組合物和治療性抗腫瘤疫苗的製作方法

2023-12-09 02:00:06 2

專利名稱：組合物和治療性抗腫瘤疫苗的製作方法
組合物和治療性抗腫瘤疫苗相關申請的交叉引用本申請要求2007年8月9日提交的美國臨時專利申請60/954，917以及2007年 8月8日提交的法國專利申請FR 0705767的優先權，這兩件專利申請在此通過引用併入本 文。本發明涉及在宿主中誘導抗腫瘤目的的細胞毒性應答的組合物，還涉及含有該組 合物的治療性抗腫瘤疫苗。針對腫瘤抗原的天然免疫應答相對無效，已經確定了多種使得腫瘤逃避抗腫瘤免 疫應答的機制。常規疫苗方法產生的體液應答已被證明是不夠的。已經研究了產生基於抗原呈遞細胞(APC)特別是基於樹突細胞的細胞毒性應答 的策略。其原理具體地為通過激活患者自身免疫防禦來破壞癌細胞。樹突細胞是抗原呈遞細胞(APC)，其在產生腫瘤細胞特異性細胞毒性效應器方面 非常有效。它們能夠吞噬凋亡細胞或來源於腫瘤細胞的凋亡小體，然後能夠與MHC I類和 II類分子聯合將腫瘤抗原呈遞至T淋巴細胞。因此，樹突細胞能夠啟動特異性溶細胞性T 淋巴細胞克隆的增殖和產生。在該反應結束時，如此分化的殺傷淋巴細胞離開淋巴區室，從 而在生物體內循環並結合到腫瘤上。對腫瘤所表達抗原進行識別，隨後誘導溶解信號，導致 腫瘤細胞的破壞。已經研究了一些靶向樹突細胞的抗癌疫苗的策略(Eymard JC, Bernard J，Bull Cancer. 2003,90 (8-9) :734_43)。其中一些是基於對樹突細胞進行體外操縱，另一些是基於 體內激活樹突細胞。在前一種情況中，將樹突細胞從取自患者的血細胞中分離出來；對它們 進行培養並使其成熟，「脈衝刺激」，即用腫瘤肽、腫瘤裂解物、凋亡腫瘤細胞或者提取自自 體腫瘤的熱休克蛋白進行離體激活，最後再注射進該患者體內。在第二種情況中，在將肽、 蛋白、經輻照的腫瘤細胞或者包含靶向樹突細胞的抗原性肽的病毒注射到患者體內之後進 行樹突細胞的激活。然而，所獲得的細胞毒性應答很少伴隨臨床效果。樹突細胞的活化成 為其有效活化溶細胞性T淋巴細胞能力的條件。樹突細胞的活化水平似乎是本疫苗策略中 的關鍵點。離體使用樹突細胞以獲得抗腫瘤疫苗帶來了有關下列項的一些問題樹突細胞的 成熟狀態，待注射細胞的數目，產生能夠遷移到二級淋巴器官並誘導有效細胞毒性T應答 之樹突細胞的注射的途徑、部位和頻率(Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka AK, Schuler G. [Dendriticcells as vectors for therapy]Cell. 2001,10,106(3) :271_4·)。樹突細胞在體內的活化部分地受到以下限制腫瘤抗原的弱免疫原性能力以及以 充足的水平活化樹突細胞的難度。在數個出版物中已有設想使用紅細胞作為載體來運輸抗原並遞送給APC的用途， 其中抗原被包封到紅細胞中或者結合到其表面上。已經在體內和體外研究了引發的免疫應答。Hamidi等人最近描述了將BSA (牛血清白蛋白)作為抗原模型包封到人紅細胞 中(Hamidi M 等人.，Drug Deliv.，2007 ；14(5) :295_300 以及 IntJ Pharm.，2007，29，338(1-2) :70-8)。作者建議將紅細胞用作載體來將抗原呈遞到網狀內皮系統(RES)的APC 中。在 Hamidi 等人發表的另一篇綜述(J. Control. Release, 2007,118 (2) 145-60)中，作 者指出已經研究了數種策略以促進靶向RES，所述靶向是由紅細胞的衰老促進的，導致它們 被攝取從而被裂解。還提到了其它途徑，例如使紅細胞暴露於穩定劑(特別是交聯劑)，用 抗RH抗體包裹紅細胞，用IgG類型的抗體靶向脾臟或者用IgM類型的抗體靶向肝臟，熱休 克或者暴露於氧化劑、酶或抗生素。在用裝載抗原的紅細胞免疫後可在體內獲得體液免疫應答。由Murray等人進行 的研究使得可在小鼠中靜脈內注射裝載了下列四種抗原之一的小鼠紅細胞之後檢測IgG 免疫球蛋白KLH(鑰孔帽貝血藍蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、CTB(霍亂毒素b亞基)以及 ADA (牛腺苷脫氨酶)。檢測到在Th2應答期間主要的免疫球蛋白同種型IgGl和IgG3以及 Thl應答標誌物IgG2免疫球蛋白同種型，表明涉及兩種類型的免疫應答，即體液應答和細 胞應答(Murray AM et al. , Vaccine.，200628，24 (35-36) :6129_39)。與紅細胞一起使用的另一種抗原製劑已由Dominici等人進行了測試。HIV-1病 毒的Tat蛋白通過親和素/生物素偶聯錨定到小鼠紅細胞的表面上。通過腹膜內注射該抗 原製劑對小鼠進行免疫，所述製劑被樹突細胞內化，引發體液介導的體內免疫應答。所測得 的免疫球蛋白的同種型表徵顯示出誘導Thl和Th2應答。針對用偶聯了所述抗原的紅細胞 處理的小鼠，通過常規的鉻釋放方法體外顯示了抗Tat細胞毒活性。(Dominici S et al., Vaccine.，200316，21 (17-18) :2073_81)。Corinti等人已經使用相同的製劑在體外證明了細胞應答。如⑶4+和⑶8+應答的 誘導，來源於人單核細胞的樹突細胞顯示出對綴合Tat蛋白的紅細胞的細胞吞噬作用。此 夕卜，在幹擾素Y存在下樹突細胞的成熟促進了 I型免疫應答(Corinti S. et al. ,Leukoc. Biol.2002，71 (4) :652_8)。Boberg等人給小鼠腹膜內注射來源於HIV-1蛋白酶的肽組成且通過親和素/生物 素體系錨定於小鼠紅細胞表面的疫苗。它們從化學上修飾了紅細胞，以促進它們被APC所 識別，但是獲得了弱的免疫反應。他們得出如下結論由於紅細胞有限裝載抗原肽，所以遞 送的抗原量少，所注射的血容量並沒有被原本認為促進APC抗原識別的載體的化學修飾所 補償(Boberg A. et al. , Infect. Agents Cancer. , 2007,182 9)。本發明的目的是提供可用於根據免疫治療方法治療癌症的組合物和疫苗。因此，本發明的目的之一是在宿主中誘導針對腫瘤細胞的細胞毒性細胞應答的組 合物，並且所述組合物包含含有腫瘤抗原的紅細胞。術語「宿主」優選指人，但也指動物，特別是寵物(特別是狗或貓)以及運動用動 物(animals for sport)(特別是馬)。根據本發明，所述紅細胞含有所述抗原，即包封有所述抗原，其意指該抗原在紅細 胞內部或基本上在紅細胞內部。優選地，對所述紅細胞進行設計、選擇或修飾，以促進其被APC吞噬，最特別是被 樹突細胞吞噬。特別地，對所述紅細胞進行設計、選擇或修飾以促進其在脾臟和肝臟中被吞 噬，主要目標是靶向脾臟的APC。 在一個優選的實施方案中，根據本發明的組合物包含有所述抗原並靶向脾臟的紅 細胞。所述組合物促進這些紅細胞在脾臟中被APC特別是樹突細胞吞噬。
根據一個實施方案，所述紅細胞含有腫瘤抗原，並且是與識別所述紅細胞表面上 表位的免疫球蛋白形成的免疫複合物，以促進所述紅細胞被吞噬，特別是被樹突細胞吞噬。 所述組合物還可促進被巨噬細胞的吞噬。優選地，所述免疫球蛋白是免疫球蛋白G。所述免疫複合物的形成包括紅細胞和至少一種抗體，優選IgG亞型。樹突細胞在其表面上具有免疫球蛋白G(IgG)的恆定Fc區的受體。這些受體能引發所述抗原-IgG免 疫複合物被吞噬或內化，由此形成並促進MHC I類和II類分子的抗原呈遞，導致產生⑶4+ 輔助淋巴細胞，特別是CD8+細胞毒性淋巴細胞(A. Regnault et al.，J. Exp. Med.，Janvier 1999，189(2) 371-80)。作為合適的抗體，可提及抗恆河猴(anti-rhesus)抗體、抗血型糖蛋白A抗體和抗 CRl抗體(CRl =補體受體1型)。抗血型蛋白A抗體(A. Bigbee et al.，Mol. Immunol.， December 1983,20(12) 1353-62)是優選的形式。優選地，用於形成免疫複合物的來源於人的紅細胞是來自於供體的異體紅細胞。根據另一個實施方案，所述紅細胞含有腫瘤抗原並且被熱或化學修飾，以促進所 述紅細胞被吞噬，特別是被樹突細胞吞噬。所述組合物還可促進被巨噬細胞的吞噬。特別地，在下列條件下進行熱處理在約42至約55°C下、優選約47至約51°C下， 加熱紅細胞約15分鐘至約90分鐘、優選約25至約50分鐘。通常，在約48至約50°C例如 約48°C下，加熱紅細胞約30分鐘。使用修飾紅細胞表面的物質進行化學處理，特別是橋連劑或交聯劑，例如辛二酸 雙(硫代琥珀醯亞胺基)酯(BS3或BS3)、戊二醛或神經氨酸酶。在一個具體的實施方案中，將至少兩種靶向方法相結合，例如所述組合物包含含 有抗原的紅細胞，其為免疫複合物形式，並且被熱或化學處理，以促進它們在脾臟和/或肝 髒(優選脾臟)中的攝取，以及促進它們被APC特別是樹突細胞吞噬。在另一個實施方案中，所述含抗原紅細胞是異種的。將異種紅細胞注射進人體導 致患者的天然抗體與所注射紅細胞相結合。由此形成的免疫複合物促進其被APC吞噬，特 別是被樹突細胞吞噬。優選地，所述紅細胞是豬來源的。在一個具體的實施方案中，所述異種紅細胞經熱或化學修飾以促進其被吞噬。根據本發明的組合物可包含一種或多種腫瘤抗原。在存在數種腫瘤抗原時，優選 選擇所述腫瘤抗原以誘導針對一種類型的腫瘤或腫瘤細胞的免疫應答。所述組合物優選包含至少兩種代表所治療腫瘤的腫瘤抗原。目的是產生多個細胞 毒性T淋巴細胞克隆，其各自識別特異性抗原性肽，以產生更有效的免疫應答。在一個具體的實施方案中，所述組合物包含至少兩個紅細胞群，其各自包封不同 的抗原。可用於本文的最眾所周知的抗原示於下表中，在表中按種類對其進行分類。獨特抗原
基因/蛋白質ritl
α-輔肌動蛋白-4 b)分化抗原 c)過表達抗原 Van der Bruggen等人已開發了一個引用了 T淋巴細胞識別的並且可用於 本發明癌症免疫療法的所有人腫瘤抗原的資料庫:http://www. cancerimmunity. org/ peptidedatabase/Tcel!epitopes, htm.其它可用於本發明的抗原有例如胃泌素17、人絨毛膜促性腺激素、EGFRvIII、 HER2、HER2/neu、P501、鳥苷酸環化酶 C、PAP。詞語「抗原」涵蓋天然或合成或人工來源的抗原，來源於待治療患者的抗原，抗原 片段、衍生物或變體，只要該抗原能夠引發合適的免疫應答即可。所述抗原可以是例如提取 的、化學合成的或者通過遺傳工程產生的。為了產生有效的免疫應答，樹突細胞必須是有活性且成熟的，它們必須產生細胞 因子和趨化因子，並且表達募集和活化T淋巴細胞所需的共刺激分子。可使用多種類型的佐劑來激活APC，特別是樹突細胞。細菌或病毒RNA或DNA、熱 休克蛋白(HSP)、糖、免疫複合物和細胞因子是誘導特異性受體(Toll樣受體TLR、甘露糖受 體)激活介導的APC成熟特別是樹突細胞成熟的多種因子。巨噬細胞和樹突細胞在其表 面上並非都表達相同的受體。因此，佐劑的選擇涉及能夠在人體中產生細胞毒性免疫應答 並且其受體存在於攝取本發明紅細胞的細胞表面上(因此特別是在樹突細胞表面上)的分 子。根據一個實施方案，所述佐劑被包封到紅細胞內部或者附著於紅細胞表面上的分 子。它們優選為含有所述抗原的紅細胞。或者，所述佐劑被裝到獨立治療的其它紅細胞內部或者附著於其上。這些紅細胞 也可經過修飾或選擇，以促進其被APC吞噬，特別是被樹突細胞吞噬。因此，如上所述，它們 可以是免疫複合物形式，或者是被熱或化學修飾的，或者是異種的。根據另一個實施方案，所述佐劑是分開的佐劑組合物，其可以與包含所述抗原的 紅細胞同時或分別施用。不言而喻，只要所述佐劑可以處於分開的組合物(紅細胞組合物或佐劑組合物) 中，該佐劑就可以分開施用的方式與含有所述抗原的紅細胞伴隨施用、或者以混合物的形 式一起施用，或者分別施用，例如在施用包含所述抗原的紅細胞之後，特別是間隔數小時或 數天施用。在可以使用的佐劑中，首先可提及下文的優選佐劑-TLR(To 11樣受體)配體，特別是咪唑並喹啉類，例如優選咪唑並喹啉，例如咪唑並喹啉CL097、咪喹莫特、雷西莫特；CpG寡聚脫氧核苷酸；LPS(脂多糖)；聚(肌苷酸)-(聚 胞苷酸)聚(I:C)；-細胞因子，特別是幹擾素α、IL-2(白細胞介素2)、IFNγ (幹擾素γ )、 GM-CSF(粒細胞單核細胞-集落刺激因子)、IL-12(白細胞介素12)、TNFa (腫瘤壞死因子 α ) 0
在其它可使用的佐劑中，可特別提及-細菌成分，特別是BCG(卡介苗)、MDP (胞壁醯二肽)、TDM(海藻糖二黴菌酸酯)、 LPS (脂多糖)、MPL (單磷醯基脂A)；-礦物佐劑，特別是氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鉀和磷酸鈣；-細菌毒素，特別是CT(來自霍亂弧菌(Vibriocholera)的霍亂毒素)、CTB (來 自霍亂弧菌的霍亂毒素)、PT(來自百日咳桿菌(Bordetellapertussis)的百日咳毒素)、 LT(來自大腸桿菌(Escherichia coli)的熱不穩定淋巴細胞毒素)；-KLH，鑰孔帽貝血藍蛋白。將活性成分包封在紅細胞中的方法是已知的，本文中優選的裂解-再封的基本技 術描述於專利EP-A-101 341和EP-A-679 101中，本領域技術人員可參考。根據此方法，將 紅細胞懸液連續充入透析元件(例如透析管或透析筒)的主要區室中，同時次要區室含有 相對於所述紅細胞懸液低滲的水溶液，以裂解所述紅細胞；然後，在再封單元中，通過增加 滲透壓和/或膠體滲透壓在腫瘤抗原存在下誘導紅細胞的再封，然後收集含有所述腫瘤抗 原的紅細胞懸液。在迄今為止描述的變化形式中，優選法國專利申請No. 0408667中所述的方法，其 可有效、可重現並且安全穩固地包封腫瘤抗原。此方法包括以下步驟1-在血細胞比容水平大於或等於65 %的等滲溶液中懸浮紅細胞沉澱，於+1至 +8°C下冷卻，2-使用來自所述紅細胞沉澱的紅細胞樣品測定滲透脆性，步驟1和2可以任何順 序進行(包括平行進行)，3-腫瘤抗原的裂解和內化過程，其在相同腔室內在恆定維持在+1至+8°C的溫度 下進行，包括使血細胞比容水平大於或等於65%的紅細胞懸液和冷卻到+1至+8°C的低滲 裂解溶液通過透析筒；以及根據之前測量的滲透脆性調節裂解參數；和4-在第二腔室中進行的再封過程，在其中溫度為+30至+40°C，並且存在高滲溶 液。「內化」意為腫瘤抗原滲透進入紅細胞內部。特別地，對於透析而言，將紅細胞沉澱懸浮於大於或等於65%、優選大於或等於 70%的高血細胞比容水平的等滲溶液中，此懸液被冷卻到+1至+8°C，優選+2至6°C，通常 約+4°C。根據一個具體實施方案，所述血細胞比容水平為65 %至80 %，優選70 %至80 %。有利地，在即將進行裂解步驟之前測定所述紅細胞的滲透脆性。紅細胞或包含它 們的懸液有利地處在接近或等於裂解所選的溫度下。根據本發明的另一個有利特點，快速 地進行滲透脆性的測量，即在取得樣品之後很快進行裂解過程。優選地，取樣和開始裂解之 間的時間間隔小於或等於30分鐘，更優選地小於或等於25分鐘，甚至小於或等於20分鐘。關於進行所述裂解_再封過程的方式，以及測量和考慮的滲透脆性，本領域技術人員可參閱法國專利申請No. 0408667以獲得更多細節。
根據本發明的一個特點，根據本發明的組合物最終包含約40%至約70%、優選約 45%至約55%、更優選約50%的血細胞比容水平的紅細胞懸液。其優選地包裝在約10至 約250毫升的體積中。該包裝優選是適於輸血的血液袋類型。對應於醫生處方的被包封腫 瘤抗原的量優選全部包含於所述血液袋中。本發明的目的之一還在於治療性抗腫瘤疫苗，其包含有效量的一種或多種根據本 發明的組合物。因此，該疫苗可包含根據本發明的組合物，在存在或不存在包封的或未包封 之佐劑的情形下，其本身含有裝有一種或多種腫瘤抗原的紅細胞群體，或者可包含至少兩 種根據本發明的組合物，在存在包封或未包封之佐劑的情形下，其具有不同的裝有一種或 多種腫瘤抗原的紅細胞群體。本發明的目的之一還在於在患者體內誘導針對腫瘤細胞或腫瘤的細胞毒性細胞 應答的方法。此方法包括向該患者施用有效量的本發明組合物，特別是通過靜脈內、注射或 輸注，優選通過輸注施用。該方法的目的尤其在於誘導患者樹突細胞的活化和CD8+細胞毒 性細胞應答。如上所述，獲得特異性CD4+輔助和CD8+細胞毒性應答。本發明的目的之一還在於在患者體內誘導如上所述針對腫瘤細胞或腫瘤的細胞 毒性細胞應答的抗癌治療方法。此方法包括向該患者施用有效量的本發明抗腫瘤疫苗，特 別是通過靜脈內、注射或輸注，優選通過輸注施用。根據本發明的一個特點，施用血細胞比容水平為約40%至約70%、優選約45%至 約55%、更優選50%的約10至約250毫升紅細胞懸液。本發明的目的之一還在於本發明的組合物在製備治療性抗腫瘤疫苗中的用途。本發明的目的之一還在於本發明的組合物用於在宿主中誘導樹突細胞介導的並 針對腫瘤細胞或腫瘤的細胞毒性細胞應答的用途。本發明的的另一個目的是用作治療性抗腫瘤疫苗的本發明組合物。接下來，通過非限制性實施例方式的實施方案並且參考附圖來進一步詳細描述本 發明。

圖1 用抗TER 119抗體處理的「裝載抗原的」紅細胞在體外被脾臟樹突細胞吞噬 的測定。圖2 用抗TER 119抗體處理的或熱處理的「裝載抗原的」紅細胞在體內被脾臟巨 噬細胞和樹突細胞吞噬的測定。圖3 該圖說明在注射到小鼠體內後3天卵清蛋白特異性CD4T細胞的增殖和活 化。(A)細胞分裂導致CFSE螢光強度的降低。每次分裂時OVA-特異性CD4T細胞均失 去其一半的螢光物質。所觀察到的批次4的峰代表具有高CFSE含量的未分裂細胞。所有 其它的峰代表已經歷了 1、2、3、4、5、6或7次細胞分裂的細胞。當細胞分裂多於8次時，細 胞的CFSE含量幾乎為0。(B)⑶44細胞活化標誌物表達表示為所發生的分裂次數。實施例1.在小鼠和人紅細胞以及在豬紅細胞中裝入卵清蛋白的方法變型1 通過在透析管中進行低滲透析的方法將卵清蛋白(45kDa蛋白質，母雞卵清蛋白)包封到小鼠紅細胞(OFl小鼠或C57BI/6小鼠)中。在達到透析的70%血細胞比容之前將 紅細胞懸液洗滌幾遍。在熱處理之後發生透析時，在低摩爾滲透壓濃度的裂解緩衝液中於 透析管內透析約1小時或30分鐘。然後，通過高摩爾滲透壓濃度溶液將紅細胞再封30分 鍾。數次洗滌之後，在緩衝液Sag-甘露醇中接受最終產物，血細胞比容達到50%。實施例1的變型2 本文中，通過低滲透析的方法在透析柱中將卵清蛋白包封到小鼠紅細胞中。在達 到透析的70%血細胞比容之前將紅細胞懸液洗滌幾遍。在低摩爾滲透壓濃度的裂解緩衝液 中於透析柱內透析約10分鐘。一旦它們離開柱時，就通過高摩爾滲透壓濃度溶液在37°C下 將紅細胞再封30分鐘。數次洗滌之後，在包含葡萄糖SAG甘露醇的NaCl葡萄糖緩衝液中 或去除補體的血漿中接受最終產物，血細胞比容達到50%。 實施例2.對紅細胞的熱處理當根據實施例1的變型1實現包裝時，在透析過程之前進行熱處理。當根據實施 例1的變型2實現包裝時，在透析和再封過程之後、洗滌步驟和添加NaCl葡萄糖緩衝液之 前進行熱處理。在達到10%血細胞比容之前將紅細胞洗滌幾遍。然後，將它們在48°C下加熱30 分鐘。實施例3.對含有卵清蛋白的紅細胞進行抗體處理在達到IO9個細胞/ml (對於體內試驗)和IO8個細胞/ml (對於體外試驗)之前， 將包封了卵清蛋白的紅細胞懸液洗滌幾遍。與抗TER 119抗體(針對體外試驗為10 μ g/ ml，針對體內試驗為23 μ g/ml或5 μ g/ml) 一起在4°C下孵育30分鐘。數次洗滌之後，在具 有可注射品質的緩衝液中接受最終產物，血細胞比容達到50%。實施例4.用辛二酸雙(硫代琥珀醯亞胺基)酯(BS3)對含有卵清蛋白的紅細胞 進行化學處理在達到1.7X106個細胞/微升之前用PBS將包封卵清蛋白的紅細胞懸液清洗 數遍，將其與一倍體積的2mM BS3緩衝溶液(該BS3溶液含有葡萄糖和磷酸鹽緩衝液，pH 7. 4)混合，獲得ImM的BS3終濃度。在室溫下將細胞孵育30分鐘。加入一倍體積的20mM Tris-HCl淬滅反應。在室溫下孵育5分鐘之後，在4°C下以800g將混合物離心5分鐘。然 後，用含有葡萄糖的PBS將細胞洗兩遍(以800g離心)，用SAG-甘露醇洗一遍(以IOOOg 離心)10分鐘，然後得到終產物。實施例5.樹突細胞吞噬含卵清蛋白之紅細胞的體外測量在體外測定多種處理(加熱和抗體)對樹突細胞吞噬根據實施例1的變型1獲得 的紅細胞的效率的作用。用螢光標籤CFSE(羧基螢光素琥珀醯亞胺酯)在4°C下標記所述 紅細胞20分鐘。CFSE是一種透過細胞膜擴散的非螢光染料。一旦進入細胞內，該分子在被 細胞內的酯酶切割之後就變成具有螢光的。使用磁珠從C57BI/6小鼠的脾中分離樹突細胞。這些珠帶有識別⑶Ilc標誌物的 抗體，由此可分離⑶Ilc+樹突細胞級分。然後在37°C和5% CO2下將CFSE標記的或未標記的紅細胞與樹突細胞(10 X IO6 個細胞/毫升)以20 1的比例在終體積為200微升/孔的圓底96孔培養板中一起孵育 4小時，孵育4小時後，用NH4Cl裂解未被樹突細胞攝取的紅細胞，洗數遍。然後通過流式細胞儀測定樹突細胞對CFSE螢光團(flurochrome)的捕獲(R. Segura et al.，J. Immunol, January 2006,176(1) :441_50)。對三個紅細胞群體進行測試(A)裝載有卵清蛋白但未用CFSE螢光物標記的紅細胞，(B)裝載有卵清蛋白並且用CFSE螢光物標記的紅細胞，(C)裝載有卵清蛋白，用抗TER 119抗體處理並且用CFSE標記的紅細胞。結果表1 吞噬螢光紅細胞的樹突細胞的百分率 在體外共培養4小時後，相比於未處理的紅細胞，裝載卵清蛋白並且用抗TER 119 抗體處理的小鼠紅細胞更有效地被分離自脾臟的樹突細胞所吞噬(圖1，分別為C和B)。 36%的樹突細胞吞噬帶有抗體的紅細胞，而僅27%的樹突細胞吞噬不帶抗體的紅細胞。還 觀察到不表達⑶Ilc樹突細胞標誌物的群體吞噬抗體處理的紅細胞(10. 9% ；圖1，C)。實施例6.小鼠體內脾臟和肝臟的巨噬細胞和樹突細胞對含有卵清蛋白的紅細胞 之吞噬作用的測定該研究是異源性研究，因為是將含有卵清蛋白的OFl小鼠紅細胞注射到非同源的 C57BI/6小鼠中。製備三批74X 107個來自OFl小鼠的裝載卵清蛋白(實施例1變型1)的紅細胞， 進行熱處理、用抗TER 119抗體處理(分別如實施例2和3所述)或者不處理。按下述方 式劃分這些批次批次1 無熱處理或抗體處理(圖2，A和D)批次2 熱處理(圖2，B和E)批次3:用抗TER 119抗體處理(圖2，C和F)。每一批都用CFSE標記，並靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內。注射後三小時，取小鼠 的血液、脾臟和肝臟。通過流式細胞儀測定小鼠血液中循環的帶螢光紅細胞的百分比。通過 流式細胞儀測定納入表達F4/80標誌物的脾臟巨噬細胞(圖2，A、B、C)中、納入表達F4/80 標誌物的肝臟巨噬細胞中以及納入表達CDllc標誌物的脾臟樹突細胞(圖2，D、E、F)中的螢光。結果表2 在注射給小鼠後三個小時吞噬了螢光紅細胞的來自脾臟的巨噬細胞或樹突 細胞的百分比 注射後三個小時，裝載卵清蛋白並且被過熱處理或者抗TER 119抗體處理的小鼠 紅細胞幾乎不再存在於小鼠血液中(1.6%和)，而小鼠血液中仍有未處理的裝載卵清 蛋白的紅細胞(4.6% )。被熱處理或抗TER 119抗體處理的紅細胞被脾臟的F4/80巨噬細胞和⑶Ilc樹突 細胞吞噬(圖2)。相比於熱處理的紅細胞或者未處理的紅細胞，用抗TER 119抗體處理的紅細胞更 有效地被脾臟的F4/80巨噬細胞所吞噬(圖2，A、B、C)。81 %的脾臟巨噬細胞吞噬抗體處 理的紅細胞，而68%的巨噬細胞吞噬熱處理的紅細胞，而在未處理批次中僅有28% (表2)。相比於未處理的紅細胞，經過熱處理或抗體處理的紅細胞也更有效地被來自脾臟 的⑶Ilc樹突細胞所吞噬(圖2)。分別有22%和19%的樹突細胞吞噬抗體處理的紅細胞 和熱處理的紅細胞，而對於未處理的的紅細胞而言僅有5% (表2)。還觀察到不表達⑶Ilc樹突細胞標誌物或F4/80巨噬細胞標誌物的來自脾臟的群 體對抗體處理的紅細胞的吞噬(11. 9%和12. 8% ；圖2)。表3 在注射給小鼠後三個小時，肝臟巨噬細胞吞噬螢光紅細胞的百分比 被熱處理的紅細胞或用抗TER 119抗體處理的紅細胞被肝臟的F4/80巨噬細胞所吞噬。相比於被熱處理或未處理的紅細胞，被抗TER119抗體處理的紅細胞更有效地被 肝臟的F4/80巨噬細胞所吞噬。50%的肝臟巨噬細胞吞噬抗體處理的紅細胞，而40%的巨 噬細胞吞噬熱處理的紅細胞，而在未處理批次中僅有24% (表3)。結論是，抗體與紅細胞的結合以及熱處理使得有效靶向脾臟和肝臟中的紅細胞， 顯著增加能夠吞噬這些紅細胞的樹突細胞和巨噬細胞的百分比。實施例7.體內骨髓巨噬細胞和樹突細胞對含有螢光卵清蛋白的小鼠紅細胞的吞 噬作用的測定本研究是同源性研究，因為將OFl小鼠紅細胞注射給OFl小鼠。製備四批132X 107個使用實施例1變型2製得的裝載螢光卵清蛋白(SerlaboTechnologies, ref W0-LS003054)的OFl小鼠紅細胞，用抗TER119抗體處理、熱處理或者用BS3處理(分別如實施例3、2和4所述)或者未處理。將每個批次的紅細胞靜脈內注射 到兩隻小鼠體內。注射後一個半小時，處死小鼠，取小鼠的股骨。通過流式細胞儀測定納入 表達F4/80標誌物或者⑶lib標誌物的巨噬細胞、表達Grl標誌物的粒細胞、表達⑶Ilc和 CDllb標誌物的髓樣樹突細胞以及納入表達CDllc和CD8標誌物的漿細胞樣樹突細胞的熒 光。批次1 用BS3處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 熱處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 用抗TERl 19抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次4 裝載卵清蛋白的紅細胞批次5:NaCl葡萄糖結果表4 在注射後1小時30分，吞噬了螢光卵清蛋白的骨髓巨噬細胞、粒細胞或樹突 細胞的百分比 注射後一個半小時，用抗TER 119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞有效地被骨 髓F4/80巨噬細胞、粒細胞和樹突細胞所吞噬。骨髓的髓樣樹突細胞是最多地涉及吞噬用 抗TER 119抗體處理過的裝載卵清蛋白的紅細胞的細胞。結論是，使用被抗TER 119抗體處理的紅細胞能得到最佳靶向以及紅細胞被骨髓 中免疫細胞最佳的吞噬作用。實施例8.單次注射裝載卵清蛋白的紅細胞和聚(I:C)佐劑之後卵清蛋白特異性 CD4T細胞應答的測定對OVA(卵清蛋白)特異性CD4T細胞應答的評價由以下所組成測定OVA特異性 ⑶4T細胞的百分比，測定這些細胞的增殖、測定這些細胞的活化水平以及測定IFNg(g = Y)的產生。使用 Russo V.等人的 The Journal of Clinical Investigation, 2007,117 3087-3096 ；Stoitzner P.等人的 The Journal of Immunology 2008，180 :1991-1998 中所述方法的改進評價CD4T細胞應答。使用OT-II轉基因小鼠(Charles River, ref C57BL/6-Tg (TcraTcrb425Cbn/Crl))的 CD4 T 細胞測定 OVA-特異性 CD4T 細胞應答。OT-II小鼠是僅僅表達識別與主要組織相容性複合物II類分子相關聯的卵清蛋白肽323-339的 ⑶4T細胞的小鼠。從OT-II小鼠的脾臟分離OT-II轉基因⑶4T細胞，用CFSE標記，然後靜脈內注射 到Ly5. 1小鼠體內。OT-II小鼠和Ly5. 1小鼠具有相同的遺傳背景，但是兩種類型小鼠的細 胞都可通過⑶45標誌物來鑑定。這是因為OT-H小鼠細胞表達⑶45. 2標誌物，而Ly5. 1小 鼠表達⑶45. 1標誌物。注射轉基因小鼠⑶4T細胞後20小時，Ly5. 1小鼠接受下列批次的靜脈內注射。 用含有紅細胞的批次注射三隻小鼠，用含有游離OVA或對照的批次注射兩隻小鼠。製備兩 批183X IO7個使用實施例1的變型2製得的裝載卵清蛋白(Serlabo Technologies，參考 號TO-LS003054)的C57BI/6小鼠紅細胞，用抗TER 119抗體處理或者未處理(如實施例3 所述)。向這些批次以及含有游離卵清蛋白的批次添加佐劑即聚(I:C) (Invivogen，參考號 lrl-pic) 0每隻小鼠注射的聚(I:C)量為25微克。注射到小鼠體內的OVA量顯示於表5 中。 該研究是同源性研究，因為是將裝載卵清蛋白的C57BI/6小鼠紅細胞注射到 ly5. 1小鼠中。C57BI/6、Ly5. 1和0Τ-ΙΙ小鼠具有相同的遺傳背景。批次1 聚(I:C)和用抗TER 119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 聚(I:C)和裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 聚(I:C)和游離卵清蛋白批次4:血漿注射所述批次後三天，處死小鼠，取出小鼠的脾臟。通過流式細胞儀使用⑶4和 ⑶45. 2標誌物測量小鼠脾臟中OVA特異性⑶4T細胞的百分比(表5)。從OVA特異性⑶4T 細胞的百分比和使用臺盼藍(trypanblue) (Invitrogen，參考號15250061)計算的總淋巴 細胞數來計算OVA特異性CD4T細胞的數量(表5)。通過流式細胞儀使用⑶4、⑶44和⑶45. 2標誌物以及使用CFSE測定小鼠脾臟中 OVA特異性CD4T細胞的增殖和活化(表6和7)。每次細胞分裂時，將OVA特異性CD4T細 胞中所含的CFSE量除以因子2，其可通過流式細胞儀測定細胞分裂的次數(圖3)。在10 μ g/ml卵清蛋白肽323-339 (Neomps，ref)存在下體外刺激3天後通過ELISA 檢測在培養物上清中來測定小鼠脾細胞產生的IFNg。結果表5 注射所述批次後三天，OVA特異性⑶4 T細胞百分比和數量(平均值士標準 偏差) 注射所述批次後三天，相比於注射游離OVA和聚(I:C)的小鼠，注射聚(I:C)和用 抗TER 119抗體處理或未處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的小鼠具有顯著更高的OVA特異性 CD4T細胞的百分比和數量(Student檢驗，= 0. 01，** ρ = 0. 02)。此外，相比於含有未處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的批次，含有用抗TER 119抗 體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的批次在誘導OVA特異性CD4T細胞數量增加方面更為有 效(Student 檢驗，ρ = 0. 04)。
表6:注射所述批次後三天，分裂0、1、2、3、4、5、6或7次的^^特異性^4 T細胞
的百分比 體內細胞增殖結果證實了這些結果(表6和圖3)。細胞分裂誘導CFSE螢光強度 的降低每次分裂時螢光物質的一半消失(圖3Α)。相比於注射游離oVA和聚(I:C)的小鼠 (3至4次分裂)，注射聚(I:C)和用抗TER119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的小鼠的 OVA特異性⑶4 T細胞分裂得更快(6至7次分裂)(表6和圖3Α)。此外，相比於含有未處 理的裝載卵清蛋白的紅細胞的批次，含有用抗TER119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞 的批次在誘導細胞增殖方面似乎更為有效。表7 注射所述批次後三天，OVA特異性⑶4 T細胞的活化水平 細胞活化水平的結果(以⑶44標誌物的表達水平為特徵)顯示所有分裂的OVA 特異性CD4 T細胞都具有高的細胞活化水平(表7和圖3)。另外，OVA特異性CD4 T細胞 的活化水平可與這些細胞的分裂數相關細胞分裂和失去其CFSE標誌物含量越多，它們表 達的高水平活化標誌物就越多(圖3B)。表8 用10 μ g/ml卵清蛋白肽323-339體外刺激三天，脾細胞所產生的IFNg
脾細胞產生IFNg的結果顯示注射聚(I:C)和用抗TER 119抗體處理或未處理的 裝載卵清蛋白的紅細胞的小鼠的脾細胞產生大量IFNg。結論為，這些結果證明了用抗TER 119抗體處理或未處理的裝載卵清蛋白的紅細 胞對能夠產生IFNg的OVA特異性CD4T細胞得活化和增殖具有優越性。實施例9.單次注射裝載卵清蛋白的紅細胞和聚(I:C)佐劑之後卵清蛋白特異性 CD8T細胞應答的測定對OVA特異性⑶8T細胞應答的評價由下述步驟組成測定OVA特異性⑶8T細胞 的百分比、測定IFNg的產生以及呈遞與主要組織相容性複合物I類分子相關聯的卵清蛋白 肽257-264的細胞的體內細胞裂解。該研究是異源性研究，因為是將來自OFl小鼠的裝載 卵清蛋白的紅細胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。製備兩批167 X IO7個使用實施例1的變型2製得的裝載卵清蛋白的OFl小鼠紅 細胞，用抗TER119抗體處理或者未處理(如實施例3所述)。向這些批次以及含有游離卵 清蛋白的批次添加佐劑即聚(I:C)。每隻小鼠注射的聚(I:C)量為25微克。注射到小鼠體 內的OVA量顯示於表9中。將這些批次靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內。用給定批次注射最少4隻小鼠。使 用Hervas-Stubbs S.等人的Blood 2007，109 :5318_5326中所述方法的改進測定體內細胞 裂解。將呈遞與主要組織相容性複合物I類分子相關聯的卵清蛋白肽257-264的細胞注射 到被免疫小鼠體內。簡而言之，注射後六天，給小鼠注射0. 5 X IO6個呈遞卵清蛋白257-264 肽(Neomps，參考號SC1302)並用中等濃度CFSE標記的脾細胞，以及0. 5X IO6個不呈遞所 述肽並用高濃度CFSE標記的脾細胞(細胞裂解對照)。將與卵清蛋白肽257-264 (BOVAp)偶聯的乳膠珠以及聚(I:C)用作陽性對照，以誘 導針對乳清蛋白的CD8T免疫應答。其顯示，注射BOVAp和聚(I:C)在體內誘導了卵清蛋白特異性CD8T細胞百分比的增加以及對呈遞0VA257-264肽的細胞的破壞(Herva-Stubbs)。批次1 聚(I:C)和用抗TER 119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 聚(I:C)和裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 與卵清蛋白肽257-264偶聯的乳膠珠批次4 聚(I:C)和與卵清蛋白肽257-264偶聯的乳膠珠批次5 聚(I:C)和游離卵清蛋白批次6 =NaCl葡萄糖+血漿注射脾細胞後16小時，通過安樂死處死小鼠，取出小鼠的脾臟。通過流式細胞儀使用四聚物和CD8標誌物測量小鼠脾臟中OVA特異性CD8T細胞的百分比(表9)。在 0. 1 μ g/ml卵清蛋白肽257-264存在下體外刺激4小時後，通過流式細胞儀來測定⑶8T細 胞產生的IFNg以及與去顆粒作用相關的標誌物(CD107)的表達(表10)。通過流式細胞儀 使用CFSE測定體內細胞裂解(表11)。結果表9 注射所述批次後七天，OVA特異性⑶8T細胞百分比(平均值士標準偏差) 相比於注射游離OVA和聚(I:C)的小鼠或者注射聚(I:C)和BOVAp的小鼠，注射 聚(I:c)和用抗TER119抗體處理或未經處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的小鼠具有顯著更 高的 OVA 特異性 CD8T 細胞百分比(Student，s 檢驗，*p = 0. 001,**p = 0.01)。表10 用0. 1 μ g/ml卵清蛋白肽257-264體外刺激4小時，⑶8 T細胞產生的IFNg 所產生的CD8T細胞有效且具有細胞毒性，因為它們響應於卵清蛋白肽的刺激而 產生IFNg並且表達⑶107標誌物(表10)。相比於注射游離OVA和聚(I:C)的小鼠或者 注射聚(I:C)和BOVAp的小鼠，注射聚(I:C)和用抗TER119抗體處理或未經處理的裝載 卵清蛋白的紅細胞的小鼠具有顯著更高的產生IFNg且表達⑶107的⑶8 T細胞百分比 (Student，s 檢驗，ρ < 0. 008)。表11 體內抗OVA特異性細胞裂解的百分比(平均值士標準偏差) 細胞裂解的結果與去顆粒作用相關標誌物的表達相關聯(表10和11)。注射聚 (IC)和用抗TER 119抗體處理或未經處理的裝載卵清蛋白的紅細胞以比注射聚(I:C)和 游離卵清蛋白更有效的方式誘導顯示卵清蛋白肽257-264的細胞的裂解(表10)。結論是，這些結果證明了用抗TER119抗體處理或未經處理的裝載卵清蛋白的紅 細胞在能夠產生IFNg、脫顆粒和裂解顯示卵清蛋白肽257-264之細胞的細胞毒性CD8T細胞 的活化和增殖方面具有優越性。實施例10.在單次注射裝載卵清蛋白的紅細胞和佐劑聚(I:C)之後30天，卵清蛋 白特異性CD8T細胞應答之維持的測定對OVA特異性CD8T細胞應答維持的評價由下列組成在單次注射後34天，體內測 定OVA特異性CD8T細胞的百分比以及細胞裂解。該研究是異源性研究，因為是將裝載OFl小鼠卵清蛋白的紅細胞注射到非同源的C57BI/6小鼠中。
製備兩批150 X IO7個裝載卵清蛋白的OFl小鼠紅細胞，其根據實施例1的變型2 獲得，用抗TER119抗體處理或未經處理(如實施例3所述)。向這些批次以及含有游離卵 清蛋白或BOVAp的批次添加佐劑聚(I:C)。每隻小鼠注射的聚(I:C)量為25微克。注射到 小鼠體內的OVA量顯示於表12中。將這些批次靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內。用給定批次注射三隻小鼠。為了測 定體內細胞裂解，將顯示與主要組織相容性複合物I類分子相關聯的卵清蛋白肽257-264 的細胞注射到被免疫小鼠體內。注射後33天，給小鼠注射0.5X IO6個顯示卵清蛋白 257-264肽(NeoMPS，參考號SC1302)並用中等濃度CFSE標記的脾細胞，以及0. 5X IO6個 未顯示所述肽並用高濃度CFSE標記的脾細胞(細胞裂解試驗)。批次1 聚(I:C)和用抗TERl 19抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 聚(I:C)和裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 與卵清蛋白肽257-264偶聯的乳膠珠=BOVAp批次4 聚(I C)和 BOVAp批次5 聚(I:C)和游離卵清蛋白批次6 =NaCl葡萄糖+血漿注射所述脾細胞後16小時，對小鼠實施安樂死，取出其脾臟。通過流式細胞儀使 用四聚物和⑶8標誌物測量小鼠脾臟中OVA特異性⑶8T細胞的百分比(表12)。通過流式 細胞儀使用CFSE測定體內細胞裂解(表13)。表12 注射所述批次後34天，OVA特異性⑶8 T細胞的百分比(平均值士標準偏 差) 注射後34天，每個組中OVA特異性⑶8 T細胞的百分比相當(表12)。考慮到峰值 ⑶8T細胞增殖在約第7天且隨後是減小階段，所以該結果並非出人意料的(Hervas-Stubbs S et al，Blood，2007，109 :5318-5326)。表13 體內抗OVA特異性細胞裂解的百分比(平均值士標準偏差)
注射後34天，OVA特異性⑶8T細胞仍然能夠裂解顯示卵清蛋白肽257-264的細 胞(表13)。注射聚(I:C)和用抗TER119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞以比注射聚 (IC)和BOVAp更有效的方式誘導細胞裂解(* Student' s檢驗，ρ < 0. 04)。結論為，這些結果證明裝載卵清蛋白的紅細胞不僅在細胞毒性CD8T細胞的活化 和增殖方面具有優越性，而且在這些能夠裂解顯示卵清蛋白肽257-264的細胞的T細胞的 維持/存活方面也有優越性。實施例11.單次注射化學處理的裝載卵清蛋白的紅細胞和聚(I:C)佐劑之後卵清 蛋白特異性CD8T細胞應答的測定該研究是外源性研究，因為是將來自OFl小鼠的裝載卵清蛋白的紅細胞注射到非 同源的C57BI/6小鼠中。製備一批132 X IO7個用ImM BS3化學處理的(如實施例4所述)使用實施例1的 變型2製備的裝載卵清蛋白的OFl小鼠紅細胞。向該批次以及含有游離卵清蛋白的批次中 添加佐劑聚(I:C)。每隻小鼠注射的聚(I:C)量為25微克。注射到小鼠體內的OVA量顯示 於表14中。批次1 聚(I:C)和用ImM BS3處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 聚(I:C)和游離卵清蛋白批次3:聚(I:C)批次4 含葡萄糖的NaCl將這些批次靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內。用給定批次注射最少3隻小鼠。注 射後七天，處死小鼠，取小鼠脾臟。通過流式細胞儀使用四聚物和⑶8標誌物測量小鼠脾臟 中OVA特異性⑶8T細胞的百分比(表14)。結果表14 注射所述批次後七天的OVA特異性⑶8 T細胞的百分比和數量(平均值士 標準偏差) 與注射游離OVA和聚(I:C)的小鼠或者注射聚(I:C)的小鼠相比，注射聚(I:C)和 用BS3處理的裝載卵清蛋白的紅細胞的小鼠具有更高百分比的OVA特異性CD8T細胞。這 些結果不具有統計學上的差異，但是應當指出的是，注射的游離OVA的量比在含裝載OVA的 紅細胞批次中注射的OVA量大三倍多。結論為，這些結果顯示用BS3處理的裝載卵清蛋白的紅細胞也能夠產生OVA特異 性⑶8T細胞。實施例12.單次注射裝載卵清蛋白的紅細胞和CL-097佐劑之後卵清蛋白特異性 CD8T細胞應答的測定該研究是異源性研究，因為是將來自OFl小鼠的裝載卵清蛋白的紅細胞注射到非 同源的C57BI/6小鼠中。製備以下批次119 X IO7個用抗TER 119抗體處理的或者未處理的(如實施例3 所述)使用實施例1變型1製備的裝載卵清蛋白的OFl小鼠紅細胞。向這些批次中添加或 不添加佐劑CL097(InViVogen，參考號tlrl_c97)。每隻小鼠注射的CL097量為0. 15微克。 注射到小鼠體內的OVA量顯示於表15中。批次1 :CL097和用抗TER 119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 用抗TER 119抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 :CL097和裝載卵清蛋白的紅細胞批次4 裝載卵清蛋白的紅細胞批次5 含葡萄糖的NaCl將這些批次靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內。注射後四天，處死小鼠，取小鼠脾 髒。在0. 1 μ g/ml卵清蛋白肽257-264存在下體外刺激三天後，通過ELISA檢測在培養物 上清中測定注射多個批次的小鼠脾細胞產生的IFNg。結果表15 用0. 1 μ g/ml卵清蛋白肽257-264體外刺激3天，脾細胞產生的IFNg脾細胞產生IFNg的結果顯示，當給小鼠注射CL097佐劑和用抗TER 119抗體處理 或未處理的裝載卵清蛋白的紅細胞時產生更多的IFNg。結論為，CL097佐劑也增強了注射裝載卵清蛋白的紅細胞所誘導的IFNg應答。實施例13.在小鼠中單次注射佐劑聚(I:C)和處理或未處理的裝載卵清蛋白的紅 細胞之後腫瘤生長的測定該研究的目的是測定注射單劑量聚(I:C)和處理或未處理的裝載卵清 蛋白紅細胞之後C57BI/6小鼠中EG.7細胞系的腫瘤生長。EG. 7腫瘤細胞獲得自 ATCC(ATCC-CRL-2113)。EG. 7細胞來源於EL. 4細胞系，其組成型地合成並分泌OVA。該研究是異源性研究，因為是將來自OFl小鼠的裝載卵清蛋白的紅細胞注射到 C57BI/6小鼠中。該實驗中的模型是預防性模型。根據實施例1的變型2製備兩批次來自OFl小鼠的165 X IO7個抗體處理的或未處 理的裝載卵清蛋白的紅細胞。將佐劑聚(I:c)添加到這些批次中。每隻小鼠注射25微克 的聚(I:C)。陰性對照是未裝載的紅細胞懸液。注射到小鼠體內的OVA量顯示於表16中。批次1 聚(I:C))和用抗體處理的裝載卵清蛋白的紅細胞批次2 聚(I:C)和裝載卵清蛋白的紅細胞批次3 非裝載的紅細胞將所述批次靜脈內注射到C57BI/6小鼠體內(每組10隻小鼠)。注射批次後七 天，皮下注射2.2X106個EG.7細胞/小鼠。對小鼠腫瘤生長進行隨訪。通過以釐米計測 量腫瘤直徑來評估腫瘤生長(記錄為兩垂直直徑測量的平均值)。在14天中以兩天的間隔 每周測量3次腫瘤大小。處死腫瘤直徑超過2. O釐米的小鼠。表16 每隻小鼠注射的OVA量 表17:腫瘤生長 注射EG. 7後7天，可在之前注射未裝載的紅細胞之小鼠的側腹測量腫瘤大小，腫 瘤繼續生長直至研究結束。而在注射聚(I:C)和用抗TER119抗體處理或不處理的裝載卵 清蛋白的紅細胞的小鼠側腹觀察不到腫瘤。對小鼠的觀察仍在進行中。結論為，這些結果證明用抗TER119抗體處理或未處理的裝載卵清蛋白的紅細胞 有效地阻止了表達OVA的腫瘤細胞的生長。實施例14.體內巨噬細胞和樹突細胞對豬紅細胞的吞噬作用的測定本研究是異種性研究，因為是將豬紅細胞注射到C57BI/6小鼠體內。在含有葡萄糖的NaCl中將豬紅細胞清洗三次，然後如上所述用CFSE標記。在含 有葡萄糖的NaCl中將紅細胞再清洗三次，然後使其恢復到50%血細胞比容。將142X107 個豬紅細胞的批次靜脈內注射到三隻C57BI/6小鼠中。注射後一個小時，處死小鼠，取小鼠 的脾臟、肝臟和股骨。通過流式細胞儀測定納入表達F4/80標誌物或者CDllb標誌物的巨 噬細胞、納入表達⑶Ilc和⑶lib標誌物的髓樣樹突細胞、以及納入表達⑶Ilc和⑶8標誌 物的漿細胞樣樹突細胞的螢光。批次1 豬紅細胞批次2 含葡萄糖的NaCl結果表18 注射後1小時具有被吞噬的螢光紅細胞的脾臟巨噬細胞或樹突細胞的百分 比 表19 注射後1小時具有被吞噬的螢光紅細胞的骨髓巨噬細胞或樹突細胞的百分比 表20 注射後1小時具有被吞噬的螢光紅細胞的肝臟巨噬細胞或樹突細胞的百分 比 注射後一個小時，豬紅細胞被脾臟的F4/80巨噬細胞和樹突細胞有效吞噬(表 18)。脾臟的漿細胞樣樹突細胞是最多地涉及豬紅細胞噬菌作用的細胞。在骨髓和肝臟中， 巨噬細胞和樹突細胞不吞噬螢光紅細胞(表19和20)。結論是，使用豬紅細胞使得紅細胞能夠被涉及產生免疫應答的脾臟細胞靶向和吞 噬(Lou Y.，2007，J of Immunol,178 1534-1541)。實施例15.包含卵清蛋白的豬紅細胞的特徵。製備兩批豬紅細胞，其裝載有卵清蛋白(根據實施例1的變型2獲得)或者未裝載。批次1 裝載OVA的豬紅細胞批次2 未裝載OVA的豬紅細胞。在製備結束時以及製備後18小時表徵來自起始材料的批次。使用ABX細胞計數器 測定平均球狀體積、平均血球血紅蛋白和紅細胞濃度。使用Osmocells設備(SD Medical) 測定對應於引起50%紅細胞溶血的NaCl濃度的滲透脆性。通過分光光度法測定細胞外血 紅蛋白。使用ELISA試驗測定卵清蛋白的血球濃度、卵清蛋白的細胞外濃度以及卵清蛋白 平均球狀的量。表21 包含卵清蛋白的豬紅細胞的表徵 正如所料，透析過程造成球狀體積和血球血紅蛋白減少。此外，所述批次的滲透脆 性比初始血液中紅細胞的低(表21)。在包含卵清蛋白的批次(批次1)和不包含卵清蛋白 的批次(批次2)之間未觀察到顯著性差異。對於批次1，細胞外卵清蛋白的量比裝載的卵清蛋白的量相對低，在製備後18小 時未增加，從而證明了裝載卵清蛋白的紅細胞的穩定性。因此，可以將卵清蛋白包封到豬紅細胞內。
權利要求
一種組合物，其在宿主中誘導針對腫瘤細胞的細胞毒性細胞應答，並且包含含有腫瘤抗原的紅細胞。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述紅細胞(1)含有抗原以及(2)與免疫球蛋白形 成免疫複合物，所述免疫球蛋白識別紅細胞表面上的表位，由此促進所述紅細胞被樹突細 胞吞噬。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述紅細胞與抗Rh或抗血型糖蛋白A或抗CRl抗體 形成免疫複合物。
4.根據權利要求2或3的組合物，其中所述免疫球蛋白是IgG。
5.根據權利要求1的組合物，其中紅細胞(1)含有抗原以及(2)被熱處理或化學處理， 由此促進所述紅細胞被樹突細胞吞噬。
6.根據權利要求2的組合物，其中所述免疫複合物形式的紅細胞被熱處理或化學處理。
7.根據權利要求1、2、5或6中任一項的組合物，其中所述紅細胞是異種紅細胞。
8.根據權利要求1至7中任一項的組合物，其還包含激活樹突細胞成熟的佐劑。
9.根據權利要求8的組合物，其中所述佐劑存在於所述紅細胞內、所述紅細胞表面和/ 或所述紅細胞外。
10.根據權利要求9的組合物，其中所述佐劑是TLR(Toll樣受體)配體或細胞因子。
11.根據權利要求10的組合物，其中所述TLR配體選自屬於下組中的咪唑並喹啉類 咪唑喹啉、咪喹莫特、雷西莫特、CpG寡聚脫氧核苷酸、LPS(脂多糖)或者聚(肌苷酸)_聚 (胞苷酸)。
12.根據權利要求10的組合物，其中所述細胞因子選自幹擾素α、IL_2(白細胞介素 2)、IFN γ (幹擾素γ ) ,GM-CSF (粒細胞單核細胞-集落刺激因子)、IL-12 (白細胞介素12) 或TNF α (腫瘤壞死因子α)。
13.根據權利要求1至12中任一項的組合物，其包含待治療腫瘤的至少兩種代表性腫 瘤抗原。
14.根據權利要求1至13中任一項的組合物，其中所述腫瘤抗原選自以下抗原 α -輔肌動蛋白-4 ；ARTCl ；BCR-ABL 融合蛋白(b3a2) ；B-RAF ；CASP-5 ；CASP-8 ； β -聯蛋 白；Cdc27 ；CDK4 ；CDKN2A ；COA-I ；dek-can 融合蛋白；EFTUD2 ；延伸因子 2 ；ETV6-AML1 融 合蛋白；Fm ；GPNMB ；LDLR-巖藻糖基轉移酶 AS 融合蛋白；HLA_A2d ；HLA-AlId ；hsp70_2 ； KIAA0205 ；MART2 ；MEl ；MUM-If ；MUM-2 ；MUM-3 ；neo-PAP ；肌球蛋白 I 類；NFYC ；OGT ；0S-9 ； pml-RARa 融合蛋白；PRDX5 ；PTPRK ；K-ras ；N-ras ；RBAF600 ；SIRT2 ；SNRPDl ；SYT-SSXl 或 SYT—SSX2 融合蛋白；磷酸丙糖異構酶；BAGE-I ；GAGE-I，2，8 ；GAGE-3，4，5,6, 7 ；GnTVf ； HERV-K-MEL ；KK-LC-I ；KM-HN-I ；LAGE-I ；MAGE-Al ；MAGE-A2 ；MAGE-A3 ；MAGE-A4 ；MAGE-A6 ； MAGE-A9 ；MAGE-AlO ；MAGE-A12 ；MAGE-C2 ；粘蛋白 k ；NA-88 ；NY-ESO-1/LAGE-2 ；SAGE ； Spl7 ；SSX-2 ；SSX-4 ；TRAG-3 ；TRP2-INT2g ；CEA ；gpl00/Pmell7 ；激肽釋放酶 4 ；乳腺珠蛋 白-A ；Melan-A/MART-Ι ；NY-BR-I ；OAl ；PSA ；RAB38/NY-MEL-1 ；TRP_l/gp75 ；TRP-2 ；酪氨酸 酶；親脂素；AIM-2 ；BING-4 ；CPSF ；細胞周期素 Dl ；Ep-CAM ；EphA3 ；FGF5 ；G250/MN/CAIX ； HER-2/neu ；IL13Ra 2 ；腸羧基酯酶；甲胎蛋白；M-CSF ；mdm-2 ；MMP-2 ； MUCl ；p53 ； PBF ； PRAME ；PSMA ；RAGE-I ；RNF43 ；RU2AS ；分離蛋白 1 ；S0X10 ；STEAPl ；存活蛋白；端粒酶；WTl ；FLT3-ITD ；BCLX(L) ；DKK1 ；ENAH(hMena) ；MCSP ；RGS5 ；胃泌素-17 ；人絨毛膜促性腺激素， EGFRvIII, HER2, HER2/neu, P501，鳥苷酸環化酶 C 以及 PAP。
15.治療性抗腫瘤疫苗，其包含有效量的根據權利要求1至14中任一項的組合物。
16.根據權利要求1至14中任一項的組合物在製備治療性抗腫瘤疫苗中的用途。
17.用作治療性抗腫瘤疫苗的根據權利要求1至14中任一項的組合物。
18.在患者中誘導針對腫瘤細胞或腫瘤的細胞毒性細胞應答的方法，其包括向該患者 施用有效量的根據權利要求1至14中任一項的組合物。
19.在患者中誘導針對腫瘤細胞或腫瘤的細胞毒性細胞免疫應答的抗癌症治療方法， 其包括向該患者施用有效量的根據權利要求15的抗腫瘤疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種組合物，其在宿主中誘導針對表達抗原之細胞特別是腫瘤細胞的細胞毒性細胞應答，並且包含含有所述抗原的紅細胞。這些紅細胞可以與免疫球蛋白特別是IgG形成免疫複合物，所述免疫球蛋白識別紅細胞表面上的表位，和/或這些紅細胞可以經過熱處理或化學處理以促進所述紅細胞被樹突細胞吞噬。作為一種變化形式，所述紅細胞可以是異種紅細胞。本發明還涉及含有該組合物的治療劑，特別是抗腫瘤疫苗。
文檔編號A61K35/18GK101873862SQ200880110270
公開日2010年10月27日 申請日期2008年8月8日 優先權日2007年8月8日
發明者揚·戈德弗蘭, 愛麗絲·馬尚德 申請人:愛瑞泰克藥物公司