一種新的線紋芋螺毒素序列、製備方法及其應用的製作方法
2023-12-08 20:19:46
專利名稱：一種新的線紋芋螺毒素序列、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的中國南海線紋芋螺毒素基因及其編碼的多肽序列S6.8和該多肽的製備技術，以及該毒素在神經生物學研究和離子通道藥物開發中的應用。
背景技術：
芋螺屬於腹足綱芋螺科(Conidae)，棲息在熱帶海洋的淺海水域，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名。芋螺具有強大的自然進化能力，單一種屬中就包括有數百種物種，這種能力使芋螺成為了海洋無脊椎動物中進化最成功的生物。芋螺的獵食裝置形態與其毒液化學成分也在自然進化過程中不斷進化發展，以適應不同的棲息環境與捕食對象，構成了極富多樣化的形態。芋螺食物種類很廣，根據其捕食習性分為食魚芋螺、食螺芋螺、食蟲芋螺。芋螺毒液的毒性很強，人被刺傷時亦常導致嚴重傷害，甚至死亡，國內外報導過多例由織錦芋螺(C.textile)、地紋芋螺(C.geographus)等刺傷致死的事例。
芋螺毒液是捕食與防禦作用的主要武器，它是由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素，主要成分是一些對不同離子通道及神經受體高專一性的活性多肽化合物，即芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常為由10～30個胺基酸殘基組成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架，使之形成高度限定的立體構象。與蜘蛛、蠍、蛇、海葵等許多動物的毒素比較，芋螺毒素的肽鏈短得多，二硫鍵豐富，分子結構更為緊密，但是生物活性卻很高。大多數芋螺毒素均由單一的mRNA編碼，原始的翻譯產物是一種特定的多肽前體，約為70-120個胺基酸殘基，經蛋白酶水解後得到成熟肽。
二十世紀八十年代初，美國猶它大學Olivera BM學者實驗室最早展開了芋螺毒素全面系統研究工作。現在，芋螺毒素以其分子小，結構穩定，對受體作用範圍廣並且活性強的特點，已經躍居於動物神經毒素研究的首位。由於它們作用靶點廣泛，能高度特異地結合細胞膜上神經遞質和激肽的受體和各種離子通道，一方面，可以被直接開發成藥物或作為新藥的先導化合物應用於臨床；另一方面，可以成為神經生物學中發現鑑定新受體，研究受體構效關係及其調控細胞分子機理的重要探針，並推動了離子通道的進化研究。
至今，已經得到分離的芋螺毒素有近千種，數十種芋螺毒素已申請美國專利。它們在鎮痛、局部缺血性保護、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應用價值，有的已進入臨床研究或已被FDA正式批准為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮痛藥。目前，由Elan公司進行開發的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用分布於神經組織的N-型鈣離子通道，無需第二信使或蛋白，不成癮，已成為治療難治性神經疼痛的新一代藥物，已通過了III期臨床試驗，正式被FDA批准上市。而另一個衍生於ω-CTX C VID的化合物AM336作用類似於Ziconotide，因其對N-鈣通道的選擇性更強，副作用更低，已經批准作為對抗嚴重抗嗎啡作用慢性疼痛的治療藥物進入臨床試驗階段。此外，Conantokin-G作為NMDA受體高度選擇性的拮抗劑，對難以治療的癲癇有效，也已完成I期臨床試驗。芋螺毒素藥用研究的其他方向還有具有去甲腎上腺素轉運蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用於治療抑鬱症。以及抑制α1-腎上腺素受體的一些芋螺毒素，可用於治療良性前列腺過度增生引起的尿失禁。與此同時，圍繞著增強藥物分子的穩定性，降低過敏反應以及增加溶解性以利於口服目的的分子改造研究工作也正在進行。利用高通量篩選手段，以ω-conotoxin芋螺毒素分子為參考的一系列有機小分子得到了設計合成，顯示了良好的應用前景。
另一方面，芋螺毒素作為研究離子通道和膜受體的極好探針或工具，已經成為電壓門控型鈣離子通道(VSCCs)和N型乙醯膽鹼受體(nAChRs)等通道、受體鑑定和診斷的標準工具，在神經藥理學領域得到了廣泛的應用。
芋螺在我國南海等海域亦有廣泛分布，已查明的芋螺約有80餘種。近年來，國內也開展了芋螺毒素的生物化學、分子生物學以及藥理作用等方面的研究工作。中國科學院北京藥物化學研究所的陳冀勝研究員等人已自桶形芋螺(C.betulinus)、獨特芋螺(C.caracteristileus)、菖蒲芋螺(C.vexillum)、地紋芋螺(C.geographus)等類芋螺中分離鑑定了十餘種新序列的芋螺毒素。軍事醫學科學院生物工程研究所的盧柏松、黃培堂以及戴秋雲等著重對我國的線紋芋螺、織錦芋螺的毒素基因或毒液成份進行了研究，從中也發現了一些新的毒素成分和基因序列。雖然我國有著豐富的芋螺資源，但由於起步較晚，目前對於芋螺毒素的研究尚處於初期階段。
線紋芋螺(Conus striatus)是我國海南可採到的少數食魚芋螺種類之一，其毒液對人類有傷害作用。由於其分布較多，形體較大，毒管組織分離提取較為容易，毒素成分對於高等動物作用較為明顯，因而成為眾多學者們在多肽化學、分子生物學、毒理學、生態學等多領域的研究熱點。目前，從線紋芋螺毒素中已得到分離鑑定研究的毒素包括2種ω-家族芋螺毒素(SVIA和SVIB)、3種α-家族芋螺毒素(SI，SIA，SII)、2種κA-家族芋螺毒素(κA-SIVA和κA-SIVB)、1種δ家族-芋螺毒素(SVIE)、一種μ-家族芋螺毒素(SIIIA)。儘管線紋芋螺毒素已有近五十年的研究歷史，近來仍然有新的毒素成分被陸續發現報導。
由於芋螺毒素在其基因序列和蛋白質結構及功能方面差異較大，具有種類繁多，結構複雜和高度遺傳多樣性特徵。構建芋螺毒素cDNA文庫，從中篩選新毒素基因仍然是研究新芋螺毒素及其分子特徵的重要途徑之一。迄今為止，國外已構建了多種芋螺的cDNA文庫，而國內尚未有相關報導。
另外，目前有關芋螺毒素的生化結構及其神經藥理活性的研究都是基於天然提取毒素的分子結構，用人工合成的毒素來研究的。雖然已克隆到很多芋螺毒素基因，但目前鮮有芋螺毒素基因體外表達的報導。重組芋螺毒素將以其質優、價廉的優勢，代替產率低、成本昂貴的人工合成毒素。開展芋螺毒素體外表達技術的研究，將具有非常重要的理論研究價值和應用價值。
因此，開展我國南海線紋芋螺毒素的生物化學、藥理學等，尤其是其分子生物學和基因工程技術領域的探索研究將有助於對新毒素分子相應受體及其作用機制的深入研究，而且可為我國芋螺海洋資源的藥用開發利用提供重要理論依據。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新的中國南海線紋芋螺毒素基因及其編碼的多肽片段S6.8及其類似物和衍生物。
本發明的另一目的在於提供該多肽的生產方法。
本發明的第三個目的在於提供該多肽在製備神經生物學研究的工具藥和治療心律失常、頑痛、癲癇以及中風等疾病藥物中的應用。
通過cDNA文庫的構建和測序的方法，從中國南海線紋芋螺毒管中分離得到新的O-超家族芋螺毒素S6.8基因，其DNA序列如序列表中4001序列所示。
上述本發明基因所編碼的多肽S6.8，其胺基酸序列如序列表中4002序列所示；其成熟肽的分子量為2,746道爾頓，其理論等電點為4.35。
該蛋白通過原核細胞融合表達載體pTRX在大腸桿菌中以胞內可溶的形式表達。
所述表達載體pTRX(申請人自行構建並申請中國專利，專利名稱為一種高效原核表達載體，專利號00124832.4，授權公告號1189565C)是以硫氧還蛋白為融合伴體，中間插入His的親和標記位點及蛋白酶3C識別位點的高效表達載體。
該重組線紋芋螺毒素S6.8可明顯延遲脊椎動物大腦神經元細胞膜鈉離子通道的失活，從而延長鈉離子通道的開放時間。
本發明所選擇的線紋芋螺採自海南省三亞市。
線紋芋螺毒管cDNA文庫的構建取活螺體，使用喉閘破碎螺殼，暴露出螺肉，冰上小心並快速分離毒管組織，提取總RNA。反轉錄為一鏈cDNA後合成雙鏈cDNA，雙鏈cDNA與pcDNA3.0載體連接後轉化E.coli，並保存每個重組克隆。
本發明通過對文庫重組克隆大規模序列測定，從中得到了1個新的編碼芋螺毒素的克隆，命名為S6.8(其DNA序列如序列表中4001序列所示)。新基因編碼78個胺基酸殘基，包括有25個胺基酸的信號肽、26個胺基酸的前導肽和27個胺基酸的成熟肽。其信號肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布與O-超家族芋螺毒素其它成員具有較高的保守性。前導肽和成熟肽的胺基酸與δ-家族芋螺毒素成員相似性更高。成熟肽段分子量為2,746道爾頓，其理論等電點為4.35。
本發明通過設計了一對引物，將編碼新毒素S6.8的成熟肽基因克隆到原核融合表達載體pTRX上(本實驗構建)，構建表達質粒並將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)。此表達載體(pTRX-S6.8)以T7為啟動子，TRX為分子融合伴體，幫助重組蛋白正確摺疊，以可溶的形式表達，TRX的C端有柔鏈區和6×His結構，便於利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所設計的上遊引物含有蛋白酶3C位點，利於外源蛋白單體的獲得。通過對培養時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和優化，TRX-S6.8融合蛋白的表達量較高，絕大部分處於可溶狀態。
本發明還摸索和優化了重組S6.8蛋白的酶切和純化條件，表達產物的超聲裂解液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到融合蛋白，融合蛋白經3C蛋白酶切割、超濾和反相高效液相層析，可得到純度在95％以上的重組S6.8多肽的成熟肽。
電生理實驗結果證實，重組線紋芋螺毒素S6.8可以特異性作用於脊椎動物大腦神經元細胞膜鈉通道，明顯延遲鈉通道的失活，延長鈉離子通道的開放時間。因此本發明的重組芋螺毒素S6.8可以用於製備神經生物學研究的工具藥和治療心律失常、頑痛、癲癇以及中風等疾病的藥物。
本發明的表達質粒複製方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法將質粒轉化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青黴素(100μg/mL)的LB培養基培養轉化菌株，鹼法提取質粒。
圖1為線紋芋螺毒素S6.8成熟肽與不同種的O-超家族芋螺毒素成熟肽序列同源性分析結果。其中加黑和陰影表示相同胺基酸。
圖2為線紋芋螺毒素S6.8基因PCR產物的2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析結果。1DL2000DNA分子量標準；2S6.8基因PCR產物；3PCR反應陰性對照。
圖3為pTRX-S6.8融合表達質粒的構建流程示意圖。
圖4為pTRX-S6.8重組表達載體PCR鑑定2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析結果。1DL2000DNA分子量標準；2重組表達質粒pTRX-S6.8的PCR產物；3PCR反應陽性對照4PCR反應陰性對照。
圖5為pTRX-S6.8重組表達載體酶切鑑定2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析結果。11Kb DNA分子量標準；2重組表達質粒pTRX-S6.8；3重組表達質粒pTRX-S6.8經KpnI和NotI雙酶切產物。
圖6為重組線紋芋螺毒素TRX-S6.8誘導表達和親和層析純化Tricine SDS-PAGE電泳分析結果。1蛋白分子量標準；2誘導後的菌體超聲上清；350mMTris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑親和層析洗脫峰；450mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，50mM咪唑親和層析洗脫峰；550mM Tris-HCl(pH8.0).0.5MNaCl，150mM咪唑親和層析洗脫峰；650mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，200mM咪唑親和層析洗脫峰；750mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，250mM咪唑親和層析洗脫峰。
圖7為重組線紋芋螺毒素TRX-S6.8酶切後超濾及反相高效液相色譜純化TricineSDS-PAGE電泳分析結果。1超低蛋白分子量標準；2TRX-S6.8蛋白酶切後產物；310kDa超濾膜內組分；4濃縮後10kDa超濾膜外組分；51kDa超濾膜外組分；6保留時間為14.250min的高效液相洗脫峰；7保留時間為18.569min的高效液相洗脫峰。
圖8為重組線紋芋螺毒素S6.8的反相高效液相色譜分離圖譜。
圖9為重組線紋芋螺毒素S6.8對SD大鼠乳鼠海馬神經元細胞鈉電流峰值電流-電壓關係的影響結果。
圖10為重組線紋芋螺毒素S6.8作用前後鈉離子通道最大開放曲線單指數擬合曲線。
具體實施例方式
以下實施例將有助於本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。
實施例1線紋芋螺毒管cDNA文庫的構建和鑑定總RNA的提取和cDNA合成分離線紋芋螺毒管，參照Gibco BRL公司的TRIZOL試劑說明書進行毒管總RNA提取。取1μg線紋芋螺毒管總RNA以SMARTIII olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDS III/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)進行逆轉錄合成第一鏈，得到10μl cDNA第一鏈產物。2μl第一鏈產物以5』PCR primer(5』-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3』)，CDS III/3』PCR primer(5』-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3』)進行第二鏈擴增。將第二鏈蛋白酶K消化並純化後進行Sfi I切割，連接入同樣Sfi I酶切處理過的pcDNA3.0文庫載體(購自Invitrogen公司)上。反應體系5μl，轉化其中1μl，取1/200、1/100和2/100體積轉化液分別塗板，其餘用於搖總庫菌落。從平板中挑取單克隆保種並隨機挑取一定數目的單克隆進行測序和生物信息學分析。
實施例2線紋芋螺毒素S6.8基因的序列分析線紋芋螺毒素S6.8基因的質粒和序列來自實施例1文庫中strivd4(QID)的基因簇。對其進行生物信息學分析，結果顯示其cDNA全長序列長度為601bp，其讀碼框編碼78個胺基酸殘基，包括有25個胺基酸的信號肽、26個胺基酸的前導肽和27個胺基酸的成熟肽。其信號肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布(C-C-CC-C-C)與O-超家族芋螺毒素其它成員具有較高的保守性。前導肽和成熟肽的胺基酸分析顯示其與δ-家族芋螺毒素成員相似性更高(見圖1)。進一步分析顯示，線紋芋螺毒素S6.8基因編碼的成熟肽段含有較少的帶電胺基酸，疏水性程度與δ-家族芋螺毒素成員最為接近。該家族毒素可以通過摺疊在表面形成疏水性區域與通道蛋白的疏水部分結合，從而特異作用於脊椎動物的Na+通道，延遲通道的失活。物理化學性質預測線紋芋螺毒素S6.8成熟肽分子量為2,746道爾頓，理論等電點為4.35。預測顯示該小肽體外存在的穩定性較差，不宜分泌表達。三級結構預測，S6.8成熟肽分子呈球狀，構成三對二硫鍵，主要由短的反向β-摺疊和一些轉角所構成，不含有α-螺旋。三級結構骨架與其它已知的O-超家族芋螺毒素的結構相類似。
實施例3重組線紋芋螺毒素S6.8表達質粒的構建根據S6.8基因編碼成熟肽的胺基酸序列和大腸桿菌的密碼子偏好性，設計併合成PCR反應的模板，並結合pTRX質粒(申請人自行構建並申請中國專利，專利名稱為一種高效原核表達載體，專利號00124832.4，授權公告號1189565C)的多克隆位點，設計S6.8基因片段的擴增引物，如下所示。在上遊引物中引入Kpn I酶切位點以及ProScission Protease切割位點，下遊引物中引入Not I酶切位點及雙終止密碼了。PCR產物經卸Kpn I和Not I酶切與pTRX載體相連後，TRX基因、6個組氨酸序列、蛋白酶PreScission Protease識別位點序列、S6.8基因編碼成熟肽的核苷酸序列和終止子TTA TAA融合在一起，並構成一個完整的讀碼框。
PCR反應S6.8基因的成熟肽模板5』GAT GGT TGC TCG AAC GCT GGT GGC TTT TGC GGC ATT CAT CCAGGT CTG TGT TGT AGC GAG ATT TGC TTG GTG TGG TGT ACG 3』上遊引物5』CGGGGT ACC GATKpn I 3C Precision Protease siteGGTTGCTCGAACGCT 3』S6.8下遊引物5』ATTTGCGGCCGC CGTACACCACACCAAGC 3』Not I stop codon S6.8以合成的S6.8成熟肽基因為DNA模板，經PCR擴增出的S6.8基因片段(含限制性內切酶酶切位點和蛋白酶PreScission Protease識別序列)約為120bp，與預期PCR產物大小一致(見圖2)。擴增產物用Kpn I和Not I酶切後，克隆進線性載體pTRX，構建融合表達質粒pTRX-S6.8，其構建過程見(見圖3)。表達載體經PCR鑑定(見圖4)和酶切鑑定(見圖5)，片段大小正確。對重組質粒進行雙向測序，其序列與合成的模板序列結果完全一致，說明合成的引物與PCR擴增的S6.8基因無誤，插入表達載體的S6.8基因的讀碼框正確。
實施例4重組線紋芋螺毒素S6.8的表達將pTRX-S6.8轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Invitrogen公司)。基因工程菌超聲裂解上清液經SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經誘導後有明顯的特異表達產物帶，分子量與軟體預測的理論值17kD相符(見圖6)。
在其他條件不變的情況下，經過對培養時間，誘導濃度，溫度等條件的摸索，確定在大量表達重組線紋芋螺毒素TRX-S6.8時採了20℃的低溫誘導，0.05mM IPTG誘導10hr左右的優化方案。
實施例5重組線紋芋螺毒素S6.8的純化將誘導表達後的培養菌液在4℃，6,000rpm/min離心5分鐘，菌體先用TE緩衝液(pH8.0)重懸，離心，再用預冷的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，500mmol/L NaCl溶液洗滌菌體，超聲處理後，裂解上清液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析一步純化。收集穿流峰，分別用不同濃度咪唑(20mmol/L、50mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)的50mM Tris(pH8.0)，500mmol/L Na Cl緩衝液洗脫至平臺期，分別收集洗脫峰進行Tricine SDS-PAGE檢測。結果表明，重組TRX-S6.8蛋白主要集中於150-250mmol/L的咪唑洗脫峰中，在250mmol/L咪唑洗脫峰中融合蛋白的含量達70％以上(見圖6)。
實施例6重組線紋芋螺毒素S6.8的酶切通過Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow親和層析所得到的純化的融合蛋白，通過Sephadex G-25以除去咪唑並更換緩衝液為酶切緩衝液，進行酶切。從酶量、酶切溫度、酶切時間、酶切緩衝液等方面進行了酶切條件的優化，確定最佳條件為50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.2mmol/L DTT(pH8.0)酶切緩衝液中20℃酶切作用16hr。
實施例7重組線紋芋螺毒素S6.8酶切後純化分別使用了切割分子量(MWCO)為10kDa和1kDa的超濾膜來進行樣品的分離和濃縮處理。電泳結果顯示，10kDa的超濾膜可以有效地攔截住分子量大於10kDa的大蛋白，從而將絕大部分的雜蛋白攔截在膜內(見圖7)。將濃縮後的樣品，採用C18反向柱進行梯度洗脫分離。流動相AH2O(含0.1％TFA)B乙腈(0.1％TFA)，流速0.8ml/min。檢測215nm處的紫外吸收值，三個洗脫峰的保留時間分別為10.296min、14.250min和18.569min(見圖8)，分別收集洗脫峰，並進行了鑑定。飛行時間質譜和生物學活性鑑定結果顯示，保留時間為14.250min的洗脫峰中組分的為正確摺疊的重組多肽。
實施例8重組線紋芋螺毒素S6.8生物學活性檢測腹腔注射不同濃度20μl的重組線紋芋螺毒素S6.8溶液之後，金魚在15-20min之內出現不同程度的異常行為，記錄見表1。
表1為腹腔注射重組線紋芋螺毒素S6.8溶液後金魚的行為記錄
注高劑量為50nmol/g；中劑量為5nmol/g；低劑量為500pmol/g；陰性組注射20μl的生理鹽水。
實施例9重組線紋芋螺毒素S6.8對鈉離子通道的作用以SD大鼠乳鼠海馬神經元細胞為實驗標本，應用全細胞膜片鉗模式進行全細胞電流的記錄。對照組和實驗組分別記錄的是使用0.1μM毒素前後在梯度去極化條件下的全細胞鈉電流。鉗制電壓為-70mV，刺激電壓從-70mV至+40mV，脈衝間隔為10mV，刺激電壓的脈衝寬度為15ms。實驗記錄結果見圖9，與對照組相比，毒素能夠明顯增大細胞內向鈉電流。使用單指數擬合的方法對毒素作用前後鈉通道在最大激活電壓-20mV下的最大開放曲線進行擬合，得到各項參數如表2，繪製擬合曲線如圖10。計算結果顯示，毒素作用前後鈉通道開放時間由0.40±0.02ms延長至0.52±0.01ms。由此可見，重組線紋芋螺毒素S6.8可以明顯延遲通道的失活，從而延長鈉通道的開放時間。
表2重組線紋芋螺毒素S6.8作用前後鈉離子通道最大開放曲線單指數方法擬合得到的各項參數
序列表110中山大學120一種新的線紋芋螺毒素序列、製備方法及其應用16022101211234212DNA213中國南海線紋芋螺(Conus striatus)220
221precursor peptide222(109)…(345)40011 gaggcaacag tgacacgtgt atcacatcgt ctgtctgatc ttgcacggt gaacttggtt tcatatttct7071 ccactgtctt ctttggcatc acccaaaaca tcaccaag109ATGAAA CTG ACG TGC ATG ATG ATC GTT GCT GTG CTG TTC TTG ACC GCC TGG ACA TTC GTC 1681 M K L T C M M I V A V L F L T A W T F V 20169 ACG GCT GAT GAC TCC AGA AAT GGA CTG AAG AAT CTT TTT CCG AAG GCA CGT CAT GAA ATG 22821 T A D D S R N G L K N L F P K A R H E M 40229 AAG AAC CCC GAC GCC TCT AAA TTG AAC AAG AGA GAT GGG TGC TCT AAT GCT GGT GGA TTT 28841 K N P D A S K L N K R D G C S N A G G F 60289 TGT GGC ATC CAT CCA GGA CTC TGC TGC AGC GAG ATT TGC CTG GTT TGG TGC ACA TGA 34561 C G I H P G L C C S E I C L V W C T * 79346 gtgctattct actggtacat tttgtggctt caacggagga ctctgctgca gcaacctttg cttatttttc 415416 gtgtgcttaa cattttcgtg atgtcttcta ctcccctctg tgctacctgg cttgatcttt gattggcgcg 485486 tgcccttgac tgattatgaa cccccctgat ccgactgtct ggaggcctca ggggtccaac atccaaataa 555556 agcgacatca taatgacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa
210221178212PRT213中國南海線紋芋螺(Conus striatus)220
221precursor peptide222(1)…(78)40021 M K L T C M M I V A V L F L T A W T F V 2021 T A D D S R N G L K N L F P K A R H E M4041 K N P D A S K L N K RD G C SN A G G F6061C G I H P G L C C S E I C L V W C T*79
權利要求
1.從中國南海線紋芋螺毒管中分離得到基因，其核苷酸序列如序列表中4001序列所示。
2.一種多肽，其含有權利要求1所述基因編碼的胺基酸序列、或其保守性變異多肽序列或其活性衍生物。
3.按權利要求1所述的多肽，其特徵在於該多肽的胺基酸序列如序列表4002所示。
4.權利要求3所述的多肽的成熟肽片段DGCSNAGGFCGIHPGLCCSE ICLVWCT。
5.編碼權利要求4所述的多肽片段的核苷酸序列。
6.權利要求4所述的成熟肽片段的C末端醯胺化、或脯氨酸羥化修飾物。
7.權利要求4所述的多肽的生產方法，按照以下步驟進行(1)將編碼權利要求4所述的成熟肽基因克隆到原核融合表達載體pTRX上，構建表達質粒並將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)；(2)培養轉化後的大腸桿菌BL21(DE3)；(3)對大腸桿菌BL21(DE3)進行超聲裂解，將表達產物的裂解液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到融合蛋白；(4)融合蛋白經3C蛋白酶切割、超濾和反相高效液相層析，得到重組S6.8多肽的成熟肽。
8.權利要求2、3、4或6所述多肽用於製備神經生物學研究的工具藥和治療心律失常、頑痛、癲癇以及中風等疾病藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及一種新的中國南海線紋芋螺毒素基因及其編碼的多肽序列S6.8，該多肽的製備技術，以及該毒素在神經生物學研究和離子通道藥物開發中的應用。本發明通過構建cDNA文庫的方法，從中國南海線紋芋螺毒管中克隆得到的新的O－超家族芋螺毒素，其DNA序列如序列表中1序列所示。該基因編碼的多肽(芋螺毒素S6.8)，其前體肽和推測的成熟肽胺基酸序列如序列表2序列所示。本發明製備的重組線紋芋螺毒素S6.8可明顯延遲脊椎動物大腦神經元細胞膜鈉離子通道的失活，從而延長鈉離子通道的開放時間，可作為探針用於離子通道類型及亞型的分類鑑定或者作為先導化合物用於新藥的研製開發。
文檔編號A61K38/17GK1982457SQ200610035328
公開日2007年6月20日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者徐安龍, 劉芸, 王磊, 董美玲 申請人:中山大學