，該酶家族催化二氧化碳和碳酸氫鹽之間的可逆轉化[Pastorek等(1994);Opavsky等(1996);Chegwidden等，(2000)，見下文；Wingo等，(2001)，見下文；Pastorekova等(2004)，見下文。CAIX是14種同工型之一，這些同工型存在於哺乳動物中，位於不同的亞細胞位置，包括細胞質(CAI，II，III,VII)、線粒體(CAVA,VB)、分泌小泡(CAVI)和質膜(CAIV,IX，XII，XIV)。一些同功酶分布在多種組織中(CAI，II,CAIV)，其它的同工酶則更局限於特定的器官中(唾液腺中的CAVI),已發現兩種同工型與癌組織有關係(CAIX，XII)[綜述於Chegwidden2000;Pastorekova和Pastorekj第9章，CarbonicAnhydrase:ItsInhibitorsandActivators(Supuran等主編；CRCPress(London等)2004中卜酶活性和動力學性質以及對氨磺醯抑制劑的靈敏度從高(CAII，CAIX,CAXII,CAIV)到低(CAHI)變化[Supuran和Scozzafava(2000)，見下文]。由於不完全保守性活性位點，幾種稱為CA-相關性蛋白的同工型(CA-RPVIII,X，XI)是非催化性的(acatalytic)。屬於相同蛋白家族的遺傳相關性成員的這種特別的變異性為它們在多種生理學和病理過程中的應用創造了基礎。這種催化活性與維持代謝活性組織中的離子和水交換以及酸鹼平衡有重要關係。通過該活性，CA酶類顯著影響呼吸、體液(玻璃體液(vitreoushumor)、胃液、腦脊髓液)的產生、骨吸收、腎酸化等(Chegwidden等2000)。CAIX同功酶綜合了幾種性質，使其成為基礎研究和臨床研究的重要課題。首先，CAIX的表達與各種人腫瘤十分密切相關，而它通常不存在於相應的正常組織[Zavada等，(1993);Liao等，(1994),infra;Turner等，1997，見下文；Liao等，1997，見下文；Saarnio等，1998，見下文；Vermylen等，1999，見下文；Ivanov等(2001)，見下文；Bartosova等，(2002)，等。這主要與腫瘤低氧有關係，腫瘤低氧通過低氧誘導因子(HIF)強烈激活CA9基因的轉錄，該低氧可誘導因子結合於定位在靠近轉錄起始位點的最小CA9啟動子(位置在-10/-3)中的低氧效應元件(HRE)[Wykoff等(2000)，見下文I。HIF轉錄因子通過活化支持弱氧化腫瘤細胞的生存和對低氧應激的適應或導致這些細胞死亡的基因而顯著改變弱氧化腫瘤細胞的表達鐠。因此，低氧選擇了侵襲和轉移能力增加、從而固有地與預後不良及對抗癌治療響應較差相關的、更具侵略性的腫瘤細胞[Harris(2002),見下文J。因為腫瘤低氧是一種重要現象，其很大程度上暗示著癌症的發展及治療(結果)[Hockel和Vaupel(2001)，見下文1，MN非常有可能作為具有預後/前兆價值的一種內在低氧標記物和作為一種有前景的治療靶標[Wykoff等(2000);Wykoff等，(2001)，見下文Beasley等，(2001)，見下文；Giatromanolaki等，(2001)，見下文;Koukourakis等，(2001),見下文;Potter和Harris(2003)，見下文l。CAIX是一種整體的質膜蛋白，其大的胞外部分暴露在癌細胞的表面上，因而能夠被靶向工具(包括特異性單克隆抗體)接近，這對其臨床應用是有利的。而且，CAIX與其他CA同功酶的不同在於CAIX中存在獨特的蛋白聚糖相關性區域(PG),該區域形成胞外CA結構域的N末端延伸，從而消除了與其他同功酶的交叉識別Opavsky等(1996)1。通過調節細胞粘著和控制pH值，CAIX似乎在腫瘤生物學中發揮著活躍的作用(Svastova等，2003，見下文，Svastova等，2004，見下文，Swietach等，2007,見下文)。CAIX參與碳酸氫鹽運輸蛻變中間物質並響應於低氧條件而影響胞外小環境的酸化(Morgan等，2007，見下文，Svastova等，2004，^下文).另外，CAIX的胞內結構域(IC)具有潛在性第三致瘤作用，至少在腎細胞腫瘤中酪氨酸-磷酸化CAIX(通過EGFR介導)與PI-3K(p85)的調節亞基相互作用，導致Akt活化[Dorai等，(2005)，見下文l。由於它的很多潛在活性促使肺瘤生成，靶向CAIX蛋白從而消除其功能預期具有治療效果。然而，關於CAIX的很多基本的分子和功能方面是未知的;其中一個方面是CAIX可能的旁路剪接。旁路剪接是一種非常重要的分子機制，其有助於蛋白的結構多樣化和功能多樣化。旁路剪接常常是差異性外顯子包涵體(differentialexoninclusion)導致的，其造成結構域組成、亞細胞定位、相互作用可能性、信號容量的及其他蛋白水平的改變。通過最近的基因組技術獲得的數據顯示，超過60%的人基因是旁路剪接形成的。還有越來越明顯的一點是旁路剪接變體表達的不平衡可顯著影響細胞表型，並在多種病理學中起作用(Matlin等，2005，見下文)。本發明基於以下發現CA9基因的表達涉及旁路剪接。本文描述了小鼠和人的MNmRNA旁路剪接(AS)變體。發明人證明，腫瘤中人AS變體的豐度小於全長(FL)CA9mRNA，但是可以在正常組織和正常含氧量情況下檢測到。人ASCA9mRNA不含有外顯子8和9，該mRNA編碼截短的CAIX蛋白。因此，ASCAIX不限於質膜並顯示降低的催化活性。在HeLa細胞中過度表達時，ASCAIX降低了低氧誘導的胞外酸化，阻礙HeLa球狀體的生長。由於AS變體可存在於具有正常表型、含氧量正常的細胞中，在用來評定低氧-和腫瘤-相關的CA9基因表達的診斷和/或預後研究中有可能出現假陽性結果。而且，CAIX蛋白的AS形式可能在功能上幹擾FLCAIX形式，在中度低氧的情況下，當FL水平相對較低時尤其如此。發明概述本發明基於以下發現除編碼低氧誘導的、膜-結合和腫瘤相關的MN蛋白的全長(FL)CA9mRNA轉錄物之外，還有編碼ASMN蛋白(ASMN/CAIX或ASCAIX)的組成型產生的旁路剪接(AS)CA9mRNA轉錄物，所述ASMN蛋白不限於質膜。作為本發明治療方面的基礎的另一個發現是，ASCAIX幹擾FLCAIX的功能。獨立於低氧-和腫瘤-的CAIXAS變體產生對CAIX的診斷、預後和治療方面有很多意義。一方面中，本發明涉及與脊推動物、優選哺乳動物、更優選人中MN/CAIX的異常表達相關的肺瘤發生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預後方法，其包括區分全長[FLI和旁路剪接[ASjMN/CA9mRNA或AS和FLMN/CAIX的表達。所述方法可包括使用一個或多個探針和/或引物檢測或檢測並定量FL和/或ASMN/CA9mRNA的表達；優選地，所述方法包括使用(a)探針和/或引物，以檢測全長FLjMN/CA9mRNA，但不檢測旁路剪接[ASMN/CA9mRNA;(b)探針和/或引物，以檢測ASMN/CA9mRNA，但不檢測FLMN/CA9mRNA;和/或(c)探針和/或引物，以檢測FL和ASMN/CA9mRNA。一方面中，本發明的診斷預後方法利用旁路剪接MN/CA9核酸和全長MN/CA9核酸之間的差異，例如，通過將探針靶向存在於ASMN/CA9但不存在於FLMN/CA9mRNA中的剪接點，或靶向不存在於ASMN/CA9mRNA中，但存在於FLMN/CA9mRNA中的核酸序列。類似地，可設計引物對用於例如擴增僅在ASMN/CA9mRNA中發現但未在FLMN/CA9中發現(或反之亦然)的區域。鑑於本公開內容，本領域技術人員將能設計任意數目的有用於本發明的診斷/預後方法的探針和/或引物/引物對。在人腫瘤發生前/腫瘤性疾病的優選診斷/預後方法中，本發明的一個或多個特別優選的探針和/或引物選自SEQIDNOS:97-101及與SEQIDNOS:97-101至少80%同源(更優選與SEQIDNOS:97-101至少90%)的核酸序列。所述方法包括使用一個或多個探針和/或引物來檢測或檢測並定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達，還可包括測定FL:ASMN/CA9mRNA的比率或FL:ASMN/CA9mRNA比率隨時間的變化。此外，所述ASMN/CA9mRNA表達可用於指示MN/CA9基因正常表達，所述FLMN/CA9mRNA表達可用於指示MN/CA9基因異常表達，特別是所述AS和/或FLMN/CA9mRNA表達的水平，或者或另外地，所述ASMN/CA9mRNA表達可用於指示含氧量正常情況下MN/CA9基因表達，所述FLMN/CA9mRNA表達可用於指示低氧的情況下MN/CA9基因表達。此外，所述MNAS和/或FLmRNA表達的水平將具有特定的指示值。所述包括使用一個或多個探針和/或引物來檢測或檢測並定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達的方法還可包括使用核酸擴增方法，優選選自以下的擴增方法PCR、RT-PCR、實時PCR或實時定量RT-PCR以及本領域技術人員已知的同等核酸擴增方法。或者，所述用於檢測或檢測並定量FL和/或ASMN/CA9mRNA表達的方法可包括使用微陣列晶片。例如，所述微陣列晶片可包含結合於全長[FLIMN/CA9mRNA但不結合旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA的探針，和/或結合於ASMN/CA9mRNA但不結合FLMN/CA9mRNA的探針，其中策略地使所述探針定位在此類晶片上在本領域技術人員的能力範圍內。另一個方面，本發明涉及與哺乳動物中MN/CAIX異常表達相關的肺瘤發生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預後方法，包括區分FL和ASMN/CAIX的表達。優選地，所述方法包括使用一種或多種抗體區分腫瘤發生前/贅生性組織(neoplastictissue)中FL和ASMN/CAIX的表達。所述方法可包括檢測或檢測並定量所述組織中的ASMN/CAIX;還可包括測定所述組織中FLMN/CAIX水平與ASMN/CAIX水平的比率。此外，所述FL:ASMN/CAIX比率可用來指示所述組織中低氧的存在或程度。本發明一種優選實施方案中，該診斷和/或預後方法包括檢測或檢測並定量脊推動物組織中的FLMN/CAIX和ASMN/CAIX，其包括以下步驟(a)使所述樣品同時或按序地與至少兩種抗體、至少兩種抗原結合抗體片段、或抗體和抗原-結合抗體片段的混合物接觸，其中至少一種抗體/抗體片段特異性結合於FLMN/CAIX蛋白但不結合ASMN/CAIX蛋白，其中至少一種其他抗體/抗體片段特異性結合於FL和ASMN/CAIX兩者；(b)檢測並定量所述樣品中的抗體/抗體片段;和(c)比較所述差異結合性(differentiallybinding)抗體/抗體片段的結合，以測定FLMN/CAIX和ASMN/CAIX的相對水平。優選地，所述特異性結合於FLMN/CAIX但不結合ASMN/CAIX的抗體/抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結構域具有特異性;所述特異性結合FL的蛋白聚糖樣(PG)結構域具有特異性。更優選，所述對MN/CAIX的CA結構域具有特異性的抗體是是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生的V/10單克隆抗體；所述對MN/CAIX的PG結構域具有特異性的抗體是保藏在美國模式培養物保藏所(ATCC)、ATCC名稱編號為HB11128的雜交瘤VU-M75產生的M75單克隆抗體。此外，本發明涉及與脊推動物中MN/CAIX異常表達相關的腫瘤發生前/肺瘤性疾病的診斷和/或預後方法，包括檢測或檢測並定量合適的脊推動物組織樣品中的全長[FLlMN/CAIX蛋白但非旁路剪接[ASMN/CAIX蛋白，所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品與抗體或抗體片段接觸，其中所述抗體或抗體片段特異性結合於FLMN/CAIX但不結合ASMN/CAIX;和(b)檢測並定量所述樣品中所述抗體/抗體片段的結合。所述脊推動物優選哺乳動物，所述哺乳動物更優選人。特異性結合於FLMN/CAIX但不結合ASMN/CAIX的示例性且優選的抗體或抗體片段是對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結構域具有特異性的抗體或抗體片段。更優選，所述對MN/CAIX的CA結構域具有特異性的抗體是是保藏在比利時根特、登錄號(accessionNo.)為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生的V/10單克隆抗體。本發明特別優選的實施方案涉及與脊推動物(優選哺乳動物)中MN/CAIX異常表達相關的肺瘤發生前/肺瘤性疾病的診斷和/或預後方法，其包括檢測或檢測並定量脊推動物(優選哺乳動物)的腫瘤發生前/贅生性樣品(neoplasticsample)中的全長[FLMN/CA9mRNA但非旁路剪接[ASMN/CA9mRNA，包括使所述樣品中的mRNA與特異性結合FLMN/CA9mRNA但不結合ASMN/CA9mRNA的引物或探針接觸。本發明還涉及用來區分哺乳動物中旁路剪接[ASjMN/CA9mRNA和全長[FLjMN/CA9mRNA表達的核酸探針和/或引物。如上所述，此類基於本發明公開內容的探針/引物的設計在本領域技術人員的能力範圍之內。優選地，其中所述哺乳動物是人，所述探針和/或引物用來檢測ASMN/CA9mRNA但不檢測FLMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結合於MN/CA9基因的外顯子7和10的剪接點的核酸。更優選，所述探針或引物具有SEQIDNO:16101的序列或與SEQIDNO:101至少80%同源(更優選與SEQIDNO:101至少90%同源)的序列。或者，其中所迷哺乳動物是人，所述探針或引物用來檢測FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA，所述探針或引物包含結合於人MN/CA9基因的外顯子8或外顯子9的核酸，或結合於人MN/CA9基因外顯子7和8的剪接點的核酸、或結合於人MN/CA9基因外顯子8和9的剪接點的核酸、或結合於人MN/CA9基因外顯子9和10的剪接點的核酸。更優選，所述用於檢測人FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA的探針或引物具有SEQIDNO:100的序列或與SEQIDNO:100至少80%同源(更優選與SEQIDNO:100至少卯％同源)的序列。本發明還涉及表達此類探針或引物的載體、和/或包含此類載體的宿主細胞、包含一個或多個此類探針的微陣列晶片。本發明還涉及用來區分哺乳動物中旁路剪接[ASMN/CA9mRNA和全長[FLMN/CA9mRNA表達的探針對和/或引物對。所述探針對和/或引物對可用於檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA但不檢測全長[FL人MN/CA9mRNA。用於檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA但不檢測全長FL]人MN/CA9mRNA的示例性且優選的探針對或引物對由SEQIDNOS:99和101、或與SEQIDNOS:99和101至少80%同源(更優選與SEQIDNOS:99和101至少90%同源)的核酸序列組成。或者所述探針對和/或引物用於檢測全長[FL人MN/CA9mRNA但不檢測旁路剪接[AS1人MN/CA9mRNA。用於檢測FLmRNA的示例性且優選的探針對或引物對僅由SEQIDNOS:99和100、或與SEQIDNOS:99和100至少80%同源(更優選與SEQIDNOS:99和100至少90%同源)的核酸序列組成。在本發明另一種實施方式中，探針對和/或引物對用來檢測AS人MN/CA9mRNA和FL人MN/CA9mRNA兩者，所述ASmRNA和所述FLmRNA的長度不同。優選地，所述用於檢測AS和FL人MN/CA9mRNA兩者的探針對和/或引物對僅由SEQIDNOS:97和98、或與SEQIDNOS:97和98至少80%同源(更優選與SEQIDNOS:97和98至少90%同源)的核酸序列組成。本發明還涉及編碼哺乳動物中的旁路剪接[AS]MN/CAIX的分離核酸。優選地，所述ASMN/CAIX的分子量為約43-約48千道爾頓。本發明還涉及表達此類核酸或其片段的載體、包含此類載體的宿主細胞和/或涉及通過重組、合成或其他生物學方法產生ASMN/CAIX蛋白和多肽。所述分離核酸編碼的示例性且優選的AS形式的MN/CAIX的特徵還在於，它與對MN/CAIX的PG結構域具有特異性的抗體特異性結合，但不與對MN/CAIX的CA結構域具有特異性的抗體結合。本發明更優選的實施方案中，所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結合，但不與V/10單克隆抗體結合，所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌，所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生。更優選，所述哺乳動物是人，所述分離核酸特徵在於刪除了對應於外顯子8和外顯子9的核香酸。更優選，所迷分離的人核酸具有SEQIDNO:108的核酸序列、或與SEQIDNO:108至少80%同源(更優選與SEQIDNO:108至少90%同源)的分離核酸。優選地，由SEQIDNO:108或非常相關的序列編碼的示例性AS形式的人MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結合，但不與V/10單克隆抗體結合，所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌，所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生。此外，本發明涉及特異性結合ASMN/CAIX但不結合其他形式的MN/CAIX的抗體或抗原結合抗體片段。例如，此類AS-特異性抗體可以是特異性結合AS形式的MN/CAIX但不特異性結合FL形式的MN/CAIX的抗體或抗原-結合抗體片段；或特異性結合ASMN/CAIX但不特異性結合可溶性MN/CAIX(s-CAIX)的抗體或抗原結合抗體片段。本文還公開了用於治療哺乳動物肺瘤發生前/腫瘤性疾病的治療方法，其中所述疾病與MN/CAIX的異常表達有關，這些方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的組合物，該組合物包含相對於全長[FLlMN/CAIX水平提高旁路剪接[ASMN/CAIX水平的物質。所述ASMN/CAIX還包括幹擾FLMN/CAIX活性的ASMN/CAIX的任何蛋白或多肽片段。優選地，所所述物質可以優選處於生理學上可接受的載體中的ASMN/CAIX本身、表達ASMN/CA9mRNA的栽體、阻斷FLMN/CAIX但非ASMN/CAIX表達的反義寡核苷酸、表達所述反義寡核苷酸的載體、FLMN/CA9同工型特異性siRNA、或表達所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA的載體。例如，所述物質可以是耙向MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點的FLMN/CA9同工型特異性siRNA。或者，所述物質是調節AS和/或FLMN/CA9前mRNA(pre—mRNA)剪接的反義寡核苷酸。另一方面，本發明涉及相對於全長[FL1MN/CAIX水平提高旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸用於治療與MN/CAIX異常表達相關的腫瘤發生前/腫瘤性疾病。例如，所述寡核苷酸可以是與FLMN/CA9前inRNA互補但不與ASMN/CA9前mRNA互補的寡核苷酸；優選地，所述寡核苷酸與MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點互補。或者，所述相對於FLMN/CAIX水平提高ASMN/CAIX水平的寡核苷酸可以是與FLMN/CA9mRNA互補但不與ASMN/CA9mRNA互補的siRNA。本發明還涉及一種體外方法，其用於鑑定能夠調節旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的物質，所述方法包括使表達ASMN/CAIX的細胞與懷疑調節細胞中所述ASMN/CAIX水平的物質接觸，檢測並定量所述ASMN/CAIX水平的變化。參考文獻以下參考文獻被本文引用，或者提供了涉及MN/CA9基因和MN/CAIX蛋白、或旁路剪接mRNAs的最新信息。所有列出的參考文獻以及本文引用的其他參考文獻均通過參考具體地納入本文。Anderson等.，25:61-69(2006)Alvarez-P6rez等.，3^4GMJ18:293-301(2005)Bartosova等.，/屍fl,Ao/.197:314-321(2002)Beasley等.，Cfl/i"r及"61(13):5262-5267(2001)Cecchi等.，/3/^/CAew48:4834-41(2005)Chegwidden等.，￡%590:343-363(2000)Chrastina等.，/105:873-881(2003)Dorai等.，/Owicc41:2935-2947(2005).Garcia-Blanco,C"/rAfo/77^r.，7(5):476-82(2005)Giatromanolaki等.，Or"c^及槓61(21):7992-7998(2001)Gothie等.，C/^柳275:6922-6927(2000)Gut等.，GW/w"&油5J123:1889-1903(2002)HarrisAL.，及evCer2:38-47(2002)He等.，0腳g麼25:192-2202(2006)Hockd和Vaupel，S簡汰O歸,.28(2Suppl8):36-41(2001)Ivanov等.，/戶W/^/.158(3):905-919(2001)Kaluz等.，Owice,及^y62:4469-4477(2002)Kivela等.，『of/rf/Gfl對roe"&ro/11:155-163(2005)Koukourakis等.，C7,w.7(11):3399-3403(2001)Liao等.，j附./戶fl&o/.145(3):598-609(1994)Liao等.，57:2827-2831(1997)Lieskovska等.，A^o//"s廳46:17-24(1999)Matlin等.，iV加及evO/Z6:386-398(2005)Morgan等.,X柳/iV^wo/-CW/屍奵w》/293(2):C738-C748(2007)Olive等.，Cflcw61:8924-8929(2001)Opavsky等.，G^wo柳/"33(3):480-487(1996)Ortova-Gut，G""幽e政油^v123:1889-1903(2002)Pajares等.，丄fl/icWOwo/.，8(4):349-57(2007)Pastorek等.,9:2877-2888(1994)Pastorekova和Pastorek，第9章,CarbonicAnhvdrase:ItsInhibitorsandActivators[Supuran等主編.；CRCPress(London等)2004Pastorekova等.，腸一187:620-626(1992)Pastorekova等.，G^麼Wm/柳112:398-408(1997)Pastorekova等.，/fl似6Af^ZC7^柳19:199-229(2004)PotterandHarris,醜r/89:2-7(2003)Robertson等.，Cfl歸/"紐64:6160-6165(2004)Robinson和Stringer,/CW/SW114:853-865(2001)Romero-Ramirez等.，Cflc"Wey64:5943-5947(2004)Roy等.，iy"c/爿"V/iM33:5026-5033(2005)Saarnio等.，^附153:279-285(1998)Skotheim和Nees，/"f/別oc臉柳CW/5/o/"39(7-8):1432-49(2007)Srebrow和Kornblihtt，/Ce//5W.,119(Pt13):2635-41(2006)Supuran和Scozzafava，/E"矽附e/"A仏15(6):597-610(2000)Svastova等.，Ex/CW/及^2卯332-345(2003)Svastova等.，/^5S丄"fe,s577:439-445(2004)Swietach等.，CflwcerAf^w^s^及ev，DOI10.1007/s10555-007-9064-0(2007)Taconelli等.，CW/6:347-60(2004)Turner等.，〃《附朋戶"Z/w/.28(6):740-744(1997)VenablesJP，偷五咖w28:378-386(2006)Vermylen等.，及^p/r./14:806-811(1999)Wilton和Fletcher,開了MNcDNA序列[SEQIDNO:1(示於本文圖8中)，MN胺基酸順序[SEQIDNO:2(也示於圖8中)，以及MN基因組序列[SEQIDNO:3(示於本文圖9中)。MN基因包括11個外顯子和10個內含子。示於圖8中的MNcDNA的ORF能編碼459個胺基酸的蛋白，計算分子量為49.7kd。MN蛋白的總體胺基酸組成偏酸性(ratheracidic)，預測pi為4.3。通過雙向電泳和而後的免疫印跡對CGL3細胞自身產生的MN蛋白進行分析顯示，與計算機預測一致，MN是一種酸性蛋白質，存在幾種等電位形式，pi範圍是4.7-6.3。示於圖8中的MN蛋白的頭37個胺基酸是推定的MN信號肽[SEQIDNO:4。MN蛋白具有胞外結構域[圖8的胺基酸(aa)38-414[SEQIDNO:5、跨膜結構域[aa415434;SEQIDNO:6j和胞內結構域[aa435-459;SEQIDNO:7。胞外結構域含有蛋白聚糖樣結構域[aa53-111:SEQIDNO:8和碳酸酐酶(CA)結構域[aa135-391;SEQIDNO:9。CA結構域對錨定獨立性(anchorageindependence)非常重要，而TM錨和IC尾對該生物效應不是必要的。MN蛋白在轉染的細胞中還能夠造成質膜皺褶，似乎參與細胞對固相支持體的附著。數據證明MN參與調控細胞增殖、粘著和細胞間通訊。MN基因一克隆和測序圖8A-C提供全長MNcDNA克隆的核苷酸序列[SEQIDNO:1。圖9A-F提供MN完全基因組序列[SEQIDNO:3。建議的MN啟動子的核苷酸序列[SEQIDNO:24]示於圖9A-F(nt3001-3540)和圖10中。應理解，由於遺傳密碼簡併，即，多於一種密碼子編碼一個胺基酸[例如，密碼子TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG各編碼胺基酸亮氨酸(leu)J，核苷酸序列例如SEQIDNOS:1和3的變化(其中一種密碼子被另一種密碼子代替)可以產生與本發明蛋白或多肽基本上等同的蛋白或多肽。所有這些MNcDNA核苷酸序列和互補核酸序列的變化均包括在本發明範圍內。還應理解，本文描述並示於圖8、9和10中的核苷酸序列僅代表本文分離和描述的cDNA、基因組和啟動子核苷酸序列的精確結構。預期將發現經稍微修飾的核苷酸序列或可通過本領域已知技術來對其修飾，以編碼基本上相似或同源的MN蛋白和多肽(例如具有相似的表位的那些MN蛋白和多肽)，就本發明目的而言，認為此類核苷酸序列和蛋白/多肽是等同的。i人為具有等同密碼子的DNA或RNA在本發明範圍內，這些DNA或RNA是編碼與MN蛋白/多肽同源或基本同源的蛋白/多肽的合成核酸序列，以及能夠在嚴格條件下與所述示例性序列SEQ.ID.NOS.1、3和24j雜交的那些核酸序列，或如果不是由於遺傳密碼的簡併性將能夠在嚴格雜交條件下與所述cDNA核酸序列雜交的那些核酸序列。認為本文指出的核酸序列的修飾和變化產生了與示例性MN序列及其片段基本上相同的序列。只有具有至少80-90%(優選至少90%)的同源性的非常密切相關的核普酸序列才能夠在嚴格條件下彼此雜交，示於圖8中的MNcDNA序列和對應的人碳酸酐酶II(CAII)cDNA的序列比較表明，這兩種序列間的同一性不足以使具有25個或更多核苷酸的CAIIcDNA序列片段在嚴格雜交條件下與MNcDNA雜交，反之亦然。本文考慮的嚴格雜交條件與本領域理解的標準雜交條件一致。例如，通常理解嚴格條件包括相對低鹽和/或高溫條件，例如0.02M-0.15MNaCl，溫度50x:-70x:。可通過加入遞增量的甲醯胺(其作用是像提高溫度一樣使雜交雙鏈不穩定)使較不嚴格的雜交條件(例如0.15-0.9M鹽、溫度20X:-55匸)變得更加嚴格。示例性嚴格雜交條件描述在Sambrook等，MolecularCloning:4LaboratoryMa畫l.第1.91和9.47-9.51頁(第二版，ColdSpringHarbor31LaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989);Maniatis等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第387-389頁(ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,N.Y.;1982);Tsuchiya等，OralSurgery,OralMedicine,OralPathology,71(6、:721-725(1991年6約)；美國專利No.5,989,838、美國專利No.5,972,353、美國專利No.5,981,711和美國專利No.6,051,226。含有MN基因組序列(SEQIDNO:3)的質粒一A4a克隆及XE1和XE3亞克隆於1995年6月6日保藏在美國模式培養物保藏所(ATCC),ATCC保藏號分別為97199、97200和97198。完整的MN基因組區域的外顯子-內含子結構重疊克隆的全序列含有10,898bp(SEQIDNO:3)。人MN基因含有11個外顯子以及2個上遊的、6個內含子中的(intronic)Alu重複元件。除了第一個外顯子為445bp外，所有的外顯子都較小，為27-191bp。內含子大小為89-1400bp。CA結構域由外顯子2-8編碼，而外顯子1、lO和ll分別對應MN/CAIX蛋白的蛋白聚糖樣結構域、跨膜錨和胞質尾。下表1列出了與包括AG-GT基序的共有剪接序列[MountNucleicAcidsRes.10:459-472(1982)1—致的剪接供體和受體序列。tableseeoriginaldocumentpage33Zavada等，WO95/34650描述了定位MN基因轉錄起始和終止位點的方法步驟。核糖核酸酶保護試驗用於MN基因5'末端的精細定位。探針是均勻標記的470個核苷酸的RNA(核苷酸-205至+265)[SEQIDNO:66j，將其雜交於表達MN的HeLa和CGL3細胞中的總RNA,在測序凝膠上分析。分析顯示，MN基因轉錄在多位點起始，最長的MN轉錄物的5'末端比之前用種族鑑定的長30核苷酸。小鼠Cfl,9cDNA先前已經描述了編碼小鼠CAIX的cDNA和基因的克隆和表徵[Ortova-Gut等，Gastroenterology,123:1889-1卯3(2002)。用衍生自人cDNA的引物和從C57BL/6J小鼠胃中分離到的模板RNA進行RT-PCR從而分離小鼠C"屍9cDNA片段。在5，/3，兩個方向進行cDNA末端的快速擴增以獲得全長cDNA。它包括1982bp，由以下區域組成49bp的5，非翻譯區，1311bp的開放讀框和622bp的3'非翻譯序列(保存在EMBL資料庫中，登錄號為AJ245857;SEQIDNO:71)。Cflr9cDNA能編碼437個胺基酸的蛋白(保存在EMBL資料庫中，登錄號為CAC80975(Q8VDE4);SEQIDNO:73)，理論分子量為47.3kDa。該小鼠蛋白與它的人同源物顯示69.5%的序列同一性，並且具有相似的預測結構域排列[Opavsky等(1996)]。胺基酸(aa)1-31(SEQIDNO:74)對應於信號肽。成熟蛋白質的N-末端胞外區(aa32-389)(SEQIDNO:75)由以下區域組成蛋白聚糖樣區域(aa48-107)(SEQIDNO:76)、碳酸酐酶結構域(aa112-369)(SEQIDNO:77)。C-末端區域(aa390-437)(SEQIDNO:78)由以下區域組成跨膜錨(aa390-411)(SEQIDNO:79)和短的胞質尾區(aa412-437)(SEQIDNO:80)。小鼠和人CAIX之間的大多數序列差異發現於蛋白聚糖樣(PG)區域內，而CA結構域顯示保守性最高。然而，涉及酶活性位點的5個關鍵胺基酸(His94,His96,Glu106,His119,Thr199)[Christianson和Cox，Annu.Rev.Biochem.，68:33畫57(1999)中，在人CAIX中都是保守的，但在小鼠同工酶中有一個發生了變化(Thr'"卄Ser)。儘管存在該取代，但小鼠CAIX仍然結合於氨磺醯瓊脂糖，暗示它可能具有酶活性。CflWcDNA的可用性允許分析小鼠組織中CflWmRNA的表達才莫式。利用設計用來檢測編碼CA結構域的區域的3'部分的170bp核糖探針(riboprobe)進行核糖核酸酶保護試驗(RNP)。正如基於在人和大鼠組織中的分布所預期的，在小鼠胃中檢測到最高水平的Ozr9mRNA。在小腸和結腸中發現了中等水平的Qir9mRNA，而腎和腦顯示非常弱的表達。肝臟和脾顯示陰性結果。值得注意的是，RNP信號也存在於E18.5胚胎日齡的小鼠胚胎中，^"旦不存在於胚胎幹細胞和E10.5胚胎中。這可顯示CAIX在小鼠胃腸道發育過程中的作用。小鼠Ow9基因的結構為了分離C"r9基因並測定其結構，使用全長G^9cDNA篩選小鼠胚胎幹細胞129/01a基因組文庫(載體為pBAC108L)。通過對小鼠野生型基因組DNA的限制性內切酶圖析和DNA印跡分析，證實獲得一個BACM-355(G13)克隆，它含有完整的CVi,9基因組序列。將來源於該克隆的三個重疊基因組片段亞克隆入pBluescriptIIKS。基因組序列(GenBank登錄號AY049077;SEQIDNO:72)分析顯示，OirP基因覆蓋了6.7kb的小鼠基因組，由11個外顯子和IO個內含子組成。內含子的分布和外顯子與蛋白結構域的關係與人中對應的基因類似[Opavsky等(1996)]。Southern雜交模式指出Ow9是單拷貝基因。覆蓋5.9kb並跨越啟動子區域和外顯子1-6的EcoRI-HindIII片段用於構建目標載體。MN蛋白和/或多肽短語"MN蛋白和/或多肽"(MN蛋白/多肽)在本文定義為指MN基因或其片段編碼的蛋白和/或多肽。根據本發明的示例性且優選的MN蛋白的推定的胺基酸序列示於圖8中。優選的MN蛋白/多肽是與圖8中所示的MN蛋白具有顯著同源性的那些蛋白和/或多肽。例如，此類顯著同源的MN蛋白/多肽是與本發明的MN-特異性抗體(優選MabsM75、V/10、MN12、MN9和MN7或它們的等同物)反應的那些。分泌M75Mab的VU-M75雜交瘤於1992年9月17日保藏在ATCC，保藏號為HB11128。"多肽"或"肽"是通過肽鍵共價連接的一串胺基酸，本文認為由50個或更少的胺基酸組成。"蛋白"在本文定義為由超過50個胺基酸組成的多肽。術語多肽涵蓋術語肽和寡肽。本文所用的"ASMN/CAIX"、"ASCAIX"或"ASMN"指由MN/C49mRNA的AS形式編碼的蛋白和/或多肽。MN蛋白顯示幾種有趣的特點細胞膜定位、HeLa細胞中的細胞密度依賴性表達、與HeLax成纖維體細胞雜種的致瘤表型相關、以及在很多人贅生性組織以及其他組織中表達。MN蛋白可直接在贅生性組織切片中找到，但通常在相應的正常組織中找不到(如上所述在正常胃黏膜和膽嚢組織中例外)。MN有時也在顯示發育不良和/或惡性的組織樣本的形態上看上去正常的區域中表達。綜合起來，這些特點表明，MN參與調控細胞增殖、分化和/或轉化。可以理解，體內贅生性細胞產生的蛋白或多肽可能與細胞培養中的腫瘤細胞或轉化的細胞所產生的蛋白或多肽序列不同。因此，具有改變的胺基酸序列(包括但不限於胺基酸取代、延伸、缺失、截短及它們的組合)的MN蛋白和/或多肽均落在本發明範圍內。也可以理解，存在於體液內的蛋白可經歷降解過程，例如蛋白水解過程；因此，可在體液(例如血清)中發現顯著截短的MN蛋白和MN多肽。短語"MN抗原"在本文用於涵蓋MN蛋白和/或多肽。還可以理解，可通過遺傳技術來修飾MN蛋白和多肽的胺基酸序列。可刪除或取代一個或多個胺基酸。此類胺基酸改變可不引起該蛋白或多肽的生物活性的任何可測量的變化，並產生本發明範圍內的蛋白或多肽以及MN突變蛋白。根據本發明，可通過多種方式製備本發明的MN蛋白和多肽，例如，可通過重組、合成或生物學方法(即酶法和/或化學方法裂解較長的蛋白和多肽)來製備。優選的MN蛋白製備方法是重組方法。MN蛋白和多肽重組體的產生製備MN蛋白(例如示於圖8中的MN蛋白或其片段)的一種代表性方法是將全長MNcDNA或其合適的片段插入合適的表達載體。Zavada等WO93/18152(見上文)中描述了使用部分cDNA在載體pGEX-3X(Pharmacia)中生產融合蛋白GEX-3X-MN(現在稱為GST-MN)。非糖基化GST-MN(MN融合蛋白MN穀胱甘肽S-轉移酶)來自XL1-Blue細胞。Zavada等WO95/34650描述了使用表達質粒pEt-22b[NovagenInc.;Madison，WI(USA)1從昆蟲細胞表達糖基化的MN蛋白和從大腸桿菌表達非糖基化MN蛋白而進行的重組體生產。用重組杆狀病毒表達載體感染昆蟲細胞。在杆狀病毒-感染的sf9細胞中重組產生糖基化的MN20-19蛋白[Clontech;PaloAlto，CA(USA)。MN-特異性抗體的製備本文定義的術語"抗體"不僅包括完整抗體，而且包括抗體的生物學活性片段，優選含有抗原結合區域的片段。對MN蛋白和另一種組織特異性抗原均具有特異性的雙特異性抗體也包括在抗體的定義中。可用有用於本發明方法中的抗體可通過常規方法製備和/或通過遺傳工程製備。抗體片段可以是經過遺傳工程化的，優選來自輕鏈和/或重鏈(Vu和VL)的可變區，包括高變區，更優選來自Vh和VL兩種區域。例如，本文所用術語"抗體"包括多克隆和單克隆抗體及其生物學活性片段，包括"一價"抗體及其它可能性；Fab蛋白，包括Fab'和共價或非共價聚集的F(ab)2片段；單獨的輕鏈或重鏈，優選重鏈和輕鏈的可變區(Vh和Vl區域)，更優選包括高變區或者稱為Vh和VL區的互補決定域(CDRs)l;F。蛋白；能結合多於一種抗原的"雜合"抗體；恆變區嵌合體(constant-variableregionchimeras);帶有不同來源的重鏈和輕鏈的"複合"免疫球蛋白；用標準重組技術和寡核苷酸定向誘變技術[Dalbadie-MacFarland等，"Oligonucleotide-directedmutagenesisasageneralandpowerfulmethodforstudiesofproteinfunction,"PNASUSA79:6409(1982)]製備的特異性及其他特徵改進的"改變型"抗體。對於很多用途，特別是藥物用途或體內示蹤而言，部分或更優選地，特用本領域公知方法製備此類人源化抗體/抗體片段。可用任何常規方式將本發明的用於鑑定MN蛋白/多肽的抗體標記，例如用酶，例如辣根過氧化酶(HRP)、螢光化合物或用放射性同位素，例如125I以及很多其他標記。根據本發明的一種優選的標記是125I，優選的抗體標記方法是用氯胺-T。[Hunter,W.M""Radioimmunoassay,":HandbookofExperimentalImmunology14.1-14.40頁(D.W.Weir編；Blackwell，Oxford/London/Edinburgh/Melbourne;1978)。其他的示例性標記可包括例如別藻藍蛋白及藻紅蛋白等。Zavada等WO93/18152和WO95/34650詳細描述了產生MN-特異性抗體的方法以及製備代表性MN-特異性抗體，如M75、MN7、MN9和MN12單克隆抗體的詳細步驟。表位MAb對含有表位的肽的親合力取決於具體情況，例如，所述肽是否是短序列(4-6aa)，或是否這種短肽的一側或兩側側接了較長的aa序列，或在測試表位時，肽是否在溶液中或固定在表面上。因此，本領域技術人員能夠預期，本文描述的MN特異性MAbs的代表性表位將根據所用的MAb的具體情況而不同。術語"對應於MN蛋白多肽的表位"應理解為包括這種實際的可能性，即，在有些情況下，天然存在的蛋白或多肽的胺基酸序列變化可能是抗原性的，並帶來抗肺瘤性疾病的保護性免疫和/或抗致瘤性作用。可能的序列變化包括但不限於胺基酸取代、延伸、缺失、截短、插入及它們的組合。假設含有這些胺基酸序列變化的蛋白或多肽是免疫性的，並且這些多肽或蛋白引發的抗體在作為疫苗給藥時，與天然存在的MN蛋白和多肽交叉反應的程度足夠提供保護性免疫和/或抗致瘤性活性，則此類胺基酸序列變化均落在本發明範圍內。PG結構域和鄰近區域的免疫顯性表位如上所述，全長CAIX的胞外結構域含有PG和CA結構域以及一些間隔區或也許有一些絞鏈區。CAIX免疫顯性表位主要在PG區域中，在大約aa53-111(SEQIDNO:8)或在大約aa52國125(SEQIDNO:81)，現在認為優選在大約aa52-125(SEQIDNO:81)。CAIX的免疫顯性表位可位於鄰近PG區域的區域內。例如，aa36-51(SEQIDNO:21)的表位認為是免疫顯性表位。主要的CAIX免疫顯性表位是針對M75mab的表位。M75單克隆抗體被認為是針對CAIX的蛋白聚糖樣(PG)區域的N-末端中的免疫顯性表位。胺基酸序列的比對說明MN/CAIX蛋白的PG區域(aa53-lll)[SEQIDNO:8J和人聚集蛋白聚糖(aa781-839)[SEQIDNO:lOj之間有顯著同源性。M75的表位已鑑定為胺基酸序列PGEEDLP(SEQIDNO:11)，其是CAIX的氨基末端PG區域中的4x相同的重複[Zavada等(2000)]。也可與M75mab結合的非常相關的表位(這些也是示例性的免疫顯性表位)包括例如，可在圖8A-8C(顯示預測的CAIX胺基酸序列)的胺基酸(aa)61-96(SEQIDNO.12)中發現的免疫顯性6X串聯重複。PG結構域中的免疫顯性串聯重複表位的變化包括GEEDLP(SEQIDNO:13)(aa61-66、aa79-84、aa85-90和aa91-96)、EEDL(SEQIDNO:14)(aa62-65、aa80-83、aa86-89、aa92-95)、EEDLP(SEQIDNO:15)(aa62-66、aa80-84、aa86-卯、aa92-96)、EDLPSE(SEQIDNO:16)(aa63-68)、EEDLPSE(SEQIDNO:17)(aa62-68)、DLPGEE(SEQIDNO:18)(aa82-87、aa88-98)、EEDLPS(SEQIDNO:19)(aa62-67)和GEDDPL(SEQIDNO:20)(aa55-60)。其他的免疫顯性表位可包括例如，aa68-91(SEQIDNO:22)。單克隆抗體MN9和MN12被認為是分別針對氨基末端PG區域SEQIDNOS:19-20內的免疫顯性表位。MN7單克隆抗體可針對鄰近PG區域位於圖8A-8C的aa127-147(SEQIDNO:23)的免疫顯性表位。CA結構域(SEQIDNO:9)內優選的表位來自約aa279-291(SEQIDNO:67)。胞內結構域(IC結構域(SEQIDNO:7)內優選的表位來自於約aa435國450(SEQIDNO:68)。SEQIDNO:69(圖8A-8C的aa166-397)被認為是CA結構域的一種重要的抗原成分。CA結構域內有幾個抗原位點。在CAIX-缺失小鼠中已製備了四組CAIX特異性單克隆抗體，以使它們針對CA結構域；其中三組在SEQIDNO:69內。抗原位點還可部分地位於胺基酸135-166(SEQIDNO:84)上。特利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生的V/10單克隆抗體。試驗篩選組織中的AS和FLMN/CAIX表達的試驗這些方法可包括在取自診斷患有腫瘤發生前/腫瘤性疾病的病人的樣品中篩選AS和/或FLMN/CA9基因表達產物(如果有的話)；MN/CA9基因表達產物可以是AS或FL形式的MN蛋白、MN多肽、編碼MN蛋白或多肽的mRNA、對應於編碼MN蛋白或多肽的mRNA的cDNA等。可使多種形式適合用於本發明的方法。例如可通過核酸擴增方法例如使用PCR、RT-PCR、實時PCR、或實時定量RT-PCR或通過利用微陣列晶片進行AS和/或FLMNmRNA的檢測和定量。AS和/或FLMN蛋白或MN多肽的檢測和定量可通過以下試驗進行蛋白質印跡、酶聯免疫吸附試驗、放射免疫測定、竟爭免疫測定、雙抗體夾心試驗、免疫組織化學染色試驗、凝集試驗、螢光免疫測定、使用免疫金的免疫電子和掃描顯微鏡法以及本領域通常所知的其他試驗。這些試驗中MNAS和/或FL基因表達產物的檢測可通過本領域已知的常規方法來進行。核酸探針和/或引物本發明的核酸探針和/或是含有與圖8所示MNcDNA序列[SEQIDNO:l]或其他的MN基因序列(例如圖9A-F所示的完整基因組序列[SEQIDNO:31)互補或基本上互補的序列的那些。短語"基本上互補"在本文定義為本領域充分理解的含義，因此用在標準雜交條件的背景(context)中。可調節雜交條件的嚴格性以控制互補的精確性。如果兩個核酸在嚴格雜交條件下彼此雜交，則這兩個核酸是例如基本上彼此互補的。如上所述，只有具有至少為80-90%(優選至少90%)的同源性的非常相關的核苷酸序列才會在嚴格條件下彼此雜交。可用於本發明的尤其優選的探針和/或引物是區分全長[FL]和旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA表達的探針和/或引物。很多最近的文章提供了有關癌症中的旁路剪接的一般信息和有關用於檢測癌症相關基因表達的mRNA變體的特異性探針和/或引物設計的具體信息，根據這些信息，可設計用於檢測AS和/或FLCA9mRNA變體的探針和/或引物[參見，例如Matlin等，NatRevMolCellBiol,6:386-398(2005);VenablesJP，BioEssavs,28:378-386(2006);Skotheim和Nees,IntJBiochemCellBiol.,39(7-8):1432-1449(2007);Srebrow和Kornblihtt，JCellSci.,119fPt13):2635-2641(2006);Gothie等.，JBiolChem,275:6922-6927(2000);Robinson等"JCellSci.,114:853-865(2001);He等.，Oncogene,25:2192-2202(2006);Roy等.,NucleicAcidsRes.,33(16):5026-5033(2005);Taconelli等.，CancerCell,6:347-360(2004)。一種方法中，僅用於檢測FLCA9mRNA的至少一用於檢測ASCA9mRNA的至少一種探針或引物來源於旁路剪接產生的結點。例如，人FLMN/C45Mt異性探針/引物可包含以充分的特異性結合(優選特異性結合)於人MN/C49基因的外顯子8或外顯子9的核酸，或以充分的特異性結合(優選特異性結合)於人MN/C49基因的外顯子7和8的剪接點、外顯子8和9的的剪接點或外顯子9和10的剪接點的核酸；或可合)的任何核酸。類似地，人ASMN/CA9特異性探針/引物可包含以足夠的40特異性與人MN/CA9基因的外顯子7和外顯子10的剪接點的結合(優選特異性結合)的核酸；或可包含充分同源從而以足夠的特異性與該剪接點的結合(或優選特異性結合)的任何核酸。或者，探針和/或引物可用於檢測FL和ASCA9mRNA兩者，且FL和ASmRNA產物的長度有別，例如可在凝膠上區分。基於MN旁路剪接變體的癌症治療方法很多文章討論了基於癌症相關基因的旁路剪接變體的癌症治療方法，並提供了用於反義和RNA幹擾治療以及其他治療方法的寡核苷酸的設計策略[例如，Garcia-Blanco，CurrOpinMolTher.,7f5、:476-482(2005);Wilton和Fletcher,CurrGeneTher.,467-483(2005);Pajares等，LancetOncol.,8"、:349-357,7、:XingY.，FrontBiosci.，12:4034-4041(2007)"例如，本領域一般才支術人員可分別從SEQIDNOS:1和108的核酸序列確定對人FLCA9mRNA有特異性但對人ASCA9mRNA沒有特異性的合適的反義核酸序列，優選反義寡核苷酸。除了由AS形式的CA9mRNA表達的完整ASMN/CAIX之外，本領域技術人員可以預期，分離的ASMN/CAIX蛋白或多肽片段將能夠幹擾FLMN/CAIX活性。因此，幹擾FLMN/CAIX活性的衍生自ASMN/CAIX的任何蛋白或多肽都考慮在本發明的治療方法的範圍內。MNRNA幹擾(MNRNAi)可例如利用對MN基因表達的RNA幹擾作用來抑制MN基因的表達。RNA幹擾是一種使用RNA來抑制基因表達的方法，如近年已報導[Elbashir等.，Nature,411:494-498f2001、1。更具體地說，可使用對MN基因的具體mRNA剪接變體(例如FL剪接變體)的表達顯示RNA幹擾作用的一種或多種寡核苷酸來抑制MN基因的表達。可通過用含有cDNA片段的載體或其互補RNA轉染細胞來抑制MN基因的mRNA剪接變體的表達。因此，含有所述寡核苷酸的用於抑制MN剪接變體的物質也包括在本發明範圍內。用於抑制MNmRNA剪接變體的物質可含有一種寡核苷酸，或可含有兩種或更多種寡核苷酸。可通過使用MN基因表達體系來選擇特異性沉默FLmRNA變體表達的寡核苷酸，從而從基於MN基因的AS和/或FLmRNA變體核苷酸序列而設計的寡核苷酸中獲得顯示RNA幹擾作用的所述寡核苷酸。MN基因治療載體就使用寡核苷酸抑制FLMN/CAIX表達而言，有可能通過使用基因療法將寡核苷酸引入靶細胞中。可使用已知的方法進行基因治療。例如，可使用非病毒性轉染(包括通過注射直接給予寡核苷酸)或使用病毒載體轉染。非病毒性轉染的優選方法包括給予含有寡核苷酸的磷脂載體(例如脂質體)，以及包括通過注射直接給予寡核苷酸的方法。用於轉染的優選栽體是病毒載體，更優選DNA病毒載體，例如逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體和牛痘病毒載體或RNA病毒載體。材料和方法細胞培養、組織和抗體於溼潤氣氛、5%C02、37匸下，在補充有10%FCS(BioWhittaker，Verviers，比利時)和40jig/ml慶大黴素(LekSlovenia)的DMEM中培養小鼠NIH3T3成纖維細胞、犬MDCK上皮細胞、衍生自腎癌的人腫瘤細胞系CAKI-1和ACHN以及來自宮頸癌的Caski、SiHa、HeLa和C33a細胞系。低氧處理在厭氧性工作站(RuskinTechnologies,Bridgend,英國)、2%02、5%C02、10%112和83%]\2、37X:進行。37t;下從懸掛在組織培養皿蓋上的每2(Hd滴狀培養基中的400個細胞預先形成(pre-form)HeLa球狀體，持續3天。將所得的細胞聚集體轉移到具有非粘性(non-adherent)表面的皮式培養皿中，懸浮培養另外11天，每三天更換培養基。用NikonE400顯微鏡檢查球狀體，用NikonCoolpix990照相機拍照。人組織選自先前描述的集合(collection)(Kivela等，2005)。小鼠組織取自頸脫位致死的BALB/c小鼠。這些組織存儲在-80X:直到用於RNA分離和/或蛋白抽提。早先已表徵了特異性針對人MN/CAIX蛋白的M75和V/10小鼠MAb(Pastorekova等，1993，Zatovicova等，2003)。二級抗小鼠過氧化物酶綴合抗體和與辣才艮過氧化物酶綴合的抗兔抗體來自於Sevapharma(Prague,CzechRepublic),抗小鼠FITC綴合抗體來自於VectorLaboratories,(BurlingameCA)。Alexa488綴合的抗兔二級抗體獲自AdvancedTargetingSystems(SanDiego，CA)。免疫螢光如先前所述進行免疫螢光(Svastova等，2004)。生長在玻璃蓋玻片上的細胞用冰冷的PBS清洗兩次，在20X:用冷曱醇固定5分鐘。蓋玻片與含有1%BSA的PBS於37X:孵育30分鐘，然後與含有M75MAb的未稀釋的雜交瘤培養基或1:1000稀釋的兔抗mCAIX多克隆血清一起孵育。其他文獻描述了抗小鼠CAIX蛋白的抗體(Gut等，2002)。在溼潤的小室中於37匸用初級抗體進行孵育1小時。蓋玻片用含有0.02%吐溫-20的PBS洗滌三次(10分鐘)，然後在PBS中用1:300稀釋在0.5%BSA中的螢光素綴合的抗小鼠二級抗體於371C處理1小時，或在PBS中用1:1000稀釋在0.5%BSA中的抗兔Alexa488綴合的二級抗體處理。用PBS清洗三次(10分鐘)之後，將蓋玻片用固定劑(mountingmedium)(Calbiochem，Cambridge,MA)固定在顯微鏡載玻片上，然後用NikonE400顯微鏡檢查並用NikonCoolpix990照相機拍照。表達質粒用反向PCR從含有小鼠CA9cDNA的pSG5C-Car9質粒產生編碼小鼠剪接變體的真核生物表達質粒pSG5C-mAS。正向引物自外顯子9的起始位點設計(m9S，5，-TCCATGTGAATTCCTGCTTCACTG-3，)SEQIDNO:102反向引物特異性針對外顯子6的末端(m6A，5，-CTTCCTCCGAGATTTCTTCCAAAT畫3，)[SEQIDNO:103]。類似地，用針對外顯子10和7的引物進行反向PCR從含有全長人CA9cDNA(GenBank#X66839)的pSG5C畫MN/CA9表達質粒(Pastorek等，1994)產生編碼人剪接變體的真核生物表達質粒pSG5C-AS。正向引物(hl0S，5，-GTGACATCCTAGCCCTGGTTTTT國3，)[SEQIDNO:104特異性針對外顯子10的起始位點，反向引物(h7A，5，國CTGCTTAGCACTCAGCATCACTG-3，)[SEQIDNO:105]特異性針對外顯子7的末端。同樣的h7A和hlOS引物用於由編碼無信號肽的全長CAIX蛋白的初級質粒構建物pGEX-3XCA9來製備編碼人CAIX蛋白的GST-融合剪接變體的細菌表達載體pGEX-3X-AS。使用Phusion聚合酶進行PCR擴增(Finnzymes，Espoo，Finland).PCR反應由以下反應組成開始在98"變性30秒，98X:變性10秒(32個循環)，64X:退火30秒，72X:延伸l分40秒，最後721C延伸5分鐘。將PCR產物凝膠純化，用T4多核苷酸激酶處理，用T4DNA連接酶(InvitrogenCarlsbad，美國)連接。通過測序驗證所有的構建物。編碼含有人CAIX胞外部分的GST-PGCA融合蛋白的構建物先前已有描述(Zatovicova等，2003)。下表2提供實施例中所用的引物序列。表2tableseeoriginaldocumentpage44轉染將細胞接種在60mm的皮式培IM^中，第二天達到大約70%的密度。分另，J用2mg編碼人和小鼠CAix剪接變體的pSG5C-hAS和pSG5CmAS質粒連同200ngpSV2neo質粒進行轉染。使用GenePorterII轉染試劑(Genlantis，SanDiego，CA)，分別將2^g編碼人和小鼠CAIX剪接變體的pSG5C-hAS和pSG5C-mAS質粒連同200ngpSV2neo質粒進行轉染。用G418(Invitrogen)對轉染的細胞進行選擇，對HeLa細胞的濃度為900Mg/ml，對MDCK細胞的濃度為500pg/ml。克隆抗性集落，通過免疫印跡測試剪接變體的表達並擴增。螢光CA抑制劑的結合通過高磺胺和異硫氰酸螢光素反應獲得螢光CA抑制劑(FITC-CAI)，對CAIX的Kj值為24nM(Svastova等，2004,Cecchi等，2005)。將該抑制劑以100mM濃度和20。/o的DMSO溶於PBS中，臨加入細胞中前在培養基中稀釋至終濃度為1mM。將MDCK-CAIX細胞(Svastova等，2004)以4x15細胞/3.5cm培養皿的密度接種在含有分泌人AS變體的MDCK-AS轉染子產生的條件培養基的培養基中。對照細胞在沒有分泌的AS的培養基中培養。培育24小時之後，補充同等的新鮮培養基，添加FITC-CAI至細胞，將細胞轉入低氧工作站，允許進行結合另外48小時。平行樣品在正常含氧量中培養。最後，這些細胞用PBS洗滌5次，用NikonE400落射焚光顯微鏡觀察。使用ScionImageBeta4.02軟體(ScionCorporation,Frederick,MD)評價所獲得的影像的焚光強度，相關的FITC-CAI結合以百分比表示。蛋白抽提如先前所述(Svastova等，2004)用RIPA緩衝液從細胞單層或組織勻漿中抽提蛋白。在冰上用含有蛋白酶類Completemini抑制劑(RocheAppliedScience,Mannhein，德國)的RIPA緩衝液(PBS中的1%TritonX-100、0.1%脫氧膽酸鈉，lmM苯甲基磺醯氟)從細胞單層或組織勻漿中抽提蛋白30分鐘。抽提物以13000rpm離心15分鐘，按照製造商的說明書用BCA試驗(Pierce，Rockford，IL)測定總蛋白濃度。在10%和8%SDSPAGE(在有2-巰基乙醇(還原條件)或沒有2-巰基乙醇(非還原條件)的Laemmli樣品緩衝液中)中分離總蛋白抽提物(含有30-50|1g的等分試樣)。免疫沉澱和免疫印跡從無FCS條件下在低氧和正常含氧量下培養24小時的AS轉染細胞的培養基中製備樣品用於檢測人胞外AS。將四分之一的培養基(500inl)10倍濃縮，在SDS-PAGE中分離。對於免疫沉澱，室溫下使lml雜交瘤培養基中的CAIX特異性MAb與25)il50%的蛋白A瓊脂糖凝膠懸浮液(Pharmacia,Uppsala，瑞典)結合1小時。細胞抽提物(200pl)用20^1的50%蛋白A瓊脂糖凝膠懸浮液預清潔，然後添加到結合的MAb中。如先前所述(Zatovicova等，2003)，洗滌蛋白A瓊脂糖凝膠上收集的免疫複合物，煮沸並進行SDS-PAGE和免疫印跡。在SDS-PAGE中分離蛋白並印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ImmobilonTM~P，Millipore，Billerica，MA)上。用含有PBS配製的5%無脂奶、0.2%NonidetP-40的封閉緩衝液處理所述膜1小時，然後和稀釋在封閉緩衝液中的初級抗體(在雜交瘤培養基中l:2稀釋的M75單克隆抗體，或者1:1000稀釋的兔抗小鼠CAIX多克隆抗體)一起孵育1小時。處理後，膜用含有0.2%NonidetP-40的PBS徹底清洗45分鐘，和在封閉緩衝液中1:7500和1:5000稀釋的辣根過氧化酶綴合的豬抗小鼠或抗兔二級抗體(Sevapharma)—起孵育1小時。膜在含有0.2%NonidetP-40(Sigma,StLouis，MO)的PBS中清洗，用ECL檢測系統顯影。為了分離膜和亞膜蛋白並分析寡聚物，用PBS洗滌細胞，在冰上與RIPA抽提緩衝液孵育30秒。抽出含有蛋白的RIPA緩沖液並在細胞中添加新鮮的RIPA緩衝液。剩餘的蛋白在冰上抽提15分鐘。首先使用CAIX特異性MAbsV/10(識別FL但不識別AS)或M75(識別這兩種變體)從HeLa-AS提取物中免疫沉澱寡聚物。在還原性SDS-PAGE解析沉澱寡聚物的組分，印跡(blotted)並用過氧化物酶標記的M75抗體顯象。反轉錄PCR使用InstaPure試劑(Eurogentec，Seraing，比利時)從細胞或者組織中分離總RNA。使用隨機七聚體引物(400ng/|Lil),用M-MuLV反轉錄酶(Finnzymes，Oy，芬蘭)進行反轉錄。5嗎總RNA和隨機引物(400ng/nl)的混合物於70E加熱10分鐘，在冰上迅速冷卻，補充有0.5mMdNTPs(Fimizymes)，含有6mMMgCl2、40mMKCl、lmMDTT、0.1mg/mlBSA和50mMTris畫HCl，pH8.3的反轉錄酶緩衝液。終容積24^1的混合物進一步補充200U的反轉錄酶M-MuLV,於42E培養1小時，701C加熱15分鐘，-80€下存儲直至使用。用DynazymeEXT聚合酶(Finnzymes)和表2(見上文)中列出的引物進行PCR。所得的PCR片段在1.5。/o瓊脂糖凝膠上電泳。PCR程序由以下組成94。C3分鐘，然後30個循環94。C變性30秒，退火40秒(溫度取決於引物組)，72X:延伸40秒，然後於72°C最後延伸5分鐘。純化PCR產物，並使用AppliedBiosystemsABI3100(FosterCity，USA)的自動測序儀進行測序。以下實施例僅用於闡釋本發明，不以任何方式限制本發明。實施例1小鼠CAIX剪接變體的鑑定、結構和表達早先與小鼠組織中Car9mRNA表達相關的反轉錄(RT)PCR數據基於外顯子l-6的擴增。然而，使用引物m6S和mllA擴增跨越外顯子6-11的區域進行的Car9mRNA的RTPCR分析顯示，存在兩種擴增產物--種預期大小的PCR產物和一種較小產物(圖1A、B)。該較小PCR產物的測序證明其對Car9有特異性，表明它代表缺少外顯子7和8的小鼠Car9mRNA的旁路剪接(AS)變體。在所有三種被分析的組織，即，胃、小腸和結腸中均發現小鼠AS變體(圖1B)。使用相應的引物對(wt的引物是m8S-mlOA,AS的引物是m6/9S-mlOA)對Car9的野生型和AS變體進行的獨立的RTPCR擴增證實，在所分析的組織中同時存在兩種產物(圖1C)。AS變體序列的計算機分析表明，推定的蛋白小於全長小鼠CAIX約6kDa，其預測的分子量是48kDa。該剪接變體能編碼缺少胺基酸335-379的蛋白，該蛋白缺少催化(CA)結構域的羧基末端部分和跨膜錨上遊的區域，而跨膜和胞質內結構域是完整的(圖1D、E)。為了研究小鼠ASCAIX變體的亞細胞定位，發明人將ASOw5>cDNA克隆入pSG5C表達質粒中，並用它產生永久轉染的細胞系。AS變體已在不含有內源性CAIX蛋白的小鼠NIH3T3成纖維細胞和犬MDCK上皮細胞中過度表達。使用多克隆抗小鼠CAIX抗體(Gut等，2002)進行免疫印跡和免疫螢光來檢測兩種轉染的細胞系。在轉染子的細胞抽提物中檢測到約48kDa的單個條帶，與計算機預測的小鼠ASCAIX蛋白分子量很好地吻合(圖2A)。轉染的細胞顯示出清晰的細胞質著色，表示小鼠AS變體定位在細胞溶質中(圖2B)。實施例2人CAIX剪接變體的鑑定和結構為了搜索人組織和細胞系中的ASCA9mRNA，發明人設計了一組引物，其覆蓋了完整的人CA9mRNA(圖3A)。這些引物用於對分離自人胃和小腸的mRNAs反轉錄得到的cDNA模板進行RT-PCR。使用針對外顯子1和6設計的引物，發明人僅檢測到預計的PCR產物(圖3B)。然而，針對外顯子6和11的引物產生了兩種PCR擴增子一一種豐度較大的較長產物和一種豐度較小的較短產物(圖3C)。較短產物的序列分析證實，它對應於人CA9mRNAAS變體。剪接導致缺失外顯子8和9。計算機預測的人ASCAIX蛋白缺少胺基酸356-412，其推定的分子量約為43kDa，而全長(FL)CAIX的預測大小為49kDa。所述胺基酸缺失包括催化CA結構域的C-末端部分缺失的35個胺基酸和CA結構域與跨膜區域之間缺失的21個胺基酸，其中包括Cys柳，該胺基酸似乎參與形成分子間S-S鍵(圖3D)。由於移碼在ASmRNA1119bp處產生的終止密碼子(FLCA9mRNA中，終止密碼子在1142bp位置)，AS蛋白被截短，既不含有跨膜結構域也不含有胞質內結構域(圖3E)。實施例3人ASCAIX在腫瘤細胞系和組織中的表達為了有利於CA9mRNA的FL和AS變體的.單獨檢測，發明人使用了允許獨立擴增這兩種mRNA的引物。引物的設計U於使一條FL特異性引物位於所述刪除的區域內，一條AS特異性引物位於旁路剪接產生的結點上(圖3A)。首先，發明人分析了暴露於低氧(2°/。)和正常含氧量(21°/。)的人癌細胞系中AS變體的存在。在所有檢查的細胞系中均檢測到AS變體，並在正常含氧量和低氧兩種情況下水平相似(圖4A)。這與FLCA9mRNA相反，後者明顯地可被低氧誘導而水平顯著增加(即在衍生自腎癌的ACHN細胞中和衍生自宮頸癌的Caski和SiHa細胞中)，而CAKI-1細胞錄達極低水平的FLCA9(圖4A)。缺乏CA9基因的C33a宮頸癌細胞中沒有觀察到FLCA9特異性信號(Lieskovska等，1999)。早先的研究顯示了與細胞外周低氧相關的FLCAIX的密度誘導性表達(Kaluz等，2002)。為了確定AS變體的表達是否依賴於密度，發明人使用了分別在稀薄培養物(以1x104細胞/cm2接種)和稠密培養物(8x104細胞/cm"中培養24小時的HeLa和SiHa細胞。稠密的細胞清楚顯示FLCA9mRNA正常含氧量的表達，但其水平比低氧細胞中低。在稀薄和稠密的細胞單層之間沒有觀48察到AS變體水平的顯著差異圖4B)。最後，發明人分析了正常與惡性的人組織(包括胃、結腸、直腸和肝臟)中AS的表達。RT-PCR顯示所有檢查的組織中都存在AS變體(圖4C)。根據先前的研究，FL轉錄物僅存在於正常的胃和源自結腸和直腸的腫瘤內(Saarnio等，1998，Kivela等，2005)。實施例4人CAIXAS變體的定位和基本特點為了對CAIX的AS變體進行基本表徵，發明人用人AS蛋白的異位表達產生了穩定的轉染子。將人AScDNA轉染入CAIX陰性的MDCK細胞以及響應於密度和低氧自然地表達FLCAIX的人HeLa宮頸癌細胞中。與計算機分析(即預測的剪接-和移碼-介導刪除了TM和IC區)一致，ASCAIX蛋白不限於質膜上，而是在MDCK細胞和含氧量正常的HeLa細胞兩者中顯示胞內定位(圖5A)。這與暴露於低氧(2%02)的轉染的MDCK細胞和模擬轉染的HeLa細胞中FLCAIX的細胞表面定位明顯地不同。在免疫印跡中，轉染的HeLaAS細胞顯示約43/47kDa的兩條帶，這對應於ASCAIX，另外的54/58K兩條帶對應於低氧誘導的FLCAIX(圖5B)。由於AS蛋白完全缺少跨膜和胞內結構域，發明人還假定ASCAIX分子的至少一部分應釋放入培養基中。為了研究這種可能性，在無血清培養基中於正常含氧量和低氧情況下培養細胞。培養24小時後，濃縮四分之一的培養基，並通過SDS-PAGE分析。免疫印跡顯示在正常含氧量和低氧兩種情況下培養基中都存在ASCAIX(圖5B)綜合在一起，這些數據表明，AS存在於胞內以及細胞間隙中，這與大都限於質膜上的FLCAIX相反。然而，還可能的是，一些AS分子可與FLCAIX摻入異源寡聚體(heterooligomers)中。使用正常結合於完整的CAIX結構域但不能識別AS變體的單克隆抗體V/10測試這種假i更(數據未顯示)。該V/10Mab經由其與FL分子的相互作用用於CAIX寡聚物的免疫沉澱。然後用還原性PAGE解析寡聚物組分(包括可能摻入的AS分子)，使用與FL和AS形式均反應的過氧化物酶標記的M75抗體進行免疫印跡顯象。在非還原條件下，FL蛋白形成約153K的寡聚物，而ASCAIX變體不能這樣做，並且不能進入FLCAIX蛋白形成的寡聚物(圖6;細節參見材料和方法部分)。實施例5人ASCAIX的功能性質低氧誘導的腫瘤細胞中FLCAIX的表達。低氧還激活CAIX的催化性能，導致胞外pH的加強酸化(Svastova等，2004)。缺少CAIX的催化CA結構域的顯性-陰性突變體的過度表達可消除這種酸化能力(Svastova等，2004)。由於AS蛋白僅含有不完整的CA結構域，它對分析其是否具有催化活性和是否能夠幹擾FLCAIX蛋白介導的酸化來說尤其重要。使用含有截短的CA結構域的重組細菌GSTAS融合蛋白的停流光鐠法(stoppedflowspectrometry)檢測酶活性，與融合有GST的含有完整的CA結構域的胞外部分[例如SEQIDNO:91(從而形成含有PG和CA結構域兩者[aa52-397(SEQIDNO:83)的GST-PGCA)進行比較。結果顯示，野生型CAIX的催化活性Kcat(WT)=3.8x105s"在剪接變體中減少了一半，Kcat(AS)=1.9xl。5s1。另外，GSTAS蛋白對乙醯唑胺(一種碳酸酐酶的磺胺抑制劑)的親合力顯著降低KiWT=14nM對KiAS=110nM。這些數據說明，剪接削弱了CAIX的酶活性和其對抑制劑的親合力。發明人還想要研究ASCAIX是否可調節FLCAIX在低氧條件下酸化胞外pH的能力。出於該目的，發明人分析了轉染的HeLa-AS細胞和模擬轉染的對照細胞，這些細胞在2%02(低氧)和21%02(正常含氧量)中培養48小時。與含氧量正常的相應細胞比較，低氧培養導致對照和AS轉染的HeLa細胞中預期的胞外酸化(圖7A)。然而，培養基比在AS-過度表達的細胞中少酸化約0.2pH單位，說明AS幹擾野生型CAIX蛋白的活性。由於CAIX的催化部位暴露於細胞間隙，發明人測試了AS胞外級分(fraction)的可能的作用。如先前所述，可使用僅結合低氧激活的CAIX(其催化部位可被抑制劑接近)的螢光素-標記的CA抑制劑(FITC-CAI)來間接地證明CAIX的活性(Svastova等20(M)。因此，發明人使用已建立的CAIX轉染的MDCK細胞模型，該模型顯示用低氧處理時CAIX介導的胞外酸化以及低氧(但並非正常含氧量)中FITC-CAI的聚集。發明人分析了存在或不存在來自分泌AS的MDCK隱AS轉染子的培養基時MDCK-CAIX細胞中FITC-CAI的積聚。如圖7B所示，在混合有含AS的條件培養基的新鮮培養基中培養MDCKCAIX細胞，結果可觀察到FITC-CAIX積聚下降，這支持了胞外AS減少抑制劑的結合的觀點。用一半和三分之一的含有AS的條件培養基重複該試驗。分析獲得的影像以確定螢光強度的差異。結果清楚地證明，AS的胞外級分將FITC-CAI的積聚減少約一半(圖7C)。為確定AS變體對FLCAIX功能的這種作用是否具有生物學影響，發明人分析了HeLa-AS轉染子的生長參數並與模擬轉染的對照細胞進行比較。在不依賴於正常含氧量或低氧條件的貼壁培養的短期生長(72小時)中未觀察到兩種類型細胞之間的顯著差別(數據未顯示)。因此，發明人還使HeLa細胞球狀體生長了14天，並將HeLaAS細胞產生的球狀體的質量和形狀分別與對照HeLa細胞進行比較。HeLa-AS球狀體緊湊程度較小，缺少中心區域，在該區域中通常含有承受低氧和酸性pH的細胞(圖7D)。這些HeLa-AS球狀體的表觀顯示了AS的作用(導致FLCAIX調節pH的能力降低)可影響細胞在這些微環鏡應激下的生存能力。總而言之，我們的結果表明，與FLCAIX相比，ASCAIX受到不同的調控、定位異常、功能減弱(functionallydisabled)。討論旁路剪接的失調尤其在癌症中是一種普遍認可的現象(Venables等，2006)。有很多旁路剪接基因的實例，所述基因的產物通常涉及腫瘤的發展，例如CD44、HIF-a、VEGF、骨橋蛋白和很多其它產物(Wong等，2003，Gothie等，2000，Robinson等，2001，He等，2006)。某些情況下，在正常組織中罕見的剪接形式會在腫瘤中變得常見，而存在於正常組織中的旁路剪接形式可保持不變(Roy等，2005)。本研究中鑑定的人CAIX旁路剪接變體可歸為此類，儘管由於全長CAIX的表達模式非常特別，難以給出明確的結論。FLCAIX在極少的正常組織(包括胃和小腸)中有豐度，同時表達低水平的旁路剪接變體。在胃癌中，FLCAIX的表達降低，但AS的水平和正常胃中相似。另一方面，全長CA1X在正常的結腸和直腸(以及本研究中另外的未分析的正常組織)中不存在表達或表達極低，但在相應的在腫瘤中的表達顯著提高(Saarnio等，1998)。然而，AS變體在正常組織和結腸癌兩者中均顯示穩定的表達水平。這些數據強烈表明其表達與腫瘤表型無關。而且，與擁擠的培養物中生長和暴露於低氧的細胞中FLCAIX的水平糹皮誘導相反，AS變體不主要依賴於低氧和細胞密度。相對低但組成型的AS表達對利用CA9轉錄作為低氧肺瘤標記物用於潛在的預後或預測目的的臨床研究相當重要。由於在缺少FLCA9轉錄物的正常和/或非低氧組織中存在AS，設計用於檢測未受剪接影響的區域的引物或探針不能區分CA9mRNA的兩種形式，因此可能會給出假陽性結果，從而可能影響低氧誘導的FLCA9的真實臨床價值。值得注意的是，與FL轉錄物對比進行的ASmRNA和5，RACE分析產生了相同長度的產物，這支持了兩種變體均產生同樣的啟動子的結論(數據未顯示)。該事實可能顯示了，依賴於生理學環境，在CA9轉錄物加工過程中轉錄設備和剪接機器構件之間進行了差異性合作。實際上，有幾個被低氧調控的剪接事件的實例，例如與hTERT、TrkA和XBP1有關的那些(Anderson等，2006，Tacondli等，2004,Romero-Ramirez等,2004)。對於hTERT，已證明，低氧下含有RNA聚合酶II、TFIIB、HIF和共活化劑的轉錄複合物募集在啟動子處，並在轉錄過程中始終保持與基因相連。這種方式誘導了剪接模式的轉換，有利於酶的活性形式(Anderson等2006)。非常容易想到，在CA9基因轉錄期間可能存在一種類似的機制。由於外顯子8和9的缺失產生了人CA9mRNA的AS變體，該變體淨皮翻譯成不含跨膜區、胞內尾和催化性結構域的羧基末端部分的截短的蛋白。顯然，TM和IC區域的缺失導致該AS變體的定位改變，其主要佔據細胞間隙並釋放到胞外培養基中。這與FLCAIX蛋白形成對比，FLCAIX蛋白是一種整合的質膜蛋白。可以預期，這種與催化性結構域的部分缺失相關的不當定位將削弱蛋白的功能。實際上，GST-AS的酶活性只有含完整的催化性結構域的相應GST-PG+CA蛋白的一半。然而，m難將這種發現直接應用到具體的細胞環境中，因為在低氧條件下的細胞環境中CAIX與碳酸氫鹽轉運蛋白(transporter)相互作用並影響質膜內外的pH調節(Morgan等，2007，Svastova等，2004，Swietach等，2007)。首先，在沒有任何亞細胞結構、蛋白質-蛋白質相互作用、離子流動和微環鏡影響(這些因素當然在調控CAIX的催化性能起作用)的裝置中用細菌產生的蛋白檢測活性。其次，不同碳酸酐酶同工酶的催化活性大致在兩個數量級中變化，活性高的同工型比活性中等的同工酶的活性高20-3倍不等(Pastorekova等，2004)。因此，不可能預測(preclude)所述減少一半的活性是否足以(維持)CAIX的生理功能。不過，這個問題可能不是關鍵，因為AS變體不能恰當定位在質膜上，不能形成寡聚物，這些是對CAIX蛋白功能的重要限制。然而，組成型過度表達AS形式的CAIX的低氧HeLa-AS細胞培養物中觀察到的胞外酸化減少清楚地表明，ASCAIX幹擾內源性、低氧誘導的FL蛋白的功能。雖然目前還不清楚其機制，但基於用AS變體處理的低氧MDCK-CAIX細胞中CA抑制劑的積聚減少，可認為AS在與碳酸氫鹽運輸代謝區室(metabolon)的細胞表面組分的相互作用方面與FLCAIX竟爭。此外，AS的過度表達顯著影響HeLa細胞形成緊湊球狀體的能力，HeLa細胞球狀體通常用作模仿具有相應的瘤內微環境的腫瘤塊的三維模型。很多研究很好地記栽了穿越球狀體的氧分壓、pH值、營養物和代謝物梯度，球狀體的核心區與以較酸性的微環鏡為特徵的實體瘤低氧區非常相似(Alvarez-Perez等，2005)。其他文獻已證明，在SiHa和HeLa宮頸癌細胞產生的多細胞球狀體最內部的細胞中，FLCAIX的質膜染色顯著增加(Olive等，2001，Chrastina等，2003)。這些數據表明，FLCAIX剛好存在於那些細胞為了生存需要增加保護和適應對低氧壓力及酸性微環境的有害影響的區域。FLCAIX通過碳酸氬鹽-介導的胞內pH的緩衝來發揮作用(Swietach等，2007)。明顯地，部分擾亂pH調節的AS變體不允許對酸性球狀體內pH的適應，導致球狀體核心中最受脅迫的中心細胞的消失。這種想法與CAIX的催化活性受低氧調控是一致的，其建議CAIX調節pH的能力對低氧腫瘤細胞的存活非常重要。這種建議已經得到Robertson等(2004)中RNAi實驗的間接支持。雖然天然產生的AS變體以低水平表達，但存在僅微弱地誘導FLCAIX的生理學情況和細胞類型。例如，位置離功能性供血脈管較近的腫瘤細胞暴露於輕微低氧中，FL和AS的表達水平可能相當，從而導致CAIX活性的顯性-陰性下調。這些弱低氧的細胞假設沒有暴露於嚴重的酸中毒，因此可能不受益於這種pH控制機理的完全實施(fullperformance)。類似的解釋可適用於遭受輕微缺血的正常組織。這種想法得到了最近及先前一些數據的支持，這些數據表明，一些腫瘤細胞系、含氧量正常的稠密細胞(受微弱的細胞外周低氧的影響)和一些早期低氧程度較輕的肺瘤僅表達較低水平的CAIX。總之，發明人認為，在這兩種蛋白共同表達的情況中，AS變體起調節FLCAIX的作用。旁路剪接變體較低但組成型的表達對基於利用CA9轉錄作為低氧腫瘤標記物用於潛在的預後或預測目的的臨床研究相當重要。由於在不存在FLCA9轉錄物的正常和/或非低氧組織中存在AS,設計用於檢測不受剪接影響的區域的引物或探針不能區分CA9mRNA的兩種形式，因此可能會給出假陽性結果，這會影響低氧誘導的FLCA9的真實臨床價53值。事實上，在迄今為止發表的幾個研究中已經發生了這種現象[例如McKiernan等.，Cancer,86(3、:492-497(1999);Span等"BrJCancer,8簡:271-276(2003);Simi等"LungCancer,52m:59-66(2006);Greiner等"Blood,匿13、4109-4117f2006)，。為此原因，用於微陣列晶片和RT-PCR的正確的引物及探針的設計應避免上述現象的出現，應考慮MN/CAIX的AS形式。根據布達佩斯條約進行的保藏下列材料保藏在現位於10810UniversityBlvd.,Manassas,Virginia20110-2209(USA)的美國模式培養物保藏所(ATCC)。保藏是根據國際承認用於專利程序和控制的微生物保藏布達佩斯條約進行的。從保藏日開始計算，保證維持活培養物30年。根據布達佩斯條約可從ATCC獲得本發明的雜交瘤和質粒，根據申請人與ATCC之間的協議，保證一旦本申請授予專利權則公眾可無限制地獲得這些保藏的雜交瘤和質粒。這些保藏菌林的可獲得性並不意味著違背任何政府當局根據其專利法授予的專利權而許可實施本發明。雜交瘤保藏日ATCC#VU-M751992年9月17日HB11128MN12.2.21994年6月9日HB11647質粒保藏日ATCC#A4a1995年6月6日97199XE11995年6月6日97200XE31995年6月6日97198類似地，產生V/10單克隆抗體的雜交瘤細胞系V/10-VU根據布達佩斯條約於2003年2月19日保藏在比利時根特，B-卯OO,根特大學，K丄.Ledeganckstraat35的LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie-Plasmidencollectie(LMBP)(BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms(BCCM)的國際保藏機構(IDA))[BCCM/LMBP]，登錄號為6009CB。本發明上述實施方式的描述僅出於闡釋和說明的目的。這些實施方式不是窮盡性的，也並非將本發明限於所公開的具體形式，很明顯，根據上文教導可進行很多修飾和變化。選擇和描述這些實施方式是為了說明本發明的原則和其具體應用，以使本領域技術人員以多種實施方式和根據特定目的進行各種變化來利用本發明。本文引用的所有參考文獻均通過引用納入本文。權利要求1.與哺乳動物中MN/CAIX異常表達相關的腫瘤發生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預後方法，包括區分全長[FL]和旁路剪接的[AS]MN/CA9mRNA或MN/CAIX表達。2.如權利要求1所述的方法，包括使用一種或多種探針和/或引物來檢測或檢測並定量FL和/或ASMN/C49mRNA表達。3.如權利要求2所述的方法，包括使用(a)探針和/或引物，以檢測全長FL]MN/C49mRNA但不檢測旁路剪接的[ASMN/C49mRNA;(b)探針和/或引物，以檢測ASMN/C45>mRNA但不檢測FLmRNA;和/或(c)探針和/或引物，以檢測FL和ASMN/C49mRNA。4.如權利要求2所述的方法，其中所述哺乳動物是人，且其中所述一種或多種探針和/或引物選自SEQIDNOS:97-101和與SEQIDNOS:97-101至少80%同源的核酸序列。5.如權利要求2所述的方法，包括使用核酸擴增方法。6.如權利要求5所述的方法，其中所述核酸擴增方法包括使用PCR、RT-PCR、實時PCR或定量實時RT-PCR。7.如權利要求2所述的方法，包括使用微陣列晶片，所述晶片含有結合全長[FLmRNA但不結合旁路剪接的[AS]mRNA的探針，和/或結合ASMN/C49mRNA但不結合FLMN/C49mRNA的探針。8.如權利要求2所述的方法，還包括測定FL:ASMN/C49mRNA的比率。9.如權利要求2所述的方法，其中所述ASMN/C49mRNA表達指示正常基因表達，所述FLmRNA表達指示異常MN/C49基因表達。10.如權利要求2所述的方法，其中所述ASMN/C49mRNA表達指示正常含氧量情況下MN/C49基因的表達，所述FLmRNA表達指示低氧情況下MN/C49基因的表達。11.如權利要求1所述的方法，包括使用一種或多種抗體來區分腫瘤發生前/贅生性組織中的FL和ASMN/CAIX表達。12.如權利要求11所述的方法，包括檢測或檢測並定量所述組織中的ASMN/CAIX。13.如權利要求12所述的方法，還包括測定所述組織中FLMN/CAIX水平與ASMN/CAIX水平的比率。14.如權利要求13所迷的方法，其中所述比率指示所述組織中低氧的存在或程度。15.如權利要求11所述的方法，包括檢測或檢測並定量脊推動物組織中的FLMN/CAIX和ASMN/CAIX，其包括以下步驟(a)使所述脊推動物組織的樣品同時或按序與至少兩種抗體、至少兩種抗原結合抗體片段、或抗體和抗原-結合抗體片段的混合物接觸，其中至少一種抗體/抗體片段特異性結合於FLMN/CAIX蛋白但不結合ASMN/CAIX蛋白，其中至少一種其他抗體/抗體片段特異性結合於FL和ASMN/CAIX兩者；(b)檢測並定量所述樣品中的所述抗體/抗體片段;和(c)比較所述差異結合性抗體/抗體片段的結合以測定FLMN/CAIX和ASMN/CAIX的相對水平。16.如權利要求15所述的方法，其中所述特異性結合於FLMN/CAIX但不結合ASMN/CAIX的抗體/抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結構域有特異性;其中所述特異性結合於FLMN/CAIX和ASMN/CAIX兩者的抗體/抗體片段對MN/CAIX的蛋白聚糖樣(PG)結構域有特異性。17.如權利要求16所述的方法，其中所述對MN/CAIX的CA結構域有特異性的抗體是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生的V/10單克隆抗體；其中所述對MN/CAIX的PG結構域有特異性的抗體是保藏在美國模式培養物保藏所(ATCC)、ATCC名稱編號為HB11128的雜交瘤VU-M75產生的M75單克隆抗體。18.與脊推動物中異常MN/CAIX表達相關的腫瘤發生前/腫瘤性疾病的診斷和/或預後方法，包括檢測或檢測並定量脊推動物組織中的全長[FLMN/CAIX蛋白但非旁路剪接AS]MN/CAIX蛋白，其包括以下步驟(a)使所述脊推動物組織的樣品與抗體或抗體片段接觸，其中所述抗體或抗體片段特異性結合於FLMN/CAIX但不結合ASMN/CAIX;和(b)檢測並定量所述樣品中所迷抗體/抗體片段的結合。19.如權利要求18所述的方法，其中所述抗體或抗體片段對MN/CAIX的碳酸酐酶(CA)結構域有特異性。20.如權利要求19所述的方法，其中所述對MN/CAIX的CA結構域有特異性的抗體是保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生的V/10單克隆抗體。21.診斷和/或預後方法，包括檢測或檢測並定量哺乳動物腫瘤發生前/贅生性樣品中的全長[FL1MN/CA9mRNA但非旁路剪接[ASlMN/CA9mRNA，所述方法包括使所述樣品中的mRNA與特異性結合FLMN/CA9mRNA但不結合ASMN/CA9mRNA的引物或探針接觸。22.用於區分哺乳動物中旁路剪接[AS]MN/CA9mRNA和全長[FLJMN/CA9mRNA表達的探針或引物。23.如權利要求22所述的探針或引物，其中所述哺乳動物是人，所述探針或引物用來檢測ASMN/CA9mRNA但不檢測FLMN/CA9mRNA,所述探針或引物包含結合於MN/CA9基因的外顯子7和10的剪接點的核酸。24.如權利要求23所述的探針或引物，其中所述探針或引物具有SEQIDNO:101的序列或與SEQIDNO:101至少80%同源的序列。25，表達權利要求22所述的探針或引物的栽體。26.包含權利要求25所迷載體的宿主細胞。27.如權利要求22所述的探針或引物，其中所述哺乳動物是人，所述探針或引物用來檢測FLMN/CA9mRNA但不檢測ASMN/CA9mRNA，所述探針或引物包含結合於人MN/CA9基因的外顯子8或外顯子9的核酸，或結合於人MN/CA9基因外顯子7和8的剪接點的核酸、或結合於人MN/CA9基因外顯子8和9的剪接點的核酸、或結合於人MN/CA9基因外顯子9和10的剪接點的核酸。28.如權利要求27所述的探針或引物，其中所述探針或引物具有SEQIDNO:100的序列或與SEQIDNO:100至少80%同源的序列。29.包含一種或多種權利要求22所述的探針的微陣列晶片。30.用於區分哺乳動物中旁路剪接[ASMN/CA9mRNA和全長[FLJMN/CA9mRNA表達的探針對和/或引物對。31.如權利要求30所述的探針對和/或引物對，其用於檢測旁路剪接[ASj人MN/CA9mRNA但不檢測全長FL]人MN/CA9mRNA。32.如權利要求31所述的探針對或引物對，其由SEQIDNOS:99和101或與SEQIDNOS:99和101至少80%同源的核酸序列組成。33.如權利要求30所述的探針對和/或引物對，用於檢測全長FLj人MN/CA9mRNA但不檢測旁路剪接[AS人MN/CA9mRNA。34.如權利要求33所述的探針對或引物對，其由SEQIDNOS:99和100或與SEQIDNOS:99和100至少80%同源的核酸序列組成。35.如權利要求30所述的探針對和/或引物對，其用於檢測AS人mRNA和FL人MN/CA9mRNA兩者，所述探針對和/或引物對由SEQIDNOS:97和98、或與SEQIDNOS:97和98至少80%同源的核酸序列組成；其中所述ASmRNA和所迷FLmRNA的長度不同。36.編碼哺乳動物的旁路剪接[AS]MN/CAIX的分離核酸，其中所述ASMN/CAIX的分子量為約43-約48千道爾頓。37.表達權利要求36所述的分離核酸序列的載體。38.包含權利要求37所述載體的宿主細胞。39，如權利要求36所述的分離核酸，其特徵在於，對應於MN/C49的外顯子8和外顯子9的核苷酸缺失，其中所述哺乳動物是人。40.如權利要求36所述的分離核酸，其具有SEQIDNO:108的序列或與SEQIDNO:108至少80%同源的分離核酸序列，其中所迷哺乳動物是人。41.由SEQIDNO:108或權利要求40所述的分離核酸編碼的AS形式的MN/CAIX，其特徵在於，所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結合，但不與V/10單克隆抗體結合，所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌，所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生。42.由權利要求36所述的分離核酸編碼的AS形式的MN/CAIX,其特徵還在於，所述AS形式的MN/CAIX與對MN/CAIX的PG結構域有特異性的抗體特異性結合，但不與對MN/CAIX的CA結構域有特異性的抗體結合。43.如權利要求42所述的AS形式的MN/CAIX，其特徵還在於，所述AS形式的MN/CAIX與M75單克隆抗體特異性結合，但不與V/10單克隆抗體結合，所述M75單克隆抗體由保藏在美國模式培養物保藏所、名為ATCCNo.HB11128的雜交瘤VU-M75分泌，所述V/10單克隆抗體由保藏在比利時根特、登錄號為LMBP6009CB的BCCMTMrM/LMBP雜交瘤VU-V/10產生。44.MN/CAIX的抗體或抗原結合抗體片段。45.特異性結合於權利要求36所述的ASMN/CAIX^a不特異性結合可溶性MN/CAIX(s-CAIX)的抗體或抗原結合抗體片段。46.治療哺乳動物中腫瘤發生前/腫瘤性疾病的方法，其中所述疾病與MN/CAIX異常表達有關，所述方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的組合物，該組合物包含相對於全長[FL]MN/CAIX水平提高旁路剪接[ASjMN/CAIX水平的物質。47.如權利要求46所述的方法，其中所述增加的ASMN/CAIX的相對水平幹擾所述FLMN/CAIX的碳酸酐酶活性。48.如權利要求46所述的方法，其中所述物質是處於生理學上可接受的栽體中的ASMN/CAIX本身，表達ASMN/CA9mRNA的載體，阻斷FLMN/CAIX但不阻斷ASMN/CAIX表達的反義寡核苷酸，表達所述反義寡核苷酸的載體，FLMN/CA9同工型特異性siRNA，或表達所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA的載體。49.如權利要求48所述的方法，其中所述FLMN/CA9同工型特異性siRNA靶向MN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點。50.如權利要求46所述的方法，其中所述物質是調節AS和/或FLMN/CA9前mRNA剪接的反義寡核苷酸。51.相對於全長FLMN/CAIX水平提高旁路剪接[ASjMN/CAIX水平的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸用於治療與MN/CAIX異常表達相關的肺瘤發生前/肺瘤性疾病。52.如權利要求51所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是與FLMN/CA9前mRNA互補但不與ASMN/CA9前體mRNA互補的反義寡核苷酸。53.如權利要求51所述的寡核苷酸，其是與FLMN/CA9mRNA互補但不與ASMN/CA9mRNA互補的SiRNA。54.如權利要求53所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與FLMN/CA9mRNA的外顯子7和8、外顯子8和9或外顯子9和10的剪接點互蜂卜。55.用於鑑定能夠調節旁路剪接[AS]MN/CAIX水平的物質的體外方法，其包括使表達ASMN/CAIX的細胞與懷疑調節細胞中所述ASMN/CAIX水平的物質接觸，檢測並定量所述ASMN/CAIX水平的變化。全文摘要本文公開了MN/CA9mRNA的旁路剪接[AS]變體及相關蛋白-ASMN/CAIX。不同於在大多數組織中意味著腫瘤形成和/或低氧的與癌症相關的全長[FL]MN/CA9mRNA和FLMN/CAIX，ASMN/CA9mRNA在正常含氧量下組成型表達，不受低氧刺激，ASMN/CAIX不限於細胞膜上。本文提供了區分AS和FLMN/CA9的表達從而用於腫瘤發生前/腫瘤性疾病的診斷/預後的方法，以及用於這些方法的探針、引物和抗體。還公開了涉及MN基因和蛋白的腫瘤發生前/腫瘤性疾病的治療方法，這些方法基於ASMN蛋白(ASMN/CAIX)幹擾FLMN蛋白(FLMN/CAIX)催化活性的能力；此類方法還可使用具有所述幹擾能力的ASMN蛋白片段。所述方法可包括相對於FLMN/CAIX水平增加ASMN/CAIX水平。示例性治療方法可包括給予物質，例如，ASMN/CAIX本身、表達ASMN/CA9mRNA的載體、阻斷FLMN/CAIX表達但不阻斷ASMN/CAIX表達的反義寡核苷酸、表達此類反義寡核苷酸的載體、FLMN/CA9-同工型特異性siRNA、或表達此類FLMN/CA9-同工型特異性siRNA的載體。還公開了鑑定能夠調節ASMN/CAIX水平的物質的方法。文檔編號C12Q1/68GK101641450SQ200780045271公開日2010年2月3日申請日期2007年10月12日優先權日2006年10月12日發明者J·帕斯託雷克,M·巴拉索瓦申請人:病毒學研究所