一種預測前列腺癌易感性的檢測試劑盒和方法
2023-12-09 08:52:26
專利名稱：一種預測前列腺癌易感性的檢測試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及一種預測前列腺癌易感性的檢測試劑盒和方法，更具體的說是通過測定與前列腺癌相關基因F0XP4基因5』端附近rs4714476位點多態性預測受試者對於前列腺癌的易感性，該方法可用於疾病的輔助診斷和新藥開發，屬於生物技術領域。
背景技術：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性最常見的與老齡相關的惡性腫瘤,其發病機制尚不清楚，家族史和雙生子研究表明遺傳因素是PCa發生的一個重要危險因素。隨著我國老齡化人口的增長，PCa的發病率正逐年增長(劉振偉，項永兵，張薇.上海市區1973 1999年PCa發病趨勢分析·中國衛生統計，2003，20 (6) : 335-337.)，目前PCa特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)在PCa篩查中的應用引起眾多爭議,現有的PCa篩查又多依賴PSA水平的檢測，臨床上發現，由於PSA檢測精度的特異性和敏感性不足，帶來了 PCa的診斷不足和過度治療的嚴重問題。然目前尚未見有替代PSA的臨床早期篩查PCa技術的研究，原因是缺乏有效的PCa生物標誌。研究表明越來越多的PCa遺傳標誌物的發現為PCa早期診斷提供了可能。隨著大規模全基因組關聯研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)的出現，目前國外已經通過這種方法鑑定了 50多個PCa易感SNPs位點，約解釋25%的PCa遺傳病因。證明了 SNPs作為基因組標誌的關聯分析方法在PCa遺傳研究中的有效性。SNPs是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標記，這種單鹼基變化中有70. 1%為同型鹼基之間的轉換如G/A或T/C，29. 1%為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶)是人類基因組中最易發生變化的位點，因為大多數是甲基化 胞嘧啶，能夠自發脫氨基轉換為T (胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多態性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由於生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I個)、代表性強(位於基因內部的SNPs可能直接影響蛋白質結構或表達水平)、遺傳穩定性好(同微衛星多態性比較而言)、易於自動化分析(因SNPs在人群中為雙等位基因標記，可簡單以「+ / 一或1/0」直接分型)等特點成為很好的遺傳標誌。F0XP4 (叉頭轉錄因子P4) (forkhead box P4，F0XP4)基因是FOX轉錄因子家族的P亞家族，在胚胎發育、細胞周期調節和腫瘤形成中起主要作用，在野生小鼠組織和人類腫瘤組織中，F0XP4在腎癌患者組織中表達明顯減少，Frohme et al.等研究也證明在喉癌時F0XP4的表達也減少。證明了 F0XP4基因與腫瘤的相關性。目前，F0XP4在PCa中可能的作用還未被研究，然而，在與PCa發病機制及遺傳機制相似的乳腺癌中，已經鑑定了 F0XP4基因的變異或異位改變。F0XP4基因上的PCa易感SNP位點rsl983891是2010年Takata R等在日本人群中GWAS研究鑑定的，F0XP4基因位於6p21，rsl983891位於F0XP4基因第2內含子，目前這一位點與PCa的關聯性在歐洲、中國人群中已經被複製驗證，而F0XP4基因及附近其他位點與PCa的風險還未見有研究報導，我們結合以上F0XP4與其他腫瘤有關的功能，在此基因及基因兩端5KB內選擇SNPs進行分型並分析了與PCa及PCa相關臨床表型的相關性，鑑定出位於F0XP4基因5』端附近的rs4714476與PCa及PCa相關的臨床信息關聯。Rs4714476 位於 6p 上 F0XP4 基因 5』端附近，F0XP4 基因全長 55. 96kbp，在 6p21 上位置從 41，622，142 到 41，678，099，rs4714476 在染色體上位置為 41，621，717，距離 F0XP4基因僅425bp，可能會對F0XP4基因轉錄有調節作用，或者連鎖有轉錄起始區的功能位點，經查詢檢索，截至目前，尚未見有F0XP4基因5』端附近rs4714476位點多態性與PCa的風險未見報導。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的方法。本發明的第二個目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列為F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段。圖1為F0XP4基因結構及rs4714476多態性變異位點的示意圖，rs47144768位點標在F0XP4基因圖中5』端附近的相應位置。所述單苷酸多態性位點rs4714476的基因型為CC或TC時，前列腺癌易感性最高；基因型為TT時，前列腺癌 易感性較低。該基因型位點差異還可預測受試者前列腺癌臨床表型與正常對照人群相比較，F0XP4基因5』端附近rs4714476的基因型為CC或TC時，前列腺癌患者中診斷年齡彡65歲，PSA (PCa特異性抗原)水平>20ng/ml，腫瘤分期〈III及進展性前列腺癌的發生率都將明顯高於TT基因型的患者。一組檢測前列腺癌易感性的引物，能擴增得到權利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，包括如下步驟(I)抽提樣品的基因組DNA，擴增F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段；(2)檢測步驟(I)產物中單苷酸多態性位點rs4714476的基因型，基因型為CC或TC時，前列腺癌易感性最高；基因型為TT時，前列腺癌易感性較低。所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs4714476位點位於該核苷酸序列的+301位。所述擴增F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。本發明提供了一種檢測前列腺癌易感基因的試劑盒，其中含有本發明特異性擴增F0XP4基因5』端附近rs4714476位點的引物對和用於PCR擴增檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩衝液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下一種預測PCa的試劑盒，供10人份檢測應用，由以下試劑組成10 μ L 10XPCR 緩衝液(購自 Pharmacia)，2 μ L IOmM dNTP 混合液(購自 Pharmacia)，2 μ L Taq DNA 聚合酶(2unit/μ L)(購自 Takara)，1μL Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/μ L ；1uL Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為10pmol/μ L ；8 μ L IOXLC-green PLUS 飽和螢光染料；2μ L寡核苷酸內參引物各0. 5μ L，濃度為10pmol/μ L，其中低溫內參引物F為SEQID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫內參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；64 μ L 純水。使用方法1) PCR擴增通過PCR擴增F0XP4基因5』端附近部分片段，製備混合液=IOXPCR反應緩衝液 lyL，10mmol/L dNTP 0. 2 μ L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 μ L，10pmol/L 上遊引物
0.lμL，10pmol/L下遊引物O.1μL, 10XLC Green PLUS飽和螢光染料0. 8 μ L，寡核苷酸內參0. 2 μ L (高、低溫寡核苷酸內參上、下遊引物各0. 05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加去離子水至10 μ Lo PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR 時於每一體系中加入 20 μ l 的石蠟油，以防止液體揮發。2)基因型判定將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light scanner TMHR-196上進行HRM分析，用Light Scanner Call IT軟體對採集後的曲線進行分析，根據熔解曲線的差異判定基因型。F0XP4基因5』端附近單苷酸多態性位點rs4714476在製備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。本發明的測定方法測定了來源於人的基因組DNA，樣品沒有限制，如體液(血液、腹水及尿液等)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可製備基因組DNA。調整基因組DNA的濃度，使其儘可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含F0XP4基因5』端附近突變位點rs4714476的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含F0XP4基因5』端附近突變位點的DNA片段獲得的樣品，特別適於用作測定材料。在進行基因輔助診斷時，本發明優先適用於測定根據F0XP4基因5』端附近突變位點rs4714476突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試齊U，其對應於用於測定rs4714476基因突變類型的方法。按採用的測定方法來選擇適當的特定試劑，如DNA片段和/或用於PCR擴增步驟的引物。本發明的優點是本發明首次闡明了 F0XP4基因5』端附近rs4714476多態性位點與PCa的相關性，提供了一種預測PCa易感性的方法和檢測試劑，該方法可用於PCa的輔助診斷和新藥研發。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步敘述，以便公眾對發明內容有更深入的了解，並非對本發明的限制，凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。
圖1為F0XP4基因結構及5』附近端多態性變異位點的示意2為F0XP4基因5』附近端rs600928位點經HRM分型溶解曲線3為F0XP4基因5』附近端rs600928位點的測序圖
具體實施例方式用於下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下10XPCR 緩衝液10mM Tris-HCI (ρΗ=8· 3)，500mM 氯化鉀(KC1)，IOmM 氯化鎂(MgCl2)7O. 01%(W/V)白明膠dNTP :脫氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二鈉 TE IOmM Tris-HCl (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. O)實施例1 :血液樣本收集和基因組DNA的提取(I)PCa患者均經組織病理學診斷，共選取來自北京和天津地區無血緣關係的PCa患者277例(年齡46 - 93歲，平均72. 3歲)，同地區的年齡匹配的對照602例(年齡58 - 94歲，平均70. 5歲)，均為男性，無PCa家族史、DRE陰性並且PSA〈4ng/mL。所有受檢者均為漢族且籤署書面知情同意書，這項研究得到衛生部北京醫院，衛生部老年醫學研究所倫理審核委員會的認可，符合世界醫學會赫爾辛基宣言人體醫學研究的倫理原則。(2)根據下列方法，製備人基因組DNA。①首先在已標號的1.5mLEP管中加1000 μ L紅細胞裂解液，後加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3-5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；②13000rpm離心30秒後，除去上清液；③在所得沉澱中加480 μ I核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻後加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時上下混勻，確保無凝塊)；④拿出後降至室溫，加300mL蛋白沉澱液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；⑤將上清液移至新EP管中，加入670 μ L預冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；⑥棄上清液並確保沉澱留在EP中，加入670 μ L 70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；⑦棄上清，使管內乙醇揮發乾淨；⑧加入TE溶解液(400 μ L)，充分溶解，然後對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/l·! L，放置於4°C備用，剩餘基因組DNA置_20°C冰箱保存。實施例2SNP的識別鑑定 本發明採用PCR-高解析度溶解曲線(HRM)分析法和PCR測序技術同時對F0XP4基因3』端附近基因區的rs4714476位點(其等位位點為C/T)的基因型進行檢測。I) PCR-HRM弓丨物的確定從Genebank中查取rs4714476附近的DNA鹼基序列(SEQ ID NO.1),引物設計在Oligo 6. O和primer5. O軟體下完成。目的片段定位在F0XP4基因5』near gene區，全長61bp，確定了正義鏈Fl (+271bp—+291bp)與反義鏈Rl (+315bp—+331bp)，特異性引物序列如下Fl :5，-ACCGTGTGGGATCAGGACTTG-3』 (SEQ ID NO. 2)Rl :5，-TTGCAAACCCCGGCCAT-3，(SEQ ID NO. 3)2 ) PCR-HRM反應體系及條件通過PCR擴增F0XP4的5』端附近基因區的rs4714476位點所在片段，PCR反應體系為10XPCR 反應緩衝液 I μ L，10mmol/L dNTP O. 2 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ L，IOpmol/L上遊引物0. lyL，10pmol/L下遊引物O.1yL, 10XLC Green PLUS飽和螢光染料O. 8 μ L，寡核苷酸內參O. 2 μ L (高、低溫寡核苷酸內參上、下遊引物各O. 05 μ L，3』端C3封閉，阻止延伸，見表1)，基因組DNA I μ L，加去離子水至10μ L。PCR時於每一體系中加入20 μ I的石蠟油，防止液體揮發。PCR反應條件為95°C預變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s,24°C 4min。表I高、低溫寡核苷酸內參引物序列、退火溫度及產物片段長度
權利要求
1.一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於所述核苷酸序列為F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段。
3.根據權利要求2所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特徵在於所述單苷酸 多態性位點rs4714476的基因型為CC或TC時，前列腺癌易感性最高；基因型為TT時，前列腺癌易感性較低。
4.一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特徵在於能擴增得到權利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根據權利要求4所述的一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特徵在於所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
6.一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟 Cl)抽提樣品的基因組DNA，擴增F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段； (2)檢測步驟(I)產物中單苷酸多態性位點rs4714476的基因型，基因型為CC或TC時，前列腺癌易感性最高；基因型為TT時，前列腺癌易感性較低。
7.根據權利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs4714476位點位於該核苷酸序列的+301位。
8.根據權利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特徵在於所述擴增F0XP4基因5』端附近包含單苷酸多態性位點rs4714476的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。
9.一種檢測前列腺癌易感基因的試劑盒，其特徵在於由以下試劑組成10 μ L 10 X PCR 緩衝液； 2 μ L IOmM dNTP 混合液；2 μ L Taq DNA 聚合酶，2unit/ μ L ； IuL Fl引物，為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/yL; IuL Rl引物，為SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/μ L ； 8 μ L 10 X LC-green PLUS 飽和螢光染料； 2 μ L寡核苷酸內參引物各O. 5 μ L，濃度為IOpmol/ μ L，其中低溫內參引物F為SEQ IDNO. 4所示的核苷酸序列，低溫內參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 64 μ L純水。
10.F0XP4基因5』端附近單苷酸多態性位點rs4714476在製備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種預測前列腺癌易感性的檢測試劑盒和方法，屬於生物技術領域。本發明通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的FOXP4基因5』端附近rs4714476位點的基因型，預測受試者對前列腺癌的易感性FOXP4基因5』端附近rs4714476的基因型為CC或TC時，受試者的易感性較高，rs4714476的基因型為TT時，受試者的易感性最低；並可預測受試者前列腺癌臨床表型。腫瘤分期<III及進展性前列腺癌的發生率都將明顯高於TT基因型的患者。本發明的優點是首次闡述了rs4714476基因多態性位點與前列腺癌及前列腺癌臨床信息的相關性，提供了一種預測前列腺癌易感性的方法，該方法可用於前列腺癌的早期預防診斷、臨床輔助診斷，還可以用於新藥研發。
文檔編號C12N15/11GK103060315SQ20121039920
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者楊澤, 劉銘, 王建業, 史曉紅, 魏東, 朱小泉, 楊帆, 張耀光, 梁思穎, 唐雷, 孫亮 申請人:衛生部北京醫院