提取超氧化物岐化酶的方法和試劑盒的製作方法

2023-12-09 06:24:16

專利名稱：提取超氧化物岐化酶的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種提取蛋白質的方法和試劑盒，具體地，一種提取超氧化物岐化 酶(SOD)的方法和試劑盒。
背景技術：
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)簡稱SOD，是一種廣泛存在於動、
植物及微生物中的金屬酶，它至少可分為以下三種類型CuZn-SOD(微藍綠色)、 Mn-SOD (微粉紅色)、Fe-SOD (微淡黃色)。SOD是一種氧自由基清除劑，它的存在與人體衰老延緩、腫瘤的預防、自身免 疫力和防護輻射能力有著密切的關係。目前臨床上主要運用SOD延緩機體衰老，保護機 體免疫功能，防止和消除色素沉著，消除局部炎症，由於它無抗原性、無毒副作用，被 廣泛應用於食品、藥品、化妝品和保健品等領域[1]。現有的SOD純化過程中，粗分級工藝是不可避免的環節，其中必須使用大量的 有機溶劑(如乙醇，氯仿等)或無機鹽(如硫酸銨，磷酸鹽等)，通過有機溶劑和無機鹽 的分級沉澱以去除大部分雜蛋白，獲得粗品SOD。然後才能使用後續工藝，如丙酮沉 澱、超濾濃縮、透析、柱層析等，進行深入提純。使用有機溶劑和無機鹽對蛋白質溶液 進行分級沉澱存在較大的局限性。首先，使用分級沉澱法提取目標蛋白後，廢棄液中常 常含有高濃度的有機溶劑或無機鹽，這些有毒/有害物質的回收非常困難，而一旦排放 又會對環保造成巨大壓力；其次，有機溶劑和無機鹽分級沉澱法操作周期長，提取液經 常要在低溫下靜置過夜；另外，為了促使蛋白質沉澱，有機溶劑和無機鹽的使用量通常 都很大，抬高了產品的成本。因此，經濟、高效、環保的蛋白質純化技術一直是蛋白質 提純領域的瓶頸環節[2]。目前SOD的提取/生產工藝中，依然沿用傳統的分級沉澱技 術，這使得SOD生化產品的成本和產量一直難以達到理想水平[3，4]。

發明內容
本發明涉及一種利用丙烯酸聚合物作為雜蛋白沉澱劑提取超氧化物岐化酶的新 方法。提取的產品純度較高，穩定性好。該方法簡單環保，成本低，周期短，有利於大 規模提純SOD產品。本發明還涉及用於提取超氧化物岐化酶的試劑盒。本發明的內容包括1、一種提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，包含去除雜蛋白的步驟，其 中使用丙烯酸聚合物作為雜蛋白沉澱劑。2、根據以上1所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述丙烯酸聚 合物是聚丙烯酸或者聚丙烯酸鹽。3、根據以上1或2所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述丙烯 酸聚合物的使用終濃度範圍為0.1% -2.5% (重量/體積(Wt/V))。
4、根據以上1-3中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所 述丙烯酸聚合物的分子量範圍為3000-10000道爾頓。5、根據以上1-4中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所 述去除雜蛋白的步驟在溫度55-65°C下進行。6、根據以上1-5中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，在 所述去除雜蛋白的步驟中還使用酶保護劑。7、根據以上6所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述酶保護劑
是海藻糖。8、根據以上6或7所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述酶保 護劑的使用終濃度為-10% (Wt/V)。9、根據以上5-8中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，在 所述去除雜蛋白的步驟中還使用氯化銅，其中在提取體系達到55-65°C後，再加入氯化 銅。10、根據以上9所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述氯化銅 的使用終濃度為0.5% -2% (Wt/V)。11、根據以上1-10中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於， 在所述去除雜蛋白步驟之前進行破碎生物體樣品步驟，在所述去除雜蛋白步驟之後進行 沉澱步驟，復溶超濾濃縮步驟，和冷凍乾燥步驟。12、用於提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，包括作為雜蛋白沉澱劑 的丙烯酸聚合物。13、根據以上12所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，所述丙烯 酸聚合物是聚丙烯酸或者聚丙烯酸鹽。14、根據以上12或13所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，所述 丙烯酸聚合物的分子量範圍為3000-10000道爾頓。15、根據以上12-14中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在 於，還包括酶保護劑。16、根據以上12-15中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在 於，所述酶保護劑是海藻糖。17、根據以上12-16中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在 於，還包括氯化銅。本發明通過以下方式來實施(1)破碎生物體樣品步驟於生物體樣品中，加入1-1.5倍的蒸餾水或緩衝液， 充分攪拌或破碎，繼續放置30min，過濾得到濾液；(2)去除雜蛋白步驟於所述濾液中加入作為雜蛋白沉澱劑的丙烯酸聚合物， 使其在該提取體系中的終濃度為0.1%-2.5% (Wt/V),然後置於60-65°C恆溫水浴中加熱 至55-65°C，再加入氯化銅溶液，使其在該提取體系中的終濃度為0.5%-2% (Wt/V)，恆 溫10-15min，過濾除去雜蛋白，收集藍綠色濾液；(3)沉澱步驟於收集的藍綠色濾液中加入0.8-1.0倍體積的預冷丙酮，充分攪 拌，靜止2-4個小時，得到沉澱。
(4)復溶超濾濃縮步驟將所述沉澱溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中， 除去非溶沉澱，用分子量6000道爾頓超濾膜進行超濾濃縮，連續補水三次進行濃縮，收 集濃縮液；和(5)冷凍乾燥步驟將濃縮液進行_50°C冷凍乾燥，收集凍乾粉末。上述技術發明工藝中丙烯酸聚合物可以是聚丙烯酸或者聚丙烯酸鹽，分子量範 圍為3000-10000道爾頓。優選地，步驟(2)中還可以使用酶保護劑，即在步驟(1)獲得的濾液中加入 作為雜蛋白沉澱劑的丙烯酸聚合物後，加入酶保護劑，使其在該提取體系中的終濃度 為-10% (Wt/V)，然後置於60-65°C恆溫水浴中加熱至55-65°C，再加入氯化銅溶 液，恆溫10-15min，過濾除去雜蛋白，收集藍綠色上清液。酶保護劑可以是非還原性二 糖——海藻糖。與現有技術相比較，本發明的特點是(1)分離過程時間短，操作簡單便捷。(2)不使用氯仿、乙醇等有機溶劑和硫酸銨、磷酸鹽等無機鹽，清潔環保，雜蛋 白去除效率高。(3)降低了生產成本。(4)產品性能穩定、活性高，允許大規模生產。


圖1顯示實施例1中實驗1所獲得產物的紫外吸收曲線圖。圖2顯示實施例1中實驗1所獲得產物的SDS-PAGE凝膠電泳圖，其中泳道1中 加載分子量標記；泳道2中加載所獲得產物。圖3顯示H202對實施例1中實驗1所獲得產物的酶活性抑制曲線。
圖4顯示KCN對實施例1中實驗1所獲得產物的酶活性抑制曲線。圖5顯示實施例1中實驗6中使用TritonX-100所獲得產物的SDS-PAGE凝膠電 泳圖，其中泳道1中加載分子量標記；泳道2中加載所獲得產物。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明實施例1 提取超氧化物岐化酶實驗1 1、取動物豬血樣品(自然凝固後取其中血塊)lkg，加入1L的蒸餾水，充分攪 拌，直至血塊成碎狀為止，繼續放置30min充分溶血，用濾布過濾，收集濾液，即為溶 血液；2、向以上收集的溶血液裡加入溶血液體積5%濃度為2% (Wt/V)的聚丙烯酸 (平均分子量3000D)，置於60°C恆溫水浴中加熱，至溶血液溫度達55°C時，加入液體體 積5%的濃度為10% (Wt/V)的氯化銅溶液，恆溫lOmin，紗布過濾除去雜蛋白，收集藍 綠色濾液；3、於藍綠色濾液中加入0.8倍體積的預冷丙酮，均勻混合，靜止2小時收集沉澱，再將沉澱重新溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中，除去非溶沉澱，用截留分子 量為的6000道爾頓超濾膜(購自Millipore公司)對上液進行超濾濃縮，連續補水三次， 濃縮、純化，收集濃縮液，-50°C冷凍乾燥，得到淺蘭色凍乾粉末。實驗2 1、取動物豬血樣品(自然凝固後取其中血塊)lkg，加入1.5L的蒸餾水，充分攪 拌，直至血塊成碎狀為止，繼續放置30min充分溶血，用濾布過濾，收集濾液，即為溶 血液；2、向溶血液裡加入溶血液體積10%濃度為5% (Wt/V)的聚丙烯酸(平均分子 量10000D)，以及終濃度為10% (Wt/V)的海藻糖，置於65°C恆溫水浴中加熱，至溶血 液溫度達60°C時，加入液體體積5%的濃度為10% (Wt/V)的氯化銅溶液，恆溫lOmin， 紗布過濾除去雜蛋白，收集藍綠色濾液；3、於藍綠色濾液中加入0.8倍體積的預冷丙酮，均勻混合，靜止2小時收集沉 澱，再將沉澱重新溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中，除去非溶沉澱，用截留分子 量為的6000道爾頓超濾膜對上液進行超濾濃縮，連續補水三次，濃縮、純化，收集濃縮 液，-50°C冷凍乾燥，得到淺蘭色凍乾粉末。實驗3 1、取新鮮牛肝臟勻漿lkg，加入1.5L的pH7.6的磷酸鹽緩衝液，充分攪拌，直 至形成均勻乳狀液為止，繼續放置30min充分溶解，用濾紙過濾混合物，收集濾液；2、向所述濾液裡加入濾液體積25%濃度為10% (Wt/V)的聚丙烯酸鈉(平均 分子量5000D)，以及終濃度為(Wt/V)的海藻糖，置於60°C恆溫水浴中加熱，至 溶血液溫度達55°C時，加入液體體積20%的濃度為10% (Wt/V)的氯化銅溶液，恆溫 15min,紗布過濾除去雜蛋白，收集藍綠色濾液；3、於藍綠色濾液中加入1.0倍體積的預冷丙酮，均勻混合，靜止3小時收集沉 澱，再將沉澱重新溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中，除去非溶沉澱，用截留分子 量為的6000道爾頓超濾膜對上液進行超濾濃縮，連續補水三次，濃縮、純化，收集濃縮 液，-50°C冷凍乾燥，得到淺蘭色凍乾粉末。實驗4 1、取洗淨的銀杏葉lkg，加入1L的蒸餾水，充分攪拌破碎，直至形成勻漿為 止，繼續放置30min，用濾布過濾混合物，收集濾液；2、向所述濾液裡加入濾液體積10%濃度為25% (Wt/V)的聚丙烯酸鉀(平均分 子量8000D)，以及終濃度為5% (Wt/V)的海藻糖，置於65°C恆溫水浴中加熱，至溶液 溫度達60°C時，加入液體體積20%的濃度為10% (Wt/V)的氯化銅溶液，恆溫lOmin， 紗布過濾除去雜蛋白，收集藍綠色濾液；3、於藍綠色濾液中加入1.0倍體積的預冷丙酮，均勻混合，靜止4小時收集沉 澱，再將沉澱重新溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中，除去非溶沉澱，用截留分子 量為的6000道爾頓超濾膜對上液進行超濾濃縮，連續補水三次，濃縮、純化，收集濃縮 液，-50°C冷凍乾燥，得到淺蘭色凍乾粉末。實驗5:1、取蟲草真菌(Cordyceps fongus)的培養物lkg，加入1L的蒸餾水，充分攪拌破碎，直至形成勻漿為止，繼續放置30min，用濾布過濾混合物，收集濾液；2、向收集的濾液裡加入濾液體積10%濃度為25% (Wt/V)的聚丙烯酸鉀(平 均分子量8000D)，以及終濃度為5% (Wt/V)的海藻糖，置於65°C恆溫水浴中加熱， 至溶液溫度達60°C時，加入液體體積20%的濃度為10% (Wt/V)的氯化銅溶液，恆溫 lOmin,紗布過濾除去雜蛋白，收集藍綠色濾液；3、於藍綠色濾液中加入1.0倍體積的預冷丙酮，均勻混合，靜止4小時收集沉 澱，再將沉澱重新溶解於一定量的pH7.6的磷酸鹽緩衝液中，除去非溶沉澱，用截留分子 量為的6000道爾頓超濾膜對上液進行超濾濃縮，連續補水三次，濃縮、純化，收集濃縮 液，-50°C冷凍乾燥，得到淺蘭色凍乾粉末。實驗6 對照組對照組以與實施例1實驗1相類似的程序進行，唯一區別在於使用 TritonX-100,[八冗丨山等有機或無機聚合物，或分子量> 10000道爾頓的聚丙烯酸(鈉)， 或分子量< 3000道爾頓的聚丙烯酸(鈉)，以替代分子量範圍為3000-10000道爾頓的聚 丙烯酸或者聚丙烯酸鹽，最後得到凍乾粉末。實施例2 酶種類的鑑定採取紫外光譜法、SDS-PAGE法、H202和KCN抑制試驗鑑定實施例1中實驗1
所得到的結晶粉末樣品。a)紫外光譜法(參見圖1)在190nm-500nm範圍內，用紫外光譜掃描實施例1 中實驗1所得到的凍乾粉末樣品，其紫外吸收最高峰在258nm-265nm處，與典型的SOD 吸收光譜曲線一致。b) SDS-PAGE法(參見圖2)使用SDS-PAGE凝膠電泳檢測實施例1中實驗1
所得到的凍乾粉末樣品的溶液，結果顯示，該樣品溶液在電泳中呈現出一個主要條帶。 由於SOD有兩個相同的亞基，因此參照蛋白質分子量標記可以計算出其亞基分子量在 16KD附近(如箭頭所示)，這和文獻報導的SOD亞基分子量(在15.0-17.0KD之間)一致。c)H202抑制試驗(參見圖3)取6支幹淨的試管，各加入1.5%的H20210、20、 30、40、50ul及適量實施例1中實驗1所得到的凍乾粉末樣品的溶液，以雙蒸水補足為 3ml, 30°C水浴恆溫30min，迅速冷卻到25°C的室溫，以雙蒸水的酶活力為標準，計算相 對酶活力，並繪製相對酶活力曲線。結果表明該樣品對H202敏感，與SOD特徵相符。d)KCN抑制試驗(參見圖4)取6支幹淨的試管，各加入10mM KCN100、 200、300、400、500ul,及適量實施例1中實驗1所得到的凍乾粉末樣品的溶液，以雙蒸 水補足為3ml，30°C水浴恆溫30min，迅速冷卻到25°C的室溫，以雙蒸水的酶活力為標 準，計算相對酶活力，並繪製相對酶活力曲線。結果表明該樣品對KCN敏感，與Cu/ Zn-SOD的特徵符合。由以上方法可知，按照此流程製備的凍乾粉末樣品具有SOD的典型特徵，因此 確定為SOD，且提取率在0.1-0.2%左右。本發明人還分別對實施例1中實驗2、3、4和5中獲得的淺蘭色凍乾粉末分別 採取紫外光譜法、SDS-PAGE法、H202和KCN抑制試驗進行鑑定，其結果均與實施例 2中關於實施例1的實驗1的結果相近似，顯示出SOD的典型特徵。且提取率大致在0.05-0.2%範圍內變化，具體隨原料等因素的變化而有所變化。此外，本發明人還對實施例1的實驗6中獲得的凍乾粉末進行SDS-PAGE電泳。 圖5顯示關於使用TritonX-100提取獲得的產物的SDS-PAGE電泳結果，該結果顯示產物 中含有多種不同的蛋白質成分。這表明，使用該方法不能去除SOD以外的其他雜蛋白， 因此不能用於提取SOD。關於使用實施例1中實驗6中其他物質的結果與圖5所示的結 果近似。實施例3 酶活力檢測取實施例1中實驗1所得到的凍乾粉末少量，按照SOD試劑盒(購自南京建成生 物公司)的操作說明進行SOD活力測定。結果表明，按照此流程製備的凍乾粉末樣品， 其活力穩定保持在3000U/mgprO以上。且該樣品在-20°C冰箱中保存6個月，活力基本 不變。本發明人還通過前述方法分別對實施例1中實驗2、3、4和5中獲得的淺蘭色凍 乾粉末進行了酶活力檢測，結果顯示其產物活力均穩定保持在3000U/mgprO以上。且 在-20°C冰箱中保存6個月，活力基本不變。此外，本發明人還通過前述方法對實施例1中實驗6中獲得的凍乾粉末進行了酶 活力檢測，結果顯示所獲得的產物的活力均< 1500U/mgprO，或根本不具有酶活力。具 體檢測結果如表1所示。表1.對照組(實施例1中實驗6)產物的酶活力檢測結果
權利要求
1.一種提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，包含去除雜蛋白的步驟，其中使 用丙烯酸聚合物作為雜蛋白沉澱劑。
2.根據權利要求1所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 物是聚丙烯酸或者聚丙烯酸鹽。
3.根據權利要求1所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 物的使用終濃度範圍為0.1%-2.5% (Wt/V)。
4.根據權利要求1所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 物的分子量範圍為3000-10000道爾頓。
5.根據權利要求1所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 的步驟在溫度55-65°C下進行。
6.根據權利要求5所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 白的步驟中還使用酶保護劑。
7.根據權利要求6所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 海藻糖。
8.根據權利要求7所述的提取超氧化物岐化酶的方法， 使用終濃度為-10% (Wt/V)。
9.根據權利要求5、6或7中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在 於，在所述去除雜蛋白的步驟中還使用氯化銅，其中在提取體系達到55-65°C後，再加入 氯化銅。
10.根據權利要求9所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，所述氯化銅的 使用終濃度為0.5% -2% (Wt/V)。
11.根據以上權利要求中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，在 所述去除雜蛋白步驟之前進行破碎生物體樣品步驟，在所述去除雜蛋白步驟之後進行沉 澱步驟，復溶超濾濃縮步驟，和冷凍乾燥步驟。
12.用於提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，包括作為雜蛋白沉澱劑的丙烯 酸聚合物。
13.根據權利要求12所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，所述丙烯酸 聚合物是聚丙烯酸或者聚丙烯酸鹽。
14.根據權利要求12所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，所述丙烯酸 聚合物的分子量範圍為3000-10000道爾頓。
15.根據權利要求12所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，還包括酶保 護劑。
16.根據權利要求15所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，所述酶保護 劑是海藻糖。
17.根據權利要求12-16中任一項所述的提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在 於，還包括氯化銅。其特徵在於，所述丙烯酸聚合 其特徵在於，所述丙烯酸聚合 其特徵在於，所述丙烯酸聚合 其特徵在於，所述去除雜蛋白 其特徵在於，在所述去除雜蛋 其特徵在於，所述酶保護劑是 其特徵在於，所述酶保護劑的
全文摘要
本發明涉及一種提取超氧化物岐化酶的方法，其特徵在於，包含去除雜蛋白的步驟，其中使用丙烯酸聚合物作為雜蛋白沉澱劑。本發明還涉及用於提取超氧化物岐化酶的試劑盒，其特徵在於，包括所述作為雜蛋白沉澱劑的丙烯酸聚合物。
文檔編號C12N9/02GK102021151SQ20091009287
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月9日 優先權日2009年9月9日
發明者李昭華, 王保全, 董先智 申請人:中國科學院生物物理研究所