白蛋白-澱粉樣肽綴合物及其用途的製作方法

2023-12-08 20:11:01 2

專利名稱：白蛋白-澱粉樣肽綴合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含白蛋白-澱粉樣肽綴合物的組合物及其用途，更具體地，涉及治療與澱粉樣蛋白沉積相關疾病的用途，如阿爾茨海默病。
背景技術：
澱粉樣疾病或澱粉樣變性包括許多具有各種外在症狀的疾病。這些疾病的共同點是存在蛋白質原纖維異常細胞外沉積，蛋白質原纖維也稱為「澱粉樣原纖維」，「澱粉樣蛋白沉積」或「澱粉樣蛋白斑」，其直徑通常約IO-IOOnm並且局部集中於特定的器官或組織區。這種斑塊主要由自然生成的可溶性蛋白或肽組成。這些不溶性的沉積主要是由直徑約 10-15nm的原纖維橫向聚集而成。儘管他們的發生多樣化，但是所有的澱粉樣蛋白沉積都有著共同的形態學特徵，用特定的染料染色(例如硫磺素T、剛果紅)，染色後在偏振光下出現特有的紅綠雙折射。澱粉樣相關疾病的特徵在於存在於沉積中的蛋白質類型。例如，神經退行性疾病如羊瘙癢病、牛海綿狀腦炎、克雅氏病等等，其特徵在於中樞神經系統中的朊蛋白(稱為 AScr或ft~P-27)抗蛋白酶的形成出現和聚集。同樣地，另一種神經退行性疾病阿爾茨海默氏病，其特徵在於由澱粉樣蛋白斑塊和神經原原纖維纏結的沉積。在這種情況下，斑塊和血管澱粉樣蛋白由原纖維狀澱粉樣β蛋白沉積而成。其他疾病，如成人發病型糖尿病(11型糖尿病)的特徵在於澱粉樣蛋白在胰腺中的局部積累。每個澱粉樣蛋白都有能力摺疊成摺疊並且形成不溶性原纖維，其在細胞內或細胞外沉積。雖然胺基酸序列不同，但每個澱粉樣蛋白具有形成原纖維並與其他元素(如蛋白聚糖、澱粉樣蛋白P以及補體成分)結合的相同的屬性。此外，每個澱粉樣蛋白都有胺基酸序列，其儘管不同，但可催化β-摺疊細胞的形成。例如，澱粉樣β原纖維與阿爾茨海默氏症患者的神經細胞死亡和小膠質細胞增生相關。在體外測試時，已經證明β澱粉樣肽能夠引發小膠質細胞(腦巨噬細胞)的激活過程，這可以解釋在阿爾茨海默氏症患者的大腦中發現存在小膠質細胞增生和腦部炎症。在II型糖尿病患者中發現的另一種類型的澱粉樣變性中，澱粉源蛋白IAPP已經顯示在體外誘導β胰島細胞毒性。因此，在II型糖尿病患者的胰腺中出現的IAPP原纖維可能導致了 β胰島細胞(朗格漢斯)的缺少和器官功能障礙。最突出的澱粉樣疾病之一是阿爾茨海默氏症，其是一種進行性神經退行性疾病， 該疾病影響西方世界人口總數的約0.5% 1%。阿爾茨海默氏症的特徵是在大腦中的大量澱粉樣蛋白斑沉積。這種沉積被認為是引起疾病的病理，大多數防止阿爾茨海默氏症的方法其目的都是減少，消除或阻止澱粉樣蛋白斑塊的形成。澱粉樣蛋白斑的主要成分是澱粉樣β肽(Αβ)，一個40-42個胺基酸的蛋白質，通過澱粉樣前體蛋白(APP)剪切產生。專利申請US20070172496公開了這樣的綴合物，其含有A β (33-42)肽，由單克隆抗體和白蛋白識別的肽以及所謂的配體呈遞的聚合物oLPA，該單克隆抗體和白蛋白用來在 ELISA檢測中捕獲抗原，以便確定樣品中抗-Αβ抗體的存在，所述樣品來自已經接種了複合物的患者，這種複合物由不同的來自Αβ (1-42)肽的多肽組成。因此，在本領域中，需要額外的免疫源性組合物來減少澱粉樣蛋白沉積的數量，該免疫原性組合物能夠誘導有效的和持續的血漿中的澱粉樣蛋白的水平下降。發明簡述第一方面，本發明涉及一種用於藥物的包含源自Αβ的C端區域(1-42)的肽和白蛋白的綴合物。另一方面，本發明涉及一種用於藥物的組合物，所述組合物包含包括源自 Αβ (1-42)的C端區域的肽和白蛋白以及佐劑組成的綴合物。另一方面，本發明涉及包括至少一種源自Αβ (1-42)的C端區域的免疫原性肽和白蛋白的綴合物或涉及一種組合物，其包含至少一種源自Αβ (1-4幻(端區域的免疫原性肽、白蛋白的和佐劑，用於治療或預防與澱粉樣蛋白沉積有關的疾病。


圖1是Αβ肽(底部的箭頭)的免疫注射時間表，在線下標示出了免疫接種的次數，採血(頂部的箭頭)，以周(w)為單位來標示出了每個樣品採集相應的時間點，CFS樣品的採集是在第0周和第13周(雙箭頭)。(A)表和(B)表分別是A β (Χ-42)肽和A β (Χ-40) 肽免疫注射時間表。在(A)表裡，左圖框代表所有的動物都遵循的時間表，右邊的圖框代表僅影響C組和D組的額外幹預措施。圖2 (A-C)。血漿抗A β抗體滴度的演變。Α)血漿樣品的抗A β抗體滴度，表達為等值的ng/μ 1的單克隆抗體6Ε10。B)血漿樣品的抗A β抗體滴度，通過他們的EC50來表示。D)血漿樣品的抗Αβ抗體滴度，通過最大的血漿稀釋度的倒數來表示，其中吸光度比空白孔的平均吸光度高出三倍。在橫軸上表示不同的時間點(以周為單位)。每條線代表圖例中的一隻動物。各組動物接受的製劑都是合成肽-藍載體加水化凝膠HPA(A)合成肽-藍載體加Abisco-300 (B)；合成肽-BSA加水化凝膠HPA (C)和合成肽-BSA加Abisco-300 (D)。 較短的連續線條對應於的非應答動物(A和B組)，其中在第十三周停止治療。C組動物由折線和相應的個別符號表示。D組由虛線和相應的個別符號表示。圖3(A_B)。血漿Αβ肽濃度的演變。Α)代表在不同時間點的血漿A β (1-42)肽濃度的演變。B)代表在不同時間點的血漿Αβ (1-40)肽濃度的演變。橫軸Y軸交叉於 3. 125pg/ml。為了使圖示清晰，低於3. 125的值已表示為_5pg/ml。在橫軸上表示著不同的時間點(以周為單位)。每條線代表圖例中的一隻動物。4組(A、B、C和D)動物接受不同的疫苗製劑。較短的連續線條對應的非應答動物(組A和B)在第十三周停止處理。C組動物由折線和相應的個別符號表示。D組由虛線和相應的個別符號表示。圖4。各實驗組的血漿抗體滴度與免疫前的狀態肽濃度的變化比率的演變。橫軸代表時間點(以周為單位)。折線代表不同時間點Αβ (1-42)肽血漿濃度與在免疫前的狀態下(第0周)的比率的演變。虛線代表不同時間點Αβ (1-40)肽血漿濃度的與在免疫前的狀態下(第0周)的比率的演變。連續線表示不同時間點血漿抗Αβ的抗體滴度與在免疫前的狀態(第0周)的比率的演變。對於每一個比率來說，縱軸的值代表組中的三隻動物的總和。為了使圖示清晰，血漿抗Αβ抗體滴度比率的值已經除以了 20。圖5。血漿抗Αβ (33-40)抗體滴度的演變。Α)血漿樣品的抗A β抗體滴定度表達為等值的ng/μ 1的抗Ai340(SAR 22)抗體。B)血漿樣品的抗Αβ抗體滴度用他們的 EC50來表示。在橫軸上表示著不同的時間點(以周為單位)。每條線代表圖例中的一隻動物(Α1-Α3用黑色表示，Β1-Β3用白色表示)。兩組(組A和B)接受不同的疫苗製劑。圖6是一個圖表，示出了與對照組相比，在接種疫苗的兩組中，可溶性或不溶性形式的肽濃度。Vacc. 1 對應於 A β (X-42)+BSA+Th2-型佐劑，Vacc. 2 對應於 A β (X-42) +BSA+ 混合的Thl/Th2型佐劑。欄(1)對應於Αβ (1-40)可溶性形式；(2)對應於Αβ (1-42)可溶性形式；(3)對應於A β (1-40)不溶性形式；(4)對應於A β (1-42)不溶性形式。圖7是一個圖表，示出了與對照組相比，接種疫苗組的可溶性形式的肽濃度。(A) 對應於可溶性A β (1-40)肽；(B)對應於可溶性A β (1-42)肽。而(1)標示小腦樣本；(2) 額側；(3)內鼻和(4)顳腦區。發明詳述本發明的綴合物在醫學中的用途本發明的作者發現，令人驚訝的是，施用一種包含源自澱粉樣β蛋白(1-42) [A(1-42)]C端區域的肽和白蛋白的綴合物，導致存在所述肽的抗體並降低了蛋白 Aβ (1-40)和Αβ (1-42)的血清水平，Aβ (1-40)和Αβ (1-42)是阿爾茨海默氏病的澱粉樣蛋白斑的主要成分。這些結果打開了一個新的治療窗，來治療、預防和/或緩解與澱粉樣蛋白沉積相關的疾病。因此，一方面，本發明涉及一種用於藥物的源自Αβ (1-42) C端區域的免疫原性肽和白蛋白的綴合物。來自Ag (1-42)C端區域的免疫原性肽此處使用的術語「免疫原性肽」指的是一種包括等位基因特異性的基序、表位或其他序列的肽，這樣該多肽或片段將結合MHC分子並誘導細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)反應，和/或B細胞反應(例如，抗體的產生)，和/或輔助性T淋巴細胞反應，和/或遲髮型超敏反應(DTH)，對抗免疫原性肽源自的抗原，S卩β澱粉樣蛋白肽。在本發明的實施例中示出了確定一個給定的肽是否具有免疫原性的合適的方法。這些方法都是基於在動物體施用所述肽後，所述免疫原性肽能夠產生抗澱粉樣β蛋白抗體的能力而言的。此處使用的術語「澱粉樣β肽」與Αβ、澱粉樣β蛋白、「Αβ 」、「βΑΡ」、「Αβ肽」 交替使用的，是指一個肽家族，其是在阿爾茨海默氏病(AD)、唐氏綜合症、荷蘭型(HCHWAD) 遺傳性澱粉樣變性腦出血患者大腦中發現的老年斑和血管澱粉樣蛋白沉積(澱粉樣血管病)的主要化學成分。不論以何種形式，澱粉樣β肽是澱粉樣β蛋白前體蛋白(APP)的一個片段，其包括一可變數目的胺基酸，典型地39-43個胺基酸。此處使用的「Α β (1-42)」 指的是一個42個胺基酸的肽，對應於APP的672至713位胺基酸，其由β分泌酶和、分泌酶連續蛋白水解裂解澱粉樣前體蛋白產生。澱粉樣β肽通常表示為"A β (x-y)「，其中χ代表澱粉樣β肽的氨基末端的胺基酸數量而y代表羧基末端的胺基酸數量。例如Αβ (1-40)是一種澱粉樣β肽，其氨基末端從胺基酸1開始，羧基末端終止於胺基酸40，其序列定為序列號1。在本發明中，「源自Αβ (1-42) C端區域的肽」意味著具有2至40個胺基酸殘基的多肽，包含部分或全部的A β (1-42)的C端區域。該術語還包括與A β (1-42) C端區域基本上相似的區域(如結構變異)的肽。
術語「基本上相似」指的是兩個肽序列，最優比對時，具有至少50%的序列同源性， 優選至少有60 %的序列同源性，更優選至少有70 %的序列同源性，更優選至少有80 %的序列同源性，更優選至少有90%的序列同源性，更優選至少有95%或更多的序列同源性(例如，99%的序列同源性)。優選地，殘基的位置，其不同，通過保守的胺基酸替代而不同。保守的胺基酸替代是指具有相似側鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側鏈的胺基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；脂肪族羥基側鏈的胺基酸是絲氨酸和蘇氨酸；含醯胺側鏈的胺基酸是天冬醯胺和穀氨醯胺；具有芳香側鏈的胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側鏈的胺基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和側鏈含硫的胺基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。不相同的殘基位置也可能是由肽類似物組成，包括非天然胺基酸或該胺基酸的衍生物。肽類似物通常與天然發生的肽通常靠保守替代，在一個、兩個或幾個位置不同。一些類似物還包括在一個，兩個或幾個位置的非天然胺基酸或修飾的N端或C端胺基酸。非天然胺基酸的例子包括但不限於D胺基酸、α, α-二取代的胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸、4-羥基脯氨酸、y-羧基穀氨酸鹽、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε _Ν_乙醯基賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙醯絲氨酸、N-甲醯甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸以及異天冬氨酸。在本發明的綴合物的特殊的實施例中，源自Αβ (1-42)的C端區域的肽選自 Aβ (35-42)(序列號:2)，Αβ (33-42)(序列號:3)y Αβ (33-40)(序列號4)。此處使用的「Α β (35-42) 」涉及與A β (1-42)最後的8個胺基酸相對應的8個胺基酸。此處使用的「Α β (33-42) 」涉及與A β (1-42)最後的10個胺基酸相對應的10個
胺基酸。此處使用的「Α β (33-40) 」涉及與A β (1-42)從33至40的胺基酸相對應的8個
胺基酸。源自Αβ (1-4幻(端區域的肽包括肽接頭組，可由固相或液相多肽化學標準方法合成。固相技術概要可在 Mewart 和 Young(1963) Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), and Meienhofer(1973)Hormonal Proteins and Peptides, Academic Press (New York)中找至 lj。經典溶液合成可以參考 Schroder and Lupke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press(New York)。—般來說，這些方法包括給不斷增長的肽鏈連續添加一個或多個胺基酸或適當的保護胺基酸。通常情況下，第一個胺基酸的氨基或是羧基會被適當的保護基所保護。保護胺基酸則無論是連接到一個惰性固體支持或是利用在溶液中按順序加入下一個胺基酸中， 在適合形成醯胺連接的條件下使互補(氨基或羧基)基團得到適當的保護。然後保護基會從這個新添加的胺基酸殘基中移除，並添加下一個胺基酸(適當的保護)等。在所需的胺基酸已經以正確的順序連接後，任何剩餘的保護基(任何固體支持)都被按順序移除或同時給予最終的肽。通過簡單的修飾這個一般程序，可以給生長鏈一次添加一個以上的胺基酸。例如，通過耦合(在非外消旋手性中心的條件下)被保護的三肽與經過適當保護的二肽形成後，脫保護後形成五肽。在優選的實施方案中，半胱氨酸殘基被添加到所述免疫原性肽氨基N端，以便促進利用能夠與半胱氨酸的巰基反應的雙功能試劑使所述肽與載體分子
6華禹合。白蛋白如上所述，本發明的一方面涉及一種用於藥物的綴合物，其由含有源自Αβ (1-42) 的C端區域的肽和白蛋白組成。此處使用的「白蛋白」是指血漿中最豐富的蛋白質，根據物種的起源不同，其單體形式，具有大約65至67千道爾頓的分子量。術語「白蛋白」可與「血清白蛋白」交替使用， 並不旨在限定與本發明的修飾的肽形成綴合物的白蛋白的來源。因此，此處使用的術語「白蛋白」可以是指從天然來源如血液或漿膜中純化的白蛋白，也可以是指化學合成或重組產生的白蛋白。在不同的實施方案中，白蛋白變體或天然的白蛋白衍生物能夠用於形成本發明的綴合物。在一些實施方案中，白蛋白是哺乳動物白蛋白，或其變體或衍生物。可用的哺乳動物白蛋白的例子包括但不限於人、牛、綿羊、山羊、兔、貓、犬、豬、靈長類動物或是齧齒動物白蛋白。在優選的實施方案中，哺乳動物白蛋白是人白蛋白。在一個實施方案中，人白蛋白是從血液或漿膜純化而來的。例如，白蛋白可以從個人或實驗動物的血清或血漿樣品純化而來，更多使用的是牛白蛋白，但它也可以從來自其他動物(雞、豬、兔等)的血清中提取，這種提取可以使用任何標準方法，如通過Cohn方法 (Cohn EJ 等，J Am Chem Soc 1946 ；68 :459-75)或 Kistler 和 Nitschmann 方法(Kistler P和Nitschmann HS.，Vox Sang 1962 ；7 :414-24)的冷乙醇分溜或通過層析純化(Bergloff JH.等 In :Curling JM, ed. Separation of Plasma Proteins. Uppsala :Pharmacia,1983 ； 51-8)或冷乙醇分離和層析純化的組合。白蛋白也可從蛋清(卵清蛋白)中提取。一類不同的白蛋白，貯藏白蛋白，可以從一些植物的種子(如大豆)中提取。在另一實施方案中，白蛋白是重組白蛋白。在特別的實施方案中，白蛋白是重組人體白蛋白(以下簡稱「rHA」)。在不同的實施方案中，rHA可以在哺乳動物或非哺乳動物的有機體中產生。在一個實施方案中，rHA在非哺乳動物的有機體中產生。可用於產生rHA 的非哺乳動物的生物體的例子包括但不限於，酵母、細菌、植物、真菌和昆蟲。在一個實施方案中，rHA產生於整個植物或整個真菌。在另一實施方案中，rHA產生於培養的植物細胞， 培養的真菌細胞，或培養的昆蟲細胞。在另一實施方案中，rHA產生於非人類的哺乳動物或非人類的哺乳動物細胞。可使用非人類哺乳動物用於生產rHA的例子，包括但不限於下列中的任何一個牛科、犬科、豬科、齧齒目、兔形目以及靈長目動物(人類除外)。在特別的實施方案中，rHA生產中使用的非人類的哺乳動物選自由牛、狗、豬、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、 家兔、黑猩猩和大猩猩組成的組。在另一實施方案中，rHA生產使用的非人類的哺乳動物細胞包括但不限於牛、犬、豬、綿羊、山羊、齧齒動物、兔或者非人類靈長類動物細胞。與人體血液或漿液純化的白蛋白相比，利用非人類生物產生的rHA在生產過程中沒有人源性產品。 使用這種控制的生產方法，產品更純，結構異源性更少。以往的研究表明，可溶性rHA與從血液或漿液純化而來的人白蛋白之間，其生化特性、放射性標記效率和在體外和體內的生物學行為方面都沒有顯著的差異。見Dodsworth等，1996，Biotechnol. Appl. Biochem. 24 171-176。在特別的實施方案中，白蛋白是商品名RECOMBUMIN(R)(諾維信公司，英國諾丁漢)指定的rHA。RECOMBUMIN(R)是重組人體白蛋白，採用重組酵母技術在體外生產，其中基因修飾的酵母(釀酒酵母)分泌可溶性rHA，而後收穫，純化並配製，作為生物製藥輔料或醫療器械的塗層而使用。
可選地，形成了本發明的綴合物的白蛋白、白蛋白的變體或衍生物可以是商業來源的，例如，像RECOMBUMIN(R)(諾維信公司，英國諾丁漢)；PLASBUMIN人體白蛋白(R) (Talecris生物療法，北卡羅來納州研究三角園)；ALBAGEN(R)(新世紀製藥，漢茨維爾， AL)；人體白蛋白(皮質-生化，聖萊安德羅，加利福尼亞州)，人血清白蛋白，ZLB Behring 公司(普魯士國王，賓夕法尼亞州)，或ALBREC(R) (Mistubishi製藥公司，日本)。在本發明中，「白蛋白」是指任何具有水溶性的蛋白質，其中度溶於濃鹽溶液，並經歷熱凝聚(蛋白質變性)。其具有約65，000的分子量，由不同數量的胺基酸組成，這些胺基酸為609個胺基酸(在大多數物種中，包括人白蛋白)到615個胺基酸(例如雞白蛋白)。 它們都含有35個半胱氨酸殘基，其可用於與免疫原性肽通過二硫鍵形成綴合物。根據本發明，適合用於獲得綴合物的白蛋白包括但不限於人白蛋白(序列號力)或其成熟的部分 (序列號5的25至609位的胺基酸)與牛白蛋白(序列號6)或其成熟的部分(序列號 6的25至607位的胺基酸)。在本發明中使用的白蛋白還包括白蛋白的結構性變體，其來自保守的胺基酸替代，如在上文解釋的從A β (1-42) C端區域衍生的肽。在某些實施方案中，本發明的綴合物包括白蛋白的分子變體，例如在WO 2005/058958中所描述的，將其全部內容併入本文中作為參考。重組人血清白蛋白的變體已經可以從新世紀製藥(阿拉巴馬州漢茨維爾)買到，其名稱為Albagen 。根據本發明， 用於形成綴合物的白蛋白，可以採用本領域已知的方法或材料獲得。例如白蛋白是可以從商業途徑獲取到的，例如，諾維信公司(戴維斯，CA;來自釀酒酵母屬中的重組人白蛋白)； Cortex-Biochem(加州聖萊昂納多，Calif 血清白蛋白)，Talecris生物治療公司(北卡羅萊納州研究三角園；血清白蛋白)。ZLB Behring公司(普魯士國王，PA)，或新世紀製藥伊勒，阿拉巴馬州來自赤壁酵母屬(Pichia pastupsilonris)的重組人白蛋白)。白蛋白變體包括人類群體中白蛋白多態性的天然變體。通過各種條件下的電泳分析已經確定了人血清白蛋白的超過30個明顯不同的遺傳變體。參見例如狗itkamp等，Ann. Hum. Genet. , 36 (4) :381-92(1973) ；Weitkamp, Isr. J. Med. ScL,9(9) :1238-48(1973) ；Fine 等，Biomedicine，25 (8) :291-4(1976) ；Fine 等，Rev. Fr. Transfus. immunohematoL, 25 (2) 149-63. (1982) ；Rochu 等，Rev. Fr. Transfus. Immunohemato 1. 31 (5) :725-33(1988) ；Arai 等，Proc. Natl. Acad. Sd. U. S. A 86(2) :434-8 (1989)，它們的全部內容併入本文作為參考。 在具體的實施方案中，本發明提供與白蛋白的分子變體形成的綴合物。在一些實施方案中，本發明的綴合物包括與白蛋白具有實質性同源性的白蛋白衍生物。例如，綴合物可能由與白蛋白的胺基酸序列的同源性至少達到75%、至少為80%、至少有85 %、比較典型的至少90 %，最典型的至少95 %的白蛋白同源物形成。在某些是實施方案中，白蛋白的同源物包括游離的半胱氨酸。在一些實施方案中，本發明的綴合物包括白蛋白的結構衍生物。白蛋白的結構衍生物可包括具有白蛋白型活性的蛋白質或多肽。例如，白蛋白功能片段。在一些實施方案中，衍生物是白蛋白的抗原決定簇，即，可以通過抗白蛋白抗體識別的多肽的部分。在一些實施方案中，重組白蛋白可以是具有較高的血漿半衰期的任何蛋白質，該蛋白可以通過修飾編碼人血清白蛋白的基因而獲得。修飾的例子如，但不限於，重組白蛋白可以含有插入或缺失，白蛋白的痕量金屬結合區，從而結合痕量金屬元素，例如如美國專利號6，787，636 描述的鎳和/或銅的減少或清除，其內容整體併入本文作為參考。減少與白蛋白結合的痕量金屬，可以有利於減少在用白蛋白組合物處理的受試者的痕量金屬過敏反應的可能性。在某些實施方案中，白蛋白衍生物包括任何通過體外修飾白蛋白獲得的具有高血漿半衰期的大分子。在一些實施方案中，白蛋白由脂肪酸修飾。在一些實施方案中，白蛋白由金屬離子修飾。在一些實施方案中，白蛋白由對白蛋白具有高親和力的小分子修飾。在一些實施方案中，白蛋白通過糖類修飾，包括但不限於葡萄糖、乳糖、甘露糖和半乳糖。白蛋白的結構衍生物可以採用任何本領域技術人員已知的方法生產，包括但不限於，寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描以及聚合酶鏈式反應(PCR)突變。定
( Cotter, Biochem J 2371-7(1986), Zoller and Smith, Methods Enzymol 巧4329-50(1987))，盒式誘變，限制選擇誘變(Wells et alphal，Gene 34 315-323(1985)) 或其他已知的技術，可以在克隆的白蛋白編碼DNA上進行，產生白蛋白變體DNA或序列， 其編碼白蛋白的結構衍生物(Ausubel et al phal, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York(目前的版本)，Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3d ed, Cold Spping Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(2001)，其內容整體併入本文作為參考。在某些實施方案中，白蛋白衍生物包括任何在體外用血漿半衰期高於天然白蛋白修飾的白蛋白大分子。在一些實施方案中，白蛋白被一個或多個脂肪酸修飾。在一些實施方案中，白蛋白被一個或多個金屬離子修飾。在一些實施方案中，白蛋白被一個或多個對白蛋白具有高親和力的小分子修飾。在一些實施方案中，白蛋白被一個或多個糖類修飾，包括但不限於葡萄糖、乳糖、甘露糖、半乳糖。人血清白蛋白的製備，無論是從血清中獲得的或重組產生的，都可以包括非巰基白蛋白(即「封閉」白蛋白)和巰基白蛋白(即「不封閉」白蛋白)的異源混合物。人白蛋白多肽含有35個半胱氨酸殘基，其中34個形成17個穩定的二硫鍵。雖然巰基白蛋白的34 位的半胱氨酸殘基包括游離的SH基團，在非巰基白蛋白中相同的殘基包括與例如半胱氨酸或穀胱甘肽的混合二硫鍵，或經歷了由金屬離子或其他佐劑的氧化，從而使巰基反應活性降低或不反應。典型的是，巰基白蛋白富集的實現是使重組白蛋白與任何具有將氧化白蛋白Cys34轉化為還原白蛋白Cys34能力的因子，如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙酸(TGA)或 β-巰基乙醇(BME)等接觸。在本發明的某些實施方案中，重組白蛋白在綴合物反應前可以去糖基化。人們相信，白蛋白的去糖基化，尤其是酵母產生的重組白蛋白，可以產生形成相關綴合物耐受性和穩定性更優的白蛋白。一般來說，白蛋白的去糖基化可以採用本領域技術人員已知的能夠還原非酶催化的糖蛋白的任何技術，在任何條件下進行，如Miksik等人(J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.，1997，699 =311-345)所述。可選地，白蛋白可採用酶催化的方法去糖基化。例如，去糖基化可以通過使用糖類內切酶H或不同糖類內切酶的混合物進行。在另一實施方案中，重組白蛋白可以進一步加工，使綴合物具有更好的特異性，即減少非Cys34綴合物形成的可能性。舉例來說，重組白蛋白可以接觸化學阻斷殘基的試劑， 在該殘基處，已知人血清白蛋白形成共價佐劑。本領域已知的任何能夠阻斷除了 Cys34之外的白蛋白的反應點的試劑都可以使用。在一些是實施方案中，試劑阻斷了賴氨酸殘基。 白蛋白含有可變數目的賴氨酸殘基(例如，人白蛋白是60而牛白蛋白是61)，其中25-30 個賴氨酸殘基位於白蛋白表面，並可形成綴合物。因此，在一些實施方案中，本領域技術人員已知的阻斷白蛋白的任何賴氨酸殘基的試劑，也具有形成共價佐劑的潛力，如白蛋白的 Lys71、Lysl99、Lys351、Lys525、Lys541。連接區域源自Αβ (1-42)的C末端區域的肽和白蛋白可直接連接，或可選地，可以通過一個或多個連接基團連接(以下也稱為介入分子或間隔部分)。在本發明特殊的實施方案的綴合物中，如果至少一個免疫原性肽和白蛋白通過連接區M連接，那麼所述連接區M包含連接到其上的不超過一個免疫原性肽。在本發明的另一特殊實施方案的綴合物中，連接βΜ連接至少一個免疫原性肽和白蛋白，所述連接區域包括半胱氨酸，更優選地該半胱氨酸位於免疫原性肽的N末端。在某些實施方案中，連接基團是生物相容性的聚合物，例如，肽或含有聚合物的烷基或烷氧基。在具體的實施方案中，連接基團具有一個不穩定化學鍵的肽，該化學鍵可通過酶剪切或者在特定的化學條件下(例如，在酸性條件下)剪切。在一個實施方案中，修飾的肽包括一個活性基團通過一個或多個連接基團共價結合到該肽上。在某些實施方案中，連接基團包含一個或多個活性基團，典型地一個連接基團。在某些實施方案中，連接基團有1 到100個原子。正如本文所述，連接基團的長度通過連接基團連接的基團之間最短的鏈的原子數量表示。在某些是實施方案中，連接基團有1到100個原子、1到80個原子、1到60 個原子、1到50個原子、1到40個原子、1到30個原子、1到20個原子、10到20個原子或是5到15個原子。凡是出現超過一個連接基團的，該連接基團可以是相同或不同的連接基團。連接基團可以通過本領域技術人員已知的任何方法或技術連接到源自Αβ (1-42)的C 端區域的肽。在美國專利號6849714中描述了示範的方法或技術，將其內容整體併入本文作為參考。連接基團可以包括一個或多個烷基如甲基、乙基、丙基、丁基等基團，烷氧基、烯基、炔基或被烷基取代的氨基、環烷基、多環芳烴基、芳基、聚芳基、取代的芳基、雜環基和取代的雜環基。在某些實施方案中，連接基團可以選自包括氨基和羧基的連接基團，該連接基團包括但不限於ΑΕΑ,ΑΕΕΑ和OA。在某些實施方案中，連接基團可以是1到100個原子長度的 AEA聚合物。在某些是實施方案中，連接基團可以是1到100個原子長度的AEEA聚合物。 在某些實施方案中，連接基團可以是1到100個原子長度的OA聚合物。連接基團的說明性例子包括甘氨酸、賴氨酸、穀氨酸、異亮氨酸或精氨酸殘基、AEA、AEEA或0A(例如，OA 二聚體(-0Α-0Α-)或OA三聚體(0Α-0Α-0Α-)的單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、 七聚體、八聚體、九聚體、十聚體、十一聚體、十二聚體，或其任何組合(例如，任何組合GIyn、 Ly&、0A、AEA 或 AEEA，其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。在一些實施方案中，連接基團有單一的賴氨酸。該單一的賴氨酸可以被修飾，直接或通過一個或多個連接基團連接到活性基團上。例如，K基團可以通過例如側鏈的ε氨基連接到活性基團上，或一個或多個額外的連接基團。這種連接基團的例子，包括單一的賴氨酸，例如序列為(單體)aK(單體)b、K(單體)。和(單體)dK、其中a、b、c和d均為大於或等於一的整數，例如，一、二、三、 四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些實施例中，a和b可能是相同的，而在其他的實施例中，a和b是不同的。例如，a可以是3而b可以是4，可以提供具有以下順序的連接基團，(OA)nK(OA)n, (OA)nK(AEA)n, (G)nK(OA)n, (OA)nK(G)n,其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在活性基團位於兩個TMI^s之間接頭的情況下，兩個TMI^s之間的總長度一般不會超過100個原子。連接基團的連接不認為是兩個TMPS之間的接頭的一部分。連接基團可以包括上述生物相容聚合物的任意組合。例如，多聚甘氨酸接頭可與一個或多個具有任意結構的AEA、AEEA或OA單體相結合。在一個實施方案中，多聚甘氨酸接頭在多聚甘氨酸接頭中第一個或最後一個甘氨酸的殘基N或C末端，連接到一個或多個 AEA、AEEA或OA的單體。可選地在多聚甘氨酸接頭的甘氨酸殘基之間插入一個或多個AEA、 AEEA或OA單體。在特殊的實施方案中，活性基團(例如MPA、GMBA、NHS、磺酸基_NHS、MBS 或GMBQ，通過一個或多個連接基團來連接肽，其中包括，例如，多聚甘氨酸接頭、多聚甘氨酸-賴氨酸的接頭、AEEA、AEA或0A，或其任意組合。在某些實施方案中，活性基團通過多個連接基團連接到肽，連接基團通常可獨立地選自由包含多聚甘氨酸、多聚賴氨酸、AEA、AEEA 和OA組成的組中。在實施方案中，連接基團(例如單體聚合物單元)的數目可以為1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、1 10、1 11、1 12。凡有超過一個連接基團的情況下，連接基團可以是相同或不同的連接基團。例如多聚甘氨酸、多聚賴氨酸、AEA、AEEA和/或OA的任何順序的任意組合。在一個實施方案中，活性基團(通常是 MPA)通過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個多聚甘氨酸、多聚賴氨酸、AEA、AEEA或OA的連接基團依次排列連接到肽。在另一實施方案中，活性基團(通常MPA)通過1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11或12個多聚甘氨酸、多聚賴氨酸、AEA、AEEA或OA連接基團以分支的結構排列連接到肽。在另一實施方案中，連接基團是肽部分，其能夠充當源自於Αβ (1_42)C末端區域的肽和白蛋白之間的鉸鏈區，使得它們彼此獨立移動，而且保持各自的立體形狀。從這個意義上說，根據本發明的優選的非天然中間胺基酸序列將是鉸鏈區，其特徵在於具有允許此移動的結構性的延展性，或是非天然的彈性接頭。該彈性接頭可以是長度不超過20個胺基酸的彈性連接肽。在更優選的實施方案中，連接肽由2個胺基酸或更多選自包括甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸和蘇氨酸組成的組中的胺基酸。在本發明優選的實施方案中，所述彈性接頭是多聚甘氨酸接頭，但不限於多聚甘氨酸、多穀氨酸、多聚異亮氨酸、多聚精氨酸或包括兩個或兩個以上胺基酸的其他合適的連接基團。在一些例子中，胺基酸連接基團可以包括至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二個胺基酸殘基，例如甘氨酸或賴氨酸殘基。多聚甘氨酸接頭可以包含以任意結構插入的一個或多個不同殘基(如賴氨酸殘基)，例如，在N 或C末端附近，或在甘氨酸殘基延伸的中間。在其他實施方案中，多聚甘氨酸接頭以任意的結構與AEA、AEEA或OA的一個或多個單體相結合，在一個實施方案中，多聚甘氨酸接頭，在多聚甘氨酸接頭中第一個或最後一個甘氨酸的殘基的N或C末端，連接到一個或多個AEA、 AEEA或OA的單體。可選地，在多聚甘氨酸接頭的甘氨酸殘基之間插入一個或多個單體的 AEA、AEEA或OA。例如，如果多聚甘氨酸作為接頭，多聚甘氨酸可以包括單一的賴氨酸，以提供了一個能夠與另一個接頭或蛋白質反應的游離的ε氨基。這種包括胺基酸(例如，單一的賴氨酸)的多聚甘氨酸的例子，具有例如(G) aK (G)b、K (G)。、(G)dK的胺基酸序列。其中a、 b、c和d每個是大於或等於1的整數，例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些實施例中，a和b可以是相同的，而在其他的實施例中a和b是不一樣的。 例如，a可以是3而b可以是4。在一些實施例中，多聚甘氨酸接頭內的單賴氨酸可以本身連結到其他基團，例如，一個連接基團、活性基團或活性基團的殘基。例如，賴氨酸殘基可以與一個或多個額外的接頭連接，例如側鏈的ε氨基。接頭/間隔物序列可能的例子包括SGGTSGSTSGTGST(序列號7)， AGSSTGSSTGPGSTT(序列號8)或 GGSGGAP(序列號9)和 GGGKGGGG(序列號10)。這些序列被用於結合指定的螺旋到其他蛋白的結構域((Muller，K.M.，Arndt，K.M. and Alber,T.， Meth. Enzymology, 2000, 328 :261-281).。所述接頭優選地包括胺基酸序列GGGVEGGG (序列號11)或由胺基酸序列GGGVEGGG(序列號11)組成。連接區域的作用是為源自Αβ (1-42)的C端區域的肽和白蛋白之間提供間隔。因此，這確保了源自Αβ (1-42)的C端的肽的二級結構不會受到白蛋白存在的影響，反之亦然。間隔物優選地具有肽性質。連接肽優選地包括至少2個胺基酸、至少3個胺基酸、至少 5個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少30個胺基酸、至少 40個胺基酸、至少50個胺基酸、至少60個胺基酸、至少70個胺基酸、至少80個胺基酸、至少90個胺基酸或約100個胺基酸。此外，接頭可以通過共價鍵結合到源自Αβ (1_42)C端區域的肽和白蛋白的兩側的組合物，優選地間隔物基本上是非免疫原性和/或不包括任何半胱氨酸殘基。在類似的方式中，間隔物的三維結構優選地是線性的或實質上線性的。接頭可以包括四連接素的53-56殘基，其在四連接素中形成了 β摺疊，殘基57_59 在四連接素形成了轉角(Nielsen, B. B.等，FEBS Lett. 412 =388-396,1997) 該片段的序列是GTKVHMK(序列號12)。此接頭的優勢是當它在天然四連接素中出現時，適合與三聚域與CRD域結合，因此總的來說，它適合連接三聚域到另一個域。此外，由此產生的結構不會有比沒有接頭的結構具有更多的免疫原性。另外，來自人纖連蛋白鏈3的子序列可被選擇作為接頭，相對應的是胺基酸1992 至 2102(SWISSPR0T 編號，登錄號(entry) P02751)。子序列 PGTSGQQPSVGQQ (序列號13)對應的胺基酸數2037至2049優選地採用，其中，對應於胺基酸2038至2042的子序列片段 GTSGQ(序列號14)是更優選的。這種結構的優勢在於，它不太容易被蛋白酶剪切，不具有非常高的免疫原性，因為纖維連接蛋白在血漿中高濃度存在。可選地，合適的肽接頭可以以小鼠IgG3上遊鉸鏈區的10個胺基酸殘基序列為基礎。根據本發明，這種肽(PKPSTPPGSS，序列號1 已被用來產生螺旋(Pack P.和 Pluckthun,A.，1992，Biochemistry 31 :1579-1584) 二聚抗體，且可作為有用的間隔肽。更優選人IgG3上遊鉸鏈區的相應的序列。人IgG3序列預計不會在人類中產生免疫原性。在優選的實施方案中，連接肽選自由序列APAETKAEPMT的多肽(序列號16)和GAP序列的肽組成的組中。在特別的實施方案中，連接區不包括以下基團-N(CH2-)2、-NHCH <或-NHCH (CH2-) 2。在特別的實施方案中，本發明的綴合物不具有以下結構
權利要求
1.一種用於藥物的綴合物，包含至少一個源自Αβ (1-42)C端區域的免疫原性肽和白蛋白。
2.根據權利要求1所述的綴合物，其中如果該至少一個免疫原性肽和白蛋白通過接頭區域連接，所述接頭區域包含連接在其上的不超過一個免疫原性肽。
3.根據權利要求2所述的綴合物，其中該至少一個免疫原性肽是通過包含半胱氨酸的接頭區域與白蛋白分子連接的。
4.根據權利要求3所述的綴合物，其中所述半胱氨酸位於免疫原性肽的N末端。
5.根據權利要求1至4所述的綴合物，其中源自Aβ (1-42)C端區域的肽選自由一個或多個 Αβ (35-42)(序列號2)、Αβ (33-42)(序列號3)和 Αβ (33-40)(序列號4) 組成的組中。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的綴合物，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。
7.一種用於藥物的組合物，包含根據權利要求1至6中任一項所述的綴合物和佐劑。
8.根據權利要求7所述的組合物，其中所述佐劑選自由Thl型佐劑、Th2型佐劑和混合型Thl/Th2型佐劑組成的組中。
9.一種包含至少一個源自Αβ (1-42) C端區域的免疫原性肽和白蛋白的綴合物或包含至少一個源自Αβ (1-42) C端區域的免疫原性肽和白蛋白以及佐劑的組合物，所述綴合物或組合物用於治療或預防澱粉樣蛋白沉積有關的疾病。
10.根據權利要求9所述的供使用的綴合物或組合物，其中所述綴合物或組合物是雙周施用的。
11.根據權利要求10所述的供使用的綴合物或組合物，其中如果至少一個免疫原性肽和白蛋白通過接頭區域連接，所述接頭區域包含連接在其上的不超過一個的免疫原性肽。
12.根據權利要求9至11中任一項所述的供使用的綴合物或組合物，其中源自Αβ (1-42) C端區域的所述肽選自Αβ (35-42)(序列號2)、Αβ (33-42)(序列號3)和Αβ (33-40)(序列號4 )。
13.根據權利要求9至12中任一項所述的供使用的綴合物和組合物，其中所述與澱粉樣蛋白沉積有關的疾病選自阿爾茨海默氏症、克雅氏病、腦澱粉樣血管病和朊蛋白相關疾病。
14.根據權利要求9至13中任一項所述的供使用的綴合物或組合物，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。
15.根據權利要求9至14中任一項所述的供使用的綴合物，其進一步包含佐劑。
16.根據權利要求15所述的供使用的綴合物，其中所述佐劑選自由Thl型佐劑、Th2型佐劑和混合型Thl/Th2型佐劑組成的組中。
17.根據權利要求9至16中任一項所述的供使用的綴合物或組合物，其中所述綴合物和組合物是雙周施用的。
全文摘要
本發明提供了包含白蛋白和源自β澱粉樣蛋白肽C端區域的肽的綴合物，以及其在治療具有澱粉樣蛋白沉積特徵的疾病尤其是在阿爾茨海默氏病的治療上的用途。
文檔編號A61K39/00GK102458478SQ201080031742
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者J·曼努埃爾·薩拉薩·巴裡奧 申請人:阿拉克隆生物技術商業有限公司