一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及由該菌製備的脂肽與應用的製作方法

2023-12-12 22:08:02

專利名稱：一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌及由該菌製備的脂肽與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物學技術領域，具體涉及一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌的分離篩選及 活性物質的製備。本發明還涉及部分生物化學與分子生物學技術領域。
背景技術：
許多芽胞桿菌，例如枯草芽胞桿菌(5"c,7附^to'fo),蕈狀芽胞桿菌(5.W_yc0/&5)和解澱粉芽胞杆 菌(及a/ y/0/!々"e/ac/em)，都可以抑制許多植物病原真菌和人類病原真菌的生長。許多這類抗真菌物質都 被鑑定出具有環狀脂肽表面活性劑的特徵。這些脂肽能抑制很多真菌的生長，包括麴黴屬G^pe/"g說^)， 鐮孢菌屬(Fm^7',)，絲核菌屬(燦/加加"/a)和一些酵母(假絲酵母屬)等。還有一些脂肽的抗腫瘤活 性也得到了關注。現在有許多研究者對芽孢桿菌產生的脂肽產生了濃厚的興趣，關注的內容主要包括它很 高的表面活性和潛在的療效方面的特性。
芽胞桿菌產生的環狀脂肽主要包括一個脂肪酸鏈連接的多肽形成一個環，所以脂肽是一個生物學上的 表面活性劑，它包括-個親脂和一個親水基團。基於脂肽是-個高生物表面活性劑，被認為它能通過與細 胞膜的相互作用而使其破裂。還有人認為它們能在雙層膜中形成選擇性離子通道，包括在磷脂雙分子層中 形成選擇性離子通道。
有關脂肽的作用機理如上所述，基於其表面活性劑的作用導致細胞質膜的穿孔而起殺菌作用。然而， 我們在對由一株解澱粉芽胞桿菌產生的脂肽作用機理進行研究的時候發現，誘導真菌細胞凋亡也是其抑菌 的重要機理之一。凋亡，又稱細胞程序性死亡，首先在動物中發現。最近的研究成果表明，真菌(包括酵 母和絲狀真菌)在某些條件下(如衰老、UV、某些化學物質)也可誘導凋亡的發生，從而表現為典型的 凋亡現象，如核濃縮，DNA的斷裂，細胞質膜磷脂醯絲氨酸的外翻，活性氧的產生，凋亡小泡的形成等 等一些動物中出現的凋亡特徵。在動物細胞中，凋亡通常有2條途徑， 一條是通過胞外信號激活細胞內的 凋亡酶caspase，另一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的 重要蛋白降解，引起細胞凋亡。我們的實驗結果表明，在解澱粉芽胞桿菌脂肽作用後，表現為核斷裂，核 濃縮、細胞質膜磷脂醯絲氨酸外翻、活性氧等細胞凋亡特徵。脂肽誘導的細胞凋亡可能在解澱粉芽胞桿菌 對真菌的拮抗作用中起重要的作用，因為在自然生態中芽胞桿菌產生的脂肽可能並不足以導致細胞膜的穿 孔，但卻可誘導凋亡的發生，這也部分解釋了一定濃度的脂肽表現為抑菌作用而非完全殺死真菌。
許多芽胞桿菌產生的生物活性劑物質能用於植物病害的生物控制，從而減少化學藥物的使用來保護環境。抗真菌，腫瘤和病毒也使芽胞桿菌作為尋找新抗生素的生物資源。但是現在僅有很少的抗真菌物質被 分離鑑定，而且現在被鑑定的芽胞桿菌產抗菌物質多為枯草芽胞桿菌所產脂肽。我們分離到的解澱粉芽胞 桿菌產生的脂肽為分子量較火的脂肽，不同於以往報導的小分子量脂肽，該脂肽對水稻紋枯病菌、玉米小 斑病菌、棉花枯蔞病菌、小麥赤黴病、棉鈴炭疽病菌、楊樹潰瘍病菌、灰黴菌等多種植物病原真菌具有顯 著的拮抗效果。我們以絲狀真菌水稻紋枯病菌以及酵母菌中的假絲酵母為代表進行研究，發現該脂肽促真 菌細胞凋亡的作用是其拮抗作用的重要表現。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，通過分離、篩選獲得一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞杆 菌，分析該菌株是否具有能對植物真菌病原菌具有有很好拮抗作用的活性物質，申請人從水稻根系分離得 到了這株目的細菌。試驗表明分離的這株細菌屬於一株解澱粉芽胞桿菌，它能產生促真菌凋亡的一種脂肽， 可作為細胞凋亡研究的誘導物，也可作為抗植物病原菌的有效成分。本發明提供了分離篩選該解澱粉芽胞 桿菌的方法，對其產生的活性物質進行了表徵分析，並對該活性物質的應用前景進行了試驗，從而完成本 發明。
實現本發明的技術如下所述
申請人通過分離篩選獲得一株分離的對植物真菌病原菌具有很好拮抗作用活性物質的微生物菌株 CH1,經16SrRNA分析和其他形態學等分析，確定該菌株為解澱粉芽胞杆齒(S""7/肌a，/o/i—e々c/era)， 申請人:將其命名為解澱粉芽胞杆齒(5ac(7/泌awj/o/i々恥/ac/e朋)CH1。該菌株已於2008年9月5日送交 湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏屮心〔CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO:M208127。
從該解澱粉芽胞桿菌菌株CH1的培養物中獲得具有生物活性物質，被表徵為促真菌凋亡脂肽。該脂肽 的分子量為1065或它的同系物。具有如說明書附圖6所示的的紅外圖譜。該脂肽由9碳烷基和8個氨基 酸組成，在第7個烷基碳與最後一個胺基酸通過一個氧原子形成環肽。其序列及構型如下
CH3-(CH!2)5-CH-CH2-CO- Leu-Glu-Arg-Ala-Asp-Val-Lep- Leu 。
O
對該解澱粉芽胞桿菌菌株以及其製備的脂肽在細胞凋亡中的生物學應用前景進行了試驗。
具體製備步驟是這樣的
1.細菌的分離篩選與鑑定從中國湖北省武漢市華中農業大學水稻田取分櫱期的水稻分離具有抗水稻 紋枯病菌的細菌。對檢測到顯著抗真菌活性的細菌進行16SrRNA和形態鑑定。確定我們分離得到的是一 株解澱粉芽胞桿菌CBacWws. OT77yto/z々Me/ade"s)。2. 抗真菌活性物質的分離純化及有效成分鑑定對上述獲得的解澱粉芽胞桿菌培養2天後發酵液用 "兩步萃取法"(見實施例1)提取抗菌活性物質，將萃取後液體真空旋轉蒸發濃縮(見實施例1)，並
溶於少量的蒸餾水中。用葡聚糖G-25柱進一步分離純化，繪製洗脫曲線。利用洗脫曲線各峰值的組分進 行抗菌活性檢測。
在抗真菌活性分析後，對有活性的抗菌物質進行真空冷凍乾燥進行濃縮(見實施例1)。濃縮的溶液 進行薄層層析分離，對各斑點進行抗菌活性檢測，並對純化的抗真菌物質進行定量。
3. 抗真菌脂肽誘導真菌凋亡的各種特徵檢測。用步驟2純化的脂肽處理假絲酵母和水稻紋枯病菌， 並利用螢光顯微鏡檢測觀察。
實施結果
通過16SrRNA分析和其它形態觀察確定我們分離的菌株為 一解澱粉芽胞桿菌BacWw. a附y/0/Z3wey^c/eMS 。 該菌對i /2/zoc/ow/a so/aw', //e/'w力f/!ospon'w附附^''5, ^wsan'w附qx> /30/7'kw, 5of 3*'s "."ereapers, G艦ere,/a Z)of/n'。re〃a gregaHa, Co〃"o加'c/!扁gas觀"等植物病原真菌都有明顯的抗菌效 果。我們成功的分離到了該菌株的抗真菌有效成分，並對其抗菌活性和基本特性進行了分析。隨後用純化 的脂肽處理假絲酵母和水稻紋枯病菌能很好的誘導其凋亡。用雙苯甲亞胺(Hoechest 33258)染色能很明 顯的看出脂肽處理的細胞能很好的被染色，也就是說其細胞膜通透性有較大改變，且絲狀真菌紋枯病菌單 個細胞中細胞核數量超過23個，假絲酵母細胞核則呈明顯的核濃縮現象。處理後細胞內活性氧水平也明 顯高於對照組，Annexin V檢測也顯示脂肽處理細胞有較多細胞出現磷脂醯絲氨酸外翻，而對照組明顯少 於處理組。缺口末端標記分析(TUNEL分析)同樣顯示處理組的細胞被染色多，說明細胞內DNA斷裂較 多。這些特性都為細胞凋亡特徵，從而可以肯定我們純化的該脂肽能很好的誘導細胞凋亡。由此我們推測 我們分離到的解澱粉芽孢桿菌產生的脂肽具有促真菌凋亡的作用。
解澱粉芽胞桿菌CH1 (SflcOT"s. a附^o^"e/ac&nsCHl)的菌學特徵 解澱粉芽胞桿菌CH1菌體杆狀，菌體大小1-1.4 u mX2.3-3.5 u m在PDA (含200g馬鈴薯煮出液，20g 葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)平板上能快速擴散，不形成特定的菌落形態，邊緣不規則，呈灰白色， 粘稠有莢膜，培養48h後表面有小皺褶。在LB平板上形成米白色的菌落'菌落直徑3-5mm，表面乾燥有 皺褶，中間塌陷，邊緣波狀。37'C生長明顯快於28'C。芽胞近端生，鞭毛周生。


序列表SEQ IDNO:l是本發明分離的解澱粉芽胞桿菌醜ac/"w 。wy;/o/zXflcfem CH1的16SrRNA校正序列。
序列表SEQDNO:2是本發明分離的分子量為1065的脂肽的胺基酸推測序列。
圖1是解澱粉芽胞桿菌產生的脂肽抗絲狀真菌活性。圖中圖1A，圖1D為PD培養基對照；圖1B為加有10%的在37'C培養的CH1發酵液的PDA培養基；圖1C為加有10%的在28'C培養的CH1發酵液 的PDA培養基。水稻紋枯病菌在含10%CH1發酵液的培養基上生長明顯受到抑制，而且在37'C培養的CH1 發酵液對水稻紋枯病菌的抑制效果更明顯。
圖2是解澱粉芽胞桿菌產生的脂肽抗假絲酵母活性。圖2A為用100ug/ml脂肽處理2h後，取100 個細胞塗平板；圖2B為PD培養基對照；圖2C為PBS對照。提純的脂肽可明顯抑制假絲酵母的生長繁 殖，表現為與對照相比，菌落數減少，菌落大小也明顯小於PD或PBS對照。
圖3是抗真菌物質用葡聚糖凝膠G-25柱進行分離純化收集峰抗菌活性檢測。圖3A為經葡聚糖凝膠 G-25柱分離純化後的洗脫曲線，可以看出發酵液可以被分出5個組分(5個峰值)；圖3B為吸光度峰值 處物質進行抗真菌活性檢測結果，可以看出9號和19號收集管的物質具有抗菌活性，而且9號收集管的 抗菌效果明顯比19號好。
圖4是對9號收集管的物質冷凍乾燥濃縮並進行薄層層析純化後不同斑點抗菌活性檢測。薄層層析顯 色後由近及遠依次命名為斑點1， 2， 3。結果斑點l, 2的抗菌效果比較明顯，而斑點3隻有微弱的抗菌活 性。
圖5是脂肽的紅外圖譜。分離純化的脂肽樣品經冷凍乾燥成粉末後，壓片進行紅外圖譜分析結果。從 圖中可以看出，樣品中含有氨基，甲基，醯胺鍵，碳氧鍵，亞甲基，甲基等功能鍵，和脂肽的功能基團、 功能鍵相一致。
圖6是脂肽的ESI-MS質譜圖。對分離純化的分子量為1065的成分進行ESI-MS質譜分析。 圖7是本發明製備脂肽的推測序列。該脂肽由9碳烷基和8個胺基酸組成，在第7個烷基碳和最後一
個胺基酸(即亮氨酸)通過一個氧原子形成一個環肽，具有Asp-Val-Leu結構，推測其為一種表面活性物質。
圖8是Hoechest 33258染色，顯示凋亡細胞核的形狀。圖8A， C， E為用PBS處理的水稻紋枯病菌； 圖8B， D為經過100ng/ml的抗真菌脂肽處理水稻紋枯病菌圖8E為用PBS處理的假絲酵母；圖7F為經 過100pg/ml的抗真菌脂肽處理的假絲酵母；圖8A， B是在低倍鏡下觀察效果；圖8C—F是在高倍鏡下的 觀察效果在低倍鏡和高倍鏡下處理組的螢光比對照組強很多，可以看出能很好的被Hoechest 33258染色， 說明處理後細胞膜通透性有較大改變。其中可以看出濃縮的細胞核被染色。
圖9是PI和FITC-Annexin V染色檢測細胞磷脂醯絲氨酸外翻結果。圖9A，C，F為用PBS處理的對照； 圖9B,D,G為用120ng/ml的抗真菌脂肽處理的細胞；圖9A,B為水稻紋枯病菌；圖9C~<}為假絲酵母。綠 色螢光為HTC染色結果，紅色為PI對凋亡晚期或者壞死細胞染色結果。顯示用120pg/ml的抗真菌脂肽 處理後磷脂醯絲氨酸外翻而且細胞膜完整的細胞比對照組多'即凋亡細胞比對照組明顯增多。其中D圖為 典型的凋亡細胞磷脂醯絲氨酸外翻。圖10是細胞內活性氧(ROS)檢測。圖10A， C分別為用PBS處理的水稻紋枯病菌和假絲酵母；圖 IOB， D分別為120ng/ml的抗真菌脂肽處理的水稻紋枯病菌和假絲酵母。結果顯示用120pg/ml的抗真菌脂 肽處理的細胞內的活性氧明顯高於對照組。
圖11是TUNNEL分析結果。圖IIA為用磷酸緩衝液(PBS)處理的水稻紋枯病菌對照；圖11B為用 100pg/ml的抗真菌脂ft(c處理的水稻紋枯病菌；圖11C為用PBS處理的假絲酵母對照；圖11D為用100pg/ml 的抗真菌脂肽處理的假絲酵母。經螢光顯微鏡觀察可以發現用脂肽處理的細胞內螢光比對照組強烈，說明 其細胞內DNA斷裂較多。綠色螢光為FITC標記的dUTP所發螢光。
具體實施例方式
實施例l
1、 解澱粉芽胞桿菌(^fta"7/Ma/^/o/々恥/"e&w)的篩選分離.-
從中國湖北省武漢市華中農業大學水稻田取分櫱期的水稻數株，洗淨後分離根部。將水稻根部外表面 以自來水衝洗乾淨後，再以無菌水衝洗三次，然後以70%乙醇浸泡消毒305，取出，以無菌水衝洗3次後， 用無菌剪刀將水稻根部切成約lmm大小的碎塊，然後置於PDA培養基(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄 糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)上於28'C培養48h。將分離得到的細菌以PD液體培養基(含200g馬鈴薯 煮出液，20g葡萄糖，加蒸餾水至L)於28'C，180rpm搖床中振蕩培養48h，離心，收集上清液並以0.22pm 濾膜過濾後,與PDA培養基按體積比分別為10%， 5%， 2.5%混合倒平皿接種水稻紋枯病菌(華中農業火學 植保系植物病理教研室，見參考文獻[l])，檢測抗菌活性。對檢測到顯著抗真菌活性的細菌進行16SrRNA 和形態鑑定。以PD液體培養基過夜培養分離到的細菌，用常規方法提取細菌的基因組DNA ，見參考文 獻[2]，以測定16SrRNA的通用引物(primerF : AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ; primerR : AAGGAGGTGATCCAGCCGCA,由上海生工生物工程技術有限公司合成)進行PCR (PCR反應體系為 雙蒸水18.3nl， 10xPCR緩衝液2.5nl，通用正反引物，dNTP各lpl, Taq酶0.2fil (PCR反應試劑均為廣 東東盛生物科技有限公司產品)。反應程序94'C 4min，再30循環的94。C 45s， 52°C 45s， 72°C 90s， 再72。C 10min) , 1%瓊脂糖電泳檢測成功擴增到大小大約為1.5kb的DNA片段，並由上海生工生物工程 技術有限公司進行序列測定後在NCBI中經Blast比較分析確定為解澱粉芽胞桿菌(^^ /^. a切j/o/一e》dens)。
培養解澱粉芽胞桿菌的條件為PD培養基或者LB培養基，28'C-37'C培養。
菌株保存方法取培養好的Sac!7/us. awy/o/!Xflcfera CH1菌液添加滅菌甘油至終濃度25。/。於-8(TC保存。
2. 解澱粉芽胞桿菌CH1無菌發酵液的獲取接種保存的解澱粉芽胞桿菌CH1菌種10nl到10ml滅菌的PD培養基中，28'C， 200rpm振蕩培養過 夜。然後接種2.5ml新鮮培養物到含250ml新鮮PD培養基的1L三角瓶中，28。C或者37。C， 200rpm振蕩 培養48h。 一般每次用4個三角瓶培養1L的培養物。然後8000g離心10min收集上清，並用0.45 nm的濾 膜過濾滅菌，再用0.22nm的濾膜過濾滅菌，得發酵液-20'C保存備用。
3. 解澱粉芽胞桿菌CH1發酵液中抗真菌物質的純化
用PD培養基於28'C培養解澱粉芽胞桿菌2天後離心，收集上清液。用"兩步萃取法"提取抗菌活性 物質，具體步驟是將培養物上清液首先用等體積的乙酸乙酯萃取後取水相，再以等體積的正丁醇萃取後， 以8000g離心20min收集正丁醇相。將得到的正丁醇酯相用真空旋轉蒸發器(RE52CS-2型，購自上海亞 榮生化儀器廠，按照儀器使用說明書操作)在65t;下蒸乾,再用少量的蒸餾水溶解。溶解後得到的溶液離 心去沉澱後，將上清液用葡聚糖G-25柱進一步分離純化，以蒸餾水或IO mmol/L的磷酸緩衝液(見參考 文獻[2p進行洗脫，收集各洗脫組分，每管收集6ml分離洗脫液，並測定OD280，繪製洗脫曲線，結果 見圖3A，可以看出發酵液可以被分出5個組分(5個峰值)。洗脫曲線各峰值的組分，經過濾除菌後以 10%的體積比與PDA培養基混合後用於培養水稻紋枯病菌，進行抗菌活性檢測。結果見圖3B顯示9號和 19號收集管的樣品，該樣品具有抗菌生物活性，而且9號收集管的樣品的抗菌效果明顯優於19號收集管 的樣品。
在抗真菌活性分析後,對9號收集管的抗菌物質樣品於-53'C進行真空冷凍乾燥進行濃縮(hetopowerdry LL3000型真空冷凍乾燥儀，按照儀器操作說明書操作)。濃縮的溶液用15 cmx5cmx0.25 cm的矽膠板分 離，用正丁醇-乙醇-醋酸-水(v/v=30: 70: 5: 20)作為展開液。以0.3%水合茚三酮(0.3g茚三酮，100ml 正丁醇，3ml醋酸)顯色後呈現三個紫色斑點，由近及遠依次命名為斑點1, 2， 3。顯示我們分離的物質 為一種肽或者蛋白。對不同斑點的抗真菌活性檢測，結果見圖4，顯示斑點l， 2的抗菌效果比較明顯， 而斑點3隻有微弱的抗菌活性。純化的抗真菌物質用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(購自南京建成生物工程 研究所)進行定量，以牛血清白蛋白作為標準樣品，全部分析方法參照上述南京建成生物工程研究所生產 考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒的說明書。
4. 抗真菌物質的特性鑑定
(1) 紅外分析
分離純化的上述脂肽樣品經真空冷凍(-53。C)乾燥濃縮成粉末後'壓片進行紅外圖譜分析結果。從圖 5中可以看出，樣品中含有氨基，甲基'醯胺鍵，碳氧鍵，亞甲基'甲基等功能鍵'與脂肽的功能基團、 功能鍵相一致，因此我們所分離的抗真菌物質為一種脂肽。
(2) 液相色譜/電噴霧質譜(LC/ESI—MS)分析我們選取分子量為1043的同系物進行ES-MSI質譜分析。所用質譜儀為Q-trap串聯的質 譜儀(QTRAP3200， Applied Biosystems， CA， USA)。
樣品在Nano-LC (Aksigent公司，名稱TEMPER)上通過自動進樣器吸入lOul的樣品， 然後進行反相色譜(C18, 0D-360咖，ID二4.6um)分離。進樣室處在16。C環境中，流動相A 為O. 1%的甲酸水溶液，8為60%的乙腈和0. 1%的甲酸水溶液，流速為200iiL/min。梯度淋洗 程序為5% B (0-5分鐘)，然後40分鐘內將B線性增加到6(m，並保持5分鐘。
質譜條件以Turbolonspray參數進行優化後如下
正離子模式下，離子噴霧電壓(IS) 2600V,去簇電壓60V.質量掃描範圍為200-1500。離子源氣體I (GS1),氣體II(GSIl),輔助霧化氣(CUR),和加熱溫度(TEM)分別設定為40， 5， 30和175'C。 結果見圖6，分離物質分子量為1065。結合圖5和圖6結果，我們推測該脂肽序列如圖7所示，該脂 肽由9C烷基和8個胺基酸組成，其中第7個烷基C和最後一個胺基酸(亮氨酸)通過一個氧形成一個環 肽，具有Asp-Val-Leu結構，為一個表面活性劑。
5.解澱粉芽胞桿菌CH1發酵液抗真菌活性的測定
研究中發現水稻紋枯病菌(兄w/a"i)對解澱粉芽胞桿菌CH1發酵液敏感，所以在這裡我們就選其作為 抗真菌分析的敏感真菌代表進行闡述。將步驟2所獲得的解澱粉芽胞桿菌CH1過濾滅菌發酵液用PDA培 養基按體積比為10%， 5%, 2.5%的比率混合倒平皿備用。在PDA平皿中將所述的水稻紋枯病菌培養好， 然後用打孔器打取直徑6mm的菌餅，將菌餅接種到上述含解澱粉芽胞桿菌CH1過濾滅菌發酵液的PDA 平皿中，並以菌餅直接接種在PDA平皿做對照，每個條件做3個重複。所有平皿放在28'C恆溫培養箱中 培養12h和24h，分別測量兄so/朋/培養物的直徑。從圖1可以看出水稻紋枯病菌在含10%CH1發酵液的 培養基上生長明顯受到抑制，而在37'C培養的CH1發酵液比在28'C培養的解澱粉芽胞桿菌CH1發酵液對 水稻紋枯病菌的抑制效果更明顯。
除開絲狀真菌，我們還檢測了解澱粉芽胞桿菌CH1發酵液對酵母的抗菌活性。接種假絲酵母(Ca"dcfa fro;;fcato)假絲酵母(CCTCC AY91001，湖北省武漢大學內中國典型培養物保藏中心提供)到YPD培養 基(10g酵母浸粉，20g蛋白腖和20g葡萄糖溶於800mL蒸餾水中，調節pH至5.5，補充蒸餾水至1L), 28。C培養過夜。然後取O.lml的假絲酵母新鮮菌液接種到10mlYPD培養基中繼續培養48h。取0.5ml的假 絲酵母菌液6000rpm離心2min收集細胞，用PBS重懸細胞並調節其濃度至1000細胞/ml。然後用lml濃 度為00ng/m的脂肽在28'C處理上述細胞4h,再取100^1該細胞懸液塗布在YPD瓊脂培養基上，28'C培 養2天。以僅用YPD (稀釋一倍後塗布)或者PBS處理的細胞作對照，結果見圖2。提純的脂肽可明顯抑 制假絲酵母的生長繁殖，表現為與對照相比，菌落數減少，菌落大小也明顯小於PD或PBS對照。6.解澱粉芽胞桿菌CH1抗真菌脂肽處理後的細胞凋亡標記檢測
(1) 用雙苯甲亞胺(Hoechst 33258)對經抗真菌脂肽處理過的菌絲染色 首先在蓋玻片上滴上幾滴熔化的PDA培養基讓其自然延伸至整個載玻片表面，然後接種水稻紋枯病
菌到上述載玻片上，25'C培養12h以形成菌絲。然後分別滴加100(ig/ml的抗真菌脂肽浸潤菌絲2， 4， 6h， 並以滴加PBS的處理作為對照。處理完後PBS衝洗3遍，再用0.1 ng/ml的Hoechst 33258(Sigma-Aldrich, 美國)(用PBS配製)染色5min。染色完後再用PBS洗蓋玻片3遍，再用Olyrapus BX51螢光顯微鏡觀 察。
取lmL如步驟5培養方法培養的假絲酵母菌液，4000rpm離心3min收集沉澱，用PBS洗滌一遍，再 用100ug/ml的脂肽溶液在搖床上40-50rpm低速處理2， 4， 6h後，用Hoechst 33258染色，洗滌後用50°/。 甘油重新懸浮細胞，並以螢光顯微鏡進行觀察。具體方法參見上述對水稻紋枯病菌的處理方法。以PBS處 理假絲酵母作為對照。
結果見圖8，在低倍鏡和高倍鏡下處理組的螢光比對照組強很多，處理組能很好的被Hoechst 33258 染色，說明處理後細胞膜通透性有較大改變。其中還能看出有濃縮的細胞核被染色。
(2) Annexin V-FfTC標記
在蓋玻片上培養水稻紋枯病菌，滴加幾滴120ng/ml的抗真菌脂肽覆蓋菌絲，室溫處理6h,以滴加PBS 處理的菌絲作為對照。然後用PBS洗菌絲1遍，再用稀釋液(0.3mol/L的NaCl和MgS04)配製的1%的 蝸牛酶和纖維素酶在室溫處理4h。用稀釋液洗滌洗滌菌絲1遍，然後用碘化丙錠(Pl)和異硫氰酸螢光素 FITC連接的Annexin V蛋白混合液(A加exin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自beyotime)室溫避光處 理20min。混合液按試劑盒中的說明書所述配製，19(^1的lx結合緩衝液裡加5pl的Annexin V-FITC儲存 液和的PI儲存液(上述試劑為試劑盒自帶，見Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，購自beyotime)。 處理完後，用結合緩衝液(上述試劑盒自帶)洗1遍，再用Olympus BX51螢光顯微鏡觀察。
將培養好的假絲酵母用120ug/ml的脂肽處理6h後，用1%的蝸牛酶和纖維素酶室溫處理4h,用稀釋 液洗滌菌體一遍，並以FITC-Annexin V及PI染色，處理完畢後，用結合緩衝液洗1遍，380g離心5min 收集細胞，再用100nl結合緩衝液重懸細胞後螢光顯微鏡觀察。以用PBS處理的酵母細胞作為對照。
結果見圖9，可以明顯地看出用120ng/ml的抗真菌脂肽處理後磷脂醯絲氨酸外翻而且細胞膜完整的細 胞比對照組多，即凋亡細胞比對照組明顯增多。圖9-D為典型的凋亡細胞磷脂醯絲氨酸外翻。
(3)真菌細胞中活性氧ROS的檢測
利用步驟(1)相同方法在蓋玻片上培養水稻紋枯病菌，培養好後滴加幾滴120ng/ml的抗真菌脂肽覆 蓋菌絲，室溫處理4h,以滴加PBS處理的菌絲作對照。然後用PBS洗菌絲1遍，再用稀釋液(0.3mol/L 的NaCl和MgS04)配製的1%的蝸牛酶(購自AMRESCO公司)和纖維素酶在室溫處理4h。用稀釋液洗滌菌絲1遍，再滴加幾滴用稀釋液配製的10nmol/L的DCFH-DA(二氯二氫螢光黃雙乙酸鈉)，室溫處理 45min,然後用稀釋液洗滌3遍後，在螢光顯微鏡下觀察。
取假絲酵母菌液用120pg/ml的脂肽溶液在搖床上低速處理4h後，1%的蝸牛酶和纖維素酶處理4h， 再以終濃度為10nmol/L的DCF-DA進行反應45min，然後用稀釋液重新懸浮細胞進行炎光顯微鏡觀察。 以PBS處理的酵母作為對照，具體處理方法如上述對水稻紋枯病菌處理的方法相同。
如圖10所示，結果兩種處理組菌絲紅色螢光很明顯，顯示用120ng/ml的抗真菌脂肽處理的細胞內的 活性氧明顯高於對照組。
(4)脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記分析(TUNEL分析)
將在蓋玻片上培養好的水稻紋枯病菌或假絲酵母用100ng/ml的抗真菌脂肽處理6h，然後用4%的多聚 甲醛固定lh以滅活內在的DNA末端轉移酶的活性。用PBS洗3遍後，用1%的蝸牛酶和纖維素酶溶液室 溫處理4h去壁。用裂解液洗細胞或蓋玻片1次後，再以穿透液(用PBS配製的1%的Triton X-100)冰 育2min後，立即用冰預冷的PBS衝洗細胞或蓋玻片2遍。在細胞中添加25pl的TUNEL反應混合液(按 照試劑盒說明配製lnl末端脫氧核酸轉移酶和24nl緩衝液混合而成，Byotime) 37'C反應60min。用PBS 衝洗細胞或蓋玻片3遍後用50%甘油重懸細胞或封片，然後用於螢光顯微鏡觀察。以用PBS處理的水稻紋 枯病菌或酵母細胞作為對照。經螢光顯微鏡觀察，結果見圖ll,可以發現用脂肽處理的細胞內螢光比對照 組強烈，說明其細胞內DNA斷裂較多。
參考文獻
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—株分離的產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌CH1 〈130>
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<歸 2

<210〉 1
1555
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解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)
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〈213〉 解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) 〈220〉
DOMAIN (1)..(8) 2
Leu Glu Arg Ala Asp Val Leu Leu 1 權利要求
1、一株分離的產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)CH1，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM208127。
2、 一種由權利要求1所述的解澱粉芽胞桿菌菌株CH1產生的促真菌凋亡脂肽。
3、 權利要求2所述的促真菌凋亡脂肽，其分子量為1065，該脂肽由9碳烷 基和8個胺基酸組成，在第7個烷基碳與最後一個胺基酸通過一個氧原子形成 環肽，其序列及構型如下CHHCH^-CpH-CHrCO- Leu-Glu-Arg-Ala-Asp-Val-Leu- L印。0-
4、 權利要求1所述的菌株在製備促真菌凋亡脂肽中的應用,
5、 權利要求2或3所述的脂肽在促真菌凋亡中的應用。
全文摘要
本發明屬於農業微生物學技術領域，同時涉及生物化學與分子生物學領域。分離得到一株產促真菌凋亡脂肽的解澱粉芽胞桿菌菌株(Bacillusamyloliquefaciens)CH1，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM208127。從該解澱粉芽胞桿菌菌株CH1的培養物中獲得具有生物活性物質，被表徵為促真菌凋亡脂肽。該脂肽的分子量為1065或它的同系物。具有如說明書附圖6所示的紅外圖譜。該脂肽由9碳烷基和8個胺基酸組成，在第7個烷基碳與最後一個胺基酸通過一個氧原子形成環肽。對該解澱粉芽胞桿菌菌株以及其製備的脂肽在細胞凋亡中的生物學應用前景進行了試驗。
文檔編號C12P21/04GK101418271SQ20081019740
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月27日 優先權日2008年10月27日
發明者喻子牛, 張世超, 凱 文, 朱發銀, 祁高富, 趙秀雲 申請人:華中農業大學