一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法
2023-12-10 04:06:51
專利名稱:一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲生物工程領域，更具體的說，涉及一種家蠶二化性品種的卵轉基因方法。
背景技術：
家蠶，也稱桑蠶，學名Bombyx mori Linnaeus，卵生，是鱗翅目模式昆蟲，家蠶有一個重要的生理現象是化性，所謂化性，就是指一年中發生的世代數。家蠶有一化性、二化性、 多化無滯育性、多化有滯育性等品種差別。一化性蠶品種，一年內發生一個世代，幼蟲生長期長，所結蠶繭大，但體質較弱；多化性蠶品種，一年內發生3代以上，幼蟲生長期短，所結蠶繭小，繭絲質性狀差，但體質較強；二化性品種一年內在自然環境中發生2代，其幼蟲生長期、結繭大小介於一化與多化蠶品種之間，體質與繭絲質性狀也很適合蠶業生產所需的平衡要求。因此，蠶業生產普遍使用二化滯育性卵作為種子，並形成了生產性狀優良、品種豐富的二化性實用品種群體。利用二化性蠶品種作為轉基因受體材料，不僅材料豐富，而且能夠克服多化或一化品種生產性狀上的缺點。
目前，家蠶卵期轉基因顯微注射方法，只有在胚胎發育早期，即產卵後25°C保護溫度中注射，轉基因的成功率才比較高，但是，如果二化滯育性蠶卵在胚胎發育早期轉基因顯微注射，由於還需要隨後進行鹽酸刺激等人工孵化處理蠶卵才可以催青孵化，鹽酸等活化刺激物質會通過注射孔進入蠶卵，同時也由於轉基因注射後蠶卵非常虛弱，經不起強烈的活化刺激，導致死亡，無法實現轉基因注射操作；如果在注射後不進行鹽酸等即時孵化活化刺激，通過低溫等溫和活化方法，由於所需時間漫長，蠶卵在保護過程也會虛弱或失水、變質死亡，同樣無法實現轉基因注射操作。
因此，建立一種蠶種處理方法，在轉基因操作前，高效解決家蠶二化性品種滯育性卵的活化問題，使家蠶二化性實用品種卵在顯微注射後不需要鹽酸刺激就可以直接孵化， 將對轉基因實用家蠶品種的創建發揮重要的作用。
目前已有的技術雖然一定程度解決了上述問題，但存在各自的缺陷，例如
(1)公開號為101195834(申請號200710303904. 1)的中國發明專利公布說明書公開了一種家蠶滯育種的早期浸酸轉基因方法，在滯育性蠶卵產下後2. 25h-2. 5h，使用 46°C、比重1.075的鹽酸，浸漬90s 210s來活化蠶卵。該技術轉基因操作後蠶卵孵化率只有5%左右，轉化效率不到處理卵的1%，而且孵化效果品種間差異非常大，有的品種幾乎不孵化。
(2)公開號為101195833(申請號:200710303903. 7)的中國發明專利公布說明書公開了一種家蠶滯育種的低溫轉基因方法，在親代卵孵化期使用15°C、相對溼度75%的環境保護，促使產出的子代蠶卵成為非滯育性卵。該技術對滯育性的影響不穩定，部分品種轉基因操作後蠶卵孵化率能夠達到50%左右，但孵化效果在品種間相差非常大，大部分日系二化性品種孵化率非常低，並且由於催青過程長達35d-40d，孵化的蟻蠶體質虛弱。
(3)公開號為101503704(申請號200910103397.6)的中國發明專利公布說明書公開了一種家蠶滯育種的轉基因蠶的製作方法，在親代卵孵化期使用15°C、相對溼度 75%、黑暗的環境保護；孵化後1-3齡幼蟲使用23°C、相對溼度85%、黑暗的環境飼育，以及蛹期的絕對光照條件保護，促使產出的子代蠶卵成為非滯育性卵。該技術同樣存在催青過程長、孵化蟻蠶體質虛弱的問題，而且在黑暗中進行飼育操作有一定困難，該技術保護下的成蟲羽化無規律，給轉基因操作增加了困難。
因此，發明更加簡便有效的家蠶二化性實用品種轉基因蠶卵孵化控制方法，對提高轉基因效率，建立穩定高效的家蠶轉基因技術體系，實現家蠶轉基因成果的產業化有重要的現實意義，因此需要發明一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法。
發明內容
本發明目的是提供一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法。
為達到上述目的，本發明採用的技術方案是一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法，具體包括以下步驟
(1)家蠶二化性品種的親代卵，整個催青孵化過程使用20°C、相對溼度 75%-85%、光照強度低於0. 1勒克斯(Iux)的黑暗條件保護；孵化後幼蟲使用20°C-22°C、 相對溼度80% -90%,自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至3齡起蠶；3齡起蠶開始，使用25V -26°C,75% -80%相對溼度、自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至結繭；然後在 240C -260C>70% -80%相對溼度、LD = 18h:6h(每日18h光照6h黑暗)長光制條件中保護至羽化，獲得產弱滯育性蠶卵的母蛾；
其中，LD表示Light/Dark，LD = 18h:6h表示每日18h連續光照後接6h持續黑暗；
(2)收集步驟(1)中羽化後的母蛾，23°C 46°C、光照強度低於IOlux弱光線條件與雄蛾交配池-他後，分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，25°C 46°C、光照強度低於0. Ilux的黑暗環境產卵；收集10min-15min內所產的弱滯育性卵作為人工孵化處理群體，在產卵後25°C 環境溫度中0. 5h-l. 5h完成鹽酸人工孵化處理；
(3)收集步驟O)中人工孵化處理群體蠶卵，經鹽酸活化處理，同時將蠶卵從產卵紙脫落，獲得活性化的蠶卵。
上述技術方案中，步驟(1)中所述產弱滯育性蠶卵的母蛾還可通過以下方法獲得
家蠶二化性品種的親代卵，催青前期使用22°C -2575% -85%相對溼度、自然光制條件中保護至胚胎發育階段19期，也即戊2期胚胎；然後改用20°C、相對溼度 75% -85%、光照強度低於0. Ilux的黑暗條件保護；孵化後幼蟲使用20°C _22°C、相對溼度80% -90%,自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至3齡起蠶；3齡起蠶開始，使用 25 0C -26 75% -80%相對溼度、自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至結繭；然後在 24 0C -26 70% -80%相對溼度、LD = IShJh長光制條件中保護至羽化，獲得產弱滯育性蠶卵的母蛾。
上述技術方案中，步驟O)中雄蛾選自通用方法獲得的普通同品種雄蛾或步驟 (1)方法與母蛾同時羽化的雄蛾。
上述技術方案中，步驟(3)中所述鹽酸活化處理的條件選自以下兩種的一種[0020]a、W/V為15%的鹽酸，加熱至40°C，浸漬蠶卵5min_8min ；
b、W/V為14%的鹽酸，加熱至45°C，浸漬蠶卵5min_8min。
將上述技術方案獲得的改變滯育性的家蠶二化性品種的蠶卵進行常規顯微注射並進行篩選，獲得轉基因蠶卵。
上述技術方案中，所述常規顯微注射並進行篩選步驟包括以下具體步驟
(1)鹽酸人工孵化處理的蠶卵，經水洗後，收集蠶卵在無菌和無核酸汙染的環境進行整理，然後每卵顯微注射入4000ng-5000ng的重組質粒；
(2)注射後蠶卵用無毒材料封塗注射孔，然後在無菌環境，用25°C -26 75% -80%相對溼度、自然光制條件保護蠶卵至孵化；
(3)孵化後幼蟲用桑葉或人工飼料在-2775% -80%相對溼度、自然光制條件飼養，蠶蛹在-26°C,75% -80%相對溼度、自然光制條件保護至成蟲羽化；
(4)羽化後蠶蛾自交或回交後，所產卵經過人工孵化處理，然後在22°C -26 75% -80%相對溼度、LD = 18h:6h長光制條件催青；在胚胎發育至22-25期，即己2-己3 階段，篩選出有螢光標記的蠶卵，作為轉基因Gl代個體。
本發明能夠解決二化性蠶品種滯育性卵轉基因注射後人工孵化處理對蠶卵的傷害所導致的不能孵化的問題；能夠解決二化性蠶品種滯育性卵早期鹽酸孵化處理後轉基因注射孵化率很低的問題；能夠有效克服使用多化性非滯育卵轉基因材料的繭絲量低和繭絲品質差的缺點，能夠提供適合二化性高產優質實用蠶品種的高效卵轉基因方法。
由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1.由於本發明利用家蠶二化性品種親代卵催青孵化時期的保護溫度與光制組合， 以及對子代受精前蠶卵的人工孵化處理，獲得適用於蠶卵轉基因注射的早期高效人工活化卵，使家蠶二化性實用品種的蠶卵在進行顯微注射後不再需要經過活化刺激就可以直接高效孵化。
2.該方法適合目前所有的家蠶二化性實用品種卵的轉基因操作，轉基因蠶卵注射後的催青孵化過程較短、孵化率高，孵化後蟻蠶體質強健。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述
實施例一
使用家蠶二化性品種大造的春制滯育性卵作為親代蠶卵，催青前期使用22. 5°C、 75% -85%相對溼度、自然光制條件中保護至19期胚胎發育階段；然後改用20°C、相對溼度75% -85%、光照強度低於0. Ilux的黑暗條件催青保護至蠶卵孵化；孵化後幼蟲在20°C -22°C、相對溼度80% -90%,自然光制條件中，使用桑葉飼養；3齡起蠶開始，在 251-261^75^-80%相對溼度、自然光制條件，使用桑葉飼養至結繭；然後在_26°C、 75% -80%相對溼度、LD = 18h:6h長光制條件中保護至羽化；收集羽化後的母蛾，24. 5°C、 IOlux以下弱光線條件與雄蛾交配證，雄蛾使用同批獲得的大造品種雄蛾；分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，25°C、0. Ilux以下的黑暗環境產卵；收集15min內所產卵作為人工孵化處理群體；使用W/V為15%的化學純鹽酸，加熱至40°C，在卵齡Ih時浸漬蠶卵5. 5min，促使蠶卵活化，同時將蠶卵從產卵紙脫落；鹽酸人工孵化處理後的蠶卵，經水洗後，收集蠶卵在無菌和無核酸汙染的環境進行整理，然後在卵齡ai-6h，每卵顯微注射入4000ng-5000ng的紅色螢光蛋白基因(ERFP)標記的piggyBac載體與輔助質粒(W/ W=I 1)，共注射蠶卵350粒；注射後蠶卵用無毒膠水封塗注射孔，然後在無菌環境，用 250C -25. 5°C,80% -85%相對溼度、自然光制條件保護蠶卵至孵化，共孵化205頭，孵化率 58. 6% ；孵化後幼蟲用桑葉在-2775% -80%相對溼度、自然光制條件飼養，蠶蛹在 24V -26°C,75% -80%相對溼度、自然光制條件保護至成蟲羽化；羽化後蠶蛾自交後，所產 98蛾Gl代蠶卵經過人工孵化處理，然後在25°C、75% -80%相對溼度、LD = 18h:Mi長光制條件催青；在胚胎發育至22-25期，即己2-己3階段，篩選出有螢光標記的蠶卵，作為轉基因Gl代個體，轉化率為31.5%。
實施例二
使用家蠶二化性品種皓月的春制滯育蠶卵作為親代蠶卵，整個催青孵化過程使用 20°C、相對溼度75% -85%、光照強度低於0. Ilux的黑暗條件；孵化後幼蟲在20°C _21°C、 相對溼度85% -90%、自然光制條件中使用桑葉飼養；3齡起蠶開始，在25. 5°C -26°C, 75% -80%相對溼度、自然光制條件中桑葉飼養至結繭；然後在25V -2675% -80%相對溼度、LD = IShih長光制條件中保護至羽化；收集羽化後的母蛾，25°C -26°C UOlux以下弱光線條件與雄蛾交配4h，雄蛾使用普通的皓月雄蛾；分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，25°C、0. Ilux以下黑暗環境中產卵；收集IOmin內所產卵作為人工孵化處理群體；使用W/V為15%的化學純鹽酸，加熱至40°C，在卵齡1. 25h時浸漬蠶卵6. 5min，促使蠶卵活化，同時將蠶卵從產卵紙脫落；鹽酸人工孵化處理的蠶卵，經水洗後，收集蠶卵在無菌和無核酸汙染的環境進行整理，然後在卵齡》ι-6.釙，每卵顯微注射入4000ng-5000ng的紅色螢光蛋白基因(ERFP)標記的piggyBac載體與輔助質粒(W/W = 1 1)，共注射蠶卵四0 粒；注射後蠶卵用無毒膠水封塗注射孔，然後在無菌環境，用25°C -25. 5°C,80% -85%相對溼度、自然光制條件保護蠶卵至孵化，共孵化207頭，孵化率71. 4% ；孵化後幼蟲用人工飼料在-27°C>85% -90%相對溼度、自然光制條件飼養，蠶蛹在-26°C>75% -80% 相對溼度、自然光制條件保護至成蟲羽化；羽化後蠶蛾自交後，所產卵89蛾Gl代蠶卵經過人工孵化處理，然後在22°C -2675% -80%相對溼度、LD = 18h:6h長光制條件催青；在胚胎發育至22-25期，即己2-己3階段，篩選出有螢光標記的蠶卵，作為轉基因Gl代個體， 轉化率為27.8%。
實施例三
使用家蠶二化性品種75新的春制滯育性卵作為親代蠶卵，催青前期使用 24. 5°C -25°C,75% -80%相對溼度、自然光制條件中保護至胚胎發育階段19期；然後改用 20°C、相對溼度80% -85%、光照強度低於0. Ilux的黑暗條件保護至孵化；孵化後幼蟲在 21°C _22°C、相對溼度80%、自然光制條件中，使用桑葉飼養；3齡起蠶開始，在25°C -26°C, 75% -80%相對溼度、自然光制條件，使用桑葉飼養至結繭；然後在25°C -2675% -80% 相對溼度、LD = 18: 長光制條件中保護至羽化；收集羽化後的母蛾，25°C j6°C、101ux弱光線條件與雄蛾交配證，雄蛾使用普通的75新雄蛾；分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，25°C、0. Ilux以下的黑暗環境產卵；收集15min內所產卵作為人工孵化處理群體； 在卵齡1. 25h，使用45°C、W/V為14%的化學純鹽酸，浸漬蠶卵5. Omin，促使蠶卵活化，同時將蠶卵從產卵紙脫落；鹽酸人工孵化處理的蠶卵，經水洗後，收集蠶卵在無菌和無核酸汙染的環境進行整理，在卵齡2. Oh-5.證期間，每卵顯微注射入4000ng-5000ng的紅色螢光蛋白基因(ERFP)標記的piggyBac載體與輔助質粒(W/W = 1 1)，共注射蠶卵300粒；注射後蠶卵用無毒膠水封塗注射孔，然後在無菌環境，用25°C -25. 5°C,80% -85%相對溼度、自然光制條件保護蠶卵至孵化，共孵化212頭，孵化率70. 7% ；孵化後幼蟲用桑葉在25°C -27°C、 75% -80%相對溼度、自然光制條件飼養，蠶蛹在25V -2675% -80%相對溼度、自然光制條件保護至成蟲羽化；羽化後蠶蛾自交後，所產99蛾Gl代蠶卵經過人工孵化處理，然後在-25°C>75% -80%相對溼度、LD = 18h:6h長光制條件催青；在胚胎發育至22-25 期，即己2-己3階段，篩選出有螢光標記的蠶卵，作為轉基因Gl代個體，轉化率為30. 5%。
權利要求
1.一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法，其特徵在於，具體包括以下步驟(1)家蠶二化性品種的親代卵，整個催青孵化過程使用20°c、相對溼度75%-85%, 光照強度低於0. 1勒克斯的黑暗條件保護；孵化後幼蟲使用20°C -22 °C、相對溼度 80% -90%,自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至3齡起蠶；3齡起蠶開始，使用 25 V -26 75% -80%相對溼度、自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至結繭；然後在46°C、70%-80%相對溼度、L D = 18h Mi的長光制條件中保護至羽化，獲得產弱滯育性蠶卵的母蛾；(2)收集步驟(1)中羽化後的母蛾，23n6°C、光照強度低於10勒克斯弱光線條件與雄蛾交配池-他後，分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，250C 、光照強度低於 0. 1勒克斯的黑暗環境產卵；收集10min-15min內所產的弱滯育性卵作為人工孵化處理群體，在產卵後25°C 環境溫度中0. 5h-l. 5h完成鹽酸人工孵化處理；(3)收集步驟O)中人工孵化處理群體蠶卵，經鹽酸活化處理，同時將蠶卵從產卵紙脫落，獲得活性化蠶卵。
2.一種家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法，其特徵在於，具體包括以下步驟(1)家蠶二化性品種的親代卵，催青前期使用22°C-25°C,75% -85%相對溼度、自然光制條件保護至胚胎發育階段19期；然後改用20°C、相對溼度75% -85%、光照強度低於 0. 1勒克斯的黑暗條件保護；孵化後幼蟲使用20°c -22°c、相對溼度80% -90%,自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至3齡起蠶；3齡起蠶開始，使用25°C -2675% -80%相對溼度、自然光制條件中桑葉或人工飼料飼養至結繭；然後在-26°C,70% -80%相對溼度、 L D = 18h 他長光制條件中保護至羽化，獲得產弱滯育性蠶卵的母蛾；(2)收集步驟(1)中羽化後的母蛾，23n6°C、光照強度低於10勒克斯弱光線條件與雄蛾交配池-他後，分開交配雌雄蛾，雌蛾投放在生產用產卵紙，250C 、光照強度低於 0. 1勒克斯的黑暗環境產卵；收集10min-15min內所產的弱滯育性卵作為人工孵化處理群體，在產卵後25°C 環境溫度中0. 5h-l. 5h完成鹽酸人工孵化處理；(3)收集步驟O)中人工孵化處理群體蠶卵，經鹽酸活化處理，同時將蠶卵從產卵紙脫落，獲得活性化蠶卵。
3.根據權利要求
1或2所述家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法，其特徵在於， 步驟O)中雄蛾選自通用方法獲得的普通同品種雄蛾或步驟(1)方法與母蛾同時羽化的雄蛾。
4.根據權利要求
1或2所述家蠶二化性品種卵轉基因用蠶卵的製備方法，其特徵在於， 步驟(3)中所述鹽酸活化處理的條件選自以下兩種的一種a、W/V為15%的鹽酸，加熱至40°C，浸漬蠶卵5min_8min；b、W/V為14%的鹽酸，加熱至45°C，浸漬蠶卵5min-8min。
專利摘要
本發明涉及昆蟲生物工程領域，更具體的說，涉及一種家蠶二化性品種的卵轉基因方法，利用親代蠶卵催青孵化時期的保護溫度與光制組合，以及對子代受精前蠶卵的人工孵化處理，獲得早期活化卵，然後進行常規顯微注射並進行篩選，獲得轉基因蠶卵的方法。使用本發明方法，能夠解決二化性蠶品種滯育性卵轉基因注射後人工孵化處理對蠶卵的傷害所導致的不能孵化的問題；能夠解決二化性蠶品種滯育性卵早期鹽酸孵化處理後轉基因注射孵化率很低的問題；也解決了二化性蠶品種滯育性卵受精後鹽酸孵化處理、以及利用親代蠶卵低溫與黑暗孵化條件獲得的二化性品種子代非滯育卵的胚胎強健性差和幼蟲成活率低的問題。
文檔編號C12N15/85GKCN101703035 B發布類型授權 專利申請號CN 200910212990
公開日2011年11月30日 申請日期2009年11月9日
發明者司馬楊虎, 徐世清, 牛豔山, 甘麗萍, 袁紅霞 申請人:蘇州大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),