製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法與流程
2023-12-01 23:17:21 2
本申請要求2014年3月25日提交的美國臨時申請系列No.61/970,281的優先權權益，將其全部按引用併入本文中。發明領域本發明涉及製備泊洛沙姆(例如，用於細胞培養基中)的方法、含有按照本文所述製備的泊洛沙姆的細胞培養基、和使用本文中所述的細胞培養基來培養細胞和生產多肽的方法。發明背景細胞培養製造技術廣泛用於生產基於蛋白質的治療劑(如，抗體)，用於藥物製劑中。基於蛋白質的產品(如，抗體產品)的商業生產需要細胞培養參數的優化，以使細胞產生大量蛋白質產物以滿足製造需求。以工業規模製造基於蛋白質的產品時，如蛋白質生產效率和原料(例如，細胞培養基中的組分)成本這樣的因素就非常重要。泊洛沙姆是廣泛用於工業蛋白質生產的細胞培養基中的組分。將其加入細胞培養基中，以增強所培養細胞的生存力。其許多功能中的一種是作為表面活性劑起作用，降低細胞培養基中的細胞和氣泡之間的附著力並且在氣泡破裂時保護細胞免受損傷。其還可以強化細胞膜，提高細胞從培養物的泡沫層的排出以及改變起泡頻率和速度。不幸地，已經觀察到了泊洛沙姆性能在批與批之間的變異性顯著。用於細胞培養基中時，性能差的泊洛沙姆批次可以引起降低的細胞生存力和細胞生長速率。降低的細胞生存力導致降低的蛋白質生產。以工業規模進行培養時，這種降低的生產可以導致嚴重的經濟損失。因此，需要一種簡單、廉價的技術方案來降低泊洛沙姆的變異性和提高泊洛沙姆的性能，特別是針對性能差的批次。本文中引用的所有出版物、專利和專利申請將其全部按引用併入本文中，用於全部目的。發明概述本文中提供的本發明尤其公開了用於製備泊洛沙姆(例如，用於細胞培養物中)的方法。還提供了通過本文中所述的方法製備的泊洛沙姆。本文中進一步公開了含有通過本文中所述的方法製備的泊洛沙姆的細胞培養基組合物。本文中進一步公開了，在含有通過本文中所述的方法製備的泊洛沙姆的細胞培養基中培養產生多肽的細胞以在細胞培養物中生產多肽的方法。因此，在一個方面中，本文中提供了製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法，包括步驟：(a)將固體泊洛沙姆加熱到至少約60℃，形成液體泊洛沙姆；和(b)將液體泊洛沙姆冷卻至低於約50℃的溫度，形成固體熱處理過的泊洛沙姆，其中冷卻不在造粒(prilling)或研磨設備中進行，並且其中泊洛沙姆包含環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物。在一些實施方案中，與包含步驟(a)之前的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力相比，在包含熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中細胞生存力提高。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約60℃至約185℃。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約157℃至約185℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約157℃至約185℃並且至少1分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約157℃至約185℃並且約1分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約134℃至約157℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約134℃至約157℃並且至少1分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約134℃至約157℃並且1分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約120℃至約134℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約120℃至約134℃並且至少約62分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約120℃至約134℃並且約62分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約100℃至約120℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約100℃至約120℃並且至少約98分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約100℃至約120℃並且約98分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約80℃至約100℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約80℃至約100℃並且至少約122分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約80℃至約100℃並且約122分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，步驟(a)中將泊洛沙姆加熱到約60℃至約80℃。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約80℃並且至少約143分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約80℃並且約143分鐘至約250分鐘。在一些實施方案中，與包含步驟(a)之前的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力相比，在包含熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中細胞生存力提高至少10％。在一些實施方案中，細胞生存力提高至少約20％。在一些實施方案中，細胞生存力提高至少約30％。在一些實施方案中，在包含步驟(a)之前的泊洛沙姆的細胞培養基中細胞生存力在約3小時的細胞培養後低於約80％。在一些實施方案中，在步驟(b)中，在環境溫度，約2℃至約8℃，或低於0℃，冷卻液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，泊洛沙姆在真空下加熱。在一些實施方案中，液體泊洛沙姆冷卻至少約20分鐘。在一些實施方案中，將步驟(b)中產生的熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基中。在一些實施方案中，在將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基之前，將步驟(a)和(b)重複至少一次。在一些實施方案中，在步驟(a)之前已經通過造粒工藝(prillingprocess)處理過泊洛沙姆。在一些實施方案中，泊洛沙姆具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH，其中n從約60至約150和m從約25至約60。在一些實施方案中，泊洛沙姆具有約55℃的熔化溫度。在一些實施方案中，泊洛沙姆具有約6,000至約18,000道爾頓的平均分子量。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有約80的值，m具有約27的值，並且該泊洛沙姆具有約7680至約9510g/mol的平均分子量。在一些實施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞。在一些實施方案中，細胞產生多肽。在另一個方面中，本文中提供了通過以上和本文中所述的任一種方法製備的泊洛沙姆。在進一步的方面中，本文中提供了包含通過以上和本文中所述的任一種方法製備的泊洛沙姆的細胞培養基。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約3g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約3g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在再進一步的方面中，本文中提供了在細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟：在適於多肽生產的條件下，在細胞培養基中，培養產生多肽的細胞，其中細胞培養基包含通過以上和本文中所述的任一種方法製備的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約3g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約3g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，多肽是抗體或其抗原結合片段。因此，在一個方面中，本文中提供了製備泊洛沙姆(例如，用於細胞培養基中)的方法，包括步驟：(a)將純化的泊洛沙姆加熱到約80℃或以上(例如，約80℃至約100℃)，形成液體泊洛沙姆，和(b)將液體泊洛沙姆冷卻至約50℃或以下的溫度，形成固體熱處理過的泊洛沙姆，其中冷卻不在造粒或研磨設備中進行。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物，其中n從約60至約150和m從約25至約60。在一些實施方案中，與包含步驟(a)之前的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力相比，在包含熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中細胞生存力提高。在一些實施方案中，泊洛沙姆是純化的泊洛沙姆。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆是不含另外的治療化合物或藥物化合物的泊洛沙姆組合物。在一些實施方案中，步驟(a)中泊洛沙姆不含另外的治療化合物或藥物化合物。在一些實施方案中，步驟(a)中泊洛沙姆加熱到約85℃至約91℃。在本文中的一些實施方案中，加熱泊洛沙姆約10至約15分鐘。在本文中的一些實施方案中，液體泊洛沙姆在步驟(b)中在環境溫度、約2℃至約8℃，或低於0℃冷卻。在本文中的一些實施方案中，將液體泊洛沙姆冷卻至少約20分鐘。在本文中的一些實施方案中，將步驟(b)中產生的熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基中。在本文中的一些實施方案中，在將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基之前，將步驟(a)和(b)重複至少一次。在本文中的一些實施方案中，細胞生存力提高至少約10％。在本文中的一些實施方案中，細胞生存力提高至少約30％。在本文中的一些實施方案中，在包含步驟(a)之前的泊洛沙姆的細胞培養基中細胞生存力低於約80％。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆在步驟(a)之前已經通過造粒工藝加熱。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆具有約45℃至約60℃範圍的熔化溫度。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆具有約6,000至約18,000道爾頓的平均分子量。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有約80的值，m具有約27的值，並且泊洛沙姆具有約7680至約9510g/mol的平均分子量。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆237。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有約64的值和m具有約37的值。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆338。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有約141的值和m具有約44的值。在本文中的一些實施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆407。在一些實施方案中，泊洛沙姆包含具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的共聚物，n具有約101的值和m具有約56的值。在本文中的一些實施方案中，細胞可以是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，細胞可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在本文中的一些實施方案中，細胞可以是昆蟲細胞。在本文中的一些實施方案中，細胞產生多肽。在一些實施方案中，多肽是抗體或其抗原結合片段。在另一個方面中，本文中提供了通過以上和本文中所述的任一種方法產生的泊洛沙姆。在另一個方面中，本文中提供了包含通過以上和文本中所述的任一種方法產生的泊洛沙姆的細胞培養基。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約3g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約3g/L至約10g/L的熱處理過的泊洛沙姆。在另一個方面中，本文中提供了在細胞培養物中生產多肽的方法，包括步驟：在適於多肽生產的條件下，在細胞培養基中培養產生多肽的細胞，其中細胞培養基包含通過以上和本文中所述的任一種方法產生的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約10g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約0.1g/L至約3g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包含約3g/L至約10g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞產生的多肽是抗體或其抗原結合片段。可以理解，本文中所述的各種實施方案的一個、一些或全部特性可以組合形成本發明的其他實施方案。本發明的這些和其他方面將是本領域技術人員顯而易見的。附圖簡述圖1顯示，泊洛沙姆的熱處理改善了其對培養物中的細胞生存力的作用。菱形圖表示平均值(中心線)和上/下95％置信區間(菱形的頂點)，以及每個實驗條件的細胞生存力值(點)。如x-軸所示的，每個實驗比較了來自好或差(「可疑」)的泊洛沙姆批次的未處理和熱處理(HT)的泊洛沙姆。箭頭指示在熱處理差批次後細胞生存力的提高。注意，熱處理也提高了好批次的細胞生存力，從平均大約85％提高至大約95％的值。圖2顯示，對於未處理和熱處理(_HT)泊洛沙姆樣品A、B和C，高剪切搖瓶模型(HSSF)測試的細胞生存力(％)(還參見表2)。圖3顯示在烘箱中測試的條件的響應曲面設計(Responsesurfacedesign)。每種條件以「時間，溫度」的格式標記。在HSSF中測試了帶「◆」標的條件。在烘箱中準備了帶「◇」標的條件，但沒在HSSF中測試。溫度(以℃計)表示烘箱的設定溫度，而時間(以min計)表示泊洛沙姆樣品在烘箱中的時間。圖4顯示，在所示條件下在烘箱中熱處理的C泊洛沙姆樣品與陽性(「好批次」)和陰性(「未處理的差批次」)對照(分別為D和C)相比，細胞生存力的提高(％)(Vf(處理的)-Vf(未處理的))。誤差棒描繪了一個標準偏差。圖5顯示來自全實驗設計(DOE)的等值線圖，探索不同熱處理條件對泊洛沙姆在細胞培養物中的性能的影響。HSSF測試中生存力的提高(Vf(處理的)-Vf(未處理的))顯示為時間和溫度的函數。點表示測試的樣品條件。圖6顯示了，對於在所示條件下熱處理的三個差批次(H、F和G)和一個好批次(E)的泊洛沙姆樣品，在HSSF測試中細胞生存力的提高(％)(Vf(處理的)-Vf(未處理的))。圖7顯示，對於在低溫(60-80℃)下長時間(120min)處理的差泊洛沙姆批次(H和G)，細胞生存力提高(％)(Vf(處理的)-Vf(未處理的))的比較。*HSSF模型一式二份運行。圖8顯示，與未處理相比，真空條件下熱處理的泊洛沙姆樣品(H和G)的HSSF測試中細胞生存力的提高(％)(Vf(處理的)-Vf(未處理的))。圖9顯示在烘箱中泊洛沙姆材料的加熱和冷卻曲線。測試了三個溫度：140℃、155℃和170℃。一旦溫度讀數開始穩定，從烘箱中取出材料並在室溫下冷卻。曲線在40℃(接近泊洛沙姆的熔點)趨向平緩。圖10顯示，與陽性對照(D)和未處理材料相比，每個批次的熱處理的泊洛沙姆的student’st-檢驗結果。平均值菱形表示每個數據集的95％置信區間(上下頂點)和平均值(中心線)。圖11顯示，來自響應曲面和全DOE實驗的數據的等值線圖，說明泊洛沙姆熱處理條件的大工作範圍。說明了每個實驗間隔的細胞生存力的改變(％)。作為時間和溫度的函數，顯示了HSSF測試中生存力的提高(Vf(處理的)-Vf(未處理的))。響應曲面數據反映，針對達到目標溫度所需的時間進行校正後的孵育時間和溫度。點表示測試的樣品條件。發明詳述本申請的發明人證明，泊洛沙姆的熱處理可以提高泊洛沙姆在細胞培養物中支持生存力的能力。本申請中的數據表明，與使用沒有熱處理泊洛沙姆的細胞培養基相比，使用含有熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基，可以提高細胞生存力。本發明人證明，不同批次的泊洛沙姆當加入細胞培養基時對細胞生存力具有顯著不同的影響，本文中所述的熱處理可以改善好批次和差批次的泊洛沙姆對細胞生存力的作用。在一個方面中，本文提供，通過加熱泊洛沙姆和冷卻泊洛沙姆來製備泊洛沙姆的方法，其中冷卻不在造粒或研磨設備中進行。在一些實施方案中，所述方法包括通過如下方式來製備泊洛沙姆：將泊洛沙姆加熱到約80℃或更高(例如，至約100℃)以形成液體泊洛沙姆，將液體泊洛沙姆冷卻至低於約50℃的溫度以形成固體熱處理過的泊洛沙姆，其中冷卻不在造粒或研磨設備中進行，並且其中泊洛沙姆含有環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物。在一些實施方案中，泊洛沙姆含有具有分子式HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物，其中n為約60至約150且m為約25至約60。在一些實施方案中，在加熱和冷卻處理之前，泊洛沙姆是固體泊洛沙姆。在一些實施方案中，在加熱和冷卻處理之前，泊洛沙姆在室溫下是液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，在加熱和冷卻處理之前，泊洛沙姆是溶解於液體或含水溶液中的固體泊洛沙姆。例如，本文中提供的方法可以用於製備用於細胞培養或細胞培養基中的泊洛沙姆。在另一個方面中，本文提供用於細胞培養的組合物，其包含熱處理過的泊洛沙姆。在另一個方面中，本文提供用於細胞培養的組合物，其在細胞培養基中含有熱處理過的泊洛沙姆。在另一個方面中，本文提供用於在細胞培養中生產多肽的方法，通過在適於多肽產生的條件下在含有熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中培養產生多肽的細胞。I.定義在詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限於特定組合物或生物系統，其當然可以改變。還應當理解，本文中所用的術語只是用於描述特定實施方案的目的，並不旨在構成限制。如本說明書和所附權利要求中使用的，單數形式「一個(a)」、「一個(an)」和「該(the)」包括複數指代物，除非內容另外明確規定。因此，例如，提及「一個分子」任選包括兩個或多個這樣的分子的組合，等等。如本文中使用的術語「約」是指，本
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中的技術人員容易知曉的相應值的通常誤差範圍。本文中提及「約」值或參數包括(和描述)涉及該值或參數本身的實施方案。可以理解，本文描述的本發明的各個方面和實施方案涵蓋方面和實施方案的「包括(comprising)」、「由……組成(consisting)」和「基本上由……組成(consistingessentiallyof)」的情形。術語「泊洛沙姆」是指，由側接兩條聚氧乙烯(在本文中可與術語「環氧乙烷」互換使用)鏈的聚氧丙烯(在本文中可與術語「環氧丙烷」互換使用)鏈形成的嵌段共聚物。泊洛沙姆可以以商品名銷售，包括(BASF),(BASF),(BASF)和(CrodaInternational)。除非具體指出特定的泊洛沙姆品種，否則提及「泊洛沙姆」可以泛指多種泊洛沙姆品種。在一些實施方案中，泊洛沙姆是純化的泊洛沙姆。術語「純化的泊洛沙姆」是指，基本上不含其他化合物的泊洛沙姆組合物。純化的泊洛沙姆可以包括，例如，商業上可購得的具有技術級別或更高級別的泊洛沙姆。技術級別或更高級別的實例包括技術級、純化級、N.F.級(USNationalFormulary)、U.S.P.級(USPharmacopeia)、試劑級和A.C.S.級(AmericanChemicalSociety)。純化的泊洛沙姆是指沒有與另一種化合物混合的泊洛沙姆。例如，純化的泊洛沙姆可以是指沒有與治療化合物或藥物化合物混合(例如，作為藥劑製劑的一部分)的泊洛沙姆。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆是指，該泊洛沙姆基本上不含，或未混合，未反應的反應物、催化劑、或通過泊洛沙姆合成方法或反應產生的其他產物。術語「熱處理過的泊洛沙姆」是指，通過本文中提供的方法熱處理過至少一次的泊洛沙姆。術語「培養基」和「細胞培養基」是指，用於生長或維持細胞的營養源。如本領域技術人員理解的，營養源可以含有細胞生長和/或存活需要的成分或可以含有有助於細胞生長和/或存活的成分。維生素、必需或非必需胺基酸、微量元素和表面活性劑(例如，泊洛沙姆)是培養基成分的實例。本文中提供的任何培養基還可以補充胰島素、植物水解產物和動物水解產物中的任何一種或多種。「培養」細胞是指在適於細胞生存力/或生長和/或增殖的條件下使細胞接觸細胞培養基。「分批培養」是指，在培養過程開始時向培養容器提供用於細胞培養的所有成分(包括細胞以及所有培養營養物和成分)的培養。如本文中使用的短語「補料分批細胞培養」是指這樣的分批培養，其中最初向培養容器提供細胞和培養基，在培養過程中將另外的培養營養物連續地或以不連續的增量補入培養物中，培養終止前進行或不進行周期性的細胞和/或產物收集。「灌流培養」是指，通過例如過濾、包囊、固定於微載體等方式將細胞限制在培養物中、並連續或間歇地將培養基引入和移出培養容器的培養。「培養容器」是指用於培養細胞的容器。培養容器可以是任何大小的，只要其可以用於細胞的培養即可。術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，是指任何長度的胺基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的胺基酸，並且可以被非胺基酸中斷。該術語還包括已經被天然修飾或通過幹預修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾，如與標記成分綴合。該定義內還包括，例如，含有一個或多個胺基酸類似物(包括，例如，非天然胺基酸等)、以及本領域已知的其他修飾的多肽。本文中，涵蓋在該定義中的多肽的實例包括哺乳動物蛋白，如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織因子和vonWillebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房鈉利尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織類型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(受激活調節正常T細胞表達和分泌因子)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白，如人血清白蛋白；繆勒管抑制物質；鬆弛素A-鏈；鬆弛素B-鏈；鬆弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，如β-內醯胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風溼因子；神經營養因子，如骨源神經營養因子(BDNF)，神經營養因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經生長因子，如NGF-b；血小板衍生的生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素-樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；幹擾素，如幹擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如，AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整聯蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18和ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受體；免疫粘附素；和上述任一種蛋白的片段和/或變體，以及結合蛋白(包括，例如，上述任一個蛋白)的抗體，包括抗體片段。如本文中使用的術語「滴度」是指，通過細胞培養產生的重組表達的抗體的總量除以給定量的培養基體積。滴度通常以單位毫克抗體/毫升培養基來表示。滴度可以以相對測量來表示或評價，如比較不同培養條件下獲得蛋白質產物，滴度的百分比增加。本文中的術語「抗體」以最廣的含義來使用，並且尤其涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們呈現所需的生物活性即可。抗體可以是人、人源化和/或親和力成熟的。術語「全長抗體」、「完整抗體」和「全抗體」在本文中可互換使用，是指基本上完整形式的抗體，不是如以下定義的抗體片段。該術語特別是指具有含Fc區的重鏈的抗體。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選包含其抗原結合區(術語「抗原結合片段」可互換使用)。抗體片段的實例包括Fab、Fab』、F(ab』)2和Fv片段；雙抗體(diabody)；直鏈抗體；單鏈抗體分子；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。II.製備泊洛沙姆的方法本文提供製備泊洛沙姆的方法，例如，用於細胞培養基中。加熱在一些方面，本文中提供的製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法包括加熱泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)以形成液體泊洛沙姆。例如，可以將固相的純化泊洛沙姆加熱到融化，由此形成液體泊洛沙姆。可以基於使用的特定泊洛沙姆品種的熔化溫度來調節將泊洛沙姆加熱至的溫度。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆具有約45℃至約60℃的熔化溫度。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆具有約50℃至約55℃的熔化溫度。在一些實施方案中，本文中提供的製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法包括將固體泊洛沙姆加熱到至少約60℃以形成液體泊洛沙姆，並且將液體泊洛沙姆冷卻至低於約50℃的溫度以形成固體熱處理過的泊洛沙姆，其中冷卻不在造粒或研磨設備中進行，並且泊洛沙姆包含環氧乙烷和環氧丙烷的共聚物。在一些實施方案中，泊洛沙姆是純化的泊洛沙姆。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆是不含另外的治療化合物或藥物化合物的泊洛沙姆組合物。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到至少約任一個以下溫度(以℃計)：60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180或185。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)至少1分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆至少約1分鐘，至少約2分鐘，至少約3分鐘，至少約4分鐘，至少約5分鐘，至少約6分鐘，至少約7分鐘，至少約8分鐘，至少約9分鐘，至少約10分鐘，至少約15分鐘，至少約20分鐘，至少約25分鐘，至少約30分鐘，至少約35分鐘，至少約40分鐘，至少約45分鐘，至少約50分鐘，至少約55分鐘，至少約60分鐘，至少約65分鐘，至少約70分鐘，至少約75分鐘，至少約80分鐘，至少約85分鐘，至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約60℃至約185℃。值得注意的是，除非另外明確指出，本文中所述的任一個溫度範圍旨在是包含性的。例如，約60℃至約185℃的溫度範圍將約60℃和約185℃包含在所述範圍內。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於以下任一個溫度(以℃計)的溫度：185，180，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，95，90，85，80，75，70或65。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於以下任一個溫度(以℃計)的溫度：60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175或180。即，泊洛沙姆可以加熱到在如下溫度範圍中的溫度，所述溫度範圍具有185，180，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，95，90，85，80，75，70或65的上限和60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175或180的獨立選擇的下限，其中下限小於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)到約60℃至約185℃並且至少1分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆至少約1分鐘，至少約2分鐘，至少約3分鐘，至少約4分鐘，至少約5分鐘，至少約6分鐘，至少約7分鐘，至少約8分鐘，至少約9分鐘，至少約10分鐘，至少約15分鐘，至少約20分鐘，至少約25分鐘，至少約30分鐘，至少約35分鐘，至少約40分鐘，至少約45分鐘，至少約50分鐘，至少約55分鐘，至少約60分鐘，至少約65分鐘，至少約70分鐘，至少約75分鐘，至少約80分鐘，至少約85分鐘，至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約185℃並且約1分鐘至約250分鐘。值得注意的是，除非另外明確指出，本文中所述的任一個時間範圍旨在是包含性的。例如，約1分鐘至約250分鐘的時間範圍將約1分鐘和約250分鐘包含在所述範圍內。在一些實施方案中，泊洛沙姆的加熱時間少於約以下任一個時間(以分鐘計)：250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，95，90，85，80，75，70，65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3或2。在一些實施方案中，泊洛沙姆的加熱時間多於約以下任一個時間(以分鐘計)：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230或240。即，泊洛沙姆可以加熱在如下時間範圍中的時間長度，所述時間範圍具有250，240，230，220，210，200，190，180，170，160，150，140，130，120，110，100，95，90，85，80，75，70，65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3或2的上限和1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230或240的獨立選擇的下限，其中下限小於上限。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約157℃至約185℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：185，180，175，170，165或160。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：157，160，165，170，175或180。即，泊洛沙姆可以加熱到具有185，180，175，170，165或160的上限和獨立選擇的157，160，165，170，175或180的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約157℃至約185℃並且至少約1分鐘，至少約2分鐘，至少約3分鐘，至少約4分鐘，至少約5分鐘，至少約6分鐘，至少約7分鐘，至少約8分鐘，至少約9分鐘，至少約10分鐘，至少約15分鐘，至少約20分鐘，至少約25分鐘，至少約30分鐘，至少約35分鐘，至少約40分鐘，至少約45分鐘，至少約50分鐘，至少約55分鐘，至少約60分鐘，至少約65分鐘，至少約70分鐘，至少約75分鐘，至少約80分鐘，至少約85分鐘，至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約157℃至約185℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約134℃至約157℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：157，155，150，145，140或135。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：134，135，140，145，150或155。即，泊洛沙姆可以加熱到具有157，155，150，145，140或135的上限和獨立選擇的134，135，140，145，150或155的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約134℃至約157℃並且至少約1分鐘，至少約2分鐘，至少約3分鐘，至少約4分鐘，至少約5分鐘，至少約6分鐘，至少約7分鐘，至少約8分鐘，至少約9分鐘，至少約10分鐘，至少約15分鐘，至少約20分鐘，至少約25分鐘，至少約30分鐘，至少約35分鐘，至少約40分鐘，至少約45分鐘，至少約50分鐘，至少約55分鐘，至少約60分鐘，至少約65分鐘，至少約70分鐘，至少約75分鐘，至少約80分鐘，至少約85分鐘，至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約134℃至約157℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約120℃至約134℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：134，130或125。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：120，125或130。即，泊洛沙姆可以加熱到具有134，130或125的上限和獨立選擇的120，125或130的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約120℃至約134℃並且至少約20分鐘，至少約30分鐘，至少約40分鐘，至少約50分鐘，或至少約60分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約120℃至約134℃並且至少約62分鐘，至少約65分鐘，至少約70分鐘，至少約75分鐘，至少約80分鐘，至少約85分鐘，至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約120℃至約134℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約100℃至約120℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：120，115，110或105。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：100，105，110或115。即，泊洛沙姆可以加熱到具有120，115，110或105的上限和獨立選擇的100，105，110或115的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約100℃至約120℃並且至少約20分鐘，至少約30分鐘，至少約40分鐘，至少約50分鐘，或至少約60分鐘，至少約70分鐘，至少約80分鐘，或至少約90分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約100℃至約120℃並且至少約98分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約100℃至約120℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約80℃至約100℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：100，95，90或85。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：80，85，90或95。即，泊洛沙姆可以加熱到具有100，95，90或85的上限和獨立選擇的80，85，90或95的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約80℃至約100℃並且至少約20分鐘，至少約30分鐘，至少約40分鐘，至少約50分鐘，或至少約60分鐘，至少約70分鐘，至少約80分鐘，或至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，或至少約120分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約80℃至約100℃並且至少約122分鐘，至少約130分鐘，至少約140分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約80℃至約100℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，將泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)加熱到約60℃至約80℃。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：80，75，70或65。在一些實施方案中，將泊洛沙姆加熱到高於約以下任一個溫度(以℃計)的溫度：60，65，70或75。即，泊洛沙姆可以加熱到具有80，75，70或65的上限和獨立選擇的60，65，70或75的下限的溫度範圍中的溫度，其中下限低於上限。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約80℃並且至少約20分鐘，至少約30分鐘，至少約40分鐘，至少約50分鐘，或至少約60分鐘，至少約70分鐘，至少約80分鐘，或至少約90分鐘，至少約100分鐘，至少約110分鐘，至少約120分鐘，至少130分鐘，或至少140分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約80℃並且至少約143分鐘，至少約150分鐘，至少約160分鐘，至少約170分鐘，至少約180分鐘，至少約190分鐘，至少約200分鐘，至少約210分鐘，至少約220分鐘，至少約230分鐘，或至少約240分鐘。在一些實施方案中，加熱泊洛沙姆到約60℃至約80℃並且少於或等於250分鐘。在一些實施方案中，在真空下加熱泊洛沙姆。例如，可以在所施加的真空下在真空爐中加熱泊洛沙姆。如以下所述，出乎預料地發現，在所施加的真空下在本文中所述的溫度下加熱泊洛沙姆可以導致提高的泊洛沙姆性能(參見，例如，實施例7)。換句話說，在加熱過程中給泊洛沙姆施加真空不會負面影響加熱對隨後的泊洛沙姆性能(例如在細胞培養物中)的有益作用。在其他實施方案中，加熱泊洛沙姆到目標溫度並且一段時間是指，泊洛沙姆在該段時間中處於該特定溫度。也就是說，時間＝0可以表示泊洛沙姆到達目標溫度的時間。例如，加熱泊洛沙姆到140℃並且5分鐘可以指，在達到140℃溫度後加熱泊洛沙姆5分鐘。例如，加熱泊洛沙姆(例如，純化的泊洛沙姆)到約60℃至約185℃並且至少1分鐘，可以表示泊洛沙姆已經持續達到目標溫度(例如，約60℃至約185℃)至少一分鐘。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆在加熱處理過程中的溫度不超過約120℃。在一些實施方案中，在加熱處理之前，純化的泊洛沙姆可以溶解於液體或水溶液中。在一些實施方案中，溶解於液體或水溶液中的純化泊洛沙姆可以加熱到比用於固體泊洛沙姆的溫度高的溫度。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆在加熱處理前是固體泊洛沙姆。在一些實施方案中，純化的泊洛沙姆在加熱處理前在室溫下是液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到約80℃至約100℃的溫度。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到約85℃至約91℃的溫度。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到低於約以下任一個溫度的溫度(以℃計)：100，99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82或81。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到高於以下任一個溫度的溫度(以℃計)：80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99。即，可以將純化的泊洛沙姆加熱到在如下溫度範圍中的溫度，所述溫度範圍具有100，99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82或81的上限和80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的獨立選擇的下限，其中下限低於上限。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到低於約120℃的溫度。在一些實施方案中，將純化的泊洛沙姆加熱到低於約101℃，102℃，103℃，104℃，105℃，106℃，107℃，108℃，109℃，110℃，111℃，112℃，113℃，114℃，115℃，116℃，117℃，118℃和119℃之任一個的溫度。可以加熱純化的泊洛沙姆任何期望的時間長度。在一些實施方案中，加熱純化的泊洛沙姆約10至約15分鐘。加熱時間可以指，將熱施加於泊洛沙姆的總時間，因此加熱時間不限於泊洛沙姆已經持續達到所需溫度的時間。在一些實施方案中，加熱純化的泊洛沙姆約10至約15分鐘的總時間量，並且當泊洛沙姆達到所需的最大溫度(例如，約80℃至約100℃)時，停止加熱。本領域已知的任何合適的加熱裝置可以用於加熱純化的泊洛沙姆。作為非限制性實例，可以在標準實驗室加熱板(例如，由或ThermoScientificTM銷售的攪拌熱板)上加熱的玻璃容器(例如，燒杯、燒瓶或其他敞開的容器)中，加熱固體泊洛沙姆。或者，可以在真空爐中加熱泊洛沙姆。本領域已知的任何合適的溫度測量工具都可以用於測量加熱處理過程中/加熱處理後的泊洛沙姆溫度，只要使用該溫度測量工具可以進行泊洛沙姆溫度的準確測量(例如，根據製造商的使用說明)即可。合適的溫度測量工具的非限制性實例包括不限於溫度計(例如，玻璃液體溫度計)、熱電偶(例如，如以下所述的)、電阻溫度檢測儀(RTD)和/或熱敏電阻。在一些實施方案中，溫度測量工具是用於加熱的設備本身帶有的。冷卻在一些方面，本文中所述的製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法包括冷卻加熱過的純化泊洛沙姆以形成固體熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，將液體泊洛沙姆冷卻至低於約50℃的溫度。將液體泊洛沙姆冷卻至的溫度可以是低於其凍結溫度的任何溫度，所述凍結溫度可以根據使用的特定泊洛沙姆而不同。例如，泊洛沙姆188具有約52℃的凍結溫度，因此可以將該泊洛沙姆冷卻至低於約52℃的任何溫度以形成固體熱處理過的泊洛沙姆。可以在足以使泊洛沙姆凍結的任何溫度，冷卻加熱過的液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，在環境溫度冷卻加熱過的液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，在約2℃至約8℃冷卻加熱過的液體泊洛沙姆。在一些實施方案中，在低於約0℃，例如，在約-20℃或在約-70℃，冷卻加熱過的液體泊洛沙姆。可以將加熱過的液體泊洛沙姆冷卻足以使該熱處理過的液體泊洛沙姆在該冷卻溫度下凍結的任何所需時間長度。在一些實施方案中，將液體泊洛沙姆冷卻約20分鐘。冷卻時間可以取決於將泊洛沙姆加熱至的溫度和/或冷卻溫度。可以通過觀察液體泊洛沙姆(加熱到給定溫度和給定時間量)在特定冷卻溫度下凍結所花費的時間，經驗地確定冷卻溫度和時間。本領域已知的任何合適的冷卻裝置，除了造粒或研磨設備外，可以用於冷卻加熱過的液體泊洛沙姆。例如，可以將加熱過的液體泊洛沙姆放置在維持在如上所述的足夠冷卻溫度的冰箱、冰櫃或冷室中。或者，可以不使用特定的冷卻裝置，而是可以在將加熱裝置關閉或程序化停止加熱後，在加熱裝置中冷卻該加熱過的液體泊洛沙姆。在這種情況中，允許加熱過的液體泊洛沙姆在環境溫度下冷卻。例如，如果泊洛沙姆在熱板上加熱，可以在將熱板的加熱功能關閉後，簡單地將泊洛沙姆留在熱板上來冷卻該加熱過的液體泊洛沙姆。或者，可以在真空爐中冷卻泊洛沙姆。在一些實施方案中，冷卻加熱過的液體泊洛沙姆不包括使用液氮。在一些實施方案中，冷卻加熱過的液體泊洛沙姆不包括，通過維持在特定溫度的氣體使加熱過的液體泊洛沙姆噴霧或霧化。在一些實施方案中，冷卻加熱過的液體泊洛沙姆不包括，將泊洛沙姆成型為特定或均一大小和/或形狀的顆粒或微粒。造粒/研磨在一些實施方案中，冷卻不在造粒或研磨設備中進行。在本領域中一直通過造粒或研磨來製備泊洛沙姆，以實現特定的均一泊洛沙姆顆粒大小和/或形狀(對於描述泊洛沙姆造粒和研磨的實例，參見歐洲專利EP1661558B1或美國專利No.7,887,844)。泊洛沙姆造粒涉及使液體泊洛沙姆通過霧化器以形成液體泊洛沙姆顆粒並且在冷卻介質中冷卻這些顆粒，所述冷卻介質例如是維持在特定溫度的氣體或液氮。冷卻介質的溫度被認為決定了泊洛沙姆的冷凍速度，其影響泊洛沙姆顆粒的最終大小和形狀。造粒設備的實例可以包括，不限於，造粒塔。在造粒塔中，霧化的泊洛沙姆從塔頂釋放，並且在下降通過氣體或液體冷卻介質(例如，環境空氣、維持在特定溫度的空氣、或液氮)時凍結成顆粒。泊洛沙姆研磨(或微磨)涉及研磨固體泊洛沙姆，或通過高壓迫使泊洛沙姆通過噴嘴，直至產生特定大小的泊洛沙姆顆粒。因為研磨可能產生熱並且泊洛沙姆具有相對低的熔化溫度，因此常常在研磨過程中冷卻泊洛沙姆來維持固相，例如，通過使用冷空氣或液氮來冷卻。還可以在研磨前冷卻泊洛沙姆並研磨不足以使泊洛沙姆熔化的時間長度。研磨設備的實例可以包括不限於空氣噴射磨機、球磨機和冷凍研磨機(例如，SPEXFreezer/)。對於要求泊洛沙姆顆粒大小和形狀符合嚴格標準的方法(例如，作為藥物製劑的一部分)，造粒和研磨是有用的。本領域中已知泊洛沙姆可以作為藥物製劑中幫助溶解和影響藥物釋放的成分。在這些製劑中，泊洛沙姆顆粒必須保持標準特徵，以賦予藥物製劑所需的藥代動力學特性以及遵守嚴格的藥物安全性和可重複性標準。值得注意的是，本文中所述的方法對於泊洛沙姆沒有這樣的嚴格或精確標準的要求，因此不使用這些造粒或研磨方法。在一些實施方案中，在按照本文中所述加熱前，泊洛沙姆已經通過造粒工藝進行過處理。許多商業上可購得的用於細胞培養的泊洛沙姆(例如，銷售的F68NFPrill泊洛沙姆188)在製造過程中已經經歷過造粒或微造粒處理。本文中所述的方法中包括的加熱和冷卻步驟不涉及造粒。相反，它們可以應用於已經過造粒或微造粒的泊洛沙姆。本發明發現，通過如本文中所述的加熱和冷卻，可以提高商業上可購得的泊洛沙姆(例如，造粒或微造粒的泊洛沙姆)在細胞培養中的性能。在一些方面，本文中所述的製備用於細胞培養基中的泊洛沙姆的方法包括將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基中。加熱和冷卻後，可以通過本領域已知的任何方法將固體熱處理過的泊洛沙姆溶解於細胞培養基中。例如，如果在開口的玻璃容器中加熱並冷卻泊洛沙姆，可以簡單地刮下或剝落合適量(以重量計)的所得固體熱處理過的泊洛沙姆，以加入細胞培養基中。可以將熱處理過的泊洛沙姆立即加入細胞培養基中，或可以將其儲存並在之後的時間(例如，熱處理後超過約一天，超過約一個月或超過約一年)加入細胞培養基中。在一些實施方案中，將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基之前，如上所述的加熱和冷卻步驟各進行一次。在一些實施方案中，將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基之前，如上所述的加熱和冷卻步驟重複至少一次。III.泊洛沙姆和泊洛沙姆特性本文提供用於製備泊洛沙姆的方法。在一些實施方案中，將通過所述方法產生的泊洛沙姆用於細胞培養基中。術語「泊洛沙姆」可以涵蓋許多不同的化合物，這是因為可以組合使用不同長度的聚氧丙烯和聚氧乙烯鏈。存在於泊洛沙姆中的聚氧丙烯和聚氧乙烯鏈的特定組合可以產生特定的化學和/或生物物理特性。在一些實施方案中，泊洛沙姆具有HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH的化學式。在一些實施方案中，n(即，聚氧乙烯鏈長)具有約60至約150的值。在一些實施方案中，m(即，聚氧丙烯鏈長)具有約25至約60的值。泊洛沙姆常常通過指明其大約分子量和聚氧乙烯含量百分比的編號系統來描述。這些值可以指泊洛沙姆組合物中的平均值，而非組合物中每個泊洛沙姆分子的絕對值。依據這個系統，頭兩個數字乘以100可以給出聚氧丙烯嵌段的大約分子量，而第三個數字乘以10可以給出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，泊洛沙姆188(CASNo.9003-11-6)可以指上述分子式中n具有約80的值和m具有約27的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆237可以指n具有約64的值和m具有約37的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆338可以指n具有約141的值和m具有約44的值的泊洛沙姆。泊洛沙姆407可以指n具有約101的值和m具有約56的值的泊洛沙姆。在一些實施方案中，泊洛沙姆具有約6,000至約18,000道爾頓的平均分子量。在一些實施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有約80的值和m具有約27的值的泊洛沙姆，並且該泊洛沙姆具有約7680至約9510g/mol的平均分子量。在一些實施方案中，泊洛沙姆188可以指上述分子式中n具有約80的值和m具有約27的值的泊洛沙姆，並且該泊洛沙姆具有約7000至約10000g/mol的平均分子量。可以依據不同的系統來命名以商品名銷售的泊洛沙姆，例如，字母可以用於表示物理狀態(例如，F表示固體，P表示糊狀，或L表示液體)。2個或3個數字可以用於表示化學特性。頭一個或頭兩個數字乘以300來給出聚氧丙烯嵌段的大約分子量，而第三個數字乘以10來給出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，F68可以指上述分子式中n具有約80的值和m具有約27的值的固體泊洛沙姆。F87可以指n具有約64的值和m具有約37的值的固體泊洛沙姆。F108可以指n具有約141的值和m具有約44的值的固體泊洛沙姆。F127可以指n具有約101的值和m具有約56的值的固體泊洛沙姆。由於泊洛沙姆可以具有各種長度的疏水性(聚氧丙烯)和親水性(聚氧乙烯)部分，不同的泊洛沙姆可以具有不同的親水-親脂平衡值(HLB)。可以通過計算親水性或親脂性的化合物的相對比例來確定化合物的HLB，並且HLB值可以用於預測化合物的表面活性劑特性。例如，具有低於10的HLB的化合物預測是水不溶性的，而具有高於10的HLB的化合物預測是水溶性的。在優選實施方案中，用於細胞培養中的泊洛沙姆具有24或更高的HLB。可以根據本領域公知的方法來計算泊洛沙姆的HLB，所述方法包括Griffin，W.C.(1954)J.Soc.Cosmet.Chemists5(4):249-56和Davies,J.T.(1957)Gas/LiquidandLiquid/LiquidInterfaces:Proc.of2ndIntl.CongressSurfaceActivity,Butterworths(London):426-38中所述的那些。在一些實施方案中，可以測量泊洛沙姆的物理和/或化學特性。例如，可以在按照本文中所述的熱處理之前和之後測量泊洛沙姆的物理和/或化學特性，以鑑定與熱處理過的泊洛沙姆相關的特性。作為另一個實例，可以測量如本文中所述的好泊洛沙姆批次和差泊洛沙姆批次的物理和/或化學特性，以鑑定與好泊洛沙姆批次相關的特性。測量物理和/或化學特性的試驗的實例包括，不限於，MALDI-MS、凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography)、粉末-XRD、準-彈性光散射和固態NMR。MALDI-MS(基質輔助雷射解吸/電離質譜)是本領域已知用於分析、定量或鑑定化合物的技術，例如，通過其分子質量和電荷。作為非限制性實例，MALDI-MS可以用於鑑定，與熱處理過的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，優先和熱處理前的泊洛沙姆批次或差泊洛沙姆批次相關的化合物或優先存在於其中的化合物(例如，雜質)。凝膠滲透色譜是本領域中已知用於按大小分離化合物的技術。作為非限制性實例，凝膠滲透色譜可以用於分離，與熱處理過的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，在熱處理前的泊洛沙姆批次中或差泊洛沙姆批次中優先相關的或存在的化合物(例如，雜質)。粉末-XRD(粉末X-射線衍射)是本領域已知用於表徵化合物結構的技術，可以涉及產生化合物的粉末樣品(含有多種隨機取向的微晶)和使用X-射線衍射分析微晶結構特徵的步驟。作為非限制性實例，粉末-XRD可以用於表徵熱處理過的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次(例如與熱處理前的泊洛沙姆或差泊洛沙姆批次相比)的結構特性。準-彈性光散射(也稱為動態光散射和光子相關光譜)是本領域已知用於測定溶液或懸浮液中顆粒的大小分布譜的技術。作為非限制性實例，準-彈性光散射可以用於通過其顆粒大小來鑑定，與熱處理過的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次相比，在熱處理前的泊洛沙姆批次中或差泊洛沙姆批次中優先相關的或存在的化合物(例如，雜質)。固態NMR(核磁共振，或SSNMR)是本領域已知用於測定化合物的各種結構特徵的技術。例如，固態NMR可以用於表徵化合物的分子構象、排列、化學位移或多晶型性質。作為非限制性實例，固態NMR可以用於表徵，與熱處理前的泊洛沙姆或差的泊洛沙姆批次相比，熱處理過的泊洛沙姆或好泊洛沙姆批次的結構特性。在一些實施方案中，通過固態NMR測定的結構特性可以包括泊洛沙姆樣品中晶體與無定形泊洛沙姆的比例。作為另一個非限制性實例，固態NMR可以用於提供光譜，所述光譜可以分辨或剖析一種或多種泊洛沙姆多晶型物。在一些實施方案中，固態NMR可以用於，與差的泊洛沙姆批次或熱處理前的泊洛沙姆中存在的泊洛沙姆多晶型物比較，分辨好泊洛沙姆批次或熱處理過的泊洛沙姆中的一種或多種泊洛沙姆多晶型物。在一些實施方案中，可以例如通過測量在含有好泊洛沙姆批次或熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中生長的細胞培養物的細胞生存力，並與含有差的泊洛沙姆批次或熱處理前的泊洛沙姆的細胞培養基中生長的細胞培養物的細胞生存力相比，將泊洛沙姆在細胞培養基中的性能與通過固態NMR產生的泊洛沙姆光譜相關聯。IV.泊洛沙姆在細胞培養和多肽生產中的用途本文中提供的熱處理過的泊洛沙姆可以在方法(例如，使用含有本發明公開的熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基來培養細胞和生產多肽的方法)和組合物(例如，含有本發明公開的熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基)中找到用途。泊洛沙姆在細胞培養中的用途泊洛沙姆可以用作本領域已知的細胞培養基中的添加劑。不希望受到理論的束縛，認為泊洛沙姆在細胞培養基中具有許多功能，其可以保護細胞免受損傷和增強細胞生存力。例如，泊洛沙姆可以作為細胞的剪切保護劑。泊洛沙姆可以降低細胞-氣泡粘附和/或降低氣泡破裂時的衝擊，由此防止細胞損傷。泊洛沙姆還可以改變起泡速度和頻率，提高細胞從泡沫層的排出和/或強化細胞膜。參見，例如，Meier,S.J.等，(1999)Biotechnol.Bioeng.62(4):468-78；Chisti,Y.(2000)TrendsBiotechnol.18(10):420-32和Tharmalingam,T.等，(2008)Mol.Biotechnol.39(2):167-77。如本文中所述的熱處理過的泊洛沙姆可以以泊洛沙姆常用的任何濃度加入細胞培養基中。在一些實施方案中，細胞培養基包括約0.1g/L至約10g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包括約0.1g/L至約3g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包括約3g/L至約10g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，細胞培養基包括約0.1g/L，約0.2g/L，約0.3g/L，約0.4g/L，約0.5g/L，約0.6g/L，約0.7g/L，約0.8g/L，約0.9g/L，約1g/L，約2g/L，約3g/L，約4g/L，約5g/L，約6g/L，約7g/L，約8g/L，約9g/L或約10g/L熱處理過的泊洛沙姆。在一些實施方案中，與熱處理前的泊洛沙姆相比，如本文中所述製備的熱處理過的泊洛沙姆可以以較低的濃度用於細胞培養基中，來獲得期望的細胞生存力水平。在一些實施方案中，與熱處理前的泊洛沙姆相比，如本文中所述製備的熱處理過的泊洛沙姆可以以更一致或標準化的濃度用於細胞培養基中，來獲得期望的細胞生存力水平。表面活性劑，如泊洛沙姆，在溶液中具有限值，稱為臨界膠束濃度(CMC)，超過該限後，加入的其他表面活性劑分子開始併入膠束，而不是溶解於溶液中。在高於CMC的濃度下，溶液的表面張力不再以與表面活性劑的濃度成比例的相同速率降低。在優選實施方案中，以低於其CMC的濃度，將熱處理過的泊洛沙姆加入細胞培養基中。例如，已經確定泊洛沙姆188的CMC為100mg/mL(Kabanov,A.V.等，(1995)Macromolecules28(7):2303-14)。可以通過測量泊洛沙姆加入時的溶液表面張力來測定泊洛沙姆的CMC。提高泊洛沙姆濃度不再導致提高的表面張力時的濃度為該泊洛沙姆的CMC。例如但非限制，可以使用張力計(例如，來自Attension的Sigma700/701張力計)來測量表面張力。在一些細胞培養基本發明公開的特定方面涉及在細胞培養基中培養細胞。可以使用適用於所需類型的細胞和/或多肽產物的本領域已知的任何細胞培養基。在一些實施方案中，細胞培養基是化學成分確知的培養基。在其他實施方案中，細胞培養基是化學成分不確知的培養基。在一些實施方案中，將本文中所述的熱處理過的泊洛沙姆加入基礎細胞培養基中。在一些實施方案中，將本文中所述的熱處理過的泊洛沙姆加入補料或分批補料細胞培養基。可以使用商業上可購得的培養基，包括如，但不限於，Ham’sF10(Sigma)、極限必需培養基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco’s改良Eagle’s培養基([DMEM]，Sigma)、Luria肉湯(LB)和Terrific肉湯(TB)，並且這些培養基中的任一種可以補充本文中詳述的任何培養基組分(例如，熱處理過的泊洛沙姆)。此外，Ham和Wallace，Meth.Enz.，58:44(1979)，Barnes和Sato，Anal.Biochem.，102:255(1980)，Vijayasankaran等，Biomacromolecules.，6:605:611(2005),Patkar等，JBiotechnology,93:217-229(2002)，美國專利Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；美國專利No.Re.30,985或美國專利No.5,122,469中所述的任何培養基，可以補充本文中詳述的任何培養基組分(例如，熱處理過的泊洛沙姆)，將上述文獻全部按引用併入本文中作為參考。本文中提供的任何培養基也可以按照需要補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸)、緩衝劑(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、微量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、表面活性劑(如泊洛沙姆)和葡萄糖或等價能量源。在一些方面中，本文中提供的細胞培養基含有源自植物或動物的蛋白質。在一些實施方案中，本文中提供的細胞培養基不含源自植物或動物的蛋白質。還可以以本領域技術人員已知的合適濃度包括任何其他需要的補充劑。細胞生存力在一些實施方案中，與包括未處理的泊洛沙姆(或熱處理之前的泊洛沙姆)的細胞培養基中的細胞生存力相比，包括熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力提高。本發明發現，將熱處理過的泊洛沙姆用於細胞培養基中時，與未處理泊洛沙姆用於相同的細胞培養基時相比，按照本文中所述製備泊洛沙姆可以導致提高的細胞生存力。用於測試細胞生存力的方法是本領域已知的。在一些實施方案中，按照本文提供的實施例中詳細描述的，測量細胞生存力。在一些實施方案中，可以在約1小時後，約2小時後或約3小時後(例如，如以下所述的)，測量培養基中的細胞生存力。如本文中使用的，細胞生存力可以定量為溶液中活細胞的百分比(即，活細胞的數量除以細胞總數)。本領域已知的任何合適的方法可以用於測量細胞生存力。因為細胞或是活的或是死的，因此可以通過定量死細胞或活細胞來測定細胞生存力。一種合適的方法是錐蟲藍排除法。在該方法中，從細胞培養物獲得細胞樣品。將錐蟲藍溶液加入樣品中。只有非存活的細胞才攝取錐蟲藍，並且這些細胞隨後被染成藍色。因此，對藍色細胞的數量進行計數，將其從細胞總數中減去，產生活細胞的數量，將這個數字除以細胞總數以產生細胞生存力。細胞可以人工計數，如使用血細胞計數器，或自動計數，如使用例如生存力分析儀(BeckmanCoulter)。用於測定細胞生存力的其他試驗可以包括，不限於，碘化丙啶染色、TUNEL、刃天青、甲基紫、乳酸脫氫酶、螢光素二乙酸酯水解、MTT、胱天蛋白酶(caspase)和ATP試驗。例如，可以通過測量在含有熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中生長的細胞培養物的細胞生存力，並將其與在含有相同濃度的未處理泊洛沙姆的細胞培養基中生長的細胞培養物的細胞生存力進行比較，來測定熱處理過的泊洛沙姆的作用。在一些實施方案中，可以在帶擋板的搖瓶中生長細胞培養物。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高了至少約10％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約15％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約20％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約25％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約30％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約35％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約40％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約45％。在一些實施方案中，與未處理的泊洛沙姆相比，熱處理過的泊洛沙姆的使用將細胞生存力提高至少約50％。在一些實施方案中，與包含熱處理前的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力相比，包含本發明公開的熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力提高至少10％。在一些實施方案中，細胞生存力提高至少約1％，至少約2％，至少約3％，至少約4％，至少約5％，至少約6％，至少約7％，至少約8％，至少約9％，至少約10％，至少約11％，至少約12％，至少約13％，至少約14％，至少約15％，至少約16％，至少約17％，至少約18％，至少約19％，至少約20％，至少約21％，至少約22％，至少約23％，至少約24％，至少約25％，至少約26％，至少約27％，至少約28％，至少約29％，至少約30％，至少約31％，至少約32％，至少約33％，至少約34％，至少約35％，至少約36％，至少約37％，至少約38％，至少約39％，或至少約40％。熱處理過的泊洛沙姆尤其可以用於提高加入細胞培養基時沒有產生令人滿意的細胞生存力的泊洛沙姆(例如，特定批次的期望泊洛沙姆)的性能。在一些實施方案中，含有未處理泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力低於約80％。在一些實施方案中，含有未處理泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力低於約70％。在一些實施方案中，含有未處理泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力低於約60％。在一些實施方案中，含有未處理泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力低於約50％。在一些實施方案中，含有未處理泊洛沙姆的細胞培養基中的細胞生存力低於約40％。細胞生長和多肽生產在一些實施方案中，本發明公開的細胞(例如，本文中所述的細胞培養基中培養的細胞)可以含有目標多核苷酸(例如，編碼目標多肽的多核苷酸，或本身是目標的多核苷酸)。在一些實施方案中，本發明公開的細胞可以經轉染、轉化或另外遺傳修飾以包括目標多核苷酸。適用於轉染或轉化各種細胞的方法是本領域公知的。以下提供了有關多肽生產的示例性參考文獻；本領域技術人員將明了其中公開的方法不限於多肽生產。通常，在促進細胞生長、維持和/或多核苷酸和/或多肽生產的一個或多個條件下，使細胞與本文中所述的任何細胞培養基混合(接觸)。培養細胞和產生多肽的方法可以使用培養容器(生物反應器)來容納細胞和細胞培養基。培養容器可以由適用於培養細胞的任何材料組成，包括玻璃、塑料或金屬。通常，培養容器為至少1升，並且可以是10，100，250，500，1000，2500，5000，8000，10,000，25,000升或更大。培養條件，如溫度、pH等，是選擇用於表達的宿主細胞之前使用的那些條件，並將是本領域普通技術人員明了的。可以在培養過程中調節的培養條件包括但不限於pH和溫度。可以在有助於細胞培養物的存活、生長、生存力(維持)和多肽產生能力的條件下維持細胞培養物。確切的條件將取決於細胞類型、細胞的來源生物體、以及所表達的多肽的性質和特徵。在多肽產生期中，任選可以將細胞培養物維持在有助於細胞培養物的存活和生存力並適於所需多肽表達的第二組培養條件(與初始生長期相比)下。在特定情況中，給細胞培養物補充已經被細胞耗盡或代謝的營養物或其他培養基成分，可能是有益或必需的。例如，給細胞培養物補充在細胞培養監控過程中已經觀察到耗盡的營養物或其他培養基成分，可能是有利的。備選地或另外地，在生產期之前，補充細胞培養物可能是有益或必需的。作為非限制性實例，給細胞培養物補充激素和/或其他生長因子、特定的離子(如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的終濃度存在的無機化合物)、胺基酸、脂質或葡萄糖或其他能量源，可能是有益或必需的。本文中詳述的細胞培養基可以用於培養細胞以產生多肽(包括抗體)的方法中。該培養基可以用於培養細胞的方法中，無論是分批培養、補料分批培養或是灌流培養，並且可以用於生產任何多肽的方法中，包括如本文中所述的多肽的任何方面或實施方案中。通過本文中詳述的方法(例如，使用含有本發明公開的熱處理過的泊洛沙姆的培養基來培養細胞和生產多肽的方法)產生的多肽可以是宿主細胞同源的，或優選，可以是外源性的，意思是它們相對於所用的宿主細胞是異源的，即，外來的，如通過CHO細胞產生的人蛋白，或通過哺乳動物細胞產生的酵母多肽。在一個變化方案中，多肽是由宿主細胞直接分泌至培養基中的哺乳動物多肽(如抗體)。在另一個變化方案中，多肽通過細胞裂解而釋放至培養基中，所述細胞包含編碼多肽的多核苷酸。在宿主細胞中可表達的任何多肽都可以根據本發明公開生產，並且可以存在於組合物中。可以從宿主細胞內源的基因，或從通過遺傳工程引入宿主細胞的基因來表達多肽。多肽可以是自然界中存在的，或備選地，可以具有通過人工工程化或選擇的序列。可以從各天然存在的多肽區段來裝配工程化多肽，或工程化多肽可以包括一個或多個非天然存在的區段。常常可以基於感興趣的生物或化學活性來選擇可能期望根據本發明表達的多肽。例如，本發明可以用於表達任何醫藥上或商業上相關的酶、受體、抗體、激素、調控因子、抗原、結合劑等。用於在細胞培養中生產多肽(如抗體)的方法是本領域公知的。本文提供用於在細胞培養中生產抗體(例如，全長抗體、抗體片段和多特異性抗體)的非限制性示例方法。本文中的方法可以由本領域技術人員適應性改變而用於其他蛋白質(如基於蛋白質的抑制劑)的生產。用於蛋白質(例如，治療性蛋白)生產的一般熟知的和通用的技術和程序，參見MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：實驗室手冊)(Sambrook等，第4版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，2012)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(當代分子生物學實驗方案)(F.M.Ausubel等編輯，2003)；ShortProtocolsinMolecularBiology(分子生物學簡短實驗方案)(Ausubel等編輯，J.Wiley和Sons，2002)；CurrentProtocolsinProteinScience(當代蛋白質科學實驗方案)(Horswill等，2006)；Antibodies,ALaboratoryManual(抗體，實驗室手冊)(Harlow和Lane編輯，1988)；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechniqueandSpecializedApplications(動物細胞的培養：基礎技術和專門應用手冊)(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley和Sons，2010)，所有文獻全部按引用併入本文中。針對各種宿主細胞類型和多肽，適用於多肽產生的條件是本領域已知的。培養條件，如溫度、pH等，可以是選擇用於表達的宿主細胞之前使用過的那些，並且將是本領域普通技術人員明了的。在細胞培養過程中可以攪拌或振蕩細胞培養物，以提高氧合和營養物至細胞的分散。由於剪切力潛在地傷害細胞，在攪拌的細胞培養物中使用泊洛沙姆特別有利。根據本發明，本領域普通技術人員將理解，在初始生長期中控制或調節生物反應器的一些內部條件可能是有益的，包括但不限於，pH、溫度、氧合等。例如，可以通過提供合適量的酸或鹼來控制pH，以及可以用本領域公知的噴射設備(spargingdevice)來控制氧合。細胞用於在培養基中培養並產生多肽的合適細胞可以包括原核細胞、酵母細胞或高等真核(例如，哺乳動物)細胞。在一些實施方案中，使用哺乳動物細胞。在一些實施方案中，使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。可以培養哺乳動物細胞，並且哺乳動物細胞在培養(組織培養)中的增殖已經成為常規程序。哺乳動物宿主細胞系的實例可以包括，不限於，SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚腎系(293細胞或亞克隆用於在懸浮培養中生長的293細胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10)；小鼠塞爾託利細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1ATCCCCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2)；犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34)；Buffalo大鼠肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺細胞(W138，ATCCCCL75)；人肝細胞(HepG2,HB8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI細胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞；和人肝細胞瘤系(HepG2)。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括骨髓瘤細胞系，如NS0和Sp2/0。對於適用於抗體生產的特定哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo編輯，HumanaPress，Totowa，N.J.，2003)，pp.255-268。在一些實施方案中，可以培養CHO細胞。CHO細胞是公知的並且本領域常用於在細胞培養物中生產多肽，例如抗體。CHO細胞可以包括，但不限於，DHFR-CHO細胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))，例如ATCCCRL-9096。用於這個目的的合適原核細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，變形菌屬(Proteus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，例如，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌屬(Serratia)，例如，粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如，在1989年4月12日出版的DD266,710中公開的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和鏈黴菌屬(Streptomyces)。一種優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，但其他菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些實例是舉例說明性的，而非限制。除了原核生物，真核微生物，如絲狀真菌或酵母是用於抗體編碼載體的合適克隆或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或普通麵包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，各種其他屬、種和株也是通常可得的並且可以用於本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，如，例如，乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、和馬克思克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070)；假絲酵母屬(Candida)、裡氏木黴(Trichodermareesia)(EP244,234)；粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，如許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；以及絲狀真菌，如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)和麴黴屬(Aspergillus)宿主，如構巢麴黴(A.nidulans)和黑麴黴(A.niger)。討論酵母和絲狀真菌在治療性蛋白生產中的用途的綜述，參見，例如，Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。可以選擇其中糖基化途徑已經「人源化」的特定真菌和酵母株，導致具有部分或完全人糖基化模式的抗體的產生。參見，例如，Li等，Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述了巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中糖基化途徑的人源化)；和Gerngross等，上引文。用於糖基化抗體表達的合適宿主細胞也可以源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了各種杆狀病毒株和變體以及來自宿主的昆蟲細胞，如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyxmori)。各種用於轉染的病毒株是公眾可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，並且根據本發明，這些病毒可以用作本文中的病毒，特別是用於草地貪夜蛾細胞的轉染。昆蟲細胞的實例包括，不限於，果蠅細胞(例如，S2細胞)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞(例如，HighFiveTM細胞)和草地貪夜蛾細胞(例如，Sf21或Sf9細胞)。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿、浮萍(Leninaceae)、苜蓿(M.truncatula)和菸草的植物細胞培養物也可以用作宿主。參見，例如，美國專利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述了用於在轉基因植物中生產抗體的PLANTIBODIESTM技術)。抗體生產在一些實施方案中，將含有熱處理過的泊洛沙姆的細胞培養基中培養的細胞用於產生抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。修飾語「單克隆」表示抗體獲自基本上同質的抗體群的特徵，不應解釋為需要通過任何特定方法來生產抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過各種技術來製得，包括，例如，雜交瘤方法(例如，Kohler和Milstein，Nature,256:495-97(1975)；Hongo等，Hybridoma，14(3):253-260(1995)，Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，1988)；Hammerling等，見：MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重組DNA方法(參見，例如，美國專利No.4,816,567)，噬菌體展示技術(參見，例如，Clackson等，Nature,352:624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)和Lee等，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)，以及用於在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中產生人或人樣抗體的技術(參見，例如，WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature362:255-258(1993)；Bruggemann等，YearinImmunol.7:33(1993)；美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。在一些實施方案中，通過本文中所述的方法產生的抗體是人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、文庫衍生的抗體或多特異性抗體。可以使用重組方法產生抗體，例如，在使用CHO細胞生產抗體中。對於抗抗原抗體的重組生產，分離編碼抗體的核酸並插入可複製載體中，用於進一步的克隆(DNA的擴增)或用於表達。可以容易地分離編碼抗體的DNA並使用常規程序(例如，通過使用能夠特異性地結合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)測序。許多載體是可利用的。載體組分通常包括，但不限於，以下的一種或多種：信號序列、複製起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。本發明的抗體不僅可以直接通過重組產生，而且可以作為與異源多肽的融合多肽來產生，所述異源多肽優選是信號序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特定切割位點的其他多肽。優選選擇的異源信號序列是由宿主細胞識別並加工(例如，被信號肽酶斷裂)的序列。對於沒有識別和處理天然抗體信號序列的原核宿主細胞，信號序列由選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列的原核信號序列替代。對於酵母分泌，天然信號序列可以由例如酵母轉化酶前導序列、因子前導序列(包括酵母和克魯維酵母α-因子前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌葡糖澱粉酶前導序列或WO90/13646中所述的信號替代。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如，單純皰疹gD信號，是可利用的。抗體可以在胞內、在細胞周質間隙中產生，或直接分泌至培養基中。如果抗體在胞內產生，作為第一步，除去顆粒碎片(宿主細胞或裂解的片段)，例如，通過離心或超濾來去除。Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了用於分離分泌至大腸桿菌的細胞周質間隙中的抗體的程序。簡而言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺醯氯(PMSF)的存在下在約30min內融化細胞糊狀物。通過離心除去細胞碎片。在抗體分泌至培養基中的情況中，通常首先使用商業上可購得的蛋白質濃縮過濾器，例如，Amicon或MilliporePellicon超濾裝置，濃縮來自該表達系統的上清液。蛋白酶抑制劑，如PMSF，可以包括在之前的任何步驟中，以抑制蛋白質水解，並且可以包括抗生素來防止外來汙染物的生長。可以使用例如羥磷灰石色譜、疏水性相互作用色譜、凝膠電泳、透析和親和力色譜來純化抗體，其中親和力色譜是通常優選的純化步驟之一。蛋白A作為親和力配體的的適宜性取決於抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結構域的種類和同種型。蛋白A可以用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠同種型和用於人γ3(Guss等，EMBOJ.5:15671575(1986))。親和力配體所附著的基質最常見的是瓊脂糖，但其他基質也是可利用的。與使用瓊脂糖可獲得的流速和處理時間相比，機械穩定的基質，如受控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，允許更快的流速和更短的處理時間。在抗體包含CH3結構域的情況中，BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)對於純化是有用的。取決於待收集的抗體，其他蛋白質純化技術，如離子交換柱上的分級分離、乙醇沉澱、反向HPLC、矽膠色譜、肝素SEPHAROSETM色譜、陰離子或陽離子交換樹脂色譜(如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱也是可利用的。在一些實施方案中，本文中所述的抗體是其抗原結合片段。抗原結合片段的實例包括Fab、Fab』、F(ab』)2和Fv片段；雙抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段含有重鏈和輕鏈可變結構域並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)。通過在重鏈CH1結構域的羧基末端添加一些殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸，Fab』片段不同於Fab片段。恆定結構域的半胱氨酸殘基(一個或多個)帶有游離硫醇基的Fab』在本文中命名為Fab』-SH。F(ab』)2抗體片段最初作為Fab』片段對產生，在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。「Fv」是最小抗體片段，其含有完整的抗原結合位點。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽進一步包含VH和VL結構域之間的多肽銜接物，其使scFv能夠形成用於抗原結合的期望結構。對於scFv的綜述，參見，例如，Pluckthün，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies(單克隆抗體藥理學)，vol.113，Rosenburg和Moore編輯(Springer-Verlag，NewYork，1994)，pp.269-315。用於純化上述抗體的許多方法可以適宜地進行調整以適用於純化抗原結合性抗體片段。通常，製備用於研究、測試和臨床的抗體的各種方法是本領域成熟建立的，與上述方法相一致和/或被本領域技術人員認為適用於特定目標抗體的。實施例通過參考以下實施例，可以更全面地理解本發明。然而，實施例不應當解釋為對本發明範圍的限制。可以理解，本文中所述的實施例和實施方案只是用於舉例說明性的目的，對於本領域技術人員基於其將明了各種修飾或改變，這些修飾和變化包括在本申請和所附權利要求的精神和範圍內。實施例1：熱處理提高用於細胞培養的泊洛沙姆性能泊洛沙姆通常用於細胞培養中作為保護細胞免受噴射和/或氣泡相關損傷的表面活性劑。不幸地，批與批之間的變異性破壞了其有效性並導致重組產物產量的降低。例如，差批次的泊洛沙姆降低細胞生存力並且可導致產物滴度降低高達45％。經過一系列廣泛研究後發現，差的泊洛沙姆批次是工業蛋白質生產中產物產量顯著降低以及隨後經濟損失的根源。因此，提高泊洛沙姆性能的方法將是高度有益的。令人驚訝地，已經發現，單加熱處理能夠提高泊洛沙姆在細胞培養中的性能。重要地，這種加熱處理不僅提高了壞泊洛沙姆批次的性能，而且也能夠進一步增強好批次的性能。本文中描述了用於處理泊洛沙姆來提高其作為細胞培養補充劑的性能的方法。方法泊洛沙姆處理將15g泊洛沙姆188(F68NFPrill泊洛沙姆188，BASF)在標準攪拌板上加熱10-12分鐘。當泊洛沙姆達到86-91℃溫度時，停止加熱。然後在室溫、2-8℃或-72℃，將泊洛沙姆冷卻大約20分鐘。然後將固體泊洛沙姆剝下，並加入細胞培養基中用於測試。細胞培養測試模型將按照以上所述熱處理過的泊洛沙姆188以1g/L的終濃度加入標準的、無血清的、CHO細胞培養基中。將CHO細胞以1.5×106細胞/mL的濃度在250mL帶擋板的搖瓶中在25-75mL細胞培養基中在5％CO2中37℃生長。在細胞培養過程中，將搖瓶在軌道搖床上在250至350rpm之間旋轉。使用帶擋板的搖瓶在培養物中形成了大量帶入的氣泡。使用生存力分析儀(BeckmanCoulter)，通過錐蟲藍排除，測量了細胞生存力。取樣300μL細胞培養物，並且通過活細胞數(即，沒有吸收錐蟲藍的細胞)除以樣品中的細胞總數，計算了細胞生存力百分比。結果研發了簡單篩選模型用於在實驗室規模(而非工業規模)模擬泊洛沙姆對細胞培養物生存力的影響。簡而言之，如上所述，將CHO細胞生長於250mL燒瓶中。為了最大化由好和差批次的泊洛沙姆產生的細胞生存力差異，測試了細胞培養基的體積和振蕩速度。將細胞生長於25、50或75mL培養基中並且在軌道搖床平臺上在250、300或350rpm振蕩。發現，培養基的體積對Δ生存力(即，已知的好批次和已知的差批次泊洛沙姆之間的細胞生存力差異，以百分比表示)沒有影響，但較高的振蕩速度顯示出Δ生存力的增加。如圖1中所示，發現，熱處理泊洛沙姆(參見方法部分)顯著提高了泊洛沙姆在細胞培養中的性能。使用以上的篩選模型，測試了各種泊洛沙姆批次對細胞生存力的作用。一些批次已知性能好，而其他被懷疑具有差的性能。對於每個批次，將未處理的泊洛沙姆組和熱處理過的(HT)泊洛沙姆組加入細胞培養基中用於測試。與未處理的泊洛沙姆相比，發現熱處理過的泊洛沙姆在測試的所有批次中均提高了細胞生存力(圖1)。在一些情況中，熱處理過的泊洛沙姆能夠將生存力增倍，從45％提高至接近90％。重要地，熱處理過的泊洛沙姆能夠提高已經顯示了高性能的批次的生存力(參見，例如，圖1中的「好4」)。這些結果證明，泊洛沙姆的熱處理能夠提高其對細胞培養物的生存力的作用。熱處理能夠顯著提高差泊洛沙姆批次的性能，並且甚至進一步增強好批次的性能，表明泊洛沙姆熱處理的實施可以顯著降低泊洛沙姆批次變異性的問題。實施例2：用RTD溫度計測量泊洛沙姆熱處理在熱板上進行了實施例1中所述的實驗。這些實驗涉及在10分鐘的過程中將泊洛沙姆加熱到大約80-100℃(通過RTD測量)。重複這些實驗，並增加加熱到高於100℃(即，124℃)的樣品。方法泊洛沙姆188製造商和批次使用了泊洛沙姆188材料。識別號和相關的細胞培養性能(通過在高剪切振蕩燒瓶試驗HSSF中的性能來確定)列於表1中。表1.識別號(在所有隨後實施例中用於指批號)和來自HSSF數據的相關細胞培養性能。熱處理方法為了評價泊洛沙姆熱處理方法，評價了幾種熱處理方法：在熱板上加熱、在烘箱中加熱或在壓熱器中加熱。熱板將五至十五克泊洛沙姆放置在玻璃燒杯(100-400mL)中並在熱板上持續攪拌加熱。使用熱電偶(Kaye731熱電偶)或電阻式溫度檢測器(RTD)(Fluke5627A-12PrecisionRTD探頭)測量泊洛沙姆的溫度。加熱泊洛沙姆直至其達到目標溫度(大約五至十分鐘)，然後立即停止加熱。使熔化的泊洛沙姆在室溫冷卻。烘箱稱重五克泊洛沙姆放入20mL閃爍玻璃小瓶中。將熱電偶固定在小瓶中，使得尖端插入幹的泊洛沙姆中。然後將泊洛沙姆和熱電偶放入已經處於目標溫度的烘箱(YamatoADP21真空乾燥烘箱)中。除非另外說明，運行烘箱，不使用真空功能(在大氣壓力下)。使泊洛沙姆達到目標溫度(通過熱電偶測量，+/-3℃)，並且將泊洛沙姆達到該目標溫度的時間標記為時間＝0。期望孵育時間後，施加輕微的真空10-30秒，以吸走釋放至烘箱中的任何揮發物。通氣後，從烘箱中取出玻璃小瓶並使其在室溫冷卻(未加蓋)。CHO細胞培養和培養基將標準的、無血清的CHO細胞培養基用於所有實驗，除了一個值得注意的例外：從培養基中省略PluronicF68。為了支持此研究，將兩個CHO細胞系融化物維持於種子罐(seedtrain)生物反應器(STB)中。高剪切細胞培養搖瓶方法將泊洛沙姆樣品加入細胞培養基中按每樣品250mL標準的、無血清的CHO細胞培養基(無泊洛沙姆)，將培養基等分至PETG容器中並將0.25克泊洛沙姆樣品加入每個等份試樣中，製備了培養基。將培養基在150rpm攪拌至少5分鐘，以將泊洛沙姆徹底溶解在培養基中。然後將培養基在生物安全櫃(BSC)中使用0.22μmPES過濾裝置真空過濾。將培養基儲存在37℃，在24小時內使用。培養基更換和細胞培養試驗將細胞培養物樣品轉移至50mLFalcon試管中，使得每個等份試樣含有大約7.5×10E7個細胞。將細胞在830×g下離心10分鐘，形成沉澱。除去上清液，並將細胞重懸浮於含有待測泊洛沙姆樣品的培養基中，然後轉移至250mL通氣的帶擋板的搖瓶中。將搖瓶在150rpm下振蕩幾分鐘以均勻分布細胞後，使用NOVAFlex測量初始的總細胞密度(TCD)和生存力。然後將搖瓶放入培養箱中，5％CO2，80％溼度和37℃，並在300rpm下振蕩3小時。在培養1小時、2小時和3小時後進行TCD和生存力測量，並與初始TCD和生存力比較。結果將好批次的泊洛沙姆(A)和兩個差批次(B和C)的樣品加熱到大約100℃。將另外的樣品C加熱到124℃。熱處理後，在HSSF測試中測試了樣品。處理至100℃(通過RTD測量)的所有泊洛沙姆樣品沒有顯示出超過相同批次的未處理材料的改善(圖2)。然而，與未處理的C相比，熱處理至124℃的C表現出19％的最終生存力增加。此外，對於熱處理過的C，生存力的總體變化(即，最終生存力％(Vf)減去初始生存力％(V0))為-27.4％，與未處理C相比，提高21％(表2)。表2.HSSF測試中熱處理過的泊洛沙姆樣品、條件、超過未處理批次的生存力改善、和最終生存力高剪切搖瓶模型運行，使用N＝1這些結果證實，熱處理提高了泊洛沙姆在細胞培養中的性能並且給出了有效溫度和處理持續時間的初步指示。然而，這些結果表明，高於100℃的溫度在熱處理用於細胞培養的泊洛沙姆時更有效。認為溫度測量的差異(例如，用於測量泊洛沙姆溫度的溫度計類型)可能導致用於泊洛沙姆熱處理的不同有效範圍(對於更多數據和討論，參見實施例8)。實施例3：將熱處理轉移至烘箱將臺式乾燥烘箱用作可替換的加熱機制，其提供了溫度控制和可重複性。另外，真空功能允許在打開烘箱和取出熱處理的泊洛沙姆之前從烘箱中吸出由熔化泊洛沙姆釋放的煙氣。根據實施例2中所述的方法進行了烘箱實驗。烘箱中的初始實驗使用了響應曲面設計，以便使用最小所需樣品數來測試大範圍的條件(圖3)。溫度範圍為92-148℃，培養時間為10-120分鐘。差批次(C)的樣品在烘箱中在特定條件下熱處理。然後在HSSF模型中測試所得到的樣品，以確定在細胞培養性能上的提高。在烘箱中在140℃加熱60分鐘和在150℃加熱35分鐘的差性能泊洛沙姆顯示出了最終生存力的實質性提高，在HSSF測試中與陽性對照相當(圖4和表3)。表3.在烘箱中加熱的泊洛沙姆的生存力*HSSF模型一式兩份運行然而，在這些實驗中，在低於140℃和/或短於60分鐘的條件下熱處理的泊洛沙姆沒有顯示出性能提高。這些數據表明，提高泊洛沙姆性能的熱處理的最小溫度在所測試的持續時間下為大約140℃。以下，例如，在實施例5中，描述了更廣泛的溫度和加熱持續時間的測試。實施例4：烘箱熱處理DOE用於烘箱中熱處理條件的主響應曲面圖表明了在測試條件下有效熱處理的最小溫度為大約140℃。根據實施例2的方法，在烘箱中進行了全實驗設計(DOE)，通過升至非常高的溫度和長培養時間，以確定工作範圍。測試的最大溫度為185℃，針對每個溫度測試的最大培養時間為120分鐘。處理了差批次的泊洛沙姆(G)並在六個樣品區塊中測試，所述區塊使用拉丁方設計分區。總共，處理了三個樣品區塊和另外六個感興趣條件的樣品(表4)。然後在HSSF測試中測試了這些樣品，來測定細胞培養性能。表4.在烘箱中在全DOE中評價的熱處理條件。溫度範圍為110-185℃；持續時間為1-120分鐘。帶字母標記的框(對應於表5中的區塊)指示測試的處理條件(如表5中所列)。DOE原始數據顯示於表5中。作圖在等值線圖(contourplot)上時，全DOE結果說明，提高泊洛沙姆性能的熱處理條件的大工作範圍(圖5)。表5：來自全DOE實驗的原始數據在155℃或高於155℃熱處理的樣品在所有孵育時間都導致了細胞培養性能的顯著提高。在HSSF測試中，這些樣品在3hr後具有小於10％的生存力變化。在140℃，在孵育時間達到30分鐘或更長時間前，熱處理是無效的。另外，在孵育樣品2小時之前，測試的最低溫度(125℃和110℃)是無效的。實施例5：熱處理的可靠性和再現性為了證明圖5中舉例說明的熱處理設計間隔的再現性和可靠性，根據實施例2中所述的方法，使用另外批次的泊洛沙姆，重複了全DOE的關鍵處理條件。這些條件中的兩個以一式兩份重複，以解決再現性。選定的條件落入工作範圍內或落在工作範圍的邊緣。總共，處理了三個差批次(包括G，其之前用於DOE)(表6)。為了確保熱處理對好批次進行時不會是有害的，還處理了一個好批次(E)。表6.在四個泊洛沙姆批次上測試的關鍵熱處理條件的重複次數重複的處理條件的HSSF測試結果與來自初始DOE的結果高度相當(表7和8)；然而，在差批次上存在最佳熱處理條件的可觀察的變異性(圖6)。表7.在四批泊洛沙姆上HSSF測試中測試的熱處理條件的最終細胞生存力：E(好批次)、F(差批次)、H(差批次)和G(全DOE實驗中使用的差批次)。表8.在四個不同泊洛沙姆批次上測試的熱處理條件在HSSF測試中的細胞生存力變化(Vf(處理過的)-Vf(未處理的))：E(好批次)、F(差批次)、H(差批次)和G(全DOE實驗中使用的差批次)。高剪切搖瓶模型運行，使用N＝1批次G和F，在155℃處理1min或在140℃處理1分鐘時，顯示了細胞培養性能的顯著提高。然而，批次H在使用140℃處理1分鐘時沒有顯示出改善，並且在使用155℃處理1min時僅有微小(20％)(圖8，表9)。這些結果證明，泊洛沙姆熱處理過程中可不需要外部氧暴露來產生改善的泊洛沙姆。實施例8：使用RTDvs.Wire熱電偶的溫度測量之前的數據支持80-100℃的溫度範圍用於熱處理過程。然而，全DOE(例如，如圖5中所示)支持140℃或高於140℃的操作範圍。進行了實驗來檢測用於測量熱處理過程中泊洛沙姆溫度的兩種不同溫度計。實施例1中描述的實驗使用了RTD，而wire熱電偶用於所有烘箱實驗中。使用的RTD需要4」的沒入深度用於準確溫度測量。相反，wire熱電偶設計成在其尖端精確測量溫度，使其可以在只插入幾毫米泊洛沙姆時準確測量溫度。在根據實施例2中的方法在熱板上熱處理泊洛沙姆時進行了並排比較。wire熱電偶給出了152.6℃的溫度讀數，而RTD溫度計給出了81.65℃的讀數。因此，與熱電偶相比時，RTD顯示出明顯低測量的溫度(>70℃)。這些結果說明，不同的泊洛沙姆溫度讀數是造成足夠用於產生改善的泊洛沙姆的有效溫度範圍上差異的原因。實施例9：烘箱中加熱升溫和冷卻速率的表徵泊洛沙姆樣品，一旦放在烘箱中，不會立即達到目標溫度。根據實施例2中的方法，在烘箱中評價了DOE中使用的三個溫度的加熱和冷卻曲線。樣品平均花費18分鐘在烘箱中達到目標溫度(+/-3℃)，具有5.8分鐘的標準偏差(圖9)。儘管加熱時間的變異性，冷卻速率相對相似。樣品達到泊洛沙姆的熔化溫度(～40℃)的平均時間為7分鐘，0.8分鐘的標準偏差。假定冷卻曲線在很大程度上是線性的，加熱到170℃，155℃和140℃的樣品的冷卻速率大約分別為-19℃/min，-19.5℃/min和-18℃/min。實施例10：變異性的統計學顯著性和泊洛沙姆熱處理使用了student’st-檢驗來確定HSSF測試中泊洛沙姆對照批次性能之間的差異和觀察到的細胞培養性能提高的顯著性。將來自烘箱DOE的所有HSSF對照結果包括在數據集中。對於熱處理過的樣品，只有在工作範圍內的樣品用於計算熱處理後的細胞生存力的平均變化。工作範圍定義為在HSSF測試中生存力變化低於15％時的條件。使用student’st-檢驗比較了處理過的和未處理的泊洛沙姆(α＝0.05)來確定平均值的統計學顯著性差異。另外，將處理過的材料的結果與陽性對照(D)結果進行比較。表10：測試批次的處理過的和未處理過的泊洛沙姆材料在HSSF測試中的平均Δ生存力(Vf(處理過的)-Vf(未處理的))使用0.05的α水平，未處理的差批次泊洛沙姆和陽性對照批次(D)之間的平均值比較顯示了顯著差異(表10)。熱處理後，所有批次的性能顯著好於陽性對照批次，除了H(其是相當的)。批次E(好批次)具有>0.05的p值，表明其性能與陽性對照批次相比沒有顯著不同。然而，來自批次E的熱處理過的泊洛沙姆在HSSF測試中具有顯著好於陽性對照的性能(p值＝0.0005)，證明熱處理過程改善了已經可接受的批次。這些結果舉例說明於圖10中，其展示了，與整體陽性對照數據集相比，每個批次的處理過和未處理的結果。例如，圖10舉例說明了，對於差批次G，未處理的G、陽性對照好批次D和熱處理過的G均是統計學上可區分的，其中與陽性對照好批次(D)或未處理的G差批次相比，熱處理過的G批次顯示出顯著提高的生存力。基於這種分析，熱處理過程被認為成功的例子顯示出了超過未處理材料的18％提高。此外，處理過的材料至少整體上與這些實驗中使用的陽性對照批次具有一樣好的性能。在用於細胞培養基之前熱處理差批次的泊洛沙姆是提高其細胞保護性能的有效方法。熱處理在寬的溫度和持續時間的範圍中是有效的；然而，溫度越低，需要的處理時間越長。該方法是可靠的，在幾個泊洛沙姆批次上顯示相似的結果，並且是可再現的。儘管本文呈現的結果來自在烘箱中進行的實驗，但該方法可以轉移至更大規模的設備。本文中所述的熱處理方法可以轉化為可以確保泊洛沙姆在所需溫度下連續加熱所需持續時間的任何處理方法。實施例11：DOE測試數據的統計學分析以上所述的實施例證明了泊洛沙姆熱處理對隨後細胞培養中性能(例如，細胞生存力)的影響。接著，進行分析以產生轉移函數(transferfunction)，其是輸出結果(搖瓶模型中3hr時的生存力)作為兩個因變量(溫度和時間)的函數的數學模型。通過響應曲面回歸方法，在Minitab中分析了隨著作為變量的溫度和時間的變化在烘箱中收集的DOE測試數據(描述於表12中)。每個DOE測試設計，將已知的差批次泊洛沙姆(G)進行熱處理，並在高剪切搖瓶模型中進行了測試(用作剪切保護劑功能性的替代)。在3小時測試結束時，生存力越高，表明泊洛沙姆性能越好。相似地，在未處理樣品(陰性對照)和已經處理來提高性能的相同批次泊洛沙姆之間進行了評價。為了說明在性能差的批次中觀察到的批內變異性，將六個G對照的平均最終生存力用作基線來計算針對每個測試情況觀察到的生存力提高的百分比。3小時時的生存力(％)和處理過的與未處理批次的差異(％)是響應變量。結果表明，如通過生存力的提高所測量的，該性能差的批次的品質可以被提高。在多種溫度和時間處理下可以實現生存力陽性變化(處理過的批次-未處理批次)的期望生存力目標。進行了在3hr時生存力變化(處理過的批次-未處理的批次)的分析。由於在脅迫條件下研究的性能差的批次之一(G)的平均最終生存力被發現為79.7+/-5.0％，將10％或20％的生存力增加作為目標用於等值線圖和用於建立在指定溫度下熱處理的最小持續時間。還應當注意到，在另一個差性能者(C)的情況中，對於未處理的對照，可預期低於針對G觀察到的更低生存力(44.8+/-7.8％)。因此，在針對批次G獲得了20％提升的條件下，對於C可以預期>35％的生存力提高。這些結果表明，存在溫度和時間的線性作用，溫度和時間的相互作用。模型中這些項在95％置信水平下以P-值＜0.05是統計學顯著的。在模型中鑑定最佳操作範圍和因素是出乎預料的和新的發現。表12.批次G熱處理的數據集HSSF模型一式兩份運行對於分析軟體，使用了Minitab版本17.1(Minitab.com，StateCollegePA)。分析為回歸分析(RSRegress)。使用響應曲面回歸來分析相對時間(min)和溫度(℃)的生存力提高(超過未處理的批次)。在以下表13-15中提供了方差分析、模型總結和編碼的係數(codedcoefficients)。表13.方差分析表14.模型總結SR-sqR-sq(adj)R-sq(pred)7.9373648.58％39.40％8.41％表15.編碼的係數基於這些結果，回歸等式(以未編碼的單位)確定為：生存力提高(超過未處理的批次),％＝-113.5+0.486*(時間,min)+1.238*(溫度，C)+0.00047*(時間，min)2-0.00286*(溫度，C)2-0.00333*(時間，min)*(溫度，C)以上顯示的轉移函數可以預測作為熱處理溫度和持續時間的函數的批次G超過未處理對照的生存力提高。其還含有涉及溫度和時間及其相互作用的二階項(secondorderterms)。使用以上的模型，可以獲得針對測試情況的預期生存力(不是按照經驗產生的)。以下針對157℃和1分鐘的測試條件，顯示了樣品輸出預測。生存力提高＝-113.5+(0.486*1)+(1.238*157)+0.00047*1^2)-(0.00286*157^2)-(0.00333*1*157)＝10.3％使用實驗數據來產生圖11中所示的等值線圖(經驗數據顯示在黑色圓中)。基於通過回歸產生的該模型，可以計算推斷5個點。首先，處理響應可以分為三個溫度區(157℃-185℃)、(134℃-157℃)和(60℃-134℃)。其次，在157-185℃的高溫區中，熱處理過的批次的生存力可以在一分鐘的最小熱處理中提高1至20％。第三，在134℃-157℃的中溫區中，熱處理過的批次的生存力可以在1分鐘的最小熱處理持續時間中提高1至10％。使用120分鐘的最小熱處理持續時間，生存力可以增加高達20％。第四，在60℃-134℃的低溫區中，熱處理過的批次的生存力可以在140分鐘的熱處理持續時間中提高多達10％。在164分鐘的最小熱處理持續時間中可以增加高達20％。注意，針對中溫區和低溫區描述的持續時間是簡化的指南。例如，如圖11中所示，低溫區內60℃，80℃，120℃的溫度分別需要164分鐘，147分鐘和115分鐘來實現至少10％的生存力提高。示例性數值描述於以下的表16中。表16.示例性溫度、時間和相應的生存力提高第五，以上所列的模型源自用批次G產生的數據。由於未處理的對照具有79％的較高基線生存力，因此生存力提高可以實現至最大20％。然而，對於如C這樣的批次，其中未處理的批次具有45％的低得多的生存力，則可以實現更高水平的提高。例如，在134℃-157℃的中溫區，對於批次C，生存力可以在15分鐘的熱處理持續時間中提高42％。觀察到的批次C和G之間的性能差異總結於以下的表17中。表17.C和G性能的總結因此，在如C這樣的批次中，熱處理值更明顯。由於缺乏原材料來運行整套實驗，因此不能執行這個批次的完整數據集。G是臨界差性能的批次，以上預測的模型可能被認為保守。使用批次C和G產生的數據證明，熱處理泊洛沙姆可以提高本文中未測試的其他泊洛沙姆批次的性能。如上所述，這種性能的提高受時間和溫度的影響。以上所述的結果證明，提高溫度可以縮短改善泊洛沙姆性能所需的熱處理持續時間，而較低的溫度可以用於在較長持續時間提高泊洛沙姆性能。不希望受縛於理論，認為熱處理時觀察到的生存力提高的精確百分比將取決於針對熱處理前特定泊洛沙姆批次所觀察到的基線生存力。當前第1頁1 2 3