1-o-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼(pc-o)40:1作為健康性老化的生物標誌物的製作方法
2023-12-02 13:36:06 4
1-o-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼(pc-o)40:1作為健康性老化的生物標誌物的製作方法
【專利摘要】使用基於NMR/MS的代謝組學和靶向脂質組學方法，本發明人在包括百歲老人、較年長者和年輕成年人的群組中研究了老化和長壽的代謝表型。本發明人鑑定了降低的老化相關慢性炎性病症發生風險的生物標誌物，提出使用(PC-O)40:1作為生物標誌物診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的方法。
【專利說明】1 -ο-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40:1作為健康性 老化的生物標誌物
【技術領域】
[0001] 本發明一般涉及健康生活方式和老化相關慢性病症的預防。特別地，本發明涉及 生物標誌物及其在檢測生活方式的改善中的應用。由此，本發明提供例如1-0-烷基-2-醯 基甘油磷酸膽鹼（PC-0)40:1作為生物標誌物，還提供使用生物標誌物1-0-烷基-2-醯基 甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40:1診斷生活方式的方法，其中所述生活方式允許延遲和/或避免老 化相關的慢性炎性病症。
【背景技術】
[0002] 老化被定義為：時間依賴性的功能性能力（functional capacity)和壓力抵抗 (stress resistance)的下降，與增加的發病和死亡風險相關。此外，人類的老化表型具有 非常大的異質性，可以描述為因各種各樣環境的、隨機的和遺傳-後生的變量的相互作用 引起的複雜鑲嵌（complex mosaic)。幾十年的老化研究已經發現與老化過程相關的數百個 基因和許多生物學過程，但是同時，許多基本問題仍未回答、或是激烈爭議的對象。
[0003] 這些問題常常不能通過檢查單個基因或單個途徑來解決，但是可以在系統水平得 到較好的解決，體現了老化是一個複雜的多因素過程。此外，老化可以伴有慢性的低度炎性 狀態，該狀態因促炎和抗炎過程之間的失衡引起，是一種致病性狀況，已經被揭示在主要的 年齡相關慢性疾病如動脈粥樣硬化、2型糖尿病和神經變性的發病中具有關鍵性。
[0004] 在此看法中，後天獲得的健康老化和長壽可能不僅反映了較低的炎性反應累積傾 向，也反映了有效的抗炎網絡發育。此外，越來越多地意識到腸道微生物群（microbiota) 的變化因其對宿主哺乳動物系統的影響而具有重要性，腸道微生物群已經在幾種疾病如 胰島素抗性、克羅恩氏病、腸易激惹症候群、肥胖和心血管疾病的病因學中展示了直接的影 響。
[0005] 代謝組學（Metabonomics)現今被認為是表徵代謝表型的一種成熟系統方法，代 謝表型由針對各種內在和外在參數的協同生理學反應引起，所述參數包括環境、藥物、飲食 模式、生活方式、遺傳和微生物組（microbiome)。與基因表達和蛋白組數據指示生理學改變 的可能性不同，代謝物及其濃度在細胞、組織和器官中的動力學變化是生理調節過程的真 正終點。
[0006] 代謝物組學（Metabolomics)已經成功地應用於小鼠、狗和非人靈長類動物中研 究營養幹預後老化過程的調節（包括卡路裡限制誘導的代謝變化）。特別地，在犬群中腸道 微生物群代謝的顯著改變與老化相關。儘管有這些發現，但是對影響老化過程的分子機制 的全面描繪尚未見報導。此外，仍然缺少對長壽的代謝表型研究。
[0007] 因此，本發明的目的是，向本領域提供可以容易地進行檢測且允許對如下生活方 式作出診斷的生物標誌物，所述生活方式可能允許健康性老化，且尤其允許延遲和/或避 免老化相關的慢性炎性病症。
【發明內容】
[0008] 本發明人驚奇地發現，通過獨立權利要求的主題，他們能夠實現本發明的目的。從 屬權利要求進一步拓展本發明的構思。
[0009] 在尿中使用組合的整體1Η核磁共振（NMR)光譜學，在血清中使用靶向質譜（MS)和 脂質組學（lipidomic)方法，本發明人可以在包括百歲老人、較年長者和年輕成年人的一 個明確限定的老化群組中檢測代謝譜的改變。
[0010] 所選的老化組是義大利北部的一個限制性地理區域中的均質群體，包括年輕成 年人（平均31歲）、較年長者（70歲）和百歲老人（100歲）。在這三個老化組中，百歲 老人是公認的健康性老化和長壽的模型[Sansoni P,等，Exp Gerontol. 2008;43:61-65; Franceschi C,等，Mech Ageing Dev. 2007 ; 128:92-105 ;Cevenini E,等，Expert Op in Biol Ther. 2008 ;8:1393-1405]。他們後天獲得的成功老化似乎是由促炎力和抗炎力之間 的最佳平衡驅動的[Franceschi C,等，Mech Ageing Dev. 2007;128:92-105]。 toon] 本發明人驚奇地發現在較年長者和百歲老人的表型之間存在顯著差異，其中腸道 微生物群和宿主之間相互作用的動力學以及炎症反應的中立平衡在長壽表型中要顯著得 多。
[0012] 本發明人通過使用互補的NMR-MS代謝物組學和脂質組學（lipidomic)方法，在尿 和血清兩者中表徵了老化和長壽的代謝表型（代謝型，metabotype)。
[0013] 因為獨特的延遲疾病和傷殘進入其生命後期歲月的能力，百歲老人達到人類壽命 的最極限。經典臨床參數（表1)顯示，百歲老人具有非常低的胰島素抗性發生率，具有對 於其年齡而言最佳的人體測量值（BMI)、代謝值（膽固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯）。此外， 使用簡易精神狀態檢查表（MMSE)測量了他們的認知功能，發現嚴重認知衰退的低發生率。
[0014] 特別地，百歲老人表現出獨特的代謝表型。尿的代謝譜分析揭示了，長壽表型受到 腸道微生物組的高度影響，表現出更高的苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和硫酸對甲酚（PCS)排洩。 本發明人提出，腸道微生物群大量代謝蛋白質和芳族胺基酸，包括苯丙氨酸和酪氨酸，以形 成苯乙醯穀氨醯胺和硫酸對甲酚。
[0015] 基於MS的靶向代謝組學綜合分析揭示了血清中與長壽和健康性老化相關的重要 生物學改變。此外，三個年齡組之間，百歲老人是具吸引力的用於表徵的長壽模型，因為獨 特的延遲疾病和傷殘進入其生命後期歲月的能力，他們達到人類壽命的最極限。在老化進 程中，本發明人觀察到溶血磷脂醯膽鹼（LPC 18:2，LPC 20:4)的降低，其濃度在百歲老人 中降低更多。尤其是，LPC 18:018.0的減少看上去是百歲老人所特有的。儘管有必要注意 到LPC基於脂肪酸鏈長和飽和度具有不同種類，其生理學和生物學性質不同，但是磷脂類 通常是促炎性的[Aiyar N，等，Mol Cell Biochem. 2007;295:113-120]，具有導致動脈粥 樣硬化的性質[Schmitz G,等，Atherosclerosis. 2010;208:10-18]，常常在2型糖尿病患 者中見到其水平增加 [Rabini RA,等，Diabetes. 1994;43:915-919]。
[0016] 年長的百歲老人表現出幾種醯基醚PC濃度的平衡改變，其中三種PC，即PC-0 34:3、PC-0 36:4和PC-0 40:1的含量顯著降低，而兩種醚PC，即PC-0 32:1和PC-0 34:1 顯著更高。儘管對醚磷脂的生理學作用了解較少，但是含有連接sn-Ι脂族鏈至甘油主鏈的 乙烯基醚鍵的縮醛磷脂是豐度最大的醚磷脂。在此，醯基醚磷脂醯膽鹼類分子的水平差異 可能由處理氧化損傷方面的差異造成。
[0017] 在年齡進程中，觀察到鞘磷脂（SM)類分子的增加，其中在百歲老人中SM 24. 1和 SM 16:0明顯地增加。本發明人還發現在百歲老人中SM24:0和SM-0H 22:1濃度的特異減 低。SM類分子是重要的細胞膜組成成分，在構建、代謝和運輸中與膽固醇緊密結合，富集在 脂筏中。SM的生理學作用仍不清楚，先前的研究顯示了升高的SM水平和動脈粥樣硬化之間 的關係[Kummerow FA,等，J Nutr Biochem. 2001 ; 12:602-607]，而其它研究顯示血楽鞘磷 脂水平與增加的CVD事件風險無關。最後，儘管大多數二醯基磷脂醯膽鹼類分子（PC-Ο)的 水平沒有顯著改變，但百歲老人表現出單獨PC-0 36:2水平的改變。
[0018] PC和PC-ο含量的變化影響花生四烯酸代謝物合成（前列腺素、血栓素、白三烯） 的活性，這些代謝物是宿主生理反應的關鍵介質和調節劑，參與氧化應激、細胞凋亡和免疫 及炎症功能的調節。事實上，百歲老人還顯示出具有抗炎和促炎性質的脂質介質的獨特平 衡網絡。
[0019] 與較年長者相比，觀察到更高濃度的白三烯類分子LTB-4和LTE-4。百歲老人展 示出更高水平的15-羥基-二十碳四烯酸（15-HETE)--15-脂加氧酶（15-L0X)的主要產 物。15-HETE抑制5-脂加氧酶形成，減少白三烯Μ和12-HETE的產生，抑制免疫反應。與 較年長者相比，在百歲老人中還觀察到CYP途徑活化的增加，其中8, 9-EpETrE產生增加而 11，12-DiHETrE的濃度降低。EpETrE是心臟和心外組織中許多細胞內信號傳導的重要成 分。研究已經證實，EpETrEs通過抑制核因子（NF)-kB介導的基因轉錄的激活而表現出抗 炎作用。此外，它們還在血管系統中顯示出溶血栓和血管發生性質。EpETrEs可以被可溶性 環氧化物水解酶（sEH)進一步代謝為二羥基-二十碳三烯酸（DiHETrE)。
[0020] 一般，當EpETrEs被SH1代謝為DiHETrEs時，它們的生物學活性將變得較不顯著， 因此，在此11，12-DHET濃度的降低可能揭示了減少的sHl對其前體11，12-EpETrE的作用。
[0021] 百歲老人顯示出9_H0DE(-種生物學活性分子，脂質過氧化的標誌物）和9-氧 代-H0DE(亞油酸的穩定氧化產物，當氧化應激增加時，其產生增加）的明顯降低。
[0022] 百歲老人顯示出9-氧代-H0DE(亞油酸的穩定氧化產物，當氧化應激增加時，其 產生增加）的明顯降低。大多數亞油酸以PC和膽固醇亞油酸脂的酯化形式存在，兩者 均是LDL的主要成分，並持續暴露於許多類型氧化應激以產生氫氧（hydroxy)和過氧氫 (hydroperoxy)類分子。
[0023] 增加水平的脂質氧化產物，例如9-氧代0DE先前曾在患有類風溼性關節炎和動脈 粥樣硬化的患者血漿樣品中被檢測到。
[0024] 此外，與較年長者相比，百歲老人顯示出二十碳五烯酸（EPA)的耗竭。儘管在人體 中EPA可以從α -亞油酸合成、或以更大的量直接從含油魚或魚油補充物獲得，但是EPA可 以轉化為η-3類二十烷酸，其具有多種多樣的功能。ΕΡΑ的耗竭可能反映了 η-3類二十烷酸 的生物合成增加。
[0025] 因此，本發明部分地涉及診斷生活方式的方法，所述生活方式允許延遲和/或避 免老化相關的慢性炎性疾病，所述方法包括：
[0026] _從受:試者獲得血清樣品；
[0027] -確定樣品中1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40:1的水平，和
[0028] -將受試者的PC-0 40:1水平與預定參考值比較，
[0029] 其中預定參考值以對照群體中的平均血清PC-0 40:1水平為基礎，其中相比於該 預定參考值，樣品中降低的血清PC-ο 40:1水平指示延遲和/或避免老化相關的慢性炎性 病症的可能性增加。
[0030] 本方法具有例如從受試者獲取血清是成熟方法的優點。實際的診斷方法可以在體 外血清樣品中進行。
[0031] 樣品中PC-0 40:1水平可以通過本領域已知的任何方式進行檢測和定量。例如， 可以使用質譜如UPLC-ESI-MS/MS或NMR譜如 1H-NMR譜。其它方法，例如其它光譜方法、色 譜方法、標記技術、或定量化學方法也可以使用。
[0032] 預定參考值以對照群體中平均血清PC-0 40:1水平為基礎。對照群體可以是至少 3個，優選至少10個，更優選至少50個具有相似遺傳背景、年齡和平均健康狀況的人組成的 群體。
[0033] 對照群體也可以是相同個體，由此預定參考值為先前從相同受試者獲得的值。這 將例如允許直接比較目前的生活方式和先前的生活方式，可以直接評估生活方式的改善。
[0034] 典型的老化相關慢性炎性病症是本領域熟知的。大部分的老化表型可以通過 炎性和抗炎網絡之間的失衡來解釋，該失衡導致老化的低度慢性促炎狀態，炎症性老化 "inflamm-ageing"（Candore G.，等，Biogerontology· 20100ct ; 11 (5) :565-73)。
[0035] 因此，本發明的方法可以用於診斷炎症性老化的水平。
[0036] 典型的老化相關炎性病症有：例如，動脈粥樣硬化、關節炎、痴呆、2型糖尿病、骨 質疏鬆和心血管疾病。例如，對於這些病症，炎症被視為是連接老化和年齡相關病理過程的 分子改變的可能潛在基礎（Chung 等，ANTI0XIDANTS&RED0X SIGNALING, Volume 8, Numbers 3&4, 2006, 572-581)。
[0037] 對於本發明的目的，PC-0 40:1可以作為唯一標誌物使用。
[0038] 儘管對於本發明診斷方法而言PC-0 40:1作為唯一標誌物是有效工具，但是如果 診斷依賴於一個以上標誌物，則可以提高所述診斷的質量和/或預測力。
[0039] 因此，可以與PC-0 40:1組合使用一種或多種用於延遲和/或避免老化相關的慢 性炎性病症的可能性的其它標誌物。
[0040] 本發明人驚奇地觀察到，也可以使用其它生物標誌物檢測延遲和/或避免老化相 關的慢性炎性病症的可能性。
[0041] 由此，本發明人鑑定到，增加血清濃度的
[0042] 1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 32: 1，
[0043] 1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34:1，
[0044] 15-羥基-二十碳四烯酸（15-HpETE)，
[0045] 白三烯 E4(LTE4)，
[0046] 白三烯 B4(4LTB)，和 / 或
[0047] 8, 9-環氧二十碳三烯酸（8, 9EpETre)
[0048] 允許診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式，
[0049] 而降低血清濃度的
[0050] 羥基-鞘磷脂（SM-0H) 22: 1，
[0051] 溶血磷脂醯膽鹼（LPC) 18:0
[0052] 鞘磷脂（SM) 24:0，
[0053] 1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34: 3，
[0054] 1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 36: 4，
[0055] 磷脂醯膽鹼（PC) 36:2，
[0056] 羥基十八碳二烯酸（9-H0DE)，
[0057] 9-氧代-十八碳二烯酸（9-氧代-H0DE)，
[0058] 和 / 或
[0059] 11，12-環氧二十碳三烯酸（11，12-DiHETre)
[0060] 允許診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式。
[0061] 各類脂質分子按如下進行注釋：
[0062] [脂質類型][碳原子總數]:[雙鍵總數]。例如，PC 34:1反映包含34個碳原子 和1個雙鍵的磷脂醯膽鹼類分子。
[0063] 因此，在本發明的方法中，可以還通過評估，相對於先前獲得的參考值，血清中一 種或多種下述生物標誌物的濃度是否增加：PC-0 32:l、PC-0 34:l、15-HpETE、LTE4、LTB4、 8, 9EpETre和/或血清中一種或多種下述生物標誌物的濃度是否降低：LPC 18:0、SM-OH 22:1、SM 24:0、PC-0 34:3、PC-0 36:4、PC 36:2、9-H0DE、9-氧代-H0DE、ll，12-DiHETre，以 提1?診斷的準確性。
[0064] 本發明方法可以包括對至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少 7個、或至少8個生物標誌物的評估。
[0065] 例如，可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22:1。
[0066] 也可以評估PC-0 40:1連同SM 24:0。
[0067] 可以評估 PC-0 40:1 連同 LPC 18:0。
[0068] 可以評估 PC-0 40:1 連同 LTE4。
[0069] 可以評估 PC-0 40:1 連同 PC-0 34:1。
[0070] 可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22:1 和 SM 24:0。
[0071] 可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22:1，SM 24:0 和 PC-0 40:1。
[0072] 可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22:1，SM 24:0, PC-0 40:1 和 9-H0DE。
[0073] 可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22: 1，SM 24:0, PC-0 40: 1，9-H0DE、和 9-氧 代-H0DE。
[0074] 可以評估PC-0 40:1 連同 SM-0H 22: 1，SM 24:0, PC-0 40: 1，9-H0DE, 9-氧代-H0DE 和 LPC 18:0。
[0075] 可以評估 PC-0 40:1 連同 SM-0H 22:1、SM 24:0、PC-0 34:1、9-H0DE、9-氧 代-H0DE、LPC 18:0 和 LTE4。
[0076] 評估一個以上生物標誌物的優點是，評估的生物標誌物越多，診斷將變得越可靠。 如果例如如上所述1，2, 3, 4, 5, 6,或7個以上的生物標誌物表現出升高或降低的濃度，則強 烈指示延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的可能性增加。
[0077] 因此，本發明方法可以進一步包括確定樣品中SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34:1，9-H0DE, 9-氧代-H0DE，或 LTE4 中至少一個的水平，並將 SM-0H 22:1，LPC 18:0，SM24:0，PC-0 34:l，9-H0DE，9-氧代-H0DE，或LTE4中至少一個的受試者水平與 預定參考值比較，其中預定參考值以對照群體中SM-OH 22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC-0 34: 1，9-HODE，9-氧代-HODE或LTE4的平均血清水平為基礎，且其中，相對於預定參考值，樣 品中較低血清PC-0 40:1水平和/或樣品中較低血清SM-0H 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34:1，9-H0DE或9-氧代-H0DE水平指示，延遲和/或避免老化相關慢性炎性疾病的可能性 增加，和/或其中與預定參考值比較，樣品中升高的血清LTE4, PC-0 34:1水平指示，延遲和 /或避免老化相關慢性炎性病症的可能性增加。
[0078] 本發明診斷的準確性可以通過如下而進一步提高：還評估，相對於先前獲得的參 考值，血清中生物標誌物PC-0 32:1，15-HpETE，LTB4,8,9EpETre中一個或多個是否增加， 和/或血清中生物標誌物PC-0 34:3，PC-0 36:4，PC 36:2，ll，12-DiHETre中一個或多個是 否降低。
[0079] 本發明方法可以另外地或備選地用於診斷允許健康和/或更健康的老化的生活 方式。
[0080] 可以通過將實際的PAG和/或PCS水平與先前從相同個體獲得的預定參考值比 較，診斷更健康的老化。因此，在將相同受試者用作對照群體的情況下，可以直接觀察生活 方式的改善，從而消除了在其它平均對照群體中由稍微不同的條件而引起的不確定性。
[0081] 本發明方法還可以用於診斷長壽；和/或長壽的可能性。這具有優點--可以直 接檢測更健康生活方式的後果，可以監測健康生活方式的維持，以及可以在不健康的生活 方式的第一次臨床表現出現前糾正不健康的生活方式。
[0082] 本發明方法還可以備選地和/或另外地用於診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用。腸道微生物組對宿主發揮著多種重要的生物化學功能，微生物組的紊亂與許多 且多樣的人類疾病過程相關（Kinross等，Genome Medicine 2011，3:14)。不利的腸道微生 物菌群-宿主相互作用可以具有許多臨床表現，例如系統疾病狀態，如肥胖和心血管疾病； 或腸道狀況，如炎症性腸病。
[0083] 可以在任何受試者中診斷腸道微生物菌群-宿主相互作用，但是可能尤其重要的 是在成年人或較年長者中監測健康的微生物菌群-宿主相互作用。
[0084] 因此，可以在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0085] 如果受試者超過其來源國的平均預期壽命的前二分之一，優選地其超過其來源 國的平均預期壽命的前三分之二，更優選地其超過其來源國的平均預期壽命的前四分之 三，最優選地其超過其來源國的平均預期壽命的前五分之四，則該受試者被視為一較年長 者II。
[0086] 例如，如果受試者是人，則本發明方法可以在至少45歲，至少60歲，或至少75歲 的成年人上實施。
[0087] 待使用本發明方法檢查的受試者可以是人或動物，尤其是例如哺乳動物。典型的 動物可以是例如陪伴動物如貓或狗或農場動物。
[0088] 本發明方法可以另外地或備選地用於檢測生活方式改變的結果。因此，可能有利 的是，將PC-ο 34:水平以及任選地本文提及的其它生物標誌物的水平與先前（例如在生活 方式改變之前或生活方式改變的較早期）獲自受試者的PC-0 34:水平和任選地其它生物 標誌物的水平進行比較。
[0089] 因此，本發明方法可以診斷更健康的生活方式，其中預定參考值基於從生活方式 改變前的受試者獲得的血清PC-ο 40:1水平和任選地其它生物標誌物的水平。
[0090] 生活方式改變可以是任何改變，例如不同的工作、更多的睡眠、較少的飲酒、更多 的挑戰、較少的壓力、較少的吸菸、更多的運動、不同的工作和/或生活環境，等等。
[0091] 生活方式的改變還可以是飲食的變化。
[0092] 飲食變化可以是例如使用先前未用過的或以不同量使用的至少一種營養產品。
[0093] 由此，本發明方法可以用於檢查新營養方案、營養產品和/或藥物的有效性。
[0094] 營養產品可以是例如聲稱對健康性老化和/或避免老化相關的慢性炎性病症有 作用的產品。
[0095] 典型地，營養產品可以是食品、飲品、寵物食品、食物增補物、營養藥、食物添加劑、 或營養配方產品。
[0096] 樣品中生物標誌物的水平例如PC-0 40:1的水平和任選地其它生物標誌物的水 平可以通過本領域已知的任何方式檢測和定量。例如，可以使用質譜如UPLC-ESI-MS/MS，或 NMR光譜如1H-NMR光譜。
[0097] 其它方法，例如其它光譜方法、色譜方法、標記技術或定量化學方法也可以使用。
[0098] 本發明方法包括將測試的受試者的PC-0 40:1水平和任選地其它生物標誌物的 水平與預定參考值比較，所述預定參考值可以源自可比對照受試者的血清PC-ο 40:1水平 和任選地其它生物標誌物的水平。
[0099] 受試者的PC-0 40:1水平和任選地其它生物標誌物的水平與相應的對照值之間 的差異程度也可以用於表徵風險程度，並由此確定哪些受試者將最為得益於某些治療。
[0100] PC-ο 40:1的參考值以及任選地其它生物標誌物的參考值優選使用如下單位度 量，所述單位與表徵從測試的受試者獲得的PC-ο 40:1及任選地其它生物標誌物的水平時 使用的單位相同。因此，如果PC-0 40:1及任選地其它生物標誌物的水平是絕對值，例如 PC-0 40:1的單位（μ mol/1 ( μ M)血清），則參考值也基於一般群體或選擇的對照受試者群 體中的個體的PC-ο 34:1單位（（μ mol/ι (μ Μ))。
[0101] 此外，參考值可以是單個截斷值，例如中值或平均值。在獲得的血清樣品中PC-0 40:1和任選地其它生物標誌物的參考值，例如平均水平、中值水平或一截斷||水平，可以 通過分析一般群體或所選群體中的大樣本個體，使用統計學模型而建立，例如預測值方法 用於選擇陽性標準，或受試者工作特徵曲線（receiver operator characteristic curve) 定義最佳特異性（最高的真陰性率）和靈敏度（最高的真陽性率），描述見併入此處作為 參考的 Knapp, R.G.和 Miller, M.C. (1992) .Clinical Epidemiology and Biostatistics· William and Wilkins, Harual Publishing Co. Malvern, Pa. 〇
[0102] 本領域技術人員知曉如何分派正確的參考值，其將隨著性別、種族、基因遺傳、健 康狀況或年齡等而變。
[0103] 例如，預定參考平均值可以是
[0104] _2 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 32: 1，
[0105] -7. 80 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34:1，
[0106] -1. 25 μ g/100 μ 1 血清的 15-羥基-二十碳四烯酸（15-ΗρΕΤΕ)，
[0107] -0.013yg/100y 1 血清的白三烯 E4(LTE4)，
[0108] -0.020yg/100y 1 血清的白三烯 B4(4LTB)，和 / 或
[0109] -0· 070 μ g/100 μ 1 血清的 8, 9-環氧二十碳三烯酸（8, 9EpETre)
[0110] -16.07以]?的羥基-鞘磷脂（5]\1-0!1)22:1，
[0111] -52. 00 μ Μ的溶血磷脂醯膽鹼（LPC) 18: 0，
[0112] -25. 00 μ Μ 的鞘磷脂（SM) 24: 0，
[0113] -5. 07 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34: 3，
[0114] -14. 30μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 36:4，
[0115] -1. 41 μΜ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40:1，
[0116] -10. 00 μ Μ 的磷脂醯膽鹼（PC) 36: 2，
[0117] -0· 34μ g/ΙΟΟμ 1血清的羥基十八碳二烯酸（9-H0DE)，
[0118] -0. 043 μ g/100 μ 1血清的9-氧代-十八碳二烯酸（9-氧代-H0DE)，和/或
[0119] -(λ 017μ g/ΙΟΟμ 1 血清的 11，12-環氧二十碳三烯酸（11，12-DiHETre)。
[0120] 較高或較低的值指示增加的延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的可能（如上 詳述）。
[0121] 本發明人也驚奇地發現可以用於診斷生活方式的尿中的其它生物標誌物，所述生 活方式允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症。
[0122] 由此，本發明人鑑定了，苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或硫酸對甲酚（PCS)的增加 的尿濃度允許診斷如下生活方式，所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病 症。
[0123] 苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或硫酸對甲酚（PCS)可以使用本發明的方法評估，其 中唯一的差異在於使用尿樣品。
[0124] 尿樣品具有其可以非侵入式獲得和分析的優點。
[0125] PAG和PCS的預定參考值可以由本領域技術人員確定，並且隨情形而變化很大。例 如，尿中，典型的參考值對於PCS可以是63 μ mo 1/mmo 1肌酐，對於PAG可以是81 μ mo 1/mmo 1 肌酐。更高的值指示增加的延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0126] 本發明也延及新生物標誌物的發現，所述新生物標誌物可以用於診斷允許延遲和 /或避免老化慢性炎性病症的生活方式。
[0127] 因此，本發明包括用於診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病症的生活方式的 生物標誌物，其中所述生物標誌物是PC-0 40:1。
[0128] 該生物標誌物可以在血清中檢測，其具有待測樣品能夠容易獲得（可以在為其它 目的分析血清時）的優點。
[0129] 本領域技術人員理解，他們可以自由地組合本文描述的所有本發明特徵，而不偏 離所公開的本發明的精神。尤其是，針對本發明方法描述的特徵可以應用於本發明的生物 標誌物，反之亦然。
[0130] 本領域技術人員也將理解，儘管在文中將生物標誌物及其在診斷方法中的應用描 述為
[0131] -診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式，
[0132] -診斷允許健康老化的生活方式，
[0133] -診斷長壽，和/或
[0134] -診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，
[0135] 但是所述生物標誌物同樣也可以應用於方法中以
[0136] -診斷促進老化相關慢性炎性病症發生的生活方式，
[0137] -診斷可能防止健康老化的生活方式，
[0138] -診斷壽命縮短的風險，和/或
[0139] -診斷較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0140] 在其它方面，本發明提供方法用於：
[0141] -延遲、避免和/或防止老化相關慢性炎性病症的發生，
[0142] -促進健康老化，
[0143] -促進長壽，
[0144] -降低壽命縮短的風險，
[0145] -促進更健康的腸道微生物菌群_宿主相互作用，和/或
[0146] -防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0147] 典型地這些方法包括步驟：對受試者實施本文描述的診斷方法；和基於其結果， 改變受試者的生活方式。例如，該方法可以包括：如果診斷步驟的結果指示：在受試者中
[0148] -增加的發生老化相關慢性炎性病症的可能性，
[0149] -可能防止健康老化的生活方式，
[0150] -壽命縮短的風險，和/或
[0151] -較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用；
[0152] 則改變受試者的生活方式。
[0153] 受試者生活方式的改變可以是本文所述的任何改變，例如飲食變化、不同工作、更 多睡眠、較少飲酒、更多挑戰、較少壓力、較少吸菸、更多運動、不同的工作和/或生活環境， 等等。
[0154] 優選地，所述改變是使用先前未用過或以不同量用過的至少一種營養產品，例如 對健康老化和/或避免老化相關慢性炎性病症有作用的營養產品（包括食品、飲料、寵物食 品、食物補充物、營養藥、食物添加劑或營養配方產品）。
[0155] 改變受試者生活方式也包括指明受試者需要改變他/她的生活方式，例如向受試 者開處方、推薦和/或建議如上所述的生活方式改變。例如，該方法可以包括步驟：向受試 者施用或提供至少一種上述營養產品。
[0156] 從下面的表格、實施例和附圖，本發明的其它優點和特點將是明顯的。
[0157] 表1顯示募集的老化群組的人口統計學和臨床特徵。數值表示為平均值（+SD)，括 號中顯示範圍。 1BMI =身體質量指數，2糖尿病：糖尿病史、空腹血漿葡萄糖> 126mg/dl， 3HDL=高密度脂蛋白，4LDL=低密度脂蛋白，5MMSE=使用簡易精神狀態檢查表（MMSE)的認 知功能量度。分析中使用的分值對於老年人通過年齡和受教育年數進行校正。對於較年長 者的認知損傷，MMSE分級為重度（分值0-17)、輕度（分值18-23)、或不存在（分值24-30)。 對於百歲老人，MMSE彡20不存在嚴重認知下降；〈12存在嚴重認知下降。 6CRP = C反應蛋 白；7A-SAA =血清澱粉樣蛋白A(SAA)蛋白質。
[0158] 表2展示所選老化群之間的辨別模型的特徵和模型總結。
[0159] 表3顯示通過1H-NMR檢測到的3個年齡組在尿中的所有被顯著調節的 代謝物。為了獲得半定量信息，針對所述三個代謝物，進行原始光譜中的峰面積的 積分，通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證具有統計學顯著性的差異，並標記如下： *ρ〈0· 05.，**ρ〈0· 01，***ρ〈0· 001。
[0160] 表4展示通過LC-MS檢測到的3個年齡組在血清中的所有被顯著調節的代謝物。 數值表示為平均值土 SD，並標記如下：*ρ〈0. 05.，#ρ〈0. 01，*#ρ〈0. 001。
[0161] 表5展示通過UPLC-ESI-MS/MS分析的3個年齡組在血清中的炎性標誌物的濃度 水平（ng/100 μ 1)，並標記如下：*ρ〈0· 05.，**ρ〈0· 01，***ρ〈0· 001。
[0162] 圖1為來自老化群組的典型尿600Mhz譜，顯示由主要低分子量分子引起的峰，所 述主要低分子量分子為例如酮體、有機酸、胺基酸、以及源自哺乳動物和腸道微生物代謝的 代謝物（PAG和PCS)。
[0163] 圖2顯示（A)來自較年長者和百歲老人及（B)來自年輕成年人和百歲老人的尿 ?-ΝΙ? 譜的 0PLS-DA 分值。
[0164] 圖3顯示自較年長者和百歲老人的尿1H-NMR譜產生的係數圖。
[0165] 圖4顯示有關半定量信息的盒式圖，源自原始光譜中PAG和PCS的峰面積（曲線 下面積）。統計學顯著性通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證，並列於表3中。
[0166] 圖5a和5b顯示通過靶向UPLC-ESI-MS/MS代謝組學分析測量的、三個老化時間點 之間脂質組譜（平均脂質濃度）的差異。盒式圖反映變化，從左到右指示百歲老人、較年長 者和年輕個體。濃度為μ M。平均值土SD來自三個老化組的靶向MS，統計學顯著性通過使 用Wilcoxon秩和檢驗驗證並列於表4中。僅顯不顯著差異，並通過Mann-Whitney U檢驗 進行了評估。
[0167] 圖6顯示通過靶向UPLC-ESI-MS/MS代謝組學分析測量的、三個老化時間點之間脂 質組學譜的差異（結果表示為ng/100 μ 1，代表平均脂質濃度）。盒式圖反映變化，從左到右 指示百歲老人、較年長者和年輕個體。平均值土SD來自三個老化組的靶向MS，統計學顯著 性通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證並列於表5中。僅顯不顯著差異，並通過Mann-Whitney U檢驗進行了評估。 實施例：
[0168] 受試者和研究組別
[0169] 對於要進行的研究，每個個體和他們的家庭均給出了知情同意書。總共，在義大利 北部（包括博洛尼亞、佛羅倫斯、帕爾馬、米蘭），入選了屬於不同年齡組的541名受試者用 於本研究。百歲老人組由156名個體（125名女性和31名男性）組成，較年長者組由363 名個體（205名女性和158名男性）組成，年輕成年人組由22名個體（10名女性和12名男 性）組成。
[0170] 研究方案得到Sant' Orsola-Malpighi大學醫學院（Bologna, Italy)的倫理委員 會批准。得到的生物學樣品（血清和尿）在代謝組學分析前儲存在-80°C。
[0171] 臨床化學
[0172] 使用Roche Diagnostics的相應酶學試劑盒，採用自動分析儀（Roche Diagnostics Hitachi 917, Hitachi Ltd, Tokyo, Japan)，測量了血清總的、高密度脂蛋白 膽固醇（HDL)和甘油三酯濃度。使用Friedewald的公式（Friedewald WT等，Clinical 〇^11^5^巧18(6):499 - 502)，計算了低密度脂蛋白膽固醇（〇^)濃度。細胞因子，包括小 鼠幹擾素 Y (INFy)、白介素 IMIL-Ιβ)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素 12p70(IL-12p70)、角質細胞來源的趨化因子（KC)和腫瘤壞死因子（TNF)，使用小鼠促炎多 重試劑盒（Meso Scale Discoveries, Gaithersburg, Maryland, USA)測量。根據製造商的 手冊，進行測定試驗。高靈敏C反應蛋白（CRP)使用靈敏的雙重抗體夾心ELISA以兔抗人 CRP和過氧化物酶綴合的兔抗人CRP測量。
[0173] 用於1H NMR光譜的樣品準備。來自三個老化組的lml尿樣品在凍幹設 備（Freeze-Dryer Fisher Scientific)中乾燥，並使用含有ImM 3-(三甲基甲娃燒 基）-[2, 2, 3, 3-2Η4]-1-丙酸鈉（TSP)的580 μ L磷酸鹽緩衝溶液（KH2P04,終濃度0. 2M) 調整至口^16.8，並放入5_匪1?管。在配備反向5_低溫探頭的13；1〇11^14￥311〇6 111 600MHz 光譜儀上以 300K(Bruker Biospin，Rheinstetten, Germany)測量代謝譜。對於 每個尿樣品，使用脈衝序列（包括標準1H檢測，帶水峰壓制），記錄1H NMR譜。該標準 譜採用4s的馳豫延遲和100ms的混合時間tm獲取。獲取的1H NMR譜採用Topspin軟 件包（2. 1版；Bruker Biospin，Rheinstetten,德國）處理，並參照在δ = 〇·〇的標準 (TSP)。使用內部化合物文庫和文獻，給峰分派特定代謝物，並通過在選定的樣品上的標 準二維NMR譜（JRES，TOCSY，HSQC，HMBC)驗證。對於統計學分析，將所有NMR譜轉化為在 3 0.4-10.0範圍上的121(數據點，並輸入嫩1'^^軟體（7.11.0版0?201013);1116]\&^抓〇48 Inc.，Natick，MA)，排除水殘基（水δ = 4. 7120-4.84)。該譜相對於規定範圍內的所有強 度的總和進行標化。
[0174] 用於Biocrates Life Sciences絕對IDQTM試劑盒分析的樣品準備
[0175] 如先前公布的（Rdmisch-Margl, w.，c. Prehn, R. Bogumil, c. Rdhring, K. Suhre，J. Adamski，用於高通量靶向代謝物組學的組織樣品準備和代謝物提取的程 序(Procedure for tissue sample preparation and metabolite extraction for high-throughput targeted metabolomics), Metabolomics, 2011，首先網上公布），在來 自所選老化群組的血清樣品上使用Biocrates Life Sciences絕對IDQTM試劑盒。根 據製造商的說明，進行孔板準備和樣品施用及提取。將10 μ 1終體積的血清上樣至所提 供的96孔板上，板包含同位素標記的內標。在Dionex Ultimate 3000超高壓液體色譜 (UHPLC)系統（Dionex AG，01ten, Switzerland)上進行液相色譜，其中所述色譜系統與安 裝有TurboV離子源以電噴霧離子化（ESI)模式運行的3200Q TRAP質譜儀（AB Sciex; Foster City, CA, USA)偶聯。使用梯度流速 0-2. 4min: 30 μ?/min，2.4-2· 8min: 200 μ 1/ min，2.9-3min:30μl/min，通過直接輸注，注射樣品提取物（20μl)兩次（以正和負ESI模 式）。MS源參數設置為：脫溶劑溫度（ΤΕΜ) :200°C，高電壓：-4500V(ESI-)，5500V(ESI+)， 氣簾（CUR)和霧化器（GS1和GS2)氣體；氮氣；20, 40,和50psi ;分別地，氮氣碰撞氣壓： 5mTorr。以計劃的反應監測模式（SRM)進行MS/MS獲取，其中對於本測定試驗中篩選的 163種代謝物具有優化的去簇電位值（potential values)。將原始數據文件（Analyst軟 件，版本1. 5. 1 ;AB Sciex, Foster City, CA, USA)輸入提供的分析軟體MetlQ，以計算代 謝物濃度。所有可檢測代謝物的列表可從Biocrates Life Sciences, Austria(http:// biocrates, com)獲得。使用同位素稀釋技術通過UPLC-ESI-MS/MS進行樣品準備和炎症標 志物定量。
[0176] 基於先前公布的工作（Naga 等，PROG. LIPID RESEARCH, 2001，40, 199-299)，內部 開發了測量一組63個炎症標誌物的方法。來自三個年齡組（η = 15個百歲老人，η = 30 個較年長者，η = 50個年輕成年人）的剩餘可獲得的生物材料的300 μ 1血清樣品，使用 FastPrep? 24系統，以10 μ 1 ΒΗΤ緩衝液（丁基化羥基甲苯；79. 2mg/ml PBS)勻漿。對 於每個樣品，總共50 μ 1血清與5 μ 1內標溶液（0. lng/ μ 1)混合。添加15 μ 1朽1檬酸（1N) 酸化混合物。為了沉澱蛋白質，加入550μ 1體積的甲醇/乙醇（1:1，v:v)，4°C混合樣品15 分鐘，之後離心（3500rpm，lOmin，4°C )。在恆定氮氣流下蒸發有機相至幹，殘餘物用80 μ 1 水溶解，之後加入20 μ 1乙腈，然後4°C 3500rpm離心lmin。將上清液轉移至LC-MS小瓶中， 然後分析。通過與串聯質譜偶聯的液相色譜（LC-MS/MS)，進行分析。LC在Dionex Ultimate 3000超高壓液相色譜（UPLC)系統（Dionex AG，01ten，Switzerland)上進行。MS檢測在以 ESI 模式運行的 5500Q TRAP 質譜儀（AB Sciex;Foster City，CA，USA)上進行。在 Acquity BEH C18 柱（2·1χ 150mm，1.7ym;Waters，Milford，USA)上，進行梯度色譜分離。注射體積 5 μ 1，柱子維持在50°C。流動相由含有1 %乙酸（洗脫劑A)和乙腈（洗脫劑B)的水組成， 設定在450 μ Ι/min的恆定流速。梯度洗脫開始於20% B，線性增加，在6分鐘至50% B，在 13分鐘從50 %至95% B，在95% B保持3分鐘，之後在16. 1分鐘返回到20% B，重新平衡 柱子另外 11 分鐘。分析物以 Analyst 軟體（版本 1. 5. 1 ;AB Sciex, Foster City, CA, USA) 中提供的計劃選擇反應監測（scheduled SRM)模式監測。所有質量變遷（mass transition) 和MS源參數在補充數據中提供。SRM檢查窗時間設置為120sec，靶掃描時間0. 5sec。使 用氮氣作為氣簾和脫溶劑氣，壓力分別為CUR :20, GS1:70, GS2:20 (任意單位）。Block源 溫度維持在600°C，電壓分別為：ISV:-4000V，EP:-10V，CXP:-5V。在樣品分析前，通過測 量不同稀釋度的標準溶液（〇-l〇 ng)，繪出15點的校準曲線。數據處理使用Analyst軟體 (版本1.5. 1;AB Sciex，Foster City，CA，USA)進行。計算每個分析物相對於其對應內 標或替代標誌物的峰面積比。值得提及的是，血清樣品中PGJ2, PGF2a，PGE2, PGE1，15-氧 代-HETE，15-脫氧-Λ 12, 14-PGJ2, 6-酮基PGFla，和5-氧代-ETE低於其檢測限，因此在 統計學分析中未加考慮。
[0177] 多變量數據分析（MVA)
[0178] 在幾種軟體環境中進行MVA。因此，對於1H NMR和靶向MS數據，數據輸入和預處理 步驟使用寫在嫩1'1^\13(版本7.11.0，1116]\^1:11￥〇^8 111(3.，似1:;^1^嫩，113六）中的一內部|| 程序完成。在NMR數據分析中，使用SMCA-P+軟體（版本12.0，Umetrics AB，Umet Sweden)，實施 0PLS-DA 模型。通過隨機森林（Random Forests)，使用 'randomForest '包 (A. Liaw and M. Wiener(2002). Classification and Regression by randomForest. R News2 (3), 18-22.)，在 R 環境中運行（R Development Core Team(2011) · R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org/.), 分析靶向MS數據。最後，用於驗證的單變量顯著性檢驗也在R中進行。
[0179] 老化群組的臨床特徵
[0180] 表1顯示老化群組的身體和生物化學特徵。與較年長者相比，ΒΜΙ(ρ〈0. 001)， 穩態模型評估（Η0ΜΑ) (p〈0. 001)，總膽固醇（p = 0. 001)，甘油三酯（p = 0. 004)，HDL(p =0. 001)，和LDL(p = 0. 04)在百歲老人中較低，而血清澱粉樣蛋白A(A-SAA)蛋白質 (p〈0.001)和C反應蛋白（CRP)(p〈0.001)在百歲老人中較高。與年輕個體相比，較年長者 表現出較高的810(?〈0.001)，總膽固醇（?〈0.001)，甘油三酯（?〈0.001)，0^(?〈0.05)，和 CRP(p<0. 001) 〇
[0181] 來自三個老化組（92名百歲老人，283名較年長者，和21名年輕成年人）的可得 樣品的尿600MHz i-NMR，用於代謝譜分析。為了探索三個年齡組之間年齡誘導的改變和代 謝差異以及最小化無關代謝物變異性的任何影響，在來自三個時間點的全解析度NMR數據 集合上應用尿NMR譜的監督式化學計量分析。隱變量正交投影-辨別分析（0PLS-DA)在單 位方差尺度歸一化數據（unit variance scaled data)上進行（圖2)。百歲老人和年輕 成年人組之間的辨別模型，通過使用13. 7 %的光譜方差（spectral variance, R2X),提供 了 1· 0的分類詞驗證錯誤（表達為ROC曲線下面積，AuROC (Fawcett, Τ· , An introduction to ROC analysis, Pattern Recogn. Lett. ,2006, 27:861-874))(表 2)。同樣地，再次使用 13. 7%的總X方差，百歲老人和較年長者組之間的模型產生了具有0. 93的AuROC驗證錯 誤的模型（表2)。為了確定與年齡組之間差異相關的代謝物標籤，使用了 0PLS-DA模型的 第一性預測成分的加載值（loadings)，根據變量的相關係數進行顏色編碼[30](圖3)。由 此，百歲老人和較年長者個體之間的尿辨別模型展示相對較高量的苯乙醯穀氨醯胺（PAG)、 硫酸對甲酚（PCS)。為了獲得半定量信息，針對這三種代謝物，對原始光譜上的峰面積進行 積分，通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證了具有統計學顯著性的差異（圖4,表3)。總之，這 些結果顯示，腸道微生物高度參與長壽過程。靶向的和定量的LC-MS代謝組學展示了血清 中與老化相關的代謝改變。
[0182] 為了確定血清中年齡相關的代謝差異，在三個老化組（143名百歲老人，90名較年 長者和20名年輕成年人）的可得生物樣品上應用靶向LC-MS/MS代謝組學方法。使用隨 機森林（RF?) (Breiman, L.，Random Forests, Machine Learning, 2001，45:5-32)，在 160 種 代謝物的預處理半定量數據上，進行多變量數據分析，其中所述代謝物包括胺基酸、糖、醯 基-肉毒鹼、鞘脂類和甘油磷脂類。使用在RF?中實行的變量重要性特徵，可以確定更好地 區分三個老化組的代謝物標籤。為了評價標籤的每個組分的各自辨別能力，在這些年齡組 中進行Wilcoxon秩和檢驗（表4中列出了所有顯著調節的代謝物）。儘管甘油磷脂類和 鞘脂類的總體濃度隨著脂肪酸組成而增加和減少，但三種一致傾向是明顯的：隨著年齡增 加或減少（統計學有效）的化合物集合，例如減少濃度的溶血磷脂醯膽鹼（LPC 18:2, LPC 20:4)，增加水平的PC32:0和增加濃度的鞘磷脂（SM 24:1，SM 16:0) ;(ii)僅特異於百歲老 人的化合物集合，在較年長者和年輕個體之間無統計學改變，如鞘磷脂和特定甘油磷酸脂 類（SM-0H 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34:3, PC-0 36:4, PC-0 40:1，PC 36:2)的減少 和特定甘油磷酸脂類（PC-0 32:l，PC-0 34:1)的增加。
[0183] 此外，在3個老化組的剩餘可得血清樣品（12名百歲老人，37名較年長者和18名 年輕成年人）上，使用靶向LC-MS/MS方法，以調查類二十烷酸合成的濃度改變。在此，在定 量數據上的RF?顯示三個年齡組之間的統計學相關改變（圖6)。通過Wilcoxon秩和檢驗 評價年齡組之間的統計學顯著性（增補表5中列出了所有顯著調節的代謝物）。百歲老人展 示出較低濃度的11，12-二羥基-二十碳三烯酸（11，12-DiHETrE)、9-羥基-十八碳二烯酸 (9-H0DE)和9-氧代-十八碳二烯酸（9-氧代-H0DE)，以及同時增加濃度的15-羥基-二十 碳四烯酸（15-HETE)和白三烯E4(LTE4)。與較年長者相比，百歲老人中二十碳五烯酸（EPA) 的水平降低。此外，在百歲老人和較年長者之間進行成對MRC分析以最大化兩個年齡組中 的變化，展示出在百歲老人中增加血清濃度水平的8, 9-環氧二十碳三烯酸（8, 9-EET)和白 三烯 M (LTB4)。
[0184] 本發明還提供下述編號段落中公開的其它實施方案：
[0185] 1.診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的方法，包括
[0186] -從受試者獲得血清樣品，
[0187] _確定樣品中9_氧代-H0DE的水平，和
[0188] -比較受試者的9-氧代-H0DE水平與預定參考值，
[0189] 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清9-氧代-H0DE水平，且
[0190] 其中與預定參考值相比，樣品中降低的血清9-氧代-H0DE水平指示增加的延遲和 /或避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0191] 2.診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的方法，包括
[0192] _從受:試者獲得血清樣品，
[0193] -確定樣品中SM-0H 22:1的水平，和
[0194] -比較受試者的SM-0H 22:1水平與預定參考值，
[0195] 其中預定參考值基於對照群體中平均血清SM-0H 22:1水平，且
[0196] 其中與預定參考值相比，樣品中較低血清SM-0H 22:1水平指示增加的延遲和/或 避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0197] 3.段落1或段落2的方法，還包括
[0198] -確定 PC-0 40:1，SM-0H 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34:1，9-H0DE，9-氧 代-H0DE，或LTE4中的至少一種在樣品中的水平，和
[0199] -將受試者中 PC-0 40: 1，SM-0H 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34:1，9-H0DE，9-氧代-H0DE，或LTE4之至少一種的水平與預定參考值比較，
[0200] 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清PC-0 40:1，SM-0H 22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC-0 34:1，9-H0DE，9-氧代-H0DE 或 LTE4 水平，且
[0201] 其中與預定參考值相比，樣品中降低的血清PC-0 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 40:1，9-H0DE，和/或9-氧代-H0DE水平指示增加的延遲和/或避免老化相關 慢性炎性病症的可能性，和/或
[0202] 其中與預定參考值相比，樣品中增加的血清LTE4和/或PC-0 34:1水平指示增加 的延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0203] 4.段落1至3之一的方法，其中還通過與先已獲得的參考值比較，評價生物標誌物 PC-0 32:1，15-HpETE，LTB4, 8, 9EpETre中的一個或多個在血清中是否增加，和/或生物標 志物PC-0 34:3，PC-0 36:4，PC 36:2，ll，12-DiHETre中的一個或多個在血清中是否降低， 以增加診斷的準確性。
[0204] 5.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的體外方法， 包括
[0205] _從受:試者獲得尿樣品，
[0206] -確定樣品中硫酸對甲酚（PCS)的水平，和
[0207] -比較受試者的PCS水平與預定參考值，
[0208] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PCS水平，且
[0209] 其中與預定參考值相比，樣品中升高的尿PCS水平指示增加的延遲和/或避免老 化相關慢性炎性病症的可能性。
[0210] 6.段落5的方法，還包括
[0211] -確定樣品中苯乙醯穀氨醯胺（PAG)的水平，和
[0212] -比較受試者PAG水平與預定參考值，
[0213] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PAG水平，且
[0214] 其中與預定參考值相比，樣品中升高的尿PCS和PAG水平指示增加的延遲和/或 避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0215] 7.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的非侵入式 方法，包括
[0216] _從受:試者獲得尿樣品，
[0217] -確定樣品中苯乙醯穀氨醯胺（PAG)的水平，和
[0218] -比較受試者的苯乙醯穀氨醯胺（PAG)水平與預定參考值，
[0219] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PAG水平，且
[0220] 其中與預定參考值相比，樣品中升高的尿PAG水平指示增加的延遲和/或避免老 化相關慢性炎性病症的可能性。
[0221] 8.段落7的方法，還包括
[0222] -確定樣品中硫酸對甲酚（PCS)的水平，和
[0223] -比較受試者的PCS水平與預定參考值，
[0224] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PCS水平，且
[0225] 其中與預定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和PCS水平指示增加的延遲和/或 避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
[0226] 9.段落1至8之一的方法，用於診斷允許健康老化的生活方式。
[0227] 10.段落1至9之一的方法，用於診斷長壽。
[0228] 11.段落1至10之一的方法，用於診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0229] 12.段落11的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互 作用。
[0230] 13.段落1至12之一的方法，用於診斷更健康的生活方式，其中預定參考值基於從 生活方式改變前的受試者獲得的血清或尿水平。
[0231] 14.段落13的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
[0232] 15.段落14的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或以不同量用過的至少 一種營養產品。
[0233] 16.段落14或15的方法，用於檢查新的營養方案的有效性。
[0234] 17.段落1至16之一的方法，其中通過1H-NMR和/或質譜在樣品中及在參照中確 定生物標誌物的水平。
[0235] 18.段落1至17之一的方法，用於診斷更健康的生活方式，其中預定參考平均值為
[0236] 2 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 32: 1，
[0237] 7. 80 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34:1，
[0238] 1. 25 μ g/100 μ 1 血清的 15-羥基-二十碳四烯酸（15-ΗρΕΤΕ)，
[0239] 0· 013 μ g/100 μ 1 血清的白三烯 Ε4 (LTE4)，
[0240] 0· 020 μ g/100 μ 1 血清的白三烯 B4 (4LTB)，和 / 或
[0241] 0· 070 μ g/100 μ 1 血清的 8, 9-環氧二十碳三烯酸（8, 9EpETre)
[0242] 16. 07 μ Μ 的羥基-鞘磷脂（SM-0H) 22: 1，
[0243] 52. 00 μ Μ的溶血磷脂醯膽鹼（LPC) 18: 0，
[0244] 25. 00 μ Μ 的鞘磷脂（SM) 24: 0，
[0245] 5. 07 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34: 3，
[0246] 14. 30 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 36: 4，
[0247] 1. 41 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40: 1，
[0248] 10. 00 μ Μ 的磷脂醯膽鹼（PC) 36: 2，
[0249] 0· 34 μ g/100 μ 1血清的羥基十八碳二烯酸（9-H0DE)，
[0250] 0. 043 μ g/100 μ 1的9-氧代-十八碳二烯酸（9-氧代-H0DE)，和/或
[0251] (λ 017μ g/ΙΟΟμ 1 血清的 11，12-環氧二十碳三烯酸（11，12-DiHETre).
[0252] 19.段落1至18之任何的方法，還包括：
[0253] _從受:試者獲得尿樣品，
[0254] -確定樣品中苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或硫酸對甲酚（PCS)的水平，和
[0255] -比較受試者的苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或PCS水平與預定參考值，
[0256] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PAG和/或PCS水平，且其中與預定參 考值相比，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關慢性 炎性病症的可能性。
[0257] 20.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的生物標誌 物，其中所述生物標誌物是9-氧代-H0DE。
[0258] 21.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的生物標誌 物，其中所述生物標誌物是SM-0H 22:1.
[0259] 22.段落20或21的生物標誌物，其中在血清中檢測所述生物標誌物。
[0260] 23.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的生物標誌 物，其中所述生物標誌物是苯乙醯穀氨醯胺（PAG)。
[0261] 24.用於診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的生物標誌 物，其中所述生物標誌物是硫酸對甲酚（PCS)。
[0262] 25.段落23或24的生物標誌物，其中在尿中檢測所述生物標誌物。
[0263] 26.用於診斷（i)促進老化相關慢性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健 康老化的生活方式，（iii)壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿 主相互作用的方法，包括
[0264] _從受:試者獲得血清樣品，
[0265] -確定樣品中9-氧代-H0DE和/或SM-0H 22:1的水平和
[0266] -比較受試者的9-氧代-H0DE和/或SM-0H 22:1水平與預定參考值，
[0267] 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清9-氧代-H0DE和/或SM-0H 22:1水 平，且
[0268] 其中與預定參考值相比，樣品中增加的血清9-氧代-H0DE和/或SM-0H 22:1水 平指示（i)促進老化相關慢性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健康老化的生活方 式，（iii)增加的壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作 用。
[0269] 27.用於診斷（i)促進老化相關慢性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健 康老化的生活方式，（iii)壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿 主相互作用的方法，包括
[0270] _從受:試者獲得尿樣品，
[0271] -確定樣品中PAG和/或PCS的水平，和
[0272] -比較受試者的PAG和/或PCS水平和預定參考值，
[0273] 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PAG和/或PCS水平，且
[0274] 其中與預定參考值相比，樣品中較低的尿PAG和/或PCS水平指示⑴促進老化 相關慢性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽 命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0275] 28.用於（i)延遲、避免和/或防止老化相關慢性炎性病症發生，（ii)促進健康老 化，（iii)促進長壽，（iv)降低壽命縮短的風險，（v)促進更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用，和/或（vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括：
[0276] (a)實施段落26或27所述的診斷方法；和
[0277] (b)如果受試者具有（i)增加的老化相關慢性炎性病症發生的可能性，（ii)可能 防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微 生物菌群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
[0278] 29.段落28的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
[0279] 30.段落29的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養產品，其中 所述營養產品對健康老化和/或避免老化相關慢性炎性病症有作用。
[0280] 表 1:
[0281]
【權利要求】
1. 診斷允許延遲和/或避免老化相關慢性炎性病症的生活方式的方法，包括 _從受:試者獲得血清樣品， -確定樣品中PC-ο 40:1的水平，和 -比較受試者的PC-0 40:1水平與預定參考值， 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清PC-0 40:1水平，且 其中與預定參考值相比，樣品中降低的血清PC-0 40:1水平指示增加的延遲和/或避 免老化相關慢性炎性病症的可能性。
2. 權利要求1的方法，還包括 -確定 SM-OH 22: 1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34: 1，9-HODE, 9-氧代-HODE,或 LTE4 中 的至少一種在樣品中的水平，和 -將 SM-OH 22: 1，LPC 18:0, SM 24:0, PC-0 34: 1，9-HODE, 9-氧代-HODE,或 LTE4 中的 至少一種的受試者水平與預定參考值比較， 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清SM-OH 22:1，LPC18:0，SM 24:0，PC-0 34:1，9-HODE, 9-氧代-HODE 或 LTE4 水平，且 其中與預定參考值相比，樣品中降低的血清PC-0 40:1水平和/或較低的血清SM-0H 22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC-0 40:1，9-H0DE 或 9-氧代-H0DE 水平指示增加的延遲和 / 或 避免老化相關慢性炎性病症的可能性，和/或 其中與預定參考值相比，樣品中升高的血清LTE4，PC-0 34:1水平指示增加的延遲和/ 或避免老化相關慢性炎性病症的可能性。
3. 前述權利要求之一的方法，其中還通過與先已獲得的參考值比較，評價生物標誌 PC-0 32:1，15-HpETE，LTB4, 8, 9 EpETre中的一個或多個在血清中是否增加，和/或生物標 志PC-0 34:3，PC-0 36:4，PC 36:2，ll，12-DiHETre中的一個或多個在血清中是否降低，增 加診斷的準確性。
4. 前述權利要求之一的方法，用於診斷允許健康老化的生活方式。
5. 前述權利要求之一的方法，用於診斷長壽。
6. 前述權利要求之一的方法，用於診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
7. 權利要求6的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作 用。
8. 前述權利要求之一的方法，用於診斷更健康的生活方式，其中預定參考值基於從生 活方式改變前的受試者獲得的血清水平。
9. 權利要求8的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
10. 權利要求9的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或以不同量用過的至少 一種營養產品。
11. 權利要求9或10的方法，用於檢查新的營養方案的有效性。
12. 前述權利要求之一的方法，其中通過1H-NMR和/或質譜在樣品中及在參照中確定 PC-0 40:1及任選地其它生物標誌物的水平。
13. 前述權利要求之一的方法，用於診斷更健康的生活方式，其中預定參考平均值為 2 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 32: 1， 7. 80 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34:1， 1. 25 μ g/100 μ 1血清的15-羥基-二十碳四烯酸（15-HpETE)， 0· 013 μ g/100 μ 1 血清的白三烯 E4 (LTE4)， 0· 020 μ g/100 μ 1血清的白三烯Β4 (4LTB)，和/或 0· 070 μ g/100 μ 1血清的8, 9-環氧二十碳三烯酸（8, 9EpETre) 16. 07 μ Μ 的羥基-鞘磷脂（SM-OH) 22: 1， 52. 00 μ Μ的溶血磷脂醯膽鹼（LPC) 18: 0， 25. 00 μ Μ 的鞘磷脂（SM) 24:0， 5. 07 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 34: 3， 14. 30 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 36: 4， 1. 41 μ Μ的1-0-烷基-2-醯基甘油磷酸膽鹼（PC-0) 40: 1， 10. 00 μ Μ的磷脂醯膽鹼（PC) 36: 2， 0. 34 μ g/100 μ 1血清的羥基十八碳二烯酸（9-H0DE)， 0. 043 μ g/100 μ 1血清的9-氧代-十八碳二烯酸（9-氧代-H0DE)，和/或 0· 017 μ g/100 μ 1 血清的 11，12-環氧二十碳三烯酸（11，12-DiHETre)。
14. 用於診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病症的生活方式的生物標誌物，其中 所述生物標誌物是PC-0 40:1。
15. 權利要求14的生物標誌物，其中在血清中檢測所述生物標誌物。
16. 權利要求1至13之任一的方法，還包括： -從受試者獲得尿樣品， -確定樣品中苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或硫酸對甲酚（PCS)的水平，和 -比較受試者的苯乙醯穀氨醯胺（PAG)和/或PCS水平與預定參考值， 其中預定參考值基於對照群體中的平均尿PAG和/或PCS水平，且其中與預定參考值 相比，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關慢性炎性 病症的可能性。
17. 用於診斷（i)促進老化相關慢性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健康老 化的生活方式，（iii)壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相 互作用的方法，包括 _從受:試者獲得血清樣品， -確定樣品中PC-ο 40:1的水平，和 -比較受試者的PC-0 40:1水平與預定參考值， 其中預定參考值基於對照群體中的平均血清PC-0 40:1水平，且 其中與預定參考值相比，樣品中升高的血清PC-0 40:1水平指示（i)促進老化相關慢 性炎性病症發生的生活方式，（ii)可能防止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短 的風險，和/或（iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
18. 用於（i)延遲、避免和/或防止老化相關慢性炎性病症發生，（ii)促進健康老 化，（iii)促進長壽，（iv)降低壽命縮短的風險，（v)促進更健康的腸道微生物菌群-宿主 相互作用，和/或（vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括： (a) 實施權利要求17所述的診斷方法；和 (b) 如果受試者具有（i)增加的老化相關慢性炎性病症發生的可能性，（ii)可能防 止健康老化的生活方式，（iii)增加的壽命縮短的風險，和/或（iv)較不健康的微生物菌 群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
19. 權利要求18的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
20. 權利要求19的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養產品，其中 所述營養產品對健康老化和/或避免老化相關慢性炎性病症有作用。
【文檔編號】G01N33/92GK104285150SQ201380024488
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2012年3月22日
【發明者】S·科裡諾, I·蒙託柳魯拉, F-P·馬丁, P·A·蓋, S·A·D·萊茲 申請人:雀巢產品技術援助有限公司