單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法及其應用的製作方法
2023-12-08 20:37:01 2
專利名稱：單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物殘留檢測領域。
背景技術：
硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥理動力學特性，除了作為一種抗生素被應用於獸醫醫療中外，它還曾作為豬、禽與水產品促生長的添加劑被廣泛應用。但在長時間的實驗室研究過程中發現，硝基呋喃類藥物及其代謝產物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，鑑於此，歐盟分別於1993年(歐盟法令2901/93)與1995年(歐盟法令1442/95)立法禁止在動物源性食品生產加工過程中使用呋喃它酮(Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃咀啶(Nitrofurantoin)與呋喃唑酮(Furazolidone)等四種藥物。其後，美國、加拿大、澳新與日本等國均全面禁止使用硝基呋喃類藥物。2002年3月我國也將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥。研究證明，硝基呋喃類藥物在動物體內若干小時就會迅速分解成硝基呋喃與各種代謝產物，這些代謝產物與組織內蛋白質形成較為穩定的化合物，該化合物可以在組織中存留較長時間，所以分析此類藥物殘留時應該對其代謝產物進行檢測分析，歐盟等國就是以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃殘留的目的。四種硝基呋喃類藥物的代謝產物分別對應為呋喃它酮-3-氨基-5-嗎啉基-2-氧唑酮(AMOZ)；呋喃西林—氨基脲(SEM)；呋喃咀啶-1-氨基咀啶(AHD)；呋喃唑酮-3-氨基-2-氧唑酮(AOZ)。
隨著我國加入世貿組織一年多以來，歐美日等發達國家利用自身技術優勢對我國出口食品及農副產品不斷設置新的技術壁壘措施，以達到限制我國食品與農副產品的出口，有關這方面的貿易糾紛接踵而來，歐盟早在2000年初就開始了一項長達42個月的FoodBRAND計劃(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求歐盟各認可實驗室對食品中硝基呋喃類殘留檢測方法(包括ELISA與LC-MS-MS方法)進行攻關研究，以為其設置技術壁壘提供技術支持。目前，歐盟規定不得在食品中檢測出硝基呋喃類藥物四種代謝產物殘留，鑑於此，歐盟已研製出液質聯用色譜儀檢測硝基呋喃類代謝產物的分析方法。而我國原有檢測方法僅是針對硝基呋喃類原藥的，而且檢測方法極為落後，已肯定不能滿足出口的需求。
發明內容
本發明的第一個目的是為人們提供一種呋喃西林殘留快速檢測方法。
本發明以抗呋喃咀啶單克隆抗體為介導建立呋喃西林殘留ELISA快速檢測方法。
呋喃西林殘留的快速檢測方法包括以下步驟1)將還原好的呋喃西林與卵清蛋白重氮化法偶聯合成抗原SEM-OVA；2)將合成抗原SEM-OVA包被到酶標板；3)以5％脫脂奶粉滿孔封閉；4)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；5)將抗呋喃西林單克隆抗體與SEM標準液在板外作用後加入到洗滌好的包被板上；6)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；7)加入酶標抗體，進行孵育；8)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；9)加入底物溶液；10)加入終止液，終止反應；11)測定OD490nm值。
本發明利用免疫學原理製備針對呋喃西林及其代謝產物氨基脲(SEM)特異的單克隆抗體，建立酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以檢測呋喃西林及其代謝產物氨基脲(SEM)，該方法相對於液質聯用色譜儀分析法，其對樣品的前處理要求較低，分析過程很簡單，檢測時間較短，而且檢測靈敏度也較高，使用成本低，為我國畜禽產品進出口貿易中氨丙啉藥物殘留檢測提供一種高效、簡便的途徑。
本發明的第二個目的是為上述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法提供可方便操作的應用途徑。
一種是用於製作呋喃西林殘留ELISA快速檢測試劑盒。
呋喃西林殘留ELISA快速檢測試劑盒包括
1)包被有合成抗原SEM-OVA的聚苯乙烯酶標板；2)濃縮稀釋液；3)濃縮洗液；4)抗呋喃西林單克隆抗體；5)酶標抗體；6)底物緩衝液；7)底物；8)終止液。
另一種是用於製作呋喃西林殘留ELISA快速檢測試紙條。
呋喃西林殘留ELISA快速檢測試紙條的製作方法是1)膠體金標記抗體膠體金上標記純化後的單克隆抗體；2)噴金將膠體金標記的抗體噴到玻璃纖維上，製成膠體金墊；3)製作硝酸纖維素膜將試紙條中T線和C線噴到硝酸纖維素膜上；4)將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙組裝，然後切條。
試劑盒或試紙條分別是單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法的兩種應用形式，可為人們快速檢測提供方便。
具體實施例方式(1)抗原合成首先，還原呋喃西林將氨基取代呋喃西林中的硝基，製成還原的呋喃西林溶液。
抗原合成採用重氮化法進行偶聯。取23mg亞硝酸鉀溶於1ml蒸餾水中，以冰水浴調溫度至0-5℃；還原好的呋喃西林溶液，37℃水浴作用20分鐘，上清液冷卻至4℃左右，調PH值1-2，再緩慢加入亞硝酸鉀溶液並不斷攪拌，靜置反應30min；將100mg的牛血清白蛋白溶於4ml的磷酸鹽緩衝液中，冷卻至4℃左右，將重氮化藥物緩慢加入並不斷攪拌，為保持加入過程中PH的穩定，同時加入0.2mol/L NaOH，調PH值至7.4，4℃過夜反應；然後4℃PBS透析偶聯後的產物72-96h，每6h換液一次，直至透析液中檢測不出任何小分子物質；偶聯後的產物以0.45μm濾膜過濾，-20℃分裝保存。
(2)動物免疫用合成的免疫抗原腹腔注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠。免疫程序如下首免和二免按抗原50μg/只劑量，分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等體積混合(共0.3ml)免疫，免疫間隔期為10天，之後以100μg/只的劑量加強免疫，10天一次共免疫4次，融合前3天再追加免疫一次。
(3)雜交瘤篩選方法的建立小鼠眼眶採血，分離血清後，將血清作1∶50和1∶100稀釋。包被原SEM-OVA按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000稀釋，之後倍比稀釋至1∶64000。用方陣法建立非競爭性間接ELISA方法。ELISA反應程序如下①SEM-OVA用包被緩衝液稀釋至適當濃度，每孔100ul，4℃包被過夜，以PBST洗滌3次，每次3min。②用5％脫脂乳滿孔封閉，37℃孵育2h，洗滌同上。③將陽性血清稀釋後順序加入，每孔100ul，每一稀釋度的陽性血清同時設陰性對照，37℃孵育1h，洗滌同上。④用稀釋液將酶標二抗稀釋到適當的工作濃度，每孔加100ul，37℃孵育1h，洗滌同上。⑤每孔加新鮮配製的底物使用液100ul，37℃孵育30min。⑥每孔加2N H2SO4的終止液50ul。⑦測定OD值，以空白孔調零，以測定孔OD值大於或等於陰性對照孔的2.1倍，判為陽性。
(4)細胞融合與篩選最後一次免疫後第3天，無菌操作取小鼠的脾細胞與處於對數生長期的SP2/0細胞融合。在45～60sec內加入1ml 50％的PEG 4000，隨即加入大量無血清的DMEM中止反應，靜置離心後，用HAT培養液重懸，加入適量的飼養細胞，混勻後鋪種於5塊96孔細胞培養板，於37℃、5％CO2培養箱中培養。待細胞長至孔底的1/10或培養上清變黃時，用已建立的ELISA方法篩選。陽性細胞迅速擴大培養並採用有限稀釋法進行亞克隆，並選擇優良穩定者建立細胞株。獲得能穩定分泌抗SEM抗體的雜交瘤細胞株，代號為SEM-1F8E9。
雜交瘤細胞株SEM-1F8E9已於2006年8月30日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No1790。
(5)單克隆抗體(McAb)的腹水製備取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.3ml/只，5～7天後腹腔注射陽性雜交瘤細胞106個/只，待其腹部明顯膨脹後抽取腹水，離心取上清凍存並測其效價。
(6)單抗效價測定試驗用品及試劑ELISA板(包被抗原按1∶40稀釋包被)一抗①腹水 進行1∶500，1∶1000，1∶1500，1∶2000，1∶2500，1∶3000，1∶3500，1∶4000，1∶4500，1∶5000稀釋②細胞上清 做如下倍比稀釋原液，1∶2，1∶4，…，1∶2048
二抗羊抗鼠IgG陽性判定標準P≥2.1N檢測結果顯示腹水效價為1∶20000，細胞上清效價為1∶256(7)單抗和包被抗原理想濃度的確定以方陣滴定法測定，最後選擇OD490nm值等於1.0左右的包被抗原和單抗的稀釋倍數為理想工作濃度。經測定，抗原最佳包被量為0.75ug/孔，單抗最佳稀釋倍數為1∶5000。
(8)試劑盒的組成及其成份製備按照以抗呋喃西林單克隆抗體為介導建立呋喃西林殘留ELISA快速檢測方法進行試劑盒的組裝。
採用重氮化法進行偶聯合成抗原SEM-OVA還原呋喃西林將氨基取代呋喃西林中的硝基，製成還原的呋喃西林溶液。
取23mg亞硝酸鉀溶於1ml蒸餾水中，以冰水浴調溫度至0～5℃；將還原好的呋喃西林溶液置於37℃水浴作用20分鐘，上清液冷卻至4℃左右，調PH值1-2，再緩慢加入亞硝酸鉀溶液並不斷攪拌，靜置反應30min；將100mg的卵清白蛋白(OVA)溶於4ml的磷酸鹽緩衝液中，冷卻至4℃左右，將重氮化藥物緩慢加入並不斷攪拌，為保持加入過程中PH的穩定，同時加入0.2mol/L NaOH，調PH值至7.4，4℃過夜反應；然後4℃PBS透析偶聯後的產物72-96h，每6h換液一次，直至透析液中檢測不出任何小分子物質；偶聯後的產物，即合成抗原SEM-OVA以0.45μm濾膜過濾，-20℃分裝保存。
以合成抗原SEM-OVA加入(包被)96孔酶標板，組裝SEM-Kit。其主要組成為8×12孔酶標板；10×濃縮稀釋液(0.1M PBS-T，PH7.2，含0.05％Tween-80，A號瓶)；10×濃縮洗滌液(0.1M PBS-T，PH7.2，含0.05％Tween-80，B號瓶)；單抗(抗SEM單克隆抗體，C號指形管)；HRP標記兔抗鼠IgG(全分子)(D號指形管)；底物溶液(4.86mL 0.1M的檸檬酸溶液和5.14mL 0.2M的磷酸氫二鈉溶液的混合液，E號瓶)；雙氧水(30％的H2O2，G號瓶)；鄰苯二胺(OPD片劑，F號指形管)；終止液(2NH2SO4，H號瓶)；標準液(蒸餾水溶解稀釋的SEM標準品，N號指形管)；封板膜；使用說明書。
試劑盒中各組分的製備
①包被有合成抗原SEM-OVA的聚苯乙烯酶標板用22mM的碳酸鹽溶液將抗原作1∶5000倍稀釋，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100μL，置4℃冰箱過夜；用洗液(PBST)洗滌3次，用封閉液(5％的脫脂奶粉)37℃溼盒封閉60分鐘，洗液洗3次，乾燥後即為反應板。
②濃縮稀釋液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩衝液(PBST)。按常規法配製，4℃分裝保存。
③濃縮洗液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸鹽緩衝液(PBST)。按常規法配製，4℃分裝保存。
④抗體由本室製備，工作濃度為1∶2000，-70℃保存。
⑤酶標抗體購自Sigma公司。工作濃度為1∶30000，-20℃保存。
⑥底物緩衝液磷酸氫二鈉14.2g，檸檬酸10.5g，加去離子水定容至500mL，分裝4℃保存。
⑦底物溶液在底物緩衝液中加入0.15％的30％的H2O2。
⑧終止液0.2M硫酸溶液。
⑨底物片劑鄰苯二胺片劑。底物片劑在4℃避光保存1年以上應穩定、不變色，放入底物緩衝液中應在2-3分鐘溶解。
(9)試紙條的組成及其成份製備按照以抗呋喃西林單克隆抗體為介導建立呋喃西林殘留ELISA快速檢測方法的建立進行試紙條的組裝。
①膠體金標記抗體將單克隆抗體純化後按常規方法進行。具體方法a、取522nm膠體金溶液20ml恢復至室溫，用1％碳酸鉀調至PH8.2；b、取抗呋喃西林單克隆抗體12000rpm離心5min，按每毫升膠體金加1微克抗呋喃西林單克隆抗體的比例，取總量為20微克的抗呋喃西林單克隆抗體，用PB稀釋到1ml體積；c、將稀釋後的抗呋喃西林單克隆抗體緩慢地逐滴加入到磁力攪拌狀態下的膠體金溶液中，室溫下攪拌30min；d、逐滴加入1ml 10％BSA至終濃度為0.5％，磁力攪拌30min；e、置4℃冰箱內2小時，然後8800rpm離心min，儘可能小心吸棄上清，用含0.5％BSA和0.2％PEG20000的磷酸鹽緩衝液懸浮收集沉澱物，至最後體積為1ml，4℃冰箱保存備用。
②噴金將膠體金標記的抗體噴到玻璃纖維上，製成膠體金墊；③噴膜將試紙條中T線和C線噴到硝酸纖維素膜上；
④將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙按常規方法進行組裝，然後切條。
(10)靈敏度實驗將SEM標準液用超純水溶解、梯度稀釋，與等體積的單抗同時加入ELISA板中。
1.將包被抗原以稀釋液稀釋成一定濃度，100μl/孔，4℃過夜；2.磷酸鹽緩衝液(PBST)洗滌1遍；3.以5％脫脂奶粉滿孔封閉，並儘量排除孔中可能產生的貼壁氣泡，37℃水浴作用1h或4℃過夜。
4.PBST洗滌3遍，每次3~5分鐘，洗後於吸水紙上拍幹；5.將SEM標準品與單抗等體積混合後加入板中，37℃水浴作用1h；6.PBST洗滌3遍，每次3~5分鐘，洗後於吸水紙上拍幹；7.加入HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5000，in PBS)，100μl/孔，37℃水浴作用1h；8.PBST洗滌4遍，每次3~5分鐘，洗後於吸水紙上拍幹；9.加入新鮮配置的鄰苯二胺(OPD)底物溶液，100μl/孔，37℃水浴作用30min；10.加入2M濃硫酸終止顯色反應；11.用酶聯免疫閱讀儀測定OD490nm值。
實驗結果表明本試劑盒靈敏度10μg/kg以下且較穩定。
(11)臨床樣品檢測採集臨床樣品，用試劑盒進行檢測。
①檢測樣品的處理採集肝、腎、肌肉、蛋黃、牛脂肪等組織，按一定比例加水進行研磨、離心處理。
②測定方法A、呋喃西林殘留快速檢測試劑盒的操作方法及結果分析使用前取B瓶液(濃縮洗滌液)按1∶10用蒸餾水稀釋至工作濃度為洗滌液；C管液100μL用A液1∶100稀釋待用；D管液100μL用A液1∶100稀釋待用；N管液用A液作系列梯度稀釋待用。按下表格式，先將樣品與單抗在板外37℃水浴作用1hr，再整體移到ELISA板上，37℃水浴45min(A1、A2孔只加入稀釋液100μL，不加單抗)。棄去孔內液體，每孔加入洗滌液至滿孔，棄去洗滌液，於吸水紙上拍幹，重複洗滌5遍。洗滌後立即在每孔中加入稀釋好的D液100μL，置37℃水浴1hr。棄去孔內液體，每孔加入洗滌液至滿孔，放置2min，棄去洗滌液，於吸水紙上拍幹，重複洗滌5遍。將F管中片劑(2片)溶於10mL底物緩衝液(E液)，完全溶解後，加入30ul G液混勻後每孔加入100μL，37℃避光顯色30min。顯色結束，每孔加50μL的H液；以A1孔為調零孔，用酶標儀測定樣品的OD490值。
結果判定標準加入H液後各孔顏色由黃色變為橙紅色，用酶標儀測定在490nm波長處每孔的光吸收值(OD值)，分別計算出每份被檢樣品孔、標準品的平均OD值，利用下列公式求出OD比值。
若OD比值小於15％，判定為「-」；OD比值在16-20％，判定為「±」；OD比值介於21-40％，判定為「+」；OD比值介於41-60％，判定為「++」；OD比值大於60％，判定為「+++」。
若需要，可以各標準品孔的濃度為橫坐標，以各自的吸光值為縱坐標，作標準曲線。求出回歸方程，將各樣品的吸光值帶入方程即可求出殘留量。
B、呋喃西林殘留膠體金快速診斷試紙條應用與判定將樣品處理液與試紙條樣品墊充分浸透，樣品液向膜的方向進行擴散，如果T線和C線同時出現，則待檢樣品判為陰性，如果僅出現T線，則待檢樣品判為陽性。
權利要求
1.單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法，其特徵在於以抗呋喃西林單克隆抗體為介導建立呋喃西林殘留ELISA快速檢測方法。
2.根據權利要求1所述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法，其特徵在於包括以下步驟1)將還原好的呋喃西林與卵清蛋白重氮化法偶聯合成抗原SEM-OVA；2)將合成抗原SEM-OVA包被到酶標板；3)以5％脫脂奶粉滿孔封閉；4)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；5)將抗呋喃西林單克隆抗體與SEM標準液在板外作用後加入到洗滌好的包被板上；6)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；7)加入酶標抗體，進行孵育；8)磷酸鹽緩衝液洗滌，拍幹；9)加入底物溶液；10)加入終止液，終止反應；11)測定OD490nm值。
3.如權利要求1所述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法的應用，其特徵在於用於製作呋喃西林殘留ELISA快速檢測試劑盒。
4.根據權利要求3所述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法的應用，其特徵在於呋喃西林殘留ELISA快速檢測試劑盒包括1)包被有合成抗原SEM-OVA的聚苯乙烯酶標板；2)濃縮稀釋液；3)濃縮洗液；4)抗呋喃西林單克隆抗體；5)酶標抗體；6)底物緩衝液；7)底物；8)終止液。
5.如權利要求1所述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法的應用，其特徵在於用於製作呋喃西林殘留ELISA快速檢測試紙條。
6.根據權利要求5所述單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法的應用，其特徵在於呋喃西林殘留ELISA快速檢測試紙條的製作方法是1)膠體金標記抗體膠體金上標記純化後的單克隆抗體；2)噴金將膠體金標記的抗體噴到玻璃纖維上，製成膠體金墊；3)製作硝酸纖維素膜將試紙條中T線和C線噴到硝酸纖維素膜上；4)將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙組裝，然後切條。
全文摘要
單克隆抗體介導的呋喃西林殘留檢測方法及其應用，屬於藥物殘留檢測領域。本發明以抗呋喃西林單克隆抗體為介導建立呋喃西林殘留ELISA快速檢測方法，可就用於製作檢測試劑盒和檢測試紙條，可方便地對呋喃西林殘留量進行ELISA快速。該方法相對於液質聯用色譜儀分析法，對樣品的前處理要求較低，分析過程很簡單，檢測時間較短，而且檢測靈敏度也較高，使用成本低。
文檔編號G01N33/544GK1920573SQ20061004148
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月8日 優先權日2006年9月8日
發明者蔡寶亮, 餘兵, 陶宏錦, 秦愛建, 金文杰, 沈崇鈺, 施偉良, 李應國, 王華全, 陳忘名, 劉寶榮, 蔣原, 丁濤, 王倩倩, 邵紅霞 申請人:蔡寶亮, 餘兵, 陶宏錦