作為mcp－1受體拮抗劑的吲哚類衍生物的製作方法

2023-12-08 20:22:36

專利名稱：作為mcp－1受體拮抗劑的吲哚類衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過CCR2受體(也稱作MCP-1受體)的拮抗作用起效的抗炎化合物，尤其導致對單核細胞化學引誘物蛋白-1(MCP-1)的抑制作用。這些化合物含有吲哚部分。本發明進一步涉及含有它們的藥物組合物、其製備方法、其製備中所用的中間體和其作為治療劑的應用。
MCP-1是促炎蛋白的趨化因子家族的一員，其介導白細胞趨化性和激活作用。MCP-1是C-C趨化因子，其是最有效和選擇性T細胞和單核細胞的化學引誘物和公認激活劑地一種。MCP-1與許多炎性疾病的病理生理學有關，包括類風溼關節炎、腎小球腎炎、肺纖維化、再狹窄(國際專利申請WO94/09128)、牙槽炎(Jones等，1992，J.Immunol.，149，2147)和哮喘。認為MCP-1在其病理學中發揮一定作用的其它疾病領域是動脈粥樣硬化(例如Koch等，1992，J Clin.Invest.，90，772-779)、牛皮癬(Deleuran等，1996，J.Dermatological Science，13，.228-236)、皮膚的延遲型過敏反應、炎性腸病(Grimm等，1996，J Leukocyte Biol.，59，.804-812)、多發性硬化和腦創傷(Berman等，1996，J.Immunol.，156，.3017-3023)。MCP-1抑制劑也可以有效治療中風、再灌注損傷、局部缺血、心肌梗塞和移植排異。
MCP-1通過CCR2受體起作用。MCP-2和MCP-3也可以，至少部分，通過這種受體起作用。所以在本說明書中，當引用″MCP-1的抑制或拮抗作用″或″MCP-1介導的效應″時，這包括當MCP-2和/或MCP-3通過CCR2受體起作用時MCP-2和/或MCP-3介導的效應的抑制或拮抗。
申請人發現一類含有吲哚部分的化合物，其具有抗MCP-1的有效抑制活性。國際專利申請，公開號WO99/07351公開了一類具有MCP-1抑制作用的吲哚類化合物。這篇申請基於特定取代的5-羥基吲哚類化合物是MCP-1抑制劑的驚奇發現，此類化合物在效價和/或血液水平和/或生物利用度和/或溶解度方面具有意外和有益的特性。
所以，本發明提供式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥
(I)其中
R1是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；
R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；
R3是滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基、烷氧基、三氟甲基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7，或S(O)nR7，其中n是0、1或2且R7是烷基；
R4是滷素、三氟甲基、甲硫基，甲氧基、三氟甲氧基或低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基；
R5是氫、滷素、氰基、低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基或COR8
其中R8是低級烷基；
R6是氫、滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基或COR9
其中R9是低級烷基；
條件是當R1是氫、滷素或甲氧基，R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基，R5和R6同時為氫，和R3或R4之一是氯、氟或三氟甲基時，則R3或R4的另一個不是滷素或三氟甲基。
在本說明書中術語″烷基″包括直鏈和支鏈烷基，但對於個別烷基例如″丙基″僅僅具體指直鏈形式。同樣地，術語″鏈烯基″和″炔基″是指直鏈或支鏈不飽和部分。除非另外說明，烷基適合含有1-10碳原子，優選1-6碳原子並最優選1-4個碳原子。鏈烯基和炔基適合含有2-10個碳原子，優選2-6碳原子和最優選2-4碳原子。前綴″低級″是指至多6個並優選至多4個碳原子。術語″滷素″是指氟、氯、溴和碘。
優選R1是氫或滷素，例如氯或氟並最優選氫。
優選R2是氫或滷素，例如氯或氟並最優選氫。
R3的適當實例包括滷素如氯，硝基或烷氧基如甲氧基。
在一種實施方式中，R3是三氟甲基且R4是甲硫基、甲氧基、三氟甲氧基、烷基(特別是甲基)或炔基(特別是乙炔基)。
R4的具體實例是滷素，例如氯；烷基，例如甲基；烷氧基，例如甲氧基或三氟甲氧基。
在另一優選實施方式中，R4是滷素，例如氯或三氟甲基和R3是烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7或S(O)nR7，其中R7和n定義如上，並且R7具體是甲基或乙基。
優選R5是氫。
優選R6是氫。
在本發明的一個優選方面，提供式(IA)的化合物
或其藥學可接受鹽或前藥，其中R1、R2定義如上；
R3』是烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、三氟甲基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7或S(O)nR7，其中R7是烷基；
R4』是滷素、甲硫基、甲氧基、三氟甲氧基或甲基；
條件是當R3』是三氟甲基時，R4』不是三氟甲基或滷素。
優選R1和R2是氫。
優選R3』是選自甲氧基、氯或硝基。
優選R4』選自氯、甲基、甲氧基或三氟甲氧。
本發明的優選化合物包括實施例的任一化合物，其在表1中舉例說明。
表1
本發明進一步涉及式(I)的化合物的所有互變異構形式。
還應理解某些式(I)的化合物可以存在溶劑化和非溶劑化形式，例如水合形式。可以理解本發明包括所有這些溶劑化形式。
式(I)的化合物是單核細胞化學引誘物蛋白-1的抑制劑。此外，它們似乎抑制RANTES誘導的趨化性。RANTES(活化後可調節的、正常T細胞表達並可逆分泌的)是來自與MCP-1同一家族的另一種趨化因子，具有相似的生物性能，但通過CCR1受體起作用。因此，這些化合物可以用來治療這些試劑介導的疾病，尤其是炎性疾病。
適宜的式(I)化合物的藥學可接受鹽包括鹼性鹽，例如鹼金屬鹽，如鈉鹽；鹼土金屬鹽，如鈣或鎂鹽；有機胺鹽，如三乙胺、嗎啉、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、普魯卡因、二苄胺、N，N-二苄基乙胺；或胺基酸，如賴氨酸。在另一方面中，當所述化合物鹼性足夠時，適當的鹽包括酸加成鹽，如甲磺酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽和與磷酸和硫酸形成的鹽。它們可以是不止一個陽離子或陰離子，這取決於帶電官能團的數目和陽離子或陰離子的化合價。優選的藥學可接受鹽是鈉鹽。
所屬領域已知多種形式的前藥。此類前藥衍生物的實例，參見
a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard編輯(Elsevier，1985)和方法in Enzymology，Vol.42，p.309-396，K.Widder等編輯(Academic Press，1985)；
b)A Textbook of Drug Design和Development，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard編輯，第5章″Design和Application ofProdrugs″，H.Bundgaard撰寫p.113-191(1991)；
c)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；
d)H.Bundgaard，等，Journal of Pharmaceutical Scienees，77，285(1988)；和
e)N.Kakeya，等，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
此類前藥的實例是本發明化合物的體內可裂解酯。含有羧基的本發明化合物的體內可裂解酯是，例如藥學可接受酯，其在人體或動物機體中裂解產生母體酸。適合羧基的藥學可接受酯包括例如C1-6烷基酯，例如甲基或乙基；C1-6烷氧基甲基酯類，例如甲氧基甲基；C1-6烷醯氧基甲基酯類，例如新戊醯氧基甲基；苯並[c]呋喃酮基酯類；C3-8環烷氧基羰氧基C1-6烷基酯類，例如1-環己基羰氧基乙基；1，3-二氧雜環戊烷-2-基甲基酯類，例如5-甲基-1，3-二氧雜環戊烷-2-基甲基；C1-6烷氧基羰氧基乙基酯類，例如1-甲氧基羰氧基乙基；氨基羰基甲基酯類及其一-或二-N-(C1-6烷基)形式，例如N，N-二甲基氨基羰基甲基酯類和N-乙基氨基羰基甲基酯類；並且可以在本發明化合物中的任何羧基處形成。含羥基的本發明化合物的體內可裂解酯是，例如藥學可接受酯，其在人體或動物機體內裂解產生母體羥基。適合的羥基藥學可接受酯包括C1-6烷醯基酯類，例如乙醯基酯類；和苯甲醯基酯類，其中苯基可以被氨基甲基或N-取代的一-或二-C1-6烷基氨基甲基取代，例如4-氨基甲基苯甲醯基酯類和4-N，N-二甲基氨基甲基苯甲醯基酯類。
本發明的另一方面提供一種製備式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥的方法，該方法包括
a)式(II)的化合物
其中R1、R2、R5和R6如式(I)中有關定義，Ra是羧基或其被保護形式，和Rb是氫或適當的羥基保護基，與式(III)的化合物反應
其中R3和R4如式(I)有關定義且L是可替換基團；和此後如果必要
i)使式(I)的化合物轉化為另一種式(I)的化合物；
ii)脫去任何保護基；或
iii)形成其藥學可接受鹽或前藥。
適合的L是，例如滷素或磺醯氧基，例如氯、溴、甲磺醯氧基或甲苯-4-磺醯氧基。
式(II)和(III)的化合物適當地一起在惰性有機溶劑(如N，N-二甲基甲醯胺，二氯甲烷或乙腈)中在鹼(如氫氧化鈉、氫化鈉或碳酸鉀)的存在下反應。該反應適合在相轉移催化劑如四-正丁基硫酸氫銨的存在下完成。反應時間可以在1-6小時內，優選1-3小時。採用適度的溫度，例如15-30℃，優選20-25℃。
式(II)的化合物可以購得，或者可以通過利用已知方法修飾購得的式(II)的化合物來製成。具體地，它們可以通過式(IV)的化合物
其中R1、R5、R6和Rb定義如上，與式(V)的化合物反應來製備
其中Rc和Rc』獨立地選自C1-4烷基。
式(IV)和(V)的化合物適宜一起在Reissert反應條件下如在惰性溶劑(例如四氫呋喃)中，在鹼(例如乙醇鉀)的存在下，於15-30℃的溫度內，優選20-25℃，反應10-20小時，優選15-17小時。分離所得的化合物並溶於醇如乙醇和有機酸(例如乙酸)，並且加入過渡金屬催化劑(例如10％ Pd/C)和環己烯。該化合物可以在60-120℃的溫度下，優選70-90℃下加熱15-25小時，優選16-20小時，得到式(II)的化合物，其中Ra是-CO2C1-4烷基。
或者，式(II)的化合物可以通過式(VI)的化合物
其中R1、R5、R6和Rb定義如上，與式(VII)的化合物反應來製備
其中Rd是C1-4烷基。
式(VI)和(VII)的化合物適合一起在Fischer條件下如與有機酸(如乙酸)，在醇(例如乙醇)中，於60-90℃的溫度下，優選75-85℃下反應1-5小時，優選1-3小時。所得的化合物與強酸(例如多磷酸)混合且在90-150℃，優選100-120℃下加熱0.5-4小時，優選0.5-2小時得到式(II)的化合物，其中Ra是氫。隨後，如果希望，可以利用文獻中的已知技術把R2任選地轉化為式(I)中定義Ra的另一個值。
在一個優選方案中，式(II)的化合物是通過式(VIII)化合物的環化來製得
其中R1、Ra、Rb和R2定義如上。
環化作用可以通過在有機溶劑如二甲苯中回流該化合物來完成。式(VIII)的化合物適宜通過式(IX)的化合物
其中R1、R2和Rb定義如上，與式(X)的化合物反應來製備
其中Ra定義如上。該反應適宜在有機溶劑如醇中，具體如甲醇中，在鹼如鹼金屬醇鹽的存在下，特別是甲醇鈉的存在下完成。適宜採用-30-20℃的適度溫度。
式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的化合物已知或者可以購得，或者通過所屬領域的已知方法經過市售或已知原料的標準處理製備。
Rc和Rd是C1-4烷基。優選Rc和Rd是甲基或乙基。
還應理解在上述一些反應中，可能需要/期望保護所述化合物中的任何敏感基團。所屬領域技術人員懂得需要或希望進行保護的情形以及適當的保護方法。所以，如果反應物包括基團如羧基或羥基，可能希望在上述一些反應中將該基團保護起來。
適合羥基的保護基是，譬如，醯基，例如烷醯基，如乙醯基，芳醯基，如苯甲醯基；或芳基甲基，例如苄基。上述保護基的脫保護條件必須隨選擇的保護基而改變。所以，例如醯基，如烷醯基或芳醯基可以通過，譬如用適當的鹼如鹼金屬氫氧化物(如氫氧化鋰或氫氧化鈉)來脫除。或者，例如通過用催化劑如碳載鈀氫化，來脫除芳基甲基如苄基。
適合羧基的保護基是，例如酯化基團，如甲基或乙基，它們可以通過例如用鹼(如氫氧化鈉)水解來脫除；或者，叔丁基可以通過，譬如用酸，例如有機酸，如三氟乙酸處理來脫除；或者，譬如苄基可以通過，例如用催化劑如碳載鈀氫化來脫除。
保護基可以在合成中的任何適當階段，利用化學領域熟知的常規技術來脫去。一些在此描述的中間體可以是新的化合物，例如式(II)的中間體，因此它們是本發明的另一特徵。
當需要式(I)化合物的藥學可接受鹽時，通過例如該化合物與適當酸(其提供生理可接受陰離子)的反應，或與適當鹼(其提供生理可接受陽離子)的反應，或通過其它常規成鹽方法來製備來獲得。
按照本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其含有定義如上的式(I)的化合物或其其藥學可接受鹽或前藥，以及藥學可接受賦形劑或載體。
本發明的組合物可以是適合口服使用的形式(例如成為片劑、錠劑、硬或軟膠囊、水或油性混懸液、乳液、可分散粉末或顆粒、糖漿劑或酏劑)、適合局部使用的形式(例如霜劑、凝膠，或水或油性溶液或混懸液)、通過吸入給藥的形式(例如成為細分的粉末或液體氣溶膠)、通過吹入給藥的形式(例如成為細分的粉末)或非腸道給藥的形式(例如作為滅菌水或油性溶液用於靜脈內、皮下、肌肉內或肌肉內給藥，或作為栓劑直腸給藥)。
本發明的組合物可以通過所屬領域熟知的常規方法利用常規藥物賦形劑製備。所以，口服用的組合物可以含有，例如，一種或多種著色劑、甜味劑、矯味劑和/或防腐劑。
用於片劑製劑的適當藥學可接受賦形劑包括，例如，惰性稀釋劑如乳糖、碳酸鈉、磷酸鈣或碳酸鈣；制粒或崩解劑如玉米澱粉或藻酸；粘合劑如澱粉；潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石；防腐劑如對羥基苯甲酸乙酯或丙酯；和抗氧劑，如抗壞血酸。片劑製劑可以是未包衣或者被包衣以改進在胃腸道內其崩解作用和活性成分的後續吸收作用，或改善其穩定性和/或外觀，在這些情況中，使用所屬領域熟知的常規包衣劑和方法。
口服使用的組合物可以是硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，例如，碳酸鈣、磷酸鈣和高嶺土混合；或成為軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水混懸液一般含有微粉形式的活性成分以及一種或多種助懸劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯膠；分散或溼潤劑，如卵磷脂或氧化烯與脂肪酸的縮合產物(例如聚氧化乙烯硬脂酸酯)，或氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產物，例如十七碳乙烯氧基十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或氧化乙烯與由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產物，例如十七碳乙烯氧基十六烷醇，或氧化乙烯與由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或氧化乙烯與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。水混懸液還含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸乙酯或丙酯)，抗氧劑(如抗壞血酸)，著色劑，矯味劑，和/或甜味劑(如蔗糖、糖精或阿司帕坦)。
油性混懸液可以通過把活性成分懸浮在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰油)中或礦物油(例如液體石蠟)中來製成。油性混懸液也可以含有增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可以加入甜味劑(如上文所述的那些)和矯味劑來提供可口的口服製劑。通過加入抗氧劑如抗壞血酸可以使這些組合物防腐。
適合通過加入水製備水混懸液的可分散粉末和顆粒一般含有活性成分以及分散或溼潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑。適當的分散或溼潤劑和助懸劑例如是上文提及的那些。附加的賦形劑如甜味劑、矯味劑和著色劑也可以存在。
本發明的藥物組合物還可以是水包油乳液。油相可以是植物油，如橄欖油或花生油，或是礦物油，如液體石蠟，或這些油的混合物。適用的乳化劑可以是，例如，天然樹膠如阿拉伯樹膠或黃芪膠，天然磷脂如大豆、卵磷脂、從脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯(如脫水山梨糖醇一油酸酯)和所述偏酯與氧化乙烯的縮合產物如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。乳液也可以含有甜味劑、矯味劑和防腐劑。
糖漿劑或酏劑可以用甜味劑配製，如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿司帕坦或蔗糖，並且還可以含有溼潤劑、防腐劑、矯味劑和/或著色劑。
所述的藥物組合物還可以是滅菌可注射水或油性混懸液的形式，其可以按照已知方法利用一種或多種適當的分散劑或溼潤劑和助懸劑來配製，這些試劑如上所述。滅菌可注射製劑還可以是存在於無毒非腸道可接受稀釋劑或溶劑中的滅菌可注射溶液或混懸液，例如存在於1，3-丁二醇中的溶液。
通過把活性成分與適當的無刺激賦形劑混合來製備栓劑製劑，所述賦形劑在常溫下為固體但在直腸溫度下為液體並因此在直腸中融化釋放出藥物。適當的賦形劑包括，例如，可可脂和聚乙二醇類。
局部製劑，如霜劑、軟膏、凝膠和水或油性溶液或混懸液，一般可以通過把活性成分與常規局部可接受載體或稀釋劑利用所屬領域熟知的常規方法混合來獲得。
通過吹入給藥的組合物可以是細分粉末的形式，該粉末含有例如30μ或更小的平均粒徑的微粒，粉末本身含有單獨的活性成分或用一種或多種生理可接受載體(如乳糖)稀釋的活性成分。吸入用的粉末一般保留在含有例如1-50mg活性成分的膠囊中，用於渦輪增壓器吸入裝置，例如用於已知藥物色苷酸鈉的吸入。
通過吸入給藥的組合物可以是常規加壓氣溶膠的形式，使活性成分分配為含有細分固體或液滴的氣霧。可以使用常規氣溶膠拋射劑，如揮發性氟代烴類化合物或烴類化合物，氣溶膠裝置一般裝配為分散計量量的活性成分。
對於有關製劑的其它信息，讀者可以參考ComprehensiveMedicinal Chemistry(Corwin Hahsch；Chairman of EditorialBoard)的第5卷第25.2章，Pergamon Press 1990。
活性成分與一種或多種賦形劑混合製成單劑量形式的量必需根據被治療宿主和具體給藥途徑而變化。例如，用於口服給予人體的製劑一般含有，例如，0.5mg-2g的活性成分與適當和常規量的賦形劑，其可以在該組合物總重量的約5-約98％(重量)內變化。劑量單位形式通常含有約1mg-約500mg的活性成分。對於有關給藥途徑和劑量方案的信息，讀者可參考Comprehensive Medicinal Chemistry(CorwinHansch；Chairman of Editorial Board)的第5卷第25.3章，Pergamon Press 1990。
式I的化合物的治療或預防目的的劑量大小自然將按照病症的本質和嚴重性、動物或患者的年齡和性別與給藥途徑，根據熟知的醫學原理來變化。如上所述，式I的化合物可以有效治療單獨或部分歸因於MCP-1和/或RANTES的作用的疾病或醫學病症，例如，類風溼關節炎。
在為了治療或預防目的使用式I的化合物中，通常給藥應使在，例如0.5mg-75mg/kg體重的日劑量是可接受的，如果需要可以分次給藥。一般地當採用非腸道途徑時應該給予較低劑量。所以，例如，對於靜脈內給藥，一般採用如0.5mg-30mg/kg體重的劑量範圍。同樣地，對於吸入給藥，採用如0.5mg-25mg/kg體重的劑量。然而優選口服給藥。
按照本發明的另一方面提供定義如上的式(I)化合物或其藥學可接受鹽或前藥，通過療法應用於人體或動物的治療方法中。因此，本發明提供一種通過施用定義如上的式(I)化合物或其藥學可接受鹽或前藥或藥物組合物治療炎性疾病的方法。
本發明的另一特徵是式(I)的化合物及其藥學可接受鹽或前藥，用作藥物。
因此，式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，用作拮抗溫血動物如人體中MCP-1介導的效應(和/或RANTES介導的效應)的藥物。
按照本發明的另一方面提供式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，在製備用來拮抗溫血動物如人體中MCP-1介導的效應(和/或RANTES介導的效應)的藥物中的應用。
按照本發明的另一特徵提供一種拮抗需要所述治療的溫血動物如人體中MCP-1(和/或RANTES)介導的效應的方法，其包括給該動物施用有效量的定義如上的式(I)化合物或其藥學可接受鹽或前藥。生物學試驗
下列生物試驗方法、數據和實施例用於說明本發明。
縮寫ATCC美國模式培養物保藏所，Rockville，USA。BCA Bicinchroninic acid，(與硫酸銅一起用來測定蛋白質)BSA 牛血清白蛋白DMEMDulbecco改進的Eagle培養基EGTA亞乙基雙(氧乙烯基次氨基)四乙酸FCS 胎牛血清HEPES (N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸])HBSSHanks平衡鹽溶液hMCP-1 人單核細胞化學引誘物蛋白-1PBS 磷酸鹽緩衝鹽水PCR 聚合酶鏈式反應
AMPLITAQTM，購自Perkin-Elmer Cetus，用作熱穩定DNA聚合酶的來源。
結合緩衝液是50mM HEPES，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％胎牛血清，用1M NaOH調至pH7.2。
非必需胺基酸(100×濃度)是L-丙氨酸，890mg/l；L-天門冬醯胺，1320mg/l；L-天門冬氨酸，1330mg/l；L-穀氨酸，1470mg/l；甘氨酸，750mg/l；L-脯氨酸，1150mg/l和；L-絲氨酸，1050mg/l。
次黃嘌呤和胸苷補充物(50×濃度)是次黃嘌呤，680mg/l和；胸苷，194mg/l。
青黴素-鏈黴素是青黴素G(鈉鹽)；5000單位/ml；硫酸鏈黴素，5000(g/ml.
人單核細胞細胞系THP-1細胞購自ATCC，登記號ATCC TIB-202.
Hanks平衡鹽溶液(HBSS)得自Gibco；參見Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1949，71，196。
合成細胞培養基，RPMI 1640得自Gibco；它含有無機鹽[Ca(NO3)2.4H2O 100mg/l；KCl 400mg/l；MgSO4.7H2O 100mg/l；NaCl 6000mg/l；NaHCO3 2000mg/l&Na2HPO4(無水)800mg/l]，D-葡萄糖2000mg/l，還原型穀胱甘肽1mg/l，胺基酸和維生素。
FURA-2/AM is 1-[2-(5-羧基噁唑-2-基)-6-氨基苯並呋喃-5-氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸五乙醯氧基甲酯和得自Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA。
血液沉降緩衝液含有8.5g/l NaCl和10g/l羥乙基纖維素。
溶胞緩衝液是0.15M NH4Cl-，10mMKHCO3，1mM EDTA。
全細胞結合緩衝液是50mM HEPES，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％BSA，0.01％NaN3，用1M NaOH調至pH7.2。
洗滌緩衝液是50mM HEPES，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％熱滅活的FCS，0.5MNaCl，用1M NaOH調至pH7.2。
通用分子生物學方法可以按照下列著作中所述的任何方法″Molecular Cloning-A Laboratory Manual″第2版，Sambrook，Fritsch & Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。i)hMCP-1受體的克隆和表達
MCP-1受體B(CCR2B)cDNA是通過PCR從THP-1細胞RNA利用適當的低聚核苷酸引物基於已公開的MCP-1受體序列(Charo等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2752)來克隆。所得的PCR產物克隆在運載體PCR-IITM(InVitrogen，San Diego，CA.)中。無差錯CCR2B cDNA作為Hind M-Not I片段亞克隆化在真核表達運載體pCDNA3(InVitrogen)中分別生成pCDNA3/CC-CKR2A和pCDNA3/CCR2B。
通過磷酸鈣沉澱法使線性化pCDNA3/CCR2B DNA轉染到CHO-K1細胞中(Wigler等，1979，Cell，16，777)。利用加入1mg/ml的硫酸Geneticin(G418，Gibco BRL)挑選轉染的細胞，24小時後細胞業已轉染。RNA的製備和RNA印跡法按照現有公開方法進行(Needham等，1995，Prot.Express.Purific.，6，134).CHO-KL克隆7(CHO-CCR2B)被鑑定為最高MCP-1受體B表達子。ii)膜片段的製備
令CHO-CCR2B細胞在DMEM中生長，其中補充有10％胎牛血清，2mM谷醯胺，1×非必需胺基酸，1×次黃嘌呤和胸苷補充物與青黴素-鏈黴素(50μg鏈黴素/ml，Gibco BRL)。利用細胞溶胞/差速離心法按照現有技術所述(Siciliano等，1990，J.Biol.Chem.，265，19658)製備膜片段。通過BCA蛋白測定法(Pierce，Rockford，Illinois)按照製造商的說明估計蛋白濃度。iii)測定
利用Bolton & Hunter偶聯法(Bolton等，1973，Biochem.J.，133，529；Amersham International plc]製備125I MCP-1。利用Ernst等，1994，J.Immunol.，152，3541的方法進行平衡結合試驗。簡單而言，將不同量的125I-標記MCP-1加入到含7μg的純化CHO-CCR2B細胞膜的100μl結合緩衝液中。室溫下孵育1小時後過濾結合反應混合物且通過平板洗滌器(Brandel MLR-96T Cell Harvester)用冰冷的結合緩衝液洗滌5次。使用之前過濾墊(Brandel GF/B)在0.3％聚乙烯亞胺中預浸溼60分鐘。過濾後將各個濾液分開置於3.5ml管(SarstedtNo.55.484)內且測定結合的125I-標記的MCP-1(LKB 1277Gammamaster)。按照上述方法利用100 pM 125I-標記的MCP-1在不同濃度的未標記MCP-1的存在下進行冷競爭研究。通過在該反應中包含200倍摩爾過量的未標記MCP-1測定非特異結合作用。
利用由CHO-CCR2B細胞製成的膜片段的配體結合研究顯示，CCR2B受體是以0.2pmoles/mg膜蛋白的濃度存在，並且選擇性結合MCP-1且具有高親和力(IC50＝110pM，Kd＝120pM)。與這些膜的結合作用是完全可逆的且在室溫下45分鐘後達到平衡，而且當MCP-1使用的濃度介於100pM-500pM內時，在MCP-1結合作用與CHO-CCR2B細胞膜濃度之間存在線性關係。
溶解在DMSO(5μl)的試驗化合物與100pM標記的MCP-1在一定濃度範圍內(0.01-50uM)一式兩份利用8點劑量-反應曲線進行競爭性試驗並計算IC50濃度。
本發明的被測化合物在所述的hMCP-1受體結合試驗中具有等於或小於50μm的IC50值。
b)THP-1細胞中MCP-1介導的鈣流出
令人單核細胞細胞系THP-1在合成細胞培養基RPMI 1640中生長，其中補充有10％胎牛血清，6mM谷醯胺和青黴素-鏈黴素(50μg鏈黴素/ml，Gibco BRL)。THP-1細胞在HBSS(無Ca2+和Mg2+)+1mg/mlBSA中洗滌，並且以3×106細胞/ml的密度重新懸浮在相同的緩衝液內。37℃下30分鐘內向該細胞加入1mM FURA-2/AM，用HBSS洗滌2次，和重新懸浮為1×106細胞/ml。把THP-1細胞懸浮液(0.9ml)加入到含有磁攪棒和2.1ml預熱(37℃)HBSS的5ml一次性杯中，該HBSS含有1mg/ml BSA，1mM MgCl2和2mM CaCl2。將小杯置於螢光分光光度計(Perkin Elmer，Norwalk，CT)中且在37℃下攪拌的同時預孵育4分鐘。記錄70秒內的螢光，通過在10秒後向該小杯中加入hMCP-1來刺激細胞。通過在340nm和380nm激發且隨後在510nm下測量螢光發射的強度來測定[Ca2+]i。計算出在340nm和380nm下激發後發射螢光的強度的比例，(R)，並且按照下列公式給出和評價胞質[Ca2+]其中37℃下FURA-2 Ca2+複合物的Kd是224nm。Rmax是加入10mM伊蕪諾黴素後測定的最大螢光比值，Rmin是隨後加入含5mM EGTA的無Ca2+溶液後測定的最小比值，並且Sf2/Sb2是分別在Rmin和Rmax時在380nm激發下測定的螢光值的比例。
用hMCP-1對THP-1細胞的刺激引起[Ca2+]i以特異性和劑量依賴的方式快速、瞬時性升高。劑量反應曲線顯示EC50約為2nm。測定溶於DMSO(10μl)中的試驗化合物對鈣釋放的抑制作用，這是通過在加入配體之前10秒時將它們加入到細胞混懸液中並測量[Ca2+]i的瞬時升高的減弱。通過替換加入hMCP-1還可以檢測試驗化合物沒有激動活性。
c)hMCP-1和RANTES介導的趨化性
利用人單核細胞細胞系THP-1進行體內趨化試驗。通過計算那些穿過的細胞來測量透過聚碳酸酯膜的細胞遷移作用，這可以通過Coulter計數直接進行，或者通過比色生存力試驗測量通過線粒體呼吸鏈的四唑鎓鹽的裂解(Scudiero D.A.等1988，Cancer Res.，48，4827-4833)來間接完成。
按照製造商的說明把化學引誘物引入到96孔微量滴定平板中，其構成趨化室的下部孔，趨化室帶有無PVP的5μm孔形聚碳酸酯粘合框架濾膜(NeuroProbe MB series，Cabin John，MD 20818，USA)。化學引誘物適當地在合成細胞培養基，RPMI 1640(Gibco)或補充有2mM谷醯胺和0.5％ BSA的該培養基中稀釋，或者用含Ca2+和Mg2+、無酚紅的HBSS(Gibco)加0.1％ BSA稀釋。各稀釋液在真空下脫氣30分鐘且置於(400μl)所述室的下部孔中，THP-1細胞(5×105存在於100μl RPMI1640中+0.5％BSA)在室上部的各孔中孵育。對於趨化性的抑制作用，令化學引誘物保持在預先測定的次最大濃度(1nM MCP-1)下並與不同濃度的溶於DMSO(最終的DMSO濃度＜0.05％v/v)的試驗化合物一起加入到下部孔中。所述的室在37℃5％CO2下孵育2小時。從上部孔除去培養基，隨後在打開該室之前用200μl生理鹽水洗滌，擦乾膜表面且將該96孔平板在600g下離心5分鐘以收穫細胞。抽吸上清液(150μl)，並且10μl下部增殖試劑，WST-I，{4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑鎓]-1，3-苯基二磺酸鹽}加電子耦合試劑(Boehringer Mannheim，Cat.no.1644 807)加回至孔中。該平板在37℃下孵育3小時，在450nm下讀取微量滴定平板上可溶甲_產物的吸光度。將數據輸入電子數據表，校正化學引誘物不存在下任何隨機遷移，並且計算平均吸光度值，平均值的標準誤差，和顯著性試驗。hMCP-1誘導的濃度依賴性細胞遷移具有特有的二相性反應，最大為0.5-1.0nm。
在上述試驗的另一種形式中，可以使用螢光標記的細胞，從而輔助終點檢測。在這種情況中，所用的THP-1細胞通過在5mM鈣黃綠素(Calcein)AM(甘氨酸，N，N′-[[3′，6′-二(乙醯氧基)-3-氧代螺[異苯並呋喃-1(3H)，9′-[9H]呫噸]-2′，7′-二基]二(亞甲基)]二[N-[2-[(乙醯氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]]-二[(乙醯氧基)甲基]酯；Molecular Probes)的存在下在黑暗中孵育45分鐘來螢光標記。通過離心收穫細胞並重新懸浮在含Ca2+，Mg2+和0.1％BSA的HBSS(無酚紅)。將50μl(2×105細胞)的細胞混懸液置於位於各孔上方的濾膜上，如上所述，該單位在37℃5％CO2下孵育2小時。在孵育結束時，用磷酸鹽緩衝鹽水洗掉濾膜上面的細胞，從平板取下濾膜，通過在485nm激發，538nm發射波長(finax，Molecular Devices)下讀取螢光來計算出吸在濾膜下側或下部孔的下部的數目。將數據輸入電子數據表，校正化學引誘物不存在下任何隨機遷移，並且計算平均吸光度值，平均值的標準誤差，百分抑制率和被測化合物的IC50以及顯著性試驗。除了MCP-1誘導的趨化性以外，這種試驗的另一種形式也可以用來測量對RANTES(2nM)誘導趨化性的抑制作用。
d)與人外周血單核細胞(PBMCs)結合i)人PBMCs的製備
新鮮人血液(200ml)得自志願獻血者，收集在檸檬酸鈉抗凝劑中使終濃度為0.38％。血液與沉降緩衝液混合併在37℃下孵育20分鐘。收集上清液和在1700rpm下離心5分鐘(Sorvall RT6000D)。所得的沉澱團重新懸浮在.20ml RPMI/BSA(1mg/ml)中，並且在15ml離心管內小心地使4×5mls of細胞分層堆積在4×5mls的Lymphoprep_(Nycomed)中。離心管在1700rpm下旋轉30分鐘(SorvallRT6000D)，取出所得的下部層且轉移到50ml Falcon管中。細胞用溶胞緩衝液洗滌2次除去所有殘留的血紅細胞，隨後在RPMI/BSA中洗滌2次。細胞重新懸浮在5ml的結合緩衝液中。在Coulter計數器上測量細胞數目並加入附加的結合緩衝液使終濃度為1.25×107PBMCs/ml。ii)試驗
利用Bolton & Hunter偶聯法(Bolton等，1973，Biochem.J，133，529；Amersham International plc]製備[125I]MCP-1。利用Ernst等，1994，J ImmunoL，152，3541的方法進行平衡結合試驗。簡單而言，把所有125I-標記的MCP-1(終濃度100pM)加入到96孔平板中的40μl(5×105細胞)的細胞混懸液。化合物，由在DMSO中10mM的儲備溶液在全細胞結合緩衝液稀釋，將其加入至5μl的終體積以使該試驗中DMSO濃度保持在5％。在化合物不存在下測定總的結合。通過加入5μl冷MCP-1使最終的試驗濃度為100nM來確定非特異結合。用全細胞結合緩衝液使試驗孔達到100μl的終體積且密封該平板。37℃下孵育60分鐘後，過濾該結合反應混合物且用冰冷的洗滌緩衝液使用平板洗滌器(Brandel MLR-96T細胞收穫器)洗滌10秒。使用之前過濾墊(Brandel GF/B)在0.3％聚乙烯亞胺中預浸溼60分鐘。過濾後將各個濾液分開置於3.5ml管(Sarstedt No.55.484)內且測定結合的125I-標記的MCP-1(LKB 1277 Gammamaster)。
通過試驗一式兩份利用6點劑量-反應曲線測定試驗化合物的效價並且測定IC50濃度。
在本發明被測化合物的有效劑量下沒有觀察到生理不可接受的毒性。
本發明進一步通過下列實施例舉例說明，但不受其限定，其中採用下述通用方法除非另外說明。
i)N，N-二甲基甲醯胺(DMF)用4_分子篩中乾燥。無水四氫呋喃(THF)得自Aldrich SURESEALTM瓶。其它市售試劑和溶劑在使用時無需進一步純化，除非另外說明。有機溶劑提取物用無水MgSO4乾燥。
ii)1H，13C和19F NMR在Bruker WM200，WM250，WM300或WM400儀上記錄，利用具有Me4Si或CCl3F的DMSO-d6作為適當內標，除非另外說明。化學位移表示為δ(ppm)，並且峰裂數表示如下s，單重峰；d，雙重峰；dd，成對的雙重峰；t，三重峰；dt，成對的三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬峰。
iii)質譜記錄在VG 12-12 quadrupole，VG 70-250 SE，VG ZAB2-SE或VG改進的AEI/Kratos MS9光譜儀上。
iv)對於TLC分析，使用Merck預塗的TLC平板(矽膠60 P254，d＝0.25mm)。
v)快速色譜在矽膠(Merck KieselgelArt.9385)上進行。實施例1N-(3-甲氧基-4-氯苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸
將氫氧化鈉(2M，1.9ml)加入到N-(3-甲氧基4-氯苄基)-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(305mg)在甲醇(3ml)和THF(3ml)中的攪拌溶液內。室溫下將該反應攪拌18小時。真空濃縮反應混合物且用水(5ml)稀釋。該溶液通過加入鹽酸水溶液(2M)酸化，用乙酸乙酯提取，乾燥並蒸發。殘餘物通過柱色譜純化用20％-100％乙酸乙酯洗脫，得到所需產物，其為固體(177mg，70％)NMR(CD3SOCD3)δ3.95(s，3H)，5.95(s，2H)，6.35(d，1H)，6.8(dd，1H)，6.9(d，1H)，7.0(d，1H)，7.1(s，1H)，7.25(d，1H)，7.3(d，1H)，9.0(s，1H)；m/z 332(M+H+).
重複上述實施例中所述的方法利用適當的吲哚酯作為原料。由此得到下述化合物。實施例2N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率88％.NMR(CD3SOCD3)δ3.75(s，3H)，5.7(s，2H)，6.8(dd，1H)，6.9-7.1(m，5H)，7.4(d，1H)，9.0(bs，1H)；m/z 330(M-H+).實施例3N-(3-氯-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率63％；m/z 314(M-H+)。實施例4N-(3-硝基-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率5％；m/z 326(M-H+).實施例5N-(3-氯-4-三氟甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率82％.NMR(CD3SOCD3)δ5.8(s，2H)，6.8(m，1H)，6.98(m，2H)，7.15(s，1H)，7.35(m，2H)，7.45(m，1H)，9.0(s，1H)，12.82(s，1H)；m/z 384(M-H+).實施例6N-(3-硝基-4-氯苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率56％.NMR(CD3SOCD3)δ5.85(s，2H)，6.85(dd，1H)，6.95(d，1H)，7.15(m，1H)，7.35(d，1H)，7.65(d，1H)，7.8(d，1H)，9.0(s，1H).實施例7N-(3-氟-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸收率18％.NMR(CD3SOCD3)δ5.7(s，2H)，6.7(m，3H)，6.9(s，1H)，7.1(m，3H)，7.3(m，1H)，9.0(s，1H)，12.8(s，1H)；m/z298(M-H+)。實施例8N-[(4-氯-3-乙炔基苯基)甲基]-5-羥基吲哚-2-甲酸
將氫氧化鈉(2M，1.8ml)加入到N-[(4-氯-3-三甲基甲矽烷基乙炔基苯基)甲基]-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(0.14g)在甲醇(5ml)中的溶液內，並將該混合物攪拌3小時。除去甲醇，所得的殘餘物用水(20ml)稀釋並用乙酸乙酯(20ml/次)提取2次。水層用鹽酸水溶液(2M)酸化並用乙酸乙酯提取(3×25ml)。合併的乙酸乙酯提取物用水(30ml)和鹽水(30ml)洗滌，乾燥(MgSO4)。除去溶劑得到的殘餘物溶於乙酸乙酯和異己烷(1∶1)的混合物中並通過5g矽膠Isolute柱，用乙酸乙酯/異己烷混合物(1∶1)洗脫得到該標題化合物(65mg).NMR(CD3SOCD3)δ4.5(s，1H)，5.7(s，2H)，6.8(m，1H)，6.9(m，2H)，7.1(m，1H)，7.2(s，1H)，7.35(m，1H)，7.4(m，2H)，9.0(s，1H)；m/z324.4(M-H).起始原料的製備
上述實施例的起始原料或者購得，或者很容易通過標準方法從已知物質來製備。譬如，下列反應(方法A-D)舉例說明但不限定上述反應中所用起始原料的製備。方法A5-乙醯氧基-N-(3-甲氧基-4-氯苄基)吲哚-2-甲酸乙酯i)5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯
在-78℃氬氣氛下把三溴化硼(64.58g)滴加到5-甲氧基吲哚-2-甲酸乙酯(20g)在二氯甲烷(1000ml)中的攪拌溶液內。令該反應物升至室溫並繼續攪拌2小時。將反應物傾入冰/飽和碳酸氫鈉水溶液中同時攪拌，用乙酸乙酯提取。合併的有機提取物用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和氯化鈉水溶液洗滌且乾燥。真空濃縮該溶液，殘餘物通過柱色譜純化用0-60％乙醚異己烷作為洗脫劑得到產物，其為白色固體(9.02g，48％).NMR1.31(t，3H)，4.29(q，2H)，6.79(dd，1H)，6.90(dd，1H)，7.22(d，1H)，8.84(s，1H)，11.52(brs，1H)；m/z206(M+H+).ii)5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯
將5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯(7.79g)和4-二甲基氨基吡啶(20mg)在乙酸酐(80ml)中的攪拌溶液在80℃下加熱4小時。真空濃縮該反應，殘餘物溶於乙酸乙酯。合併的有機提取物用鹽酸(2M)、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和氯化鈉水溶液洗滌且乾燥。真空濃縮該溶液得到產物，其為黃色固體(9.39g，100％).NMR1.20(t，3H)，2.10(s，3H)，4.19(q，2H)，6.86(dd，1H)，6.97(d，1H)，7.20(s，1H)，7.29(d，1H)；m/z 248(M+H+).iii)5-乙醯氧基-N-(3-甲氧基-4-氯苄基)吲哚-2-甲酸乙酯
向5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(283mg)在DMF(6ml)中的溶液內加入氫化鈉(54mg，在油中的60％分散體)。將該混合物攪拌30分鐘，加入催化量的碘化鉀和3-甲氧基-4-氯苄基溴(345mg)在DMF(2ml)中的溶液。將該混合物攪拌2小時，用水終止並用乙酸乙酯提取。乾燥有機提取物，蒸發且所得的膠通過柱色譜純化用20％乙酸乙酯/異己烷洗脫，得到所需產物，其為油，放置後固化(310mg，63％).NMR(CDCl3)δ1.4(t，3H)，2.3(s，3H)，3.8(s，3H)，4.35(q，2H)，5.8(s，2H)，6.5(dd，1H)，6.7(d，1H)，7.05(dd，1H)，7.2-7.4(m，4H)；m/z402(M+H+)
重複方法A i)-iii)中所述的過程利用適當的苄基滷化物。由此得到下列化合物。N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯收率58％；m/z 402(MH+).N-(3-氯-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯收率73％；.m/z 386(MH+).N-(3-硝基-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯收率41％；m/z 396(MH+).N-(3-氯-4-三氟甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯收率86％.NMR(CD3SOCD3)δ1.25(t，3H)，2.25(s，3H)，4.25(q，2H)，5.85(s，2H)，6.95(m，1H)，7.1(m，1H)，7.39(m，2H)，7.45(m，2H)，7.6(m，1H)；m/z 456(MH+).N-(3-硝基-4-氯苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸乙酯收率55％.NMR(CD3SOCD3)δ1.39(t，3H)，2.31(s，3H)，4.32(q，2H)，5.81(s，2H)，7.04-7.15(m，2H)，7.21-7.3(m，1H)，7.36-7.44(m，3H)，7.62(s，1H)。方法B3-甲氧基-4-氯苄基溴(i)3-甲氧基-4-氯甲苯
向2-氯-5-甲基苯酚(15.95g)在丙酮(200ml)中的溶液內加入碳酸鉀(38g)和硫酸二甲基酯(11.7ml)。將該混合物回流3小時且隨後過濾，得到所需產物，其無需進一步純化就可使用(16.95g，98％).NMR(CDCl3)δ2.35(s，3H)，3.9(s，3H)，6.7-6.8(m，2H)，7.15-7.3(m，1H)。(ii)3-甲氧基-4-氯苄基溴
回流3-甲氧基-4-氯甲苯(9.62g)和N-溴琥珀醯亞胺(12.05g)的混合物同時用超壓強烈溢光燈照射2小時。冷卻該混合物，過濾並蒸發得到油，其通過柱色譜純化用乙醚洗脫，得到所需產物，其為油(14.67g，95％)。NMR(CDCl3)δ3.9(s，3H)，4.45(s，2H)，6.9-7.0(m，2H)，7.3-7.4(m，1H)。
以類似方式但從2-氯-4-甲基苯酚起始製備3-氯-4-甲氧基苄基溴收率96％.NMR(CDCl3)δ3.9(s，3H)，4.45(s，2H)，6.9(d，1H)，7.25(dd，1H)，7.4(d，1H)。方法C3-硝基-4-氯苄基溴
向3-硝基-4-氯苄醇(4.67g)和三苯基膦(6.53g)在二氯甲烷(150ml)中的冷卻至5℃的溶液內在氬氣氛下加入四溴化碳(8.27g)。所得的混合物在室溫下攪拌18小時。濃縮該混合物，通過柱色譜純化用異己烷至20％乙酸乙酯/異己烷洗脫，得到所需產物，其為黃色油(5.39g，86％).NMR(CDCl3)d4.5(s，2H)，7.5(s，2H)，7.9(s，1H).方法DN-[(4-氯-3-三甲基甲矽烷基乙炔基苯基)甲基]-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(i)4-氯-3-碘苄醇
硼烷-THF複合物(10ml)在20分鐘內滴加至4-氯-3-碘苯甲酸(1.4g)在THF(25ml)中的溶液內。將該反應混合物攪拌2小時且隨後冷卻(冰浴)，小心加入甲醇(20ml)。除去溶劑並將殘餘物溶於甲醇(10ml)，與2M氫氧化鈉水溶液(10ml)一起攪拌2小時。加入乙酸乙酯(50ml)，該混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(50ml)洗滌。水提取物用乙酸乙酯(2×50ml)洗滌，合併的乙酸乙酯提取物用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌和乾燥。除去溶劑，得到4-氯-3-碘苄醇(1.15g).NMR(CD3SOCD3)δ4.45(d，2H)，5.3(t，1H)，7.3(m，1H)，7.5(m，1H)，7.8(s，1H)。(ii)4-氯-3-碘苄基溴
0℃下將三苯基膦(1.1g)分次加入到4-氯-3-碘苄醇(1.1g)在二氯甲烷(40ml)的溶液內並且連續攪拌10分鐘。分次在2分鐘內加入四溴化碳(1.5g)，令該反應混合物升至室溫並攪拌15小時。把該溶液直接加入到矽膠色譜柱上並用二氯甲烷洗脫，得到4-氯-3-碘苄基溴(1.9g).NMR(CD3SOCD3)δ4.6(s，2H)，7.5(m，2H)，7.6(s，1H)，8.0(m，1H)。(iii)N-[(4-氯-3-碘苯基)甲基]-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯
氬氣流下把氫化鈉(0.23g的在油中的60％分散體)加入到5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(1.29g)和四正丁基碘化銨(10mg)在無水DMF(25ml)中的溶液內。將反應混合物攪拌15分鐘並且加入4-氯-3-碘苄基溴(1.9g)在DMF(5ML)中的溶液。將該混合物攪拌15小時，隨後加入飽和氯化銨水溶液(5ml)。除去溶劑得到的殘餘物用飽和氯化銨水溶液(50ml)稀釋並用乙酸乙酯提取(3×30ml)。合併的乙酸乙酯提取物用鹽水(100ml)洗滌和乾燥。除去溶劑得到的殘餘物通過矽膠色譜純化，用乙酸乙酯和異己烷(1∶9)的混合物洗脫，得到該標題化合物(0.21g).NMR(CD3SOCD3)δ1.1(t，3H)，2.2(s，3H)，4.3(m，2H)，5.8(s，2H)，6.9(m，1H)，7.1(m，1H)，7.35(m，1H)，7.4(m，2H)，7.6(m，2H)，7.7(m，2H)；m/z 497.5(M+H)。(iv)N-[(4-氯-3-三甲基甲矽烷基乙炔基苯基)甲基]-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯
三甲基甲矽烷基乙炔(114il)加入到N-[(4-氯-3-碘苯基)甲基]-5-乙醯氧基吲哚-2-甲酸乙酯(0.2g)、雙(三苯基膦)鈀(II)氯化物(2mg)、三乙胺(56il)和碘化亞銅(I)(1mg)在乙腈中的脫氣溶液內，該混合物在氬氣氛下攪拌12小時。加入另一份的雙(三苯基膦)鈀(II)氯化物(2mg)和三甲基甲矽烷基乙炔(114il)並且連續攪拌2小時。加入另一份的三甲基甲矽烷基乙炔(114il)並連續攪拌12小時。將少量矽膠加入到反應混合物中並蒸發溶劑。殘餘物加入到5g矽膠Isolute柱上且用乙酸乙酯-異己烷混合物(1∶4)洗脫得到該標題化合物，其為無色油(0.15g).NMR(CD3SOCD3)δ0.0(s，9H)，1.1(t，3H)，2.1(s，3H)，4.1(m，2H)，5.6(s，2H)，6.7(m，2H)，6.9(m，2H)，7.1(m，1H)，7.2(m，2H)，7.3(m，1H)，7.4(m，1H)；m/z 468.5(M+H)。實施例9藥物組合物
本實施例舉例說明，但不限於，在此定義的本發明的代表性藥物劑型(活性成分被稱作″化合物X″)，為了治療或預防而應用於人體實施例A(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)(h)(i)(j)(k)(1)注意
上述製劑中的化合物X可以包括本文實施例中所述的化合物。
上述製劑可以通過製藥領域熟知的常規方法來製得。片劑(a)-(c)可以通過常規方式腸溶包衣，例如提供鄰苯二甲酸乙酸纖維素的包衣。氣溶劑製劑(h)-(k)可以與標準、計量給藥的氣溶膠分配器結合使用，並且懸浮劑脫水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂可以被其它懸浮劑如脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇倍半油酸酯、吐溫80、聚甘油油酸酯或油酸代替。
權利要求
1.式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥
其中
R1是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；
R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；
R3是滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基、烷氧基、三氟甲基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7，或S(O)nR7，其中n是0、1或2且R7是烷基；
R4是滷素、三氟甲基、甲硫基，甲氧基、三氟甲氧基或低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基；
R5是氫、滷素、氰基、低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基或COR8
其中R8是低級烷基；
R6是氫、滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基或COR9
其中R9是低級烷基；
條件是當R1是氫、滷素或甲氧基，R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基，R5和R6同時為氫，和R3或R4之一是氯、氟或三氟甲基時，則R3或R4的另一個不是滷素或三氟甲基。
2.按照權利要求1的化合物，其中在式(I)中
R1是氫或滷素；
R2是氫或滷素；
R3是滷素、硝基或烷氧基；
R4是滷素、烷基或烷氧基；
R5和R6是氫。
3.按照權利要求1的化合物，其中在式(I)中
R1是氫或滷素；
R2是氫或滷素；
R3是三氟甲基；
R4是甲硫基、甲氧基、三氟甲氧基、烷基或炔基；
R5和R6是氫。
4.按照權利要求1的化合物，其中在式(I)中
R1是氫或滷素；
R2是氫或滷素；
R3是烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7或S(O)nR7，其中R7和n如權利要求1定義；
R4是滷素或三氟甲基；
R5和R6是氫。
5.按照權利要求1的化合物，其是式(IA)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥
其中
R1、R2如權利要求1定義；
R3是烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、三氟甲基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7或S(O)nR7，其中R7是烷基；
R4』是滷素、甲硫基、甲氧基、三氟甲氧基或甲基；
條件是當R3』是三氟甲基時，R4』不是三氟甲基或滷素。
6.按照權利要求5的化合物，其中在式(IA)中
R1和R2是氫；
R3是甲氧基、氯或硝基；
R4』是氯、甲基、甲氧基或三氟甲氧基。
7.按照權利要求1的化合物，其是下列任一化合物
N-(3-甲氧基-4-氯苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-氯-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-硝基-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-氯-4-三氟甲氧基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-硝基-4-氯苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-(3-氟-4-甲基苄基)-5-羥基吲哚-2-甲酸；
N-[(4-氯-3-乙炔基苯基)甲基]-5-羥基吲哚-2-甲酸。
8.一種製備權利要求1所述化合物或其藥學可接受鹽或前藥的方法，該方法包括
(a)式(II)的化合物
其中R1、R2、R5和R6如權利要求1中定義，Ra是羧基或其被保護形式，和Rb是氫或適當的羥基保護基，與式(III)的化合物反應
其中R3和R4如權利要求1中定義和L是可替換基團；和此後任選地
(b)(i)使所得的式(I)的化合物轉化為另一種式(I)的化合物；
(ii)脫去任何保護基；或
(iii)形成其藥學可接受鹽或前藥。
9.按照權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，通過治療應用於在人體或動物體的治療方法中。
10.按照權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，用作藥物。
11.按照權利要求10的化合物，其在溫血動物中用作拮抗MCP-1介導的效應的藥物。
12.一種藥物組合物，其中含有與藥學可接受的賦形劑或載體聯合的權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥。
13.權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，在製備用來拮抗溫血動物中MCP-1介導的效應的藥物中的應用。
14.一種治療炎性疾病的方法，其包括給需要這種治療的宿主施用權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，或權利要求12所述的藥物組合物。
15.一種在需要所述治療的溫血動物中拮抗MCP-1介導的效應的方法，其包括給該動物施用有效量的權利要求1-7任一項所述的化合物或其藥學可接受鹽或前藥，或權利要求12所述的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及式(I)的化合物或其藥學可接受鹽或前藥R1是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基；R3是滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基、烷氧基、三氟甲基、硝基、氰基、三氟甲氧基、C(O)R7，或S(O)nR7，其中n是0、1或2且R7是烷基；R4是滷素、三氟甲基、甲硫基，甲氧基、三氟甲氧基或低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基；R5是氫、滷素、氰基、低級烷基、低級鏈烯基或低級炔基或COR8，其中R8是低級烷基；R6是氫、滷素、低級烷基、低級鏈烯基、低級炔基或COR9，其中R9是低級烷基；條件是當R1是氫、滷素或甲氧基，R2是氫、滷素、甲基、乙基或甲氧基，R5和R6同時為氫，和R3或R4之一是氯、氟或三氟甲基時，則R3或R4的另一個不是滷素或三氟甲基。這些化合物對炎性疾病的治療具有有效活性，尤其是拮抗溫血動物如人體中的MCP－1介導的效應。
文檔編號C07D209/42GK1395564SQ0180364
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月9日 優先權日2000年1月13日
發明者A·W·福爾, J·G·凱特爾 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司