一種製備B區缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法與流程

2023-12-01 15:45:31 1

本發明屬於生物製藥領域，涉及人凝血因子ⅷ重鏈fⅷh和輕鏈fⅷl表達載體的構建、哺乳動物細胞的轉染、fⅷh和fⅷl高效表達細胞株的篩選和鑑定、b區缺失的成熟人凝血因子ⅷ的製備、活性檢定及在藥學上的應用。

背景技術：

血友病是一類由於缺乏某種凝血因子從而致使患者發生凝血功能障礙的疾病，臨床上分為三個類型：血友病a、血友病b以及凝血因子xi缺乏症。其中血友病a多見，大概佔總數的80％。該類疾病是由於血液中的凝血因子ⅷ缺乏從而致使患者發生嚴重凝血障礙，是x染色體連鎖的隱性遺傳性疾病。

凝血因子ⅷ基因在x染色體xq28處，其基因全長為186kb，該編碼序列為當時已知的最大的基因。成熟fⅷ蛋白由三種結構域組成。a結構域：含有三個片段，在氨基端出現兩次，為a1、a2，在羧基端出現一次，為a3。每個a片段均約由330個胺基酸組成，有30％的同源性，與血漿銅藍蛋白同源性頗高。b結構域：只有一個中間片段，約由980個胺基酸組成，是高度糖基化的區域，對fⅷ的合成與分泌、蛋白清除具有重要意義，但其在fⅷ的活化過程被完全清除。c結構域：含有兩個片段，在羧基端出現兩次，為c1、c2，每個c結構域由約150個胺基酸組成。其排列順序是a1-a2-b-a3-c1-c2，其中a1-a2-b構成凝血因子ⅷ的重鏈(fⅷh)，a3-c1-c2構成凝血因子ⅷ的輕鏈(fⅷl)。

自1984年成功克隆fⅷ的cdna以來，人fⅷ的重組表達就成為研究的熱點。1989年第一次報導使用重組人全長fⅷ(rhfⅷ)製劑成功的治療了一位嚴重型a血友病患者的事例。1992年fda正式批准第一代野生型全長rhfⅷ應用於血友病a的治療。2000年拜耳公司研製的新型rhfⅷ藥物——拜科奇得到fda和emea的批准可用於治療血友病a。直到2007年sfda才批准該藥物能在我國上市，成為國內第一個上市的rhfⅷ產品。但第一代野生型全長rhfⅷ製劑中仍然含有大量血漿來源蛋白質，因而其穩定性、活性及成本等方面不能滿足市場的需要。這促使科研工作者努力開發新一代的重組fⅷ製品。

fⅷ的b結構域約佔完整分子的40％，該區域的功能還未徹底研究清楚。但自從發現重組表達b結構域缺失的bdd-rfⅷ(b-domaindeletedrecombinantfactorⅷ，bdd-rfⅷ)由於mrna長度減少，其轉錄活性提高了17倍，蛋白表達量和活性明顯高於全長rhfⅷ，且研究表明b結構域缺失不影響體內或體外的促凝活性，因此b結構域缺失的rfⅷ成為新一代rhfⅷ的重點研究方向。本發明提供了一種製備b區缺失的成熟人凝血因子ⅷ的方法。

技術實現要素：

本發明的目的是提供兩種分別克隆有rhfⅷh和rhfⅷl基因的載體，利用該載體在哺乳動物細胞系cho-kⅰsv中高效表達rhfⅷh和rhfⅷl蛋白；提供了一種製備b區缺失的成熟人凝血因子ⅷ的方法及其藥學應用。

在第一方面，本發明提供了一種獲得高效表達rhfⅷh和rhfⅷl的表達載體的方法。

首先，通過對cho細胞密碼子偏愛性的分析，發現fⅷh和fⅷl基因中胺基酸密碼子的偏愛性與cho細胞有較大差異，為了提高基因的表達效率，將fⅷh和fⅷl基因中的胺基酸密碼子改造為cho細胞高偏愛性密碼子，通過人工合成的方法獲得fⅷh和fⅷl基因。fⅷh(不包含b結構域)基因2220bp(位於fⅷ基因229-2448bp)，fⅷl基因2052bp(位於fⅷ基因5173-7224bp)。

將測序正確的fⅷh和fⅷl依次克隆至真核表達pklight載體、ires-egfp載體和pee12.4載體中，然後利用脂質體轉染法將重組的真核表達載體轉入cho-kⅰsv細胞，以綠色螢光蛋白(egfp)作為報告基因，通過穀氨醯胺合成酶(gs)加壓和流式細胞儀篩選得到分別穩定表達rhfⅷh和rhfⅷl蛋白的cho-kⅰsv細胞系。

在構建真核表達載體過程中，本發明利用了pklight載體中igkappaleader作為信號肽提高目的蛋白的分泌效率，通過ires引入egfp使目的蛋白和egpf同時表達，在進行穀氨醯胺合成酶(gs)加壓篩選的同時利用egfp進行流式細胞儀篩選。

本文中所用的術語「蛋白」、「蛋白質」、「多肽」具有相同的含義。本文中「rhfⅷh」和「rhfⅷl」與「人fⅷh」和「人fⅷl」可以互相替換使用。當用基因工程手段表達本發明的蛋白時，根據生產中所使用的宿主細胞不同，如：酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、哺乳動物乳腺反應器等，本發明的蛋白的糖基化形式可以是不一致或不均一的。

本發明中使用的載體包括但不限於：在哺乳動物細胞中表達的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。在一優選實施方式中，所表達載體為哺乳動物細胞表達載體。

在第二個方面，本發明提供了兩種宿主細胞，其特徵在於，所述細胞含有本發明第一方面所述的載體，或者所述細胞已經用本發明第一個方面所述的核酸分子轉化或轉染。同時宿主細胞可以是植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉染含本發明所述編碼蛋白的基因序列後，即構成工程化細胞或細胞株，可用於生產所需rhfⅷh蛋白和rhfⅷl蛋白。本領域技術人員能夠恰當地選擇適當的載體、宿主細胞，並熟知如何能將載體高效地轉染入宿主細胞中，所用方法包括但不限於：脂質體包裹、磷酸鈣共沉澱、電融合法以及顯微注射法等。在一個優選實例中，採用了脂質體轉染法。

在第三個方面，本發明提供了一種製備b區缺失的fⅷ因子的製備方法，其包括以下步驟：用本發明第二方面獲得的兩株工程細胞，通過無血清懸浮馴化培養的方法來表達所需要的rhfⅷh蛋白和rhfⅷl蛋白。分離純化方法包括但不限於：離心、中空纖維膜過濾、分子篩、離子交換色譜、吸附色譜、反向色譜、毛細管電泳等，這些本領域技術人員熟知的方法。而後將兩種蛋白混合使二者終摩爾濃度相同。

在第四方面，本發明提供了一種製備b區缺失的fⅷ因子的藥物應用，如將本發明製備的蛋白質藥物應用於fⅷ因子缺乏的甲型血友病的治療或利用該發明的藥物在糾正和預防出血以及急診手術中起到暫時代替缺失的fⅷ因子的作用。

本發明中的附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求所界定的本發明範圍。

本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。

為了便於理解，以下通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。

附圖說明

圖1：重組質粒pee12.4-rhfⅷh示意圖

圖2：重組質粒pee12.4-rhfⅷl示意圖

圖3：重組質粒pee12.4-rhfⅷh酶切及pcr鑑定電泳圖

圖4：重組質粒pee12.4-rhfⅷl酶切及pcr鑑定電泳圖

圖5：cho-kⅰsv細胞分別轉染重組質粒pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl後螢光顯微鏡觀察egpf表達情況

圖6：重組質粒轉染後cho-kⅰsv細胞經流式細胞儀分選情況

圖7：rt-pcr檢測陽性細胞中rhfⅷh和rhfⅷl基因的轉錄情況

圖8：western-blot檢測重組蛋白rhfⅷh和rhfⅷl

圖9：rhfⅷ標準曲線

具體實施方式

以下所述實驗方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實驗指南》(2002年，科學出版社)所述方法進行。

實例一：目的基因的合成

fⅷh和fⅷl基因的人工合成。

通過對cho細胞密碼子偏愛性的分析，發現fⅷh和fⅷl基因中胺基酸密碼子的偏愛性與cho細胞有較大差異，為了提高基因的表達效率，將fⅷh和fⅷl基因中的胺基酸密碼子改造為cho細胞高偏愛性密碼子，委託上海立菲生物技術有限公司(lifetechnologies)通過人工合成的方法獲得fⅷh和fⅷl基因。fⅷh(不包含b結構域)基因2220bp(fⅷ基因229-2448bp)，fⅷl基因2052bp(fⅷ基因5173-7224bp)。同時在兩個基因的上遊和下遊分別引入bamhi位點和nhei位點。

實例二：表達載體pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl的構建

(1)igkappaleader信號肽的引入。

利用限制性內切酶bamhi、nhei將rhfⅷh和rhfⅷl兩個基因分別定向克隆到pklight表達載體的iggkappa-chainleader信號肽下遊。目的是在兩個基因n端引入60bp的iggkappa-chainleader信號肽，保證rhfⅷh和rhfⅷl基因表達的蛋白可以高效率的分泌到培養基中。

(2)報告基因的引入。

為了便於利用流式細胞儀對轉染細胞進行篩選，在表達載體中引入報告基因egfp，利用內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite,ires)實現目的基因rhfⅷh和rhfⅷl的共表達。

(3)表達載體pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl的構建。

將pklight-rhfⅷh和pklight-rhfⅷl重組質粒進行hindiii和nhei雙酶切得到kappaleader-rhfⅷh和kappaleader-rhfⅷl片段。用nhei和ecori將ires-egfp質粒進行雙酶切得到ires-egfp片段。用hindiii和ecori將真核表達載體pee12.4進行雙酶切，得到線性化的pee12.4。將上述三種片段進行連接反應。構建得到pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl載體(如圖1、圖2)。

連接反應體系(10μl)如下：

共10.0μl體系，混合均勻後，16℃水浴連接過夜。

將上述連接產物分別全部轉化e.colidh5α感受態菌並設置對照組。隨機挑取若干單克隆，接種到含有100μg/mlamp+的25mllb液體培養基中，37℃震蕩培養10-14h，收集菌體進行質粒的提取。

(4)表達載體pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl的鑑定。

取疑似陽性重組質粒pee12.4-rhfⅷh用酶hindiii和ecori進行雙酶切鑑定。同時利用引物hf1和hr1對重組質粒進行pcr鑑定並將擴增片段送由博仕公司進行測序。

如圖1可見，用酶hindiii和ecori進行雙酶切，由於在ires-egfp的230bp處有一個hindiii酶切位點，因此可獲得三個片段。其中2513bp的片段(含有kappaleader-rhfⅷh-部分ires-egfp)、1070bp左右的部分ires-egfp片段以及pee12.4載體大片段。以hf1和hr1為引物，重組質粒pee12.4-rhfⅷh為模板進行pcr鑑定，在約2220bp處有一條目的帶，與預期插入片段rhfⅷh片段大小相符，結果如圖3。測序結果表明rhfⅷh基因序列正確無鹼基突變。確認陽性重組質粒pee12.4-rhfⅷh構建成功。

hf1引物序列：gccaccagaagata

hr1引物序列：tctaggctcgatgg

取疑似陽性重組質粒pee12.4-rhfⅷl用酶hindiii和ecori進行雙酶切鑑定。同時利用引物lf1和lr1對重組質粒進行pcr鑑定並將擴增片段送由博仕公司進行測序。

如圖2可見，pee12.4-fⅷl使用限制性內切酶hindiii、ecori進行雙酶切，由於在rhfⅷl中1989bp處含有一個ecori酶切位點，在ires-egfp的230bp處有一個hindiii酶切位點，因此可獲得四個片段。其中2049bp的片段(含有kappaleader和1989bp的rhfⅷl)、296bp左右片段(66bp的rhfⅷl和230bpires-egfp片段)、1070bp的ires-egfp片段和pee12.4載體大片段。以lf1和lr1為引物，重組質粒pee12.4-rhfⅷl為模板進行pcr鑑定，在約2052bp處有一條目的帶，與預期插入片段rhfⅷl片段大小相符，結果如圖4。確認陽性重組質粒pee12.4-rhfⅷl構建成功。

lf1引物序列：gagatcacccgcac

lr1引物序列:gtacaggtcctggg

實例三：cho-rhfⅷh和cho-rhfⅷl穩定細胞系的構建

(1)去內毒素的重組質粒的提取及其濃度的測定

將含有pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl重組質粒的dh5α陽性菌液接種於20ml含有amp+的lb培養基中，37℃培養8-10h以活化陽性菌，將活化的菌液以1/100比例無菌接種於400mllb/amp+培養基中，37℃培養12-14h。將活化的菌液按照tangen去內毒素大提質粒試劑盒說明書進行大提質粒，具體操作步驟如下：

取50ml菌液進行收菌，3500rpm10min後，棄掉上清。向bd管中加入10ml的solutioni，吹懸細胞沉澱。向上述懸液加入solutionii10ml，輕柔顛倒混勻以保證完全裂解菌體。加入5ml冰浴的buffern3，輕柔顛倒混勻，看到白色沉澱出現時停止。平衡柱子，將上述裂解液加入到針管過濾器中，推動活塞，讓裂解液過濾到柱子中。加入1/10體積的預冷的etr，輕柔顛倒混勻後，溶液出現渾濁現象。42℃水浴槽內放置5min後，離心5min，溶液出現藍色分層。將上清至50ml離心管中，加入1/2體積的無水乙醇並輕柔顛倒混勻。將上述混合液轉移到新的平衡過的柱子中，進行上柱，4000rpm，離心5min，重複上柱一次。在柱子中加入10mlhbbuffer，4000rpm，離心5min以除去蛋白質。加入15mldnawashbuffer，4000rpm，離心5min進行脫鹽，重複此步驟1次。將吸附柱置於新的ep管中，在膜中間緩慢加入適量的70℃預熱過的ddh2o。室溫放置5min後，10000rpm，3min，收集dna溶液。用核酸分析儀對質粒的濃度和純度進行測定，濃度大於800ng/μl的去內毒素質粒用於後實驗並於-20℃保存備用。

(2)細胞培養

本實驗所用的cho-kⅰsv細胞培養基為10％fbsdmem、hepes溶液2.5ml、l-穀氨醯胺4ml、gs8ml、ht1ml、氨苄青黴素100u/ml、鏈黴素100g/ml。

①細胞復甦：取出凍存於液氮中的細胞，迅速置於37℃水浴鍋中使其快速融化，將懸液800rpm/min離心4min。棄掉上清凍存液，用5ml完全培養基將細胞沉澱懸浮，復甦的細胞置於5％co2，37℃培養箱中培養。

②細胞傳代：待細胞長至對數生長期，棄去舊的培養液。pbs衝洗細胞一次，加入0.25％胰蛋白酶37℃消化2min，鏡下觀察細胞回縮變圓時，立刻加入含有fbs的完全培養基終止消化，用移液管充分吹打細胞，將細胞分散成為單細胞懸液，並按1:4的比例傳代培養。

③細胞凍存：待細胞長至對數生長期，收集舊的培養液。pbs衝洗細胞一次，加入0.25％胰蛋白酶37℃孵育細胞2min，鏡下觀察細胞收縮變圓時，加入收集舊的培養液終止消化。用移液管將細胞吹散後，將吹勻的細胞懸液800rpm/min離心4min。棄掉上清培養基，用凍存液將細胞沉澱懸浮稀釋至濃度106個/l，將細胞懸液置於凍存管內，按照慢凍快融的原則，先將凍存管置於-80℃冰箱中的專用凍存盒過夜後，次日置於液氮中長期凍存。

(3)pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl重組質粒轉染cho-kⅰsv細胞

取生長狀況良好的cho-kⅰsv細胞，用胰酶消化後，將細胞懸液以每孔3×105個細胞接種至6孔板，於5％co2，37℃培養箱中培養至90％融合度時，用脂質體轉染試劑將pee12.4-rhfⅷh和pee12.4-rhfⅷl重組質粒導入cho-kⅰsv細胞，連續轉染兩次，轉染方法按照轉染試劑盒說明書進行，具體操作步驟如下(以六孔板的一個孔說明)：

在一個ep管中取240μl無血清培養基opti-mem，加入10μl脂質體，室溫靜置5min後得到a液。同時，在另一ep管中加入適量opti-mem培養基，再加入4μg去內毒素的重組質粒，用opti-mem培養基補足250μl，靜置5min後得到b液。將這兩個ep管室溫靜置5min後，由於脂質體比較脆弱，將a液緩慢加入含有脂質體的b液中相互混合，繼續室溫孵育25min。將6孔板的細胞用pbs清洗兩次，緩慢加入上述ab液混合培養基轉染細胞。轉染6h後為了提高轉染效率按上述轉染方法再轉染一次。12h後更換為2ml新鮮無抗生素的完全培養基在37℃、5％co2、飽和溼度的條件下培養。轉染48h後，螢光顯微鏡下觀察egfp的表達情況，視野中轉染成功細胞為帶綠色螢光的細胞，結果如圖5。

(4)陽性細胞的篩選

將轉染的細胞復甦培養48h後，將6孔板中的細胞更換成加壓篩選培養基進行加壓篩選。加壓1月，未轉入重組表達質粒的細胞逐漸死亡，只有轉入目的質粒並且整合到細胞基因組中的細胞才能夠存活，待存活的轉染進載體的細胞擴增完全後，pbs洗滌細胞1次，用胰蛋白酶消化，接種到t25㎝2的培養瓶中，在依次接種到t75㎝2的培養瓶中。待存活細胞密度為1×107個/ml後收集細胞，pbs洗滌細胞沉澱1次，再用pbs重懸細胞沉澱，以空白細胞作為陰性對照，進行流式細胞儀無菌分選。p1門設為待篩選的cho空細胞，p2門設為表達egfp的陽性細胞。分選速度為每秒2000個細胞左右。將陽性細胞全部回收到6孔板中，回收純度95％，此次回收的細胞為第一輪陽性細胞篩選。待一篩的陽性細胞長至1×107個/ml後收集細胞再次進行流式細胞儀無菌篩選，檢測峰越靠右邊，代表其螢光強度越強，此次篩選時，儘量分選p2門最右側的細胞(右側峰尾後1％細胞)，即表達量高的細胞。為了獲得穩定表達外源基因的的陽性細胞，再進行陽性細胞第三輪篩選。如圖6所示，經過三個輪次的篩選，陽性細胞的比例逐漸上升。經過第三輪篩選後，cho-rhfⅷh細胞的陽性率為90％，cho-rhfⅷl細胞的陽性率為85％。

(5)陽性細胞cho-rhfⅷh和cho-rhfⅷl的rt-pcr鑑定

將第三輪流式細胞儀篩選後收集的陽性細胞cho-fⅷh和cho-fⅷl提取細胞總rna，用rt-pcr方法分別檢測細胞中fⅷh和fⅷl基因的轉錄水平並測序鑑定。以cho-kⅰsv空細胞、cho-fⅷh細胞cdna為模板，hf2/hr2為引物擴增部分fⅷh基因(620bp)；cho-fⅷh細胞cdna為模板，lf2/lr2為引物擴增部分fⅷl基因(622bp)，pcr反應(20μl體系)如下：

共20.0μl，混合均勻後進行pcr擴增。pcr循環參數：95℃預變性10min，95℃1min，58℃1min，72℃1min，經10個循環後，72℃再延伸10min。結果表明cho-fⅷh陽性細胞和cho-fⅷl陽性細胞中分別有fⅷh和fⅷl基因的轉錄，如圖7所示。

引物hf1序列：gccaccagaagata

引物hr2序列：ctcttgccctcgtcaaa

引物lf1序列：gagatcacccgcac

引物lr2序列：gcagagggccgatcagg

實例四：重組蛋白rhfⅷh和rhfⅷl的鑑定

(1)重組蛋白rhfⅷh和rhfⅷl的westernblot檢測

在igkappaleader信號肽的引導下，重組蛋白rhfⅷh(約90kda)和rhfⅷl(約79kda)分泌表達於cho-kⅰsv細胞株培養基上清。

將cho-kⅰsv空細胞、cho-rhfⅷh細胞和cho-rhfⅷl細胞分別接種至六孔板中，待細胞融合率達80％時，用pbs洗滌細胞一次，將完全培養基更換為無血清培養基，培養72h後，1000rpm離心3min，收集細胞上清進行sds-page電泳分離。採用溼轉法(恆流，230ma，110min)將凝膠上的蛋白轉移至nc膜上。將nc膜置於5％的脫脂牛奶室溫封閉2h後，分別用1:500稀釋的兔抗人fⅷh抗體和fⅷl抗體(santacruz公司)4℃輕搖孵育過夜，pbs洗膜3次，10min/次。再用羊抗兔hrp-二抗37℃孵育1h，pbs洗膜3次，10min/次。用supersignalwestfemtomaximumsensitivitysubstrate檢測試劑檢測反應信號。

cho-rhfⅷh細胞培養基上清westernblot分析結果可見分子量90kda的fⅷh蛋白條帶，cho-kⅰsv空細胞未見條帶。cho-rhfⅷl細胞培養基上清westernblot分析結果可見分子量79kda的rhfⅷl蛋白條帶，cho-kⅰsv空細胞未見條帶，結果如圖8。

(2)重組蛋白rhfⅷh和rhfⅷl的elisa檢測

在酶標板中分別設兩個空白孔、十個標準孔和所需樣品孔。標準孔中加入用標準品稀釋液稀釋的各個稀釋度的標準品，其稀釋濃度分別為120ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml，每孔50μl，並設復孔。樣品孔中分別加入50μl用樣品稀釋液稀釋5倍的樣品。用封板膜將酶標板封閉後置於37℃反應30min。棄掉板中的液體，並拍幹。滿孔加入洗滌液用震蕩器震蕩1min，棄去洗滌液，拍幹，重複4次。利用0.5％的明膠溶液進行4℃過夜封閉。在標準孔、待測樣品孔中分別加入50μl生物素標記的抗fviii-ag抗體37℃反應45min，洗滌後，加入hrp-親和鏈酶素，37℃避光反應30min。洗滌後，在空白孔、標準孔、待測樣品孔中每孔先加入50μl顯色劑a液，再依次加入50μl顯色劑b液，37℃反應避光顯色15min後，每孔加入50μl終止液以終止反應。空白孔調零，用酶標儀檢測各孔在450nm波長的od值。

按照凝血因子ⅷelisa檢測試劑盒的要求將測定od值輸入curveexpert1.4軟體，得到fⅷ標準曲線。如圖9所示。

有理函數：y＝(a*b+c*x^d)/(b+x^d)

係數值：

a＝-0.082466529

b＝2.0134437

c＝306.50856

d＝0.9180831

將樣品od值代入，得到cho-rhfⅷh細胞表達上清中rhfⅷh蛋白含量約為0.9mg/ml，cho-rhfⅷl細胞表達上清中rhfⅷl蛋白含量約為0.8mg/ml。

實例五：重組蛋白rhfⅷh和rhfⅷl促凝活性檢測

(1)檢測原理

rhfⅷ：c檢測採用一期法，以只缺乏fⅷ:c而其他條件都正常的血漿為基質血漿、鞣花酸為活化劑，在ca2+存在的條件下，受檢血漿出現凝固塊所用時間與其fⅷ:c水平相關。測定各個稀釋度的正常凝血質控血漿的凝固時間，繪製標準曲線，同時測定受檢細胞培養上清的凝固時間，由此算出受檢細胞上清中所含的rhfⅷ佔正常人血漿的百分比，即為hfⅷ的活性。

(2)檢測細胞上清中rhfⅷ：c水平

①標準曲線製作：將正常凝血質控血漿用稀釋液進行1/5、1/10、1/20等稀釋，其對應的fvⅲ：c百分活性為200％、100％、50％等。取某一稀釋度的正常凝血質控血漿100μl、凝血因子fⅷ缺乏基質血漿100μl、aptt試劑100μl置於透明試管內，混合均勻後，置於37℃水浴鍋孵育5min。迅速加入cacl2溶液100μl混勻，並啟動秒表計時，當血液出現凝固時，停止計時，並記錄凝固時間。以不同稀釋度的正常凝血質控血漿fvⅲ：c百分活性為x，對應的凝固時間為y，繪製標準曲線。

按照凝血因子ⅷ促凝活性檢測試劑盒的要求，測定正常凝血質控血漿不同稀釋倍數的促凝時間。如表一所示。

表一不同稀釋度的正常凝血質控血漿的凝固時間

根據不同稀釋度的正常凝血質控血漿的凝固時間和相對比活求得直線回歸方程為:

y＝－2.86lnx+25.158

②樣品測定：參照elisa結果，將rhfⅷh和rhfⅷl等質量混合，使其混合後的終濃度為(0.5mg/ml)在相同條件下測定細胞表達上清的促凝時間，將其凝固時間代入標準曲線方程，得出x值，即樣品fⅷ：c百分活性。

在相同條件下測得分泌至細胞培養液中的hfⅷ促凝時間為11s，根據回歸方程計算樣品的促凝活性。同時以cho-kⅰsv空細胞的培養上清作陰性對照。結果顯示cho-kⅰsv空細胞的培養上清沒有促凝活性，陽性細胞表達上清中的fⅷ：c相當於正常血液中fⅷ的1410％，即其活性效價為14.1u/ml。

東北農業大學

一種製備b區缺失的成熟人凝血因子ⅷ的方法

2

patentin3.5.1

1

2220

dna

人工序列

1

gccaccagaagatactacctgggcgccgtggagctgtcctgggactacatgcagagcgac60

ctgggcgagctgcctgtggacgccagatttcctcctagagtgcctaagtcctttcctttc120

aacacctccgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcaccgaccacctgttcaac180

atcgccaagcctagacctccttggatgggcctgctgggccctaccatccaggccgaggtg240

tacgacaccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctcccaccctgtgagcctgcacgcc300

gtgggcgtgtcctactggaaggcctccgagggcgccgagtacgacgaccagaccagccag360

agagagaaggaggacgacaaggtgttccctggcggcagccacacctacgtgtggcaggtg420

ctgaaggagaacggccctatggcctccgaccctctgtgcctgacctactcctacctgtcc480

cacgtggacctggtgaaggacctgaactccggcctgatcggcgccctgctggtgtgcaga540

gagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttatcctgctgtttgcc600

gtgtttgacgagggcaagagctggcactccgagaccaagaactccctgatgcaggacaga660

gacgccgcctccgcccgcgcctggcctaagatgcacaccgtgaacggctacgtgaacaga720

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人工序列

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