核酸和細胞疫苗的組分的製作方法

2023-12-10 10:00:22 4

專利名稱：核酸和細胞疫苗的組分的製作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗的組分，特別是疫苗的組分中含有核酸和基因修飾的抗原呈遞細胞，以及它們的應用。
背景技術：
用核酸序列，包括DNA或者RNA序列，作為接種的方法已經於最近十年期間發展起來了。DNA疫苗是比較容易製造的，而且穩定、造價低。另外，重複性的使用DNA疫苗不會產生明顯的載體特異性免疫反應。當裸的質粒DNA打進小小鼠的皮膚和肌肉，DNA將會被旁邊的細胞吸收掉。這些非淋巴組織表達質粒所編碼的蛋白，然後這抗原肽在與主要組織相容性複合體(MHC)I類或者II類分子結合後向T淋巴細胞上呈遞(Annu.Rev.Immunel.2000，18927)。
DNA免疫接種對抗不同的病原體感染和惡性疾病的能力已經在動物模型上研究過(Annu Rev.Immunol.1997，15617-648)。DNA免疫接種可以抑制自身免疫疾病以及抑制過敏反應(Nat.Med.19962899-905，Nat.Med.1996，2540-544)。最近的研究結果表明，人體上用DNA疫苗能產生對抗瘧疾感染和HIV多肽的細胞性免疫反應(Science1998，282476-480，Lancet 1998，3511320-1325)。
典型地，質粒DNA載體有兩個主要單元(1)質粒骨架，用於傳送輔助因子；(2)轉錄單元，包括啟動子、抗原性核苷酸序列以及多聚腺苷酸附加序列，它們一起指導蛋白的合成。
當今DNA疫苗的主要問題是不像我們想像的那麼有效。從臨床前工作和臨床試驗中得不到滿意的結果，讓人們對DNA疫苗的應用產生嚴重懷疑。所以，疫苗效率的改善成為DNA疫苗發展的一個重要目標。
樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是造血來源的專職化的抗原呈遞細胞(APCs)。雖然所有DCs具有共同的抗原(Ag)處理和T細胞激活化的功能，但是DCs細胞含有多種子型細胞類型和各種各樣的功能。
腫瘤表達一些能被T細胞識別的蛋白質抗原，成為癌症免疫療法的潛在目標。樹突狀細胞(DCs)具有向T細胞呈遞抗原的獨特能力。這種特性已用於開發治療癌症疫苗。在臨床試驗上用DC接種去對抗非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)和黑色素瘤，已觀察到對抗腫瘤免疫反應和腫瘤衰退的誘導(Annu Rev Med.1999，50507-529)。

發明內容
本發明的總的目的是提供一個新的疫苗組分。
本發明的一個目的是提供一個生產所述的疫苗組分的方法。
本發明的另一個目的是提供一個藥物組分。
本發明的進一步的目的是提供一個疫苗組分，其含有編碼抗原性分子的核酸序列和修飾的抗原呈遞細胞，不限於樹突狀細胞(DCs)。
本發明的一個特別目的是提供一個疫苗組分可用於防止和/或治療癌症、傳染病、老年性痴呆病、過敏、自身免疫疾病和血液病。
本發明的再一個特別的目的是提供一個疫苗組分含有樹突狀細胞子類，稱為血漿細胞狀樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)或者是幹擾素生產細胞(IPCs)。這種樹突狀細胞子類經過遺傳工程改造為可表達免疫調控分子。
這些和其它的發明目的在本發明的相應權利要求中有相關定義。
簡單地講，本發明提供了一個新穎的疫苗組分。該組分包括一個編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的抗原呈遞細胞(APCs)，更好的方式是把核苷酸序列和基因修飾的抗原呈遞細胞預先培養成混合物。
編碼抗原的核苷酸序列可以是一個裸露的DNA或RNA序列。另外，編碼抗原的核苷酸序列更好的是插人和包含在一個載體中，這時核苷酸序列置於啟動子、增強子和/或其他調節序列的轉錄控制下。本發明所述的載體優選為包含編碼抗原基因的質粒DNA載體。該載體可能也包含其他核苷酸序列，這些序列可調節或控制對象宿主的免疫應答。接受該疫苗組分的對象優選為哺乳動物，更好的對象為人。這樣的免疫應答調控序列可能是非甲基化的胞苷磷酸鳥苷(CpG)序列，或者是編碼參於調節對象免疫反應的異種(xenogenic)分子(蛋白/多肽)的基因序列。
用於本發明的疫苗組分中的APCs細胞為適合於向其它細胞處理和呈遞抗原的細胞類型，特別是向免疫系統的CD4+和CD8+T細胞。更好的APCs的例子包括專職性APCs，比如DCs、IPCs、巨噬細胞、單核細胞和B細胞。更佳的APCs細胞類型是具有pDC/IPCs特徵和功能的細胞，特別是可表達Toll-like受體9(TLR9)和P2X7受體，在微生物刺激下分泌細胞因子和產生大量I型α-幹擾素和β-幹擾素並且刺激免疫系統的效應細胞。
此外，APCs應是被基因修飾的，或被其他方式修飾過，從而可表達免疫反應調控分子。這樣的分子能通過提高抗原的輸送，刺激Th1或Th2細胞因子的分泌，激活APCs，郎格罕氏(Langerhans)細胞和效應細胞和/或者提高免疫反應，來增強對象的免疫反應。另外，特別是在自身免疫疾病和過敏中，免疫反應調控分子能幫助抑制免疫反應或者誘導對象的免疫耐受性或無變應性。用於修改APCs的合適的基因包括細胞因子基因、白介素基因、粘附分子、幹擾素基因、趨化因子基因和趨化因子受體基因和編碼熱休克蛋白的基因、腫瘤壞死因子(TNF)、抗細胞凋亡劑、細胞凋亡誘導分子、生長因子和藥物學可接受的載體。
本發明的疫苗組分中除了核酸序列和APCs以外也包括其他附加分子。這些附加分子可提高或抑制對象的免疫反應，增加APCs的抗原呈遞，刺激Th1或Th2細胞因子的分泌，激活APCs、郎格罕氏(Langerhans)細胞、效應細胞和/或調控APCs的免疫功能。
本發明的疫苗組分中最有效的組分包括基因修飾的pDCs或者是I型幹擾素(IFN)生產細胞(IPCs)和編碼MHC結合的抗原並含有CpG基序(CpG motifs)的質粒DNA。
本發明也涉及一種治療和防止疾病的方法，即將本發明的疫苗組分給予對象，優選是哺乳類，最好是人類，以及其應用。本發明的疫苗組分包括編碼與疾病相關的抗原性分子的核酸序列。例如，對於傳染病，核酸序列編碼與疾病有關的且來自感染微生物的蛋白質或多肽，例如病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲的多肽或蛋白質。在人體和動物上用編碼感染微生物的蛋白質或多肽的核酸序列和修飾APCs一起來接種，將會誘導引起對抗編碼的蛋白質或多肽的特異性的免疫反應。
癌症通常有改變的或反常的基因表達。蛋白質在癌細胞裡反常水平的表達可以作為T細胞攻擊的目標。本發明的疫苗組分中也包括編碼與腫瘤相關的抗原的核酸序列。
本發明也包括一個生產本疫苗組分的方法。這個方法包括在用本疫苗組分去治療或防止疾病時，設計鑑定與MHC結合的和與疾病或紊亂相關的抗原分子。
更好的具體化，是將編碼鑑定後的抗原分子的核酸序列引進入一個質粒DNA載體中，最好是一個含有非甲基化的CpG序列的質粒載體中。分離APCs，可從對象(或接受者)的本體的APCs中來。APCs更好是特殊的樹突狀細胞子型，類似pDCs類型和(自然)幹擾素導致細胞類型(NIPCs)並且具有在例如象質粒DNA的刺激下能產生I型幹擾素的能力。APCs由一個或幾個編碼免疫共刺激分子的基因修改過後，調節了APC的功能和刺激了免疫效應細胞。最後，將編碼抗原的核苷酸序列和基因修飾APC混合在一起，孵育，完成製造方法以及結束本發明的疫苗組分的具體化。
因此，根據本發明而獲得正結果的主要特點是將基因修飾的APCs和編碼抗原的核苷酸序列一起使用。本發明的另外的特點是在使用前預先孵育疫苗中的兩個主要成份。
這樣的預先孵育允許APCs攝取核苷酸序列。在進入APCs後，抗原序列將會被處理和呈遞，然後CpG序列結合到不同的受體上包括TLR9，結果激活了APCs和產生了免疫調控的分子，例如I型幹擾素和細胞因子。
本發明具有以下優點——與以前的DNA疫苗組分比較，本發明的疫苗組分在長腫瘤的小鼠上應用具有更優的抗腫瘤效率；——與單用核苷酸序列或者是編碼抗原的核苷酸序列的質粒作疫苗相比，本發明的疫苗組分治療癌症具有5倍以上的效應；——與用含有編碼抗原的核苷酸序列的質粒DNA或者是空的質粒載體作疫苗相比，本發明的疫苗組分對在體內活化腫瘤特異性的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)具有8倍以上的效應；——與唯一用基因修飾的APCs和其MHC-I類分子裝載了抗原多肽作疫苗相比，本發明的疫苗組分對在體內活化腫瘤特異性的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)具有2倍以上的效應；——用本發明的疫苗組分接種能活化和誘導識別在疫苗組分含有的腫瘤肽的腫瘤特異性的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)；——與削弱的或失活的病原體相比，能消除引進未完全失活的病原體的風險；——為了打破對自身抗原耐受和在對象上引導對抗自身抗原的免疫反應，本疫苗也能包括異種屬的核苷酸序列；——通過簡單地交換編碼抗原的核苷酸序列，能用於治療和/或防止大範圍疾病和紊亂；以及——通過對疫苗組分的抗原呈遞細胞進行基因工程改造，允許引進免疫調控的分子。
本發明所具有的其它優點將在下面作具體化的描述。
簡要


通過參考以下的描述與附圖，將會對由本發明的對象和優點作進一步更好的理解。
圖1為本發明生產或準備疫苗組分的方法流程圖；圖2為圖1中提供的疫苗中提供核苷酸的方法流程圖；圖3為圖1中提供的疫苗中提供APC的方法流程圖；圖4為圖1中疫苗生產方法的附加步驟的流程圖。
圖5為說明以莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒載體構造的含鼠CD40配體(CD40L)基因的反轉錄病毒載體(RVV-mCD40L)的概要圖；圖6為說明用RVV-mCD40L來轉導DCs。在重複性的轉導和篩選以後，DCs容易地在它們的細胞表面表達CD40L，而且超過96％的DCs表達CD40L，這些細胞被用於本發明所述的疫苗組分的一個例子中；圖7A說明在親代BM185wt腫瘤細胞上免疫反應激活分子的表達。
圖7B說明在DCs上表達B220分子；圖8說明在D2SC/wt，基因修飾的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF細胞上表達CD8、CD11c、MHC類II(I-A)、B7.1、B7.2和CD40L分子；圖9說明由Western blot檢測DCs表達TLR9蛋白質。
圖10概要地表明空的pVAX-1載體的一部分和含有小基因(minigene)序列跨過人的e1a2融合區域的pVAX-e1a2載體的一部分。另外，圖上表明通過體外pVAX-1和pVAX-e1a2質粒載體的轉錄結合的翻譯分析，檢查出小基因序列編碼的蛋白質產品；圖11A顯示D2SC/wt和D2SC/CD40L細胞誘導同種異體T細胞增生的能力。與未改造過的親代DCs比較，被基因修飾的DCs誘導8倍以上同種異體T細胞增生；圖11B說明D2SC/wt和D2SC/CD40L引導自體T細胞增生。與未改造過的親代DCs比較，被基因修飾的DCs誘導4倍以上的自體T細胞增生。
圖12.A說明將基因修飾的DCs用於接種時的滴定的最佳劑量，該DCs在注射前裝載了腫瘤溶解物；圖12B說明通過單獨接種脈衝腫瘤溶解物抗原的基因修飾DCs對長腫瘤小鼠的治療；圖13表明在只用腫瘤溶解物的單獨治療，或者脈衝腫瘤溶解物的基因修飾的DCs的單獨治療，在長腫瘤的小鼠上誘導產生了腫瘤特異性的CTLs。
(a)用裝載腫瘤溶解物的D2SC/CD40L或D2SC/GM-CSF細胞來單獨接種，產生了能特異殺死親代BM185wt腫瘤細胞的腫瘤CTLs。(b)值得注意的是，腫瘤CTLs不殺死同源的A20淋巴瘤。
圖14概要地說明本發明使用的小鼠接種模型的一個例子；圖15說明在長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠上用不同的疫苗組分來接種後腫瘤消失的小鼠的百分比。另外，為了檢驗所誘導的免疫保護性的效力和特異性，用活的親代BM185wt腫瘤細胞再次挑戰腫瘤消失的小鼠。
圖16說明用pVAX-e1a2和DC/CD40L來接種誘導產生腫瘤特異性的和e1a2特異性的CD8+T細胞；圖17說明本發明的疫苗組分與其它的疫苗組分在長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠的治療效果上的比較；圖18.A說明在用不同的疫苗策略進行免疫後，在體內產生腫瘤特異性的T細胞應答。從腫瘤消失的小鼠中形成的CTLs是特異性地直接對抗親代腫瘤細胞，BM185wt細胞。
圖18B說明在用不同的疫苗組分接種以後，在體內產生腫瘤特異性的T細胞的應答。從腫瘤消失的小鼠上提取的在體外培養產生的CTLs，識別在TAP缺陷的RMA-S細胞上裝載的e1a2肽；圖19說明在體外T細胞擴展以後產生的CD8+CTLs的百分比；圖20說明特異性的CD8+T細胞識別在H-2LdIg複合物上裝載的e1a2肽；以及圖21說明一個可指導本發明所述的效果的機制的假說。
具體實施例方式
除非其他定義，這裡所有被使用的技術和科學術語可被本發明所屬領域的人理解。
以下提供在本發明中使用的許多的一般定義的參考Singleton P and Sainsbury D，Dictionary of microbiology and molecular biology，3rd ed.，2002，Walker，The Cambridgedictionary of science and technology，1988，Rieger R，et al.，eds.，Glossary of genetics，5thed.，1991，Hale WG and Marham JP，Harper Collins dictionary of biology，1991，Abbas A，et al.，Cellular and Molecular Immunology，2003，Blood 20011587-600.為了發明的清晰理解，本發明涉及以下定義。
除非另外說明，「核酸序列」的定義包括雙鏈和單鏈的DNA，寡核苷酸，cDNA和RNA.在定義中也包括像DNA-RNA，DNA-DNA之類的雜交體。在核苷酸序列或核酸序列的含義中也包括本領域的人所知的鹼基修改，比如自然發生的結構變異和人工合成的非自然發生的類似物。
「免疫應答」指的是由免疫系統的細胞和分子介導的在一個個體上發生的集體和協合的對外來物質入侵的反應。
「免疫系統」指的是提供對抗外來生物體的免疫或保護的集體性功能的分子、細胞、組織和器官。
「CpG基序(CpG-motifs)」指的是比如在細菌、酵母、昆蟲和neomatode DNA中的未甲基化「CpG二核苷酸」或「CpG基序」。在許多細菌質粒上已鑑定了CpG基序並且它們可作為DNA疫苗的潛在佐劑(Immunol.Today 1998，1989-97)。CpG-DNA現已知道是一個強力的Th1-like佐劑，它不僅促進MHC-I類的限制性CTL對蛋白質或多肽的交叉激活(cross-priming)，而且觸發Th1介導的抗體反應(Immunity.2001 14499-502)。在其它方面，不含有CpG基序的DNA序列具有抑制免疫系統的作用(Arthritis and rheumatism.2003，481701-1707)。
「P2受體(P2receptors)」指的是細胞外核苷酸的受體。P2受體被劃分成兩個亞型G蛋白質耦聯受體(P2Y)和配體門控離子通道受體(P2X)(Curr Opin Cell Biol.1996，8474-483)。
「抗原呈遞細胞(APC)」指的是具有抗原處理和抗原呈遞功能的細胞。這些APCs在其細胞表面顯示與MHC分子結合的蛋白質抗原的肽片段，並且激活抗原特異性的T細胞。除了顯示肽片段-MHC結合體之外，APCs也表達最適宜T細胞激活的共刺激分子。特別是，APC特指專職性APC，包括DCs、IPCs、NIPCs、單核細胞、巨噬細胞、T細胞和B細胞，尤其是pDCs，IPCs，NIPCs，以及具有pDCs/IPCs/NIPCs特徵和功能的專職化的APCs，例如在微生物刺激後能表達TLR9並產生或分泌I型幹擾素和進一步分泌TNF-a的細胞。
「修飾APCs」指的是通過用病毒載體或由非病毒載體處理後，獲取基因或蛋白信息的抗原呈遞細胞。遺傳修飾的結果使基因或蛋白物質進入或結合到抗原呈遞細胞中並在那裡表達。
根據本發明的一個方面是提供含有分離或極大純化的異種核苷酸序列或編碼抗原分子核酸序列和基因修飾抗原呈遞細胞(APCs)的疫苗組分。
疫苗組分更好地是作為核苷酸序列和APCs的相互混合物來提供的。比如，核苷酸序列和APCs更好地是預先混合和孵育後才引入對象。與以前的DNA疫苗比較，本發明的疫苗組分獲得增強的免疫應答和優越的治療和保護效果，特別是在消滅已存在癌細胞和保護宿主抵抗腫瘤細胞的再挑戰。
以本發明的核苷酸序列編碼的抗原分子、RNA或更好是與MHC結合的抗原肽/蛋白質，當引入對象中產生對抗原的免疫應答。該抗原更好的是一個產生免疫性的分子，一個產生免疫性的分子片段，比如產生免疫性的蛋白質、肽或核糖核酸分子或其片段。
本發明的基於核酸的疫苗可以是單價的或多價的疫苗。在單價疫苗的構成中，核苷酸序列編碼一個抗原分子，而在多價疫苗的構成中，核苷酸序列包含至少一個編碼異源或同源抗原的多抗原的異源基因。因此用多價疫苗注入對象從而引進和呈遞了多個抗原，造成激活和識別不同抗原的抗原特異性的T細胞。本發明也包括抗原序列的幾個重複拷貝，比如，提供為兩倍體或三倍體等。
本疫苗組分的核苷酸序列也包括其它免疫共刺激或調控的序列，比如編碼具有免疫應答調節效應的蛋白質或肽分子的基因序列。共刺激的DNA序列，比如未甲基化的CpG基序也可包括在核苷酸序列中。
本發明所述的核苷酸序列更好但不限於的是，一起輸入的裸露DNA或RNA，更好的方案是與基因修飾的APCs作為混合物輸入。如果提供的為RNA序列，核酸序列也包括允許在對象(接受者)細胞中翻譯的基序。同樣，如果提供的為DNA，核酸序列包括基序，比如啟動子、可能的增強子和/或其它調控核苷酸序列的轉錄和翻譯的元素。
然而，編碼抗原的核苷酸序列，更好是包括在一個具有啟動子轉錄控制的載體中，比如，包括在含有表達控制序列的載體表達盒中。此外，載體或含有表達控制序列的載體更好是包括其它的核苷酸序列轉錄/翻譯所需和要求的調控序列，包括但不限於多聚腺苷酸化(polyadenylation)序列，轉錄序列和增強子。載體中含有的啟動子或增強子可以有細胞類型特異性或組織特異性。根據實驗性設計或疫苗構建，啟動子可是可誘導或有選擇性地被激活。接種人體的適當的啟動子例子包括病毒啟動子，比如巨細胞病毒(CMV)啟動子。本發明的載體可以是微生物載體或非微生物載體。
本發明所述的一個載體的例子是脂質體。多種陽離子脂質形式已被用於將DNA導入細胞。將聚乙二醇的衍生物插入脂類膜或脂質體，可能增加脂質體在靜脈輸注後的循環半衰期。
另一類被活躍研究的合成載體是陽離子聚合物。一般原則是在帶正電荷的聚合物和帶負電荷的DNA分子之間形成複合物。與陽離子脂類比較，陽離子聚合物對凝聚DNA是高效的。優選作為基因傳遞的聚合物例子是多聚L-賴氨酸、聚乙烯基亞氨(polyethylenimine(PEI)和多聚葡萄糖氨(polyglucosamines)和多聚脂質體(polylipid)。
並且，小顆粒，比如納米顆粒(nanoparticles)也能作為本發明的載體使用。
本發明所述的更優選的載體是編碼MHC結合抗原的DNA質粒載體。質粒DNA的骨架更好的是包含具有促有絲分裂活性的免疫調節序列或輔助因子。本發明所述的細菌DNA質粒載體的應用，無論是裸露DNA還是埋在脂質體或陽離子聚合物裡，或小顆粒，提供了進一步的顯著優勢。這些質粒DNA載體也包括免疫刺激的CpG核苷酸序列。因此，除了在對象上傳遞和表達本發明的抗原，質粒載體還能刺激對象的免疫應答。
另外，病毒系統也能被用於傳遞和隨後生產本發明的抗原或免疫調控分子。病毒是傳遞核苷酸序列有吸引力的載體，因為它們發展了進入寄主細胞和表達它們的基因的特殊和高效率的方法。在病毒載體發展中的主要挑戰是安全問題。複製缺陷型病毒載體或複製型病毒載體目前都用於基因治療。用病毒載體來進行基因傳遞稱為轉導。迄今在臨床試驗有至少四種類型病毒載體逆轉錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒和腺病毒相關病毒。其它研究中的病毒包括痘病毒，呼吸道腸道病毒(reovirus)，lentive病毒，新城疫病毒，甲病毒屬(alphaviruses)和多泡狀口腔炎病毒，這些都可以作為載體供本發明所用。
本發明的APCs是專門對免疫系統處理和呈遞抗原的細胞類型。本發明的APCs更好的是專職性APCs，包括但不限於DCs、IPCs、NIPCs、巨噬細胞、單核細胞、B細胞、朗格罕氏(Langherhans)細胞、肥大細胞、T細胞、骨髓來源細胞、從幹細胞分化的細胞、血管內皮細胞和/或各種各樣的上皮細胞和骨髓間質細胞。混合至少兩種類型的APCs也可用於本發明。目前更好的APCs類型是pDCs、IPCs、NIPCs或具有pDCs/IPCs/NIPCs特徵，更好的特徵是能表達TLR9和可誘導生產I型幹擾素(IFN)。這些細胞在抵抗微生物時扮演重要的角色，並且它們能交叉激活宿主T細胞以及作為先天的和適應性免疫反應的聯結。
本發明的樹突狀細胞子型更好的是pDCs/IPCs，有處理和呈遞與MHC結合抗原的高能力，當裝載病毒或細菌DNA時高水平產生I型幹擾素，表達P2X7受體和toll-like受體，比如TLR9。
TLRs在宿主抵禦感染時扮演重要角色。TLRs識別病原生物相關分子和負責激活宿主防禦系統的信號，特別是促炎症細胞因子。因為針對CpG-DNA的細胞型應答是通過TLR9來調節的，所以TLR9對本發明是特別重要的。TLR9是在樹突狀細胞(DCs)和巨噬細胞的內質網(ER)上。TLR9不觸發CpG-DNA的內吞作用而是激活DCs內吞作用的下遊。
因此，本發明中的APCs優選自pDCs或其它具有上述特徵和功能的APCs。
本發明所述的接種組分中的APCs是遺傳修飾的APCs。因此，APCs被修飾而表達調控分子，比如，增強或抑制或誘導免疫反應的耐受或過敏的分子，誘導細胞凋亡和/或根據設計或接種策略的其它細胞生存調整反應。APCs也可以被修飾而增加抗原處理和呈遞，激活APCs和/或提高效應細胞的免疫功能。因此，遺傳物質被引進或轉移入APCs，或者從附加體位置暫時性表達，或者整合到APCs的宿主基因組而穩定地表達，或提供作為一個穩定的染色體外的元素。用於修飾APCs適當的基因包括細胞因子基因、白介素基因、黏附分子、幹擾素基因(比如，I型幹擾素I IFN-a和IFN-b)，趨化因子基因、趨化因子受體基因、抗細胞凋亡基因和編碼不同免疫共刺激分子、免疫調控的分子、配體(如CD40L)和受體並且藥物中可接受載體的基因。
例如，CD40配體在參與適應性免疫反應中扮演重要角色。CD40已成為B細胞、單核細胞和DCs細胞功能的一個關鍵信號。在抗原刺激和與DCs共激活後，CD40L(CD154)表達在被激活的T細胞裡。CD40-CD40L相互作用導致DCs的活化和分化。在CD40-CD40L活化時，DCs獲取了誘導高水平生產細胞因子IL-12的能力，極化CD4+T細胞往Th1型發展，提高CD8+T細胞的增值和激活NK細胞。因此，CD40-CD40L互相作用作為觸發用於適應性免疫反應中的共激動分子表達和有效的T細胞活化作用。因此，本發明的APCs能通過基因修飾而提供高效率的CD40表達或CD40L表達。
修飾APCs適當的基因傳遞方案包括但不限於病毒和非病毒方法。能用的病毒載體舉例包括，但不限於，逆轉錄病毒、腺病毒、胞疹和腺病毒相關病毒、牛痘病毒(vaccina virus)、單純皰疹病毒和lentvirus。基因的非病毒傳遞入APCs包括但不限於質粒DNA轉入，脂質體、電脈衝擊(electroporation)微注射(microinjection)和微生物來源的載體和從微生物中獲得的毒素。
此外，APCs更好地表達其它細胞表面分子包括但不限於對T細胞和其它類型的免疫細胞有效活化所要求的黏附分子和共激化分子。另外，本發明的APCs更好地表達趨化因子和趨化因子受體和FLIt3配體。
具體化，本發明的APCs可能從對象獲得，更好的但不限於，給予組分接種的同樣的對象，比如，使用自體同源APCs。選擇地，也包括同源異體的APCs或同源的APCs(來自於對象的同一雙胞胎)。
另一具體化，在體外或體內，APCs能通過本領域公知方法可選地被富集或被純化和/或被擴增。例如，不限於，在細胞因子的存在下，從外周血液、臍帶血或骨髓來源的幹細胞和祖細胞激活和分化獲得APCs。
在進一步具體化，疫苗組分被提供為包括編碼外來抗原的核苷酸序列和基因修飾的APCs的預處理混合物。
在APCs攝進或內吞核苷酸序列後，核苷酸序列被處理。CpG基序更好的是包括在APCs中激活toll-like受體途徑的核苷酸序列中，和刺激I型IFN-a和IFN-b的生產，以及呈遞編碼的抗原。這次事件可發生在核苷酸序列和修飾APCs的孵育期間，早於疫苗組分的注射。因此在孵育後，修飾的APCs、呈遞MHC結合抗原和表達或分泌免疫共刺激分子，在給對象打入疫苗時可直接或間接地激活初始APCs。本發明所使用的修飾APCs可接著移居到淋巴腺器官，能直接地或間接地活化初始T細胞、B細胞和DCs，因此獲得對抗外來抗原更加快速、增強的和更高效率的治療和對外來抗原的保護性免疫反應。
因此，本發明所述的混合核苷酸序列和修飾APCs是對於獲得疫苗的高效率的優先的和新穎的步驟。
此外，一旦注入對象中，核苷酸序列或含有核苷酸序列的載體將被對象的細胞吞進並在其中表達。隨後，合成的抗原分子在細胞液內被蛋白酶體(proteasome)處理成多肽。
此外，在疫苗輸入以後，專職性APCs可直接地獲取抗原或從其他被轉導的細胞中釋放的抗原。本發明的轉染載體或核苷酸序列的細胞溶解，導致釋放編碼抗原從而被APCs攝取。
本疫苗構成中編碼抗原分子的核苷酸序列和(遺傳)修飾APCs被提供和引入等滲溶液，優選為緩衝溶液，或引入藥物上可接受的溶液、膠凝體，適用於注入對象，優選是人體。這樣的溶液的一個例子是磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，PBS)。
本發明的接種溶液除核苷酸序列和APCs以外可包含附加的分子。這些附加分子包括調節分子(可以調節(提高或壓制)對象的免疫反應，增加APCs的抗原呈遞，刺激Th1或Th2細胞因子的分泌，激活APCs、朗格罕氏(Langherhans)細胞、效應細胞和/或提高APCs的免疫作用)，還包括細胞因子、黏附分子、熱休克蛋白質和趨化因子，比如白介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TNFα、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、I型IFN-α，IFN-β，熱休克蛋白質(hsp)70、hsp90、gp96、CD40L和B7，載體和佐劑。
溶液也可包括調控免疫反應的載體和佐劑，增加抗原呈遞，再指導疫苗對應免疫系統和/或促進DNA進入細胞。佐劑包括，但不限於，礦物鹽佐劑或礦物鹽膠凝體佐劑、顆粒佐劑、毒素、微粒佐劑、黏膜佐劑和免疫刺激性佐劑。佐劑的例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁膠凝、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、細菌超級抗原、角鯊烯或角鯊烯水包油(oil-in-water)佐劑形式、生物可降解和生物相容性聚酯、聚合脂質體、三萜系配糖或皂角苷、N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇-D-異穀氨醯胺(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin)、LPS和單磷酸類脂A和非活性的微生物。
本發明的另一目標是在對象上使用疫苗產生免疫反應。在這種情況下，疫苗組分，包括編碼抗原分子的的核苷酸序列和基因修飾的APCs，被用藥於對象，更好的為哺乳類對象和更好的為人體。
在本發明的進一步體現是按照本發明所述注入對象所需的有效量的疫苗組分從而治療和/或預防對象疾病的方法，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人體。
本發明同樣指一種疫苗組分，含有編碼抗原的核苷酸序列和基因修飾的APCs，用作藥劑。在其它具體化，本發明教導了疫苗組分可用於生產治療或預防傳染病的藥劑的用途，其中編碼傳染物質相關抗原的核苷酸序列是介入疾病的。而另一個具體化是疫苗組分可用於生產治療或預防癌症的藥劑的用途，該核苷酸序列編碼由癌細胞表達的腫瘤相關抗原。
用於治療或預防傳染病的本發明的疫苗組分是由以下的傳染物質導致的，包括但不限於，病毒、細菌、真菌、原生動物和寄生生物。不管怎樣，疫苗組分中含有編碼與致病性微生物相關的抗原分子的核苷酸序列。此外，這個抗原分子更好地由被接種的對象的免疫系統識別為非己物。
病毒性疾病可通過本發明疫苗來治療或預防，包括由以下病毒所引起的疾病腺病毒、蟲媒病毒、柯薩奇病毒、巨細胞病毒、刺病毒(echinovirus)、棘病毒(echovirus)、漢坦病毒(hantavirus)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、單純皰疹I型病毒、單純皰疹II型病毒、阿氏病病毒(Aujeszky′s disease virus，ADV)、I型和II型HIV(HIVenv蛋白也能作為抗原分子)、流行性感冒病毒(NP抗原能作為抗原分子)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳頭瘤病毒(papilloma)、乳多空病毒(papova)、骨髓灰質炎病毒、呼吸道合胞病毒(syncytial)、鼻病毒(rhinovirus)、牛疫(rinderpest)、引致腹瀉的輪狀病毒(rotavirus)、風疹病毒和水痘。
傳染病也可用本發明的疫苗組分來防治和/或治療，引起傳染病的例子有軍團菌、分枝桿菌屬(hsp65抗原可能被用作分枝桿菌結核病抗原分子)、菌質、奈瑟氏菌和立克次氏體。
本發明的疫苗組分可能也可治療原生動物引起的疾病，包括由kokzidioa、利什曼和錐蟲(trypanosoma)造成的疾病。但是相應的寄生蟲病能由衣原體，瘧疾寄蟲、立克次氏體和利什曼主要鼠傳染(抗原分子可能是LACK抗原)造成。
本發明的疫苗組分也很適用於預防和/或治療癌症。疫苗中的核苷酸序列編碼在特定癌症類型中與腫瘤相關的抗原分子。
許多癌症具有在癌細胞中基因或染色體易位的特徵。這樣的易位引起兩個或更多編碼序列或部分連接起來，然後形成雜交或融合蛋白或多肽。這樣的雜交蛋白可能被病人的免疫系統識別為非自體，因此具有抗原性。一個最具特色的典型例子是易位造成癌症基因的雜交，是來自於費城(pH1)染色體易位，發生在慢性粒細胞白血病(CML)和急性淋巴母細胞白血病(ALL)的病人。在染色體22和染色體9之間的易位形成合成bcr-abl融合轉錄的費城染色體。在ALL中，斷裂點發生在bcr基因第一內含子從而形成e1a2融合基因和產生具有致癌活力的一個185kDa酪氨酸激酶。
另外，許多癌症的特徵是特定基因及基因產物的反常的表達。腫瘤相關抗原不但在腫瘤中而且在宿主的正常組織中表達。為了誘導一個有效的抗腫瘤的免疫應答，接種必須克服對自身抗原的免疫耐性。本發明的一個可選擇方法是選用異種來源的抗原，比如，在DNA質粒載體中提供含有編碼腫瘤相關抗原的核苷酸序列從而衝破對自身抗原的免疫耐性而誘導抗腫瘤免疫。另外，免疫系統中包含未從免疫系統發展過程中除掉的自身反應性T細胞和B細胞。自身反應的淋巴細胞可由在種類之間的交叉反應來觸發。對小鼠自身抗原的交叉反應免疫可由在異源的DNA免疫後識別相應的人蛋白質的免疫來誘導。因此，為在對象內獲得一個免疫反應，編碼自身抗原的核苷酸序列更好的是提供在異源的載體中。比如，異源DNA質粒載體(包含異源序列、異種的基因序列、外來的基因序列)，為了打破對自身抗原的耐性，更好的是編碼異源蛋白質和多肽的基因序列。
腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的非限制例子中，編碼序列可用於在本發明的疫苗組分中，包括KS 1/4全癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，前列腺酸磷酸鹽，前列腺特異的抗原，黑色素瘤相關抗原p97，黑色素瘤抗原gp75，高分子重黑色素瘤抗原，MAGE抗原家族，T細胞受體γ鏈可選擇閱讀碼框蛋白(TARP)抗原，前列腺特異的膜抗原和e1a2融合蛋白抗原和bcr/abl融合蛋白。
治療黑色素瘤、胰臟癌、乳腺癌和前列腺癌的疫苗目前被使用在臨床試驗中。與以前的癌症疫苗相比，對這些癌症類型使用本發明的疫苗組分會得到優越結果。進一步用本發明的疫苗組分治療和/或防止非限定的癌症例子是以下類型癌症人體肉瘤和癌，比如，成纖維瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨發生肉瘤、脊索瘤、血管瘤、肉皮瘤、淋巴血管瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌症、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭狀的腺癌、囊腺瘤、髓心癌、支氣管癌、腎臟細胞癌、肝細胞癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜癌、松果體癌、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜膠質瘤、黑色素瘤，神經母細胞瘤和視網膜胚細胞瘤；白血病，比如，急性淋巴母細胞的白血病(ALL)，和急性髓細胞性白血病(成髓細胞、早幼粒細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅細胞)，慢性白血病(慢性單核細胞白血病、慢性粒細胞內的白血病和慢性淋巴細胞內的白血病)，原發性紅血球增多症，淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病病)，多重性骨髓瘤，瓦爾登(Waldenstrm’s)巨球蛋白血症，重鏈疾病；病毒引起的癌症。
本發明的疫苗組分可用於消除已存在腫瘤或病原生物，治療癌症或傳染病。但是，疫苗組分也可能或供選擇地用於保護對象，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人類，免受疾病遭遇或保護免受挑戰或腫瘤細胞的復發或致病性傳染物質(微生物)的復發。在這種情況下，疫苗被使用為預防癌症或傳染病，例如，有預防疾病的特性。
過敏和超敏反應的不同的形式可由本發明來治療，通過在載體中使用適當的編碼抗原的核苷酸序列。序列的使用取決於過敏的類型，並且能由本行專業人士選擇出來。例如，針對花生過敏症，載體可包含編碼Arah 2抗原的核苷酸序列。
本發明的疫苗組分可被修飾而能治療I型糖尿病，但不限於，包含編碼胰島素的全部或部分核苷酸序列。疫苗組分也可用於治療老年性痴呆病人、不同的血液病、遺傳性的疾病、移植相伴或獲得的疾病及其獲得性的免疫缺陷。
本發明的疫苗組分可被引入一個對象，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人類，使用適當的和臨床可接受的接種途徑，包括但不限於，皮下給藥、肌內給藥、動脈內給藥、靜脈內給藥，血管內給藥、口服，皮內給藥，腹腔內給藥，直接注入淋巴結內和注入腫瘤內。編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的APCs更好的是在引入前預先混合，比如，引入本發明的疫苗組分的兩個組分的混合物。
疫苗可通過所有常規手段引入，但不限於，包括注射器，管套針，導尿管，電穿孔，無針引進等。
引入的劑量取決於受治療或接種的對象的狀況和大小以及引入疫苗組分的數量，引入頻率，引入路線，療法的類型，比如治療和/或預防，被治療或被接種的疾病類型。繼續的治療方案，包括部位、藥量和頻率可由對象的最初的反應和臨床評斷來決定。然而，在癌症的治療上，更好的是給予至少三次重複性接種。所用的疫苗組分的使用量可由本領域熟知的方法運用在動物的藥量反應試驗的結果來確定。
另外本發明的另一方面是提供用本發明的接種方法來製備的試劑盒。第一具體化試劑盒包括一個含有編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的APCs混合物的容器。抗原分子更好地同疾病，如傳染病或癌症關聯在一起，通過注入試劑盒的內容對對象進行治療或預防，更好的對象是哺乳動物和最好的對象是人類。
其它具體化試劑盒包含第一容器，包括製備編碼一個抗原分子的核苷酸序列，以及第二容器，包含遺傳修飾APCs的製品。在引入對象前，更好是將第一和第二容器的內含物交互混合，即將第一容器的內含物加入到第二容器的內含物，或者將第二容器的內含物加入到第一容器的內含物裡或將第一和第二容器的內含物單獨地加入到所提供的第三個供混合的容器內。混合物在注入對象之前可在一起孵育，更好的對象是哺乳動物和最好的對象是人類。
本發明的試劑盒包含疫苗組分，配藥構成(治療或預防疾病或紊亂(disorder)，比如傳染病、癌症、自身免疫疾病、過敏或糖尿病)。試劑盒中至少有一個容器，更好的是容器中含有基因修飾的APCs容器，也可包括另外的物質和佐劑，可增加APCs的抗原呈遞，激活APCs和/或提高APCs的免疫功能。
本發明進一步的目的是提供生產疫苗組分的方法。如圖1的流程圖所示，在步驟S1，提供一個編碼抗原分子的核苷酸序列(誘導對抗一個所希望的免疫反應)。在步驟S2提供了基因修飾的APCs，如DCs、pDCs、IPCs、巨噬細胞、單核細胞和/或B細胞。在步驟S3，核苷酸序列和APCs混合從而完成本方法和結束本發明的疫苗組分的生產。
圖2更具體地說明在圖1中步驟S1的核苷酸序列的提供。在可選步驟S11，編碼與疾病或紊亂相關的抗原分子的核苷酸序列被鑑定和分離，這些疾病或紊亂是由疫苗組分來治療或預防的。該鑑定以及至少部分的鑑定可用本領域所知的MHC-結合肽基序查詢。本領域所知的方法，包括化學合成DNA序列和PCR(聚合酶鏈式反應)，可用於獲得相關的核苷酸序列。然後在步驟S12，鑑定和分離所得的核苷酸序列被克隆進合適的載體。載體是經選擇適應於引入對象而且一但進入對象，能表達核苷酸序列，隨後得到希望的抗原分子。所獲的載體然後被繁殖在步驟S13，即在寄主細胞內，體外(in vitro)等。
圖1中提供APC的步驟S2在圖3中有較詳細的說明。在步驟S21中，分離APCs更好是從接受疫苗組分的對象上取得或前述的其它來源中取得。在該步驟S21，一個特別有利APC亞類，比如DCs或DC亞類，可被選擇和分離。在步驟S22，APCs是被(遺傳)修飾過。在這種情況下，引入一個或幾個基因，比如CD40L基因，編碼調節免疫反應分子的基因，基因可作為額外染色體元素或被插入APCs的染色體上而進入抗原呈遞細胞。
在圖4中進一步S31步驟中，另有物質加入了載體-APCs混合物中。這些物質至少包括細胞因子、黏附分子、趨化因子、熱休克蛋白和前面所提的一般調節接受疫苗組分的對象的免疫反應和免疫細胞和/或提高效應細胞和APCs的免疫作用的佐劑。核苷酸序列和修飾APCs的混合物也可能加上另外的物質，更好是在步驟S32作為疫苗使用之前預先孵育，孵育的物理條件可以由本行業專業人士決定。為了提高核苷酸序列的被內吞，孵育更好持續至少5分鐘，更好至少幾個小時。孵育時間由其它生理因素典型地表明，比如孵出溫度。通常，過夜，例如至24小時是適當的，但不限於，直到孵出時間為限。溫度在孵育期間是更好的是至少4℃，最好為室溫(約20-25℃)或約37℃。孵育溶液的酸鹼度更好是中性或輕微酸性。為了提高內吞作用更好是通過共離心法將核苷酸序列(質粒)和APCs被迫的結合在一起。或者用其他的技術，或者增加其他的技術，比如脂質轉染試劑。
以下是用本發明的疫苗組成接種來對抗急性白血病的例子。因此，核苷酸序列編碼的抗原分子是同該類型癌症相關的。但是，本領域應知本發明並不局限於這個特殊的疾病和抗原而可被用於治療和/或預防上面所提的任何疾病或紊亂。
實施例本發明的疫苗組分與各種各樣的其它接種方法比較，包括用抗原肽和編碼的抗原肽質粒DNA來接種。
細胞系
A20(H-2d)是從BALB/c小鼠上獲得的B細胞淋巴瘤細胞系，在本發明研究中用作CTL靶。A20細胞表達B220、MHC-I、MHC-II和CD19分子。
腫瘤細胞(BM185wt，H-2d)是小鼠急性白血病細胞系(pre-B ALL)。它是用編碼人的一個185 kDa bcr/abl致癌蛋白的反轉錄病毒載體轉導BALB/c小鼠骨髓細胞而建立的(Cell 1995，82981-988)。BM185wt細胞在其細胞表面表達B220、CD19和MHC-I分子。
D2SC/wt細胞(或D2SC/1)是由Paola Paglia博士熱心提供的。本發明中所使用D2SC/wt，(H-2d)是從BALB/c小鼠脾臟樹突狀細胞經過反轉錄病毒無限增殖而獲得的。(J.Immunel.Methods 1994，174269-279)D2SC/wt細胞大多顯示發育未全的DC形態，免疫表型和功能屬性，包括MHC組II分子的組成性表達(低)、共刺激分子B7/BB1，熱穩定Ag，和ICAM-1，和具有有效的Ag呈遞功能(J Immunol Methods.1994，174269-279.，J.Immunol.1999，162(7)3757-3760)。
RMA-S是TAP2缺陷的腫瘤細胞系。它是從來自B6小鼠用勞舍爾氏(Rauscher)白血病毒誘導的T細胞淋巴瘤RBL-5而建立(Nature(London)1986，319675-678)。
細胞培養DCs細胞培養於IMDM培養基而且加有10％熱滅活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.，Scotland，UK)，2mM L-穀氨酸鹽，100IU/ml青黴素/鏈黴素，10mM hepes和5×10-5M 2-巰基乙醇。細胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的溼潤空氣中。
腫瘤細胞培養於RPMI-1640培養液(ICN Biomedicals，Inc.Costa Mesa，CA)添加熱滅活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.Scotland，UK)，2mM L-穀氨酸鹽，100 IU/ml青黴素/鏈黴素，10mM hepes，0.1mM丙酮酸鈉，5x10-5M 2-巰基乙醇和10mM非必需胺基酸。細胞被孵育在37℃和5％二氧化碳的溼潤空氣中。
MHC-結合肽基序的搜索合成ALL特異性的e1a2融合蛋白的胺基酸序列用於篩選對小鼠MHC-I抗原(H-2Kd)的結合力(表I)(來自Kenneth Parker博士研製的HLA多肽結合預測程序，http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)。一個九胺基酸序列，AFHGDAEAL，位於e1a2融合蛋白的連接點區域(表I和圖10)，對結合小鼠H-2Kd顯示有高的計分。覆蓋e1a2微型蛋白多肽由標準方法合成和由高壓液相色譜(HPLC)純化。在實驗中所使用的是高計分結合肽(AFHGDAEAL，SEQ ID NO5，看作為e1a2肽)和低計分結合肽(HGDAEALQR，SEQ ID NO6，看作為肽8)。肽K(ATGFKQSSK，SEQ ID NO7)與H-2Kd不結合而用作為控制肽。
以下的表I說明用肽結合預測程序來搜索HLA-肽基序的結果，以及所用的使用參數計分在500之上被認為非常高計分的結合。
表1

遺傳修飾DCs
基於反轉錄病毒來進行基因轉導的系統已被開發了。反轉錄病毒的前病毒經處理而除去所有的gag、pol和env基因，僅保留下3′-和5′-LTRs。有缺陷的反轉錄病毒載體可從包裝細胞系的上清液中獲得。
在本發明中，反轉錄病毒載體(參見圖5)，(從MFG-mGMCSF包裝細胞系中獲得(Dr.Richard Mulligan饋贈，Children’s Hospital，Harvard Medical School，USA))和Moloney小鼠白血病病毒載體(MoMLV)，(PG1a.muCD40L(Dr.M.Brenner饋贈，Baylor College ofMedicine，USA))用於修飾DCs。
本發明所使用的DCs被修飾後釋放GM-CSF或在其細胞表面表達CD40L分子。使用muCD40L或MFG-mGMCSF反轉錄病毒載體將CD40L基因或GM-CSF轉入DCs。本發明所使用的DCs被修飾後釋放GM-CSF或在其細胞表面表達CD40L分子。在凝聚胺(polybrene)(10μg/ml，Sigma)存在下，D2SC/wt細胞由重複性的自旋離心來轉導。簡言之，105個細胞懸浮在0.5ml病毒上層清液和凝聚胺中，細胞和病毒共離心，10000rpm，在室溫下進行60分鐘。離心後，上層清液被除去並將細胞懸浮在新的培養液中，細胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的溼潤空氣中，24小時後再進行第二次轉導。DCs轉導效率因重複的離心而明顯提高。多輪的轉導後，表達CD40L分子的細胞的相應百分比在圖6中說明。
在重複轉導後，約70-80％的DCs表達CD40L轉基因。D2SC/CD40L細胞進一步由轉基因的表達而被篩選。並且大約96％的DCs表達CD40L基因產物。CD40L基因表達多年保持穩定，且即使在重複性解凍-結冰操作後依然穩定。DCs在它們的細胞表面明確表達了CD40L。看下面的圖6。
根據廠商的說明書(CytoscreenTM，immuneassay kit，Biosource Int.，California，USA，BD Bioscience，U.S.A)，由ELISA方法來評估在D2SC/wt以及CD40L和GM-CSF基因轉導後的DCs細胞培養上清液中IL-12、GM-CSF、IFN-γ的產生。在D2SC/GM-CSF細胞細胞培養上清液中GM-CSF分泌是11，370pg/ml/106細胞/24小時。
D2SC/wt和基因修飾的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF DCs腫瘤細胞的免疫表型特性描述細胞與小鼠抗表面分子的單克隆抗體一起培養(2×105細胞/0.5μg mAbs，BD，Pharmingen，San Diego，CA)。以下的mAbs被使用了CD40-FITC(異硫氰酸螢光素共軛的mAB)，CD40L-PE(巰基化藻紅蛋白)，I-A-FITC，H-2Kd-FITC，B7.1-FITC，B7.2-PE，CD 11c-FITC，CD8α-PE，B220-FTIC，B220-PE，Thy1.2-FITC，Thy1.1-PE，IgG1-FITC，IgG2-PE。細胞表型在FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析。
腫瘤細胞的免疫表型(BM185/wt)在圖7A中說明。BM185細胞在它們的細胞表面表達B220，CD19和MHC-I，I-A分子。但是，BM185wt細胞缺乏共刺激分子和CD40分子的表達(數據未顯示)。
B220分子在D2SC/wt細胞的表達在圖7B中可見。因此D2SC/wt細胞表達標記物(markers)，CD8a+，CD11c+(見圖8)；B220+，被視為小鼠DCs子類型，血漿細胞狀樹突狀細胞(pDCs)的典型標誌。
親代的D2SC/wt細胞和基因修飾的樹突狀細胞免疫表型(D2SC/CD40L)的比較及其說明可見圖8。親代的D2SC/wt細胞具有發育未全的DC表型和在它們的細胞表面表達MHC-1，I-A，CD8α、CD11.c、B7.1和B7.2，正如圖所示，但是缺乏CD40配體的表達。與之相比，在D2SC/CD40L細胞裡CD40L是明確表達了。但是，在D2SC/CD40L細胞培養液中IL-12的分泌未查出。D2SC/CD40L細胞體外(inv itro)成長動力學與它們的親代細胞相似(數據未顯示)。
蛋白質印跡法(Western Blot)根據製造商的說明書(Sigma)，DCs被溶解在緩衝液裡，含有1％NP40、0.1％SDS、TBS和蛋白酶抑制劑的混合劑(cocktail)中。在4℃下，細胞在緩衝液中用超聲波處理。在經過5000rpm、5分鐘、4℃離心後，收集可溶蛋白質並用蛋白質印跡法來分析。根據製造商的說明書(BioRad，USA，Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)，蛋白質在12％SDS聚丙烯醯胺凝體中分離並轉移在PVDF濾紙上。初級的多克隆抗體，兔抗小鼠TLR9(Cat.No IMG-431，Imgenex，San Diago，USA)，在TBS緩衝中1∶1000稀釋後用(10mM Tris-Cl and 150mM NaCl，pH 8.0)。次級抗體是與辣根過氧化物酶(HRP)共軛的羊抗兔抗體。在圖9中說明本發明中的DCs表達小鼠TLR9受體。
D2SC/wt細胞是從脾臟中分離出的功能完全而發育未成熟的樹突狀細胞。D2SC/wt細胞表達一些熟知的標記物，比如在一種DCs亞類即pDCs上發現的CD11c+，B220+，CD8α+，MHC-IIlow，TLR9+標記。另外，當與病毒、細菌和CpG DNA相互作用時，D2SC/wt細胞釋放很多I型幹擾素-α和幹擾素-β。由在原位雜交研究可檢查出D2SC/wt細胞表達極高拷貝數目的I型幹擾素mRNA(Scand.J.Immunol.1997，46235-41；ElorantaML.，et al unpublished data)，從而得出D2SC/wt細胞是在小鼠中相當於假定的人體自然幹擾素產生細胞而且是樹突狀細胞的一種pDC/IPCs子類的結論。
質粒DNA載體最近的研究表明，空的質粒pcDNA3載體骨架包含一定數量的非甲基化的CpG基序。(Science 1996，273352-354)通過豬的白細胞和質粒pcDNA3的孵育，在豬的白細胞中誘導高水平的幹擾素-α和IL-6的產生。使pcDNA3的CpG二核苷酸上所有胞苷甲基化，則廢除了誘導幹擾素-α產生的能力(Vet Immunol Immunopathol.200，7845-56)。
pVAX-1是根據FDA的推薦而從pcDNA3.1載體修改而構建的(Invitrogen，CA，USA)。pVAX-1是一個3.0kb的質粒載體，為開發人的癌症疫苗而設計。
克隆編碼e1a2融合肽的微基因進入含有CpG基序的質粒載體為放大核苷酸序列而設計PCR引物，該核苷酸序列編碼預定的與MHC-I類型結合的e1a2融合肽。微基因的生產以補平反應開始(Pharmacia)，使用了以下重疊的引物5』-TGCTAGCATGATCTGGCCCAACGACGGCGAGGGCGCCTTCCACGGCGACGCCGAGGCCCTGCAGCGC-3』(見SEQ ID NO1)和5』-AATCGATCACAGGCCCTGGGGCTCGAAGTCGCTGGCCACGGGGCGCTGCAGGGC-3』(參見SEQ ID NO2)。根據製造商的推薦，除上述兩引物外，反應混合物包括Klenow片段(大腸桿菌DNA聚合酶I)、dNTPs和酶緩衝液。反應在室溫下進行1小時，接著使用同樣引物進行PCR反應，加入PCR緩衝液、Taq DNA聚合酶、dNTPs，操作為95℃、1分鐘，隨後35個周期，每個周期為95℃、30秒，65℃、30秒和72℃、30秒。獲得的PCR片段被分離和最初地被克隆進入pUC19質粒載體的Nhe I/Cla I位置(NewEngland BioLabs)。Nhe I/Cla I片段然後被插入pBK-CMV質粒載體(Stratagene)。在pBK-CMV含e1a2融合微基因的Nhe I/Kpn I片段最後被克隆入pVAX-1質粒載體(Invitrogen，CA，USA)的Nhe1和Kpn1位置。一旦插入載體，e1a2融合微基因置於CMV啟動子的控制下。pVAX-e1a2結構由DNA消化和DNA測序所證實。根據製造商的說明書，用Qiagen EndoFree Plasmid Maga Maga kit放大質粒(Qiagen，Santas Clarita，CA，USA)。質粒DNA純度由UV分光光度測定法和agarose膠凝電泳法來確定。純化的DNA以OD 260nm/OD 280nm吸收比率大於1.9是可用的。
空的pVAX-1載體和含編碼微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列的載體pVAX-e1a2的圖見圖10。微型e1a2融合基因序列和對應的多胺基酸序列被分別顯示在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
由一個體外轉錄聯結翻譯的分析法(TNT，Promega)測試pVAX-e1a2質粒結構所生產的產物大小。約1μg質粒DNA以50μl體積孵育2小時，30℃，該混合物包含25μl兔網狀細胞溶解物、2μl TNT反應緩衝液、1μl TNT T7RNA聚合酶，1μl的1mM胺基酸減去甲硫氨酸的混合物，4μl(35S)甲硫氨酸10mCi/ml和1μl的40U/μl的RNA RNAasin核醣核酸抑制劑。取3μl容量的反應物裝載於16％SDS聚丙烯醯胺膠凝上。在烘乾以後，膠凝體暴露於放射自顯影的照片。結果在圖10表明，e1a2融合蛋白只出現於pVAX-e1a2而不出現於空的pVAX-1。另外，用Lipofectin試劑轉染後，pVAX-e1a2轉錄在COS-7細胞系被檢測到(數據未顯示)。總之，pVAX-e1a2質粒DNA，含96bp核苷酸序列跨過e1a2基因的融合區域，被轉錄和表達在轉染的細胞中。
幼稚T細胞的激活從脾臟製備單細胞的懸浮液。從BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠脾臟分離T細胞。從C57BL/6J小鼠脾臟用Percoll梯度所富集的T細胞作為同種異體T細胞的來源。根據製造廠家的說明書，從BALB/c小鼠使用MACS CD4或CD8 microBeads來分離純化CD4+或CD8+T細胞(Miltenyi Biotec，Germany)。刺激者(DCs)在輻射(50Gy，從137Cs)後用分級的量添加進人反應細胞(脾臟細胞或T細胞，2×105細胞/孔)在96-孔園底的微板上執行(Becton，Dickinson)。實驗一式三份執行在最終容量為200μl/well。增殖化的測量由在第三天加入[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷(1μCi/孔)(Amersham International，Amersham，UK)，培養6小時，隨後收穫到glass-fibre濾紙和放入閃爍計數器(Beta counter，Pharmacia)來執行。
基因修飾引發了未成熟的DCs刺激T細胞的能力作為一種未成熟的DCs，非修飾D2SC/wt細胞是差的T細胞刺激者。因此，比較了D2SC/wt和D2SC/CD40L刺激天然的同種異體T細胞增殖的能力。在圖11A說明，與非修飾親代DCs(D2SC/wt)比較，CD40L基因修飾的DCs(D2SC/CD40L)刺激同種異源T細胞增殖是高8倍。
D2SC/wt與D2SC/CD40L誘導天然的自體同源T細胞增殖的能力進行了比較。在圖11B說明，與非修飾親代DCs(D2SC/wt)比較，CD40L基因修飾的DCs(D2SC/CD40L)刺激自身的T細胞增殖是高4倍。DCs被修飾而釋放GM-CSF(D2SC/GM-CSF)也可導致強的自體同源和自身T細胞增殖(數據未顯示)。因此，在DCs上CD40配體表達是具有功能活躍的和參與了T細胞的刺激。明顯地，D2SC/CD40L細胞可獲取了在體內注射後直接敏化自身T細胞的能力。在皮膚下注射後，發現DCs遷移入脾臟和淋巴結(數據未顯示)。
腫瘤抗原的製備自體的腫瘤溶胞產物是從BM185/wt細胞製備來的。腫瘤細胞被幾次重複性結冰(液氮)-解凍(37C熱水浴)的周期處理。腫瘤細胞裂解物進一步被超聲波處理4℃30分鐘。細胞殘骸用2500rpm，10分鐘，4℃離心法去掉。收集可溶性蛋白並且由Bradford方法確定蛋白質含量(Protein Assay，Bio-Rad，CA，U.S.A)。
用腫瘤抗原或腫瘤抗原肽來脈衝DCsDCs和腫瘤細胞裂解物(100μg/106 cells)在37℃，7％二氧化碳中預先孵育過夜。用PBS/5mM EDTA將DCs是從培養瓶分開並在注入小鼠之前仔細地洗滌。在肽脈衝實驗中，106細胞與10μM肽在未含FCS培養液，37℃，5％二氧化碳中脈衝2小時。
用疫苗組分免疫雌性BALB/c小鼠(H-2d)，年齡6-8星期，購自MB(丹麥)，並且養在Uppsala大學標準條件的動物所內。所有動物實驗按照動物護養委員會的要求執行(ref.nr.C63/97，C36/1)。
在致瘤性研究上，免疫活性的同源小鼠可實行皮下注射(s.c)增長劑量的BM185/wt細胞。在6-8星期老年小鼠上注射500個腫瘤細胞，在3-4星期內導致100％死亡(參見上面的圖14)。注射用致死量(800個腫瘤細胞/小鼠)通常為目前的研究所採用。
尋找有效的消除腫瘤派生所需基因修飾的DCs最小劑量。在免疫前用腫瘤細胞裂解物隔夜裝載DCs。用106D2SC/CD40L細胞單一接種發現有效治療長有腫瘤的小鼠，見圖12.A。
長有腫瘤的小鼠被治療一次(在腫瘤點或在一個遠位置)用腫瘤細胞裂解物脈衝D2SC/CD40L(p＜0.001)或D2SC/GM-CSF細胞(p＜0.001)。用CD40L或GM-CSF基因修飾的DCs免疫誘導有效的抗腫瘤免疫反應。在圖12B顯示，單一接種已能充分根除已存在腫瘤細胞並且所有被治療的小鼠腫瘤消除(100％)。本結果代表四個重複的實驗當中一個。
誘導的抗腫瘤免疫反應與在體內同產生腫瘤特異性細胞毒素的T細胞(CTLs)聯繫在一起的。在體外增生的CTLs專殺親代BM185腫瘤細胞(圖13A)，但不殺同源的A20腫瘤細胞系(圖13B)。
這些研究表明，在長有腫瘤小鼠上，遺傳修飾的DCs、D2SC/CD40L細胞具有刺激有效的治療免疫反應的能力。
圖14中說明本發明使用的用於治療和預防接種的長有腫瘤小鼠模型例子。
質粒DNA和DCs的預孵育為了提高質粒對DCs的結合和促進質粒DNA內吞入DCs，發展了共離心法。簡言之，在細胞培養瓶裡，基因修飾的DCs生長在適合的密度，用PBS/5mM EDTA解離37℃20分鐘。收集DCs和用PBS(未含Ca+，Mg+)洗滌並且懸浮在PBS中。質粒DNA(1mg/ml)加到107DCs/ml。它們被共離心，10000rpm，室溫30分鐘。在離心後注射小鼠之前，質粒DNA/DCs混合物被孵育額外的3小時，在37℃、7％二氧化碳中。
CTL分析在接種治療後，為了調查細胞毒T細胞(CTLs)在體內的發展，從正常或接種的小鼠中分離脾臟和淋巴結(LN)。純化T細胞由Percoll梯度方法或根據製造廠說明書的磁性活化細胞分選法(Miltenyi Biotec，Germany)用MACS CD4或CD8 MicroBeads來分離。在加有rhIL-2(10ng/ml)下用BM185/wt(200Gy，137Csγ--輻射)或BM185/CD40L(200Gy)再刺激T細胞5-7天。在常規4小時51Cr釋發細胞毒分析，死細胞被去除而活細胞被用為效應器。簡言之，靶細胞先被51Cr標明(25μCi/106細胞)在37℃為2小時。活效應細胞與預先標記的目標細胞在不同的效應細胞-目標細胞(effector-to-target)比率下孵育了4個小時。由51Cr釋放入培養液來測量細胞溶解，該結果代表三份重複樣品。
根據以下公式計算特異性溶解的百分比
伴刀豆凝集素A(Con A)激活的T胚細胞在對照實驗中，從正常小鼠分離的脾臟細胞以2×106細胞/ml孵育48小時，在RPMI1640培養基中含有青黴素/鏈黴素，10％FCS，10mM Hepes，3×10-5M 2-巰基乙醇和3μg/ml ConA(Sigma)。Con A激活的T胚細胞用為抗腫瘤細胞的效應細胞(負對照)。
統計分析所有動物實驗以每組至少有五個或十個動物。所有的研究被重複了至少三次得以近似結果。分析生存區別是以卡方檢驗(Chi-square test)來解釋實驗小組之間區別的意義。
DNA和DCs接種效率的調查在0天，各只小鼠右側面(5小鼠/組)皮膚下注入有致死劑量的親代BM185/wt腫瘤細胞。在7、14和21天，在小鼠腫瘤點免疫接種了(1)PBS；(2)空的pVAX-1載體(100μg/小鼠)；(3)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(4)D2SC/CD40L單獨沒有抗原；(5)經預先孵育的pVAX-e1a2質粒DNA和D2SC/CD40L細胞(106細胞/100μg質粒DNA/小鼠)。腫瘤大小每星期檢測兩次。當腫瘤檢測到時，認為小鼠是在生存終點和被犧牲了。
儘管在質粒載體的骨架裡含有可能免疫刺激的CpG基序，單獨用空的pVAX-1載體或pVAX-e1a2載體治療長有腫瘤的小鼠，結果沒有消除已存在的腫瘤。在沒有腫瘤抗原的情況下，用D2SC/CD40L細胞治療長有腫瘤的小鼠，結果沒有消除腫瘤。相反，共同送遞pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細胞表現出優越的抗腫瘤效果。以pVAX-e1a2和D2SC/CD40L細胞接種導致100％高效率消除在所有被治療的小鼠原有的腫瘤細胞(p＜0.01)。
進一步調查所誘導的抗腫瘤免疫應答保護小鼠免受親代腫瘤細胞再挑戰的能力。最後接種以後的一個星期，在一個遠點位置將致死劑量的親代腫瘤細胞注入腫瘤已消除的小鼠。圖15顯示，用pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細胞多次性的治療長有腫瘤的小鼠，結果發展了高效率的抗腫瘤免疫應答足以保護小鼠免受腫瘤細胞再挑戰，大約80％小鼠被保護了並且保持無腫瘤存在(結果代表三個重複實驗當中的一個)。
用本發明疫苗免疫接種、pVAX-e1a2和DC/CD40L引起在體內產生可殺死腫瘤細胞的腫瘤特異性的T細胞。分析從腫瘤已消除的小鼠上分離的T細胞。體外培養的CTLs特異地殺死親代BM185腫瘤細胞。這些腫瘤特異性的CTLs只識別e1a2肽，但不識別裝載RAM-s細胞的與MHC低親合力結合的肽8，(圖16)。
比較不同接種的組成本發明的疫苗組分的效力將與其它接種方法比較，治療長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠並且保護小鼠對抗親代腫瘤細胞的再挑戰。在0天，小鼠右側面(5小鼠/組)皮膚下注入有致死劑量的親代活BM185/wt腫瘤細胞。在7、14和21天，在腫瘤位置為小鼠免疫接種(a)PBS；(b)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(c)e1a2肽(AFHGDAEAL，10mM/小鼠，SEQ ID NO5)；(d)D2SC/wt細胞與e1a2肽脈衝(106細胞/10μM/小鼠)；(e)D2SC/CD40L細胞與e1a2肽脈衝(106細胞/10μM/小鼠)；(f)D2SC/CD40L細胞與低結合的MHC肽脈衝(HGDAEALQR，106細胞/10μM/小鼠)；(g)D2SC/CD40L細胞與從BM185細胞獲得的腫瘤溶解物脈衝；(h)預先孵育的D2SC/CD40L細胞和pVAX-e1a2質粒DNA(106細胞/100μg/小鼠)。在免疫保護研究上，在最後接種以後的一個星期，用有致死劑量的親代的活BM185wt腫瘤細胞在腫瘤已消除的小鼠的左側面再挑戰。腫瘤大小每星期檢測兩次。當腫瘤可檢測到時，認為小鼠是在生存終點和被犧牲了。實驗被重複了三次並且結果代表這些實驗當中的一個。
本發明的疫苗組分(預先孵育的D2SC/CD40L細胞和pVAX-e1a2質粒DNA，填裝圓點)是最有效的消除原有的腫瘤治療方法(p＜0.01)，所有被治療的小鼠不存在腫瘤(100％)。調查了由接種引起的保護宿主免受腫瘤攻擊的免疫應答的效力和容量。在一個遠點位置將有致死劑量的親代活腫瘤細胞注入腫瘤已消除的小鼠。用pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細胞多次性的治療長有腫瘤的小鼠，結果發展了高效率的抗腫瘤免疫應答足以保護小鼠免受腫瘤，約80％小鼠被保護了並且在腫瘤細胞再挑戰之後保持幾個月無腫瘤存在(p＜0.01)，參見圖17。
與以前的研究一致，接種用pVAX-e1a2，或e1a2肽，或D2SC/CD40L細胞，與肽脈衝，對MHC-I有低親合力，不能根除小鼠的腫瘤。
D2SC/CD40L細胞與MHC-I類結合肽脈衝明顯地提高了腫瘤抗原呈遞。用裝載了e1a2肽的D2SC/CD40L治療長有腫瘤的小鼠結果引導了抗腫瘤免疫，但是，這個方法與用本發明的疫苗治療長腫瘤的小鼠的方法比較有低於2倍的效率。
本疫苗組分pVAX-e1a2和DC/CD40L的優越效力，也強調了本疫苗組分的關鍵元素。除抗原之外，pVAX-e1a2質粒DNA包含CpG基序。CpG基序已知可通過TLR9途徑刺激和激活DCs，結果產生I型幹擾素。D2SC/wt和D2SC/CD40L細胞被發現含有TLR9。而且早期的研究表示，在受病毒和細菌刺激以後，D2SC/wt細胞釋放I型幹擾素-α和幹擾素-β。
因此，與用注入D2SC/CD40L細胞與腫瘤抗原肽脈衝方法比較，用本疫苗組分治療長有腫瘤的小鼠，有體內有產生I型幹擾素以及質粒骨架裡的CpG-基序刺激免疫反應的可能性，貢獻出優越效應(圖17)。
在用不同接種方案之後引發腫瘤特異性的和腫瘤抗原肽特異性的CTLs用本發明疫苗免疫接種在體內引起可殺死腫瘤細胞的腫瘤特異性的和e1a2肽特異性的T細胞。為T細胞的體外刺激，Cs或腫瘤細胞先與e1a2肽脈衝然後幅射而作為刺激者。T細胞從腫瘤挑戰後無腫瘤小鼠上分離出來，T細胞與這些DCs或腫瘤細胞共刺激七到十天。收集細胞培養上清液並存放於-80℃，用於分析細胞因子的分泌。活細胞(80％CD8+T細胞)用作CTL檢測中的效應細胞。
測試在體外形成的CTLs溶解腫瘤細胞的能力。治療長腫瘤的小鼠(a)PBs；(b)e1a2肽；(c)pVAX-e1a2；(d)D2SC/CD40L細胞與e1a2肽脈衝；(e)D2SC/CD40L細胞與腫瘤溶解物脈衝；(f)預先孵育了的D2SC/CD40L細胞和pVAX-e1a2質粒DNA。然後從親代腫瘤細胞攻擊後的小鼠分離T細胞。用被腫瘤抗原(裂解物或e1a2肽)裝載的DC/CD40L或預先孵育了的D2SC/CD40L細胞和pVAX-e1a2質粒治療後，在腫瘤已消除的小鼠激發抗腫瘤免疫(圖18.A)。另外，在CTLs培養上清液(在6天)查出了IFN-的分泌，見表II。
表II

用腫瘤肽和含腫瘤肽的質粒治療小鼠，未導致腫瘤特異的CTLs產生。相反，用pVAX-e1a2質粒DNA載體和DC/CD40L重複接種，導致一個強烈的腫瘤特異的CTL反應，同時導致一個治療效應。
腫瘤特異性的CTLs識別由本發明的疫苗組分呈遞的腫瘤肽調查腫瘤特異性的CTLs殺死肽脈衝的靶細胞的能力。將e1a2肽裝載上TAP缺陷的RMA-S細胞。因RMA-S細胞缺乏裝載它們自己的MHC-I類的能力。因此RAM-S細胞與e1a2肽脈衝後，e1a2肽是存在於細胞表面唯一的肽。用腫瘤抗原(腫瘤溶解物或e1a2肽)裝載DC/CD40L和孵育了的D2SC/CD40L細胞和pVAX-e1a2接種之後，在無腫瘤小鼠上產生的CTLs識別RAM-S細胞呈遞的e1a2肽(圖18B)。腫瘤肽特異性的CTLs不殺死親代RMA-S細胞(沒有裝載肽，數據沒顯示)。結論是，由接種而在體內引起的抗腫瘤免疫是腫瘤抗原特異性的，並且直接對抗親代BM185腫瘤細胞。
接種後引發的e1a2肽特異性的CTLs頻率在rhIL-2(25ng/ml，RD，UK)存在的情況下擴展e1a2肽特異性的CTLs，通過將純化的T細胞(含90％CD8+細胞和10％CD4+細胞)與e1a2肽脈衝過的D2SC/CD40L細胞(50Gy)共刺激。在七天刺激以後，約85％T細胞是CD8+T細胞(圖19)。
運用DimerX肽呈遞方法(BD Bioscience，U.S.A)去研究體外腫瘤肽，e1a2肽特異性的CTLs頻率。簡言之，H-2Ld:Ig與肽(e1a2肽或肽8)混合在160摩爾過量在37℃隔夜培養。CD8+T細胞懸浮在106細胞/50μl中。從肽裝載H-2Ld:Ig蛋白複合物中取2μg加入到T細胞中，在4℃孵育60分鐘。使用PE共軛的大鼠抗小鼠IgG1抗體和用流式細胞儀檢測結合的蛋白複合物。
識別腫瘤細胞和e1a2肽脈衝的目標細胞的e1a2肽特異性的CD8+T細胞顯示與e1a2肽裝載的H-2Ld:Ig複合體的結合(圖20)。與CTL測定分析相一致，與單獨用pVAX-e1a2接種相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治療小鼠引發8倍以上e1a2肽特異性的CTLs產生。與用e1a2肽裝載的DC/CD40L接種相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治療小鼠引發2倍以上e1a2肽特異性的CTLs產生。
總之，這裡提出一個新穎的提高抵抗已存在的bcr/abl腫瘤的抗腫瘤免疫疫苗組成和接種方法。
在這個方案中使用DCs遺傳性修飾DCs子類，pDCs/IPCs，和含有編碼e1a2腫瘤特異肽基因和CpG的質粒載體。用DC/CD40L和含CpG基序的pVAX-e1a2質粒重複的接種去治療長腫瘤的小鼠引發出腫瘤特異性的和e1a2肽特異性的T細胞應答。
它進一步展示，通過CTL檢測和在這些T細胞表面間接性免疫螢光染色e1a2肽鑑別。e1a2肽特異性的CTLs在體內被誘導了。明顯地接種誘導了能識別瘤細胞和在原位殺死它們的e1a2肽特異性的T細胞。新引發的e1a2肽特異性的T細胞，可在保護宿主對抗親代腫瘤再挑戰扮演重要角色。本發明的疫苗組分有效的消除原有的bcr/abl陽性腫瘤和保護動物抵抗親代腫瘤的攻擊。因此，本發明的疫苗組分很好應用於對費城染色體陽性腫瘤的治療和藥物組成。
為疫苗組分建議的機理根據本發明的實驗結果和由其他人在腫瘤免疫學領域的研究，下面和圖21顯示貢獻於本發明成功的可能性機理和關鍵因素提出的假設。
在強迫以後，編碼腫瘤肽(CpG-DNA-e1a2)的質粒DNA與DCs結合。大多數CpG-DNA-e1a2質粒DNA被內吞和隨後肽呈遞在MHC分子上。在質粒DNA上的CpG基序結合到TLR9和激活DCs內的toll-like受體途徑。
TLR9途徑的激活可導致I型幹擾素-α和幹擾素-β的分泌。這事件可發生在CpG-DNA-e1a2與DCs的孵育期間。因此，在預先孵育時，提前、同時和/或之後，更好由共離心的方法來提高質粒DNA對DCs的結合。DCs細胞經遺傳修改後表達CD40L。因此DCs表達B7和CD40L，兩個最重要的T細胞活化信號。在CD40L、B7和I型幹擾素的存在下，基因修飾的DCs對免疫細胞，比如幼稚T細胞呈遞腫瘤肽並且通過CD40-CD40L互作用，激活幼稚DCs。在體內，DCs可攝入未結合的抗原/或CpG-DNA-e1a2的產物。
兩類型樹突狀細胞、pDCs/IPCs/CD40L/B7和被激活的DCs裝載腫瘤抗原遷移到淋巴組織並且激活免疫細胞包括幼稚T細胞、B細胞和DCs.交叉敏化和直接引發宿主的免疫系統可在同樣的組織同時發生。可產生細胞因子，比如IL12，IL15，IFN-γ，I型TNF-α和其它Th1細胞因子。CD40L修飾pDCs，表達B7分子，可能直接對幼稚CD8+T細胞呈遞腫瘤肽和激活腫瘤特異性的CTLs，因此獲得一個更快速、增強的和更高效率的治療和保護性免疫應答。用本發明免疫接種最後的結果是引發e1a2特異性的CTLs和消除已存在的腫瘤。在體內誘發的抗腫瘤的免疫性保護宿主對抗免腫瘤攻擊。
因此，我們新穎的疫苗戰略強調激活先天免疫和適應性免疫的獨特組合。這個新穎的疫苗組分適用於為了治療或防治人和動物的疾病而設計藥物疫苗組分用。它將由本領域人士了解，對本發明所作的各種各樣的修改和變動沒有超出所附加的權利要求的定義範圍。
序列表110黃冉陽120核酸和細胞疫苗的組分130P366PC00150SE 0301109-51512003-04-141607170PatentIn version 3.1210121167212DNA213人工序列220
223合成引物4001tgctagcatg atctggccca acgacggcga gggcgccttc cacggcgacg ccgaggccct60gcagcgc 67210221154212DNA213人工序列220
223合成引物
4002aatcgatcac aggccctggg gctcgaagtc gctggccacg gggcgctgca gggc 54210321196212DNA213人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)..(96)223
4003atg atc tgg ccc aac gac ggc gag ggc gcc ttc cac ggc gac gcc gag48Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu1 5 10 15gcc ctg cag cgc ccc gtg gcc agc gac ttc gag ccc cag ggc ctg tga96Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu20 25 30210421131212PRT213人(Homo sapiens)4004Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu1 5 10 15Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu20 25 30
21052119212PRT213人(Homo sapiens)4005Ala Phe His Gly Asp Ala Glu Ala Leu1 521062119212PRT213人工序列220
223對鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)低結合的合成多肽4006His Gly Asp Ala Glu Ala Leu Gln Arg1 521072119212PRT213人工序列220
223對鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)不結合的合成多肽4007Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys1 權利要求
1.核酸疫苗組分，包含-編碼抗原的核苷酸序列；和-修飾的表達免疫應答調控分子的抗原呈遞細胞。
2.核酸疫苗組分包含-編碼抗原的核苷酸序列；和-修飾的表達細胞生存調控分子的抗原呈遞細胞。
3.根據權利要求2所述的疫苗組分，其特徵在於所述的細胞生存調控分子是凋亡誘導分子。
4.根據權利要求1至3之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的疫苗組分為所述的核苷酸序列與所述的修飾的抗原呈遞細胞的混合物。
5.根據權利要求4所述的疫苗組分，其特徵在於所述的疫苗組分為所述的核苷酸序列與所述的修飾的抗原呈遞細胞的一個預先孵育的混合物。
6.根據權利要求1或5所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞是專職性抗原呈遞細胞。
7.根據權利要求所述的疫苗組分，其特徵在於所述的專職性抗原呈遞細胞是樹突狀細胞。
8.根據權利要求7所述的疫苗組分，其特徵在於所述的樹突狀細胞是高效率的抗原處理和抗原呈遞細胞。
9.根據權利要求7或8所述的疫苗組分，其特徵在於所述的樹突狀細胞是血漿細胞狀樹突狀細胞。
10.根據權利要求1到9之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞是與表達CD8α、B220、CD11C和B7分子的小鼠樹突狀細胞子類相當的人樹突狀細胞子類。
11.根據權利要求1到10之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞表達Toll-like受體9。
12.根據權利要求1到11之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞表達P2X7。
13.根據權利要求1到12之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞可誘導產生I型α幹擾素和/或β幹擾素。
14.根據權利要求13所述的疫苗組分，其特徵在於當與微生物相互作用時，誘導所述的抗原呈遞細胞產生I型α幹擾素和/或β幹擾素。
15.根據權利要求1到14之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞作為對象的先天性和適應性免疫應答的連接。
16.根據權利要求1到5之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞至少選自以下之一-樹突狀細胞；-血漿細胞狀樹突狀細胞；-幹擾素生產細胞；-天然幹擾素產生細胞；-單核細胞；-巨噬細胞；-骨髓細胞；-幹細胞分化的細胞-B細胞；-T細胞；和-肥大細胞。
17.根據權利要求1所述的疫苗組分，其特徵在於所述的免疫應答調控分子由轉入所述的抗原呈遞細胞的核苷酸序列編碼，該基因序列至少選自下列之一-細胞因子基因；-白介素基因；-粘附分子基因；-幹擾素基因；-趨化因子基因和趨化因子受體基因。
18.根據權利要求17所述的疫苗組分，其特徵在於所述的免疫反應調控分子選自CD40配體和GM-CSF。
19.根據權利要求2或3所述的疫苗組分，其特徵在於所述的細胞生存調控分子由轉入所述的抗原呈遞細胞的核苷酸序列編碼，該基因序列至少選自下列之一-抗凋亡基因；和-凋亡誘導基因。
20.根據權利要求1到19之一所述的疫苗組分，其特徵在於含所述的核苷酸序列的載體至少選自下列之一-病毒載體；-非病毒載體；-質粒；-微生物載體；-脂質體；-小分子載體。
21.根據權利要求20所述的疫苗組分，其特徵在於所述的載體包含免疫應答調控核苷酸序列。
22.根據權利要求21所述的疫苗組分，其特徵在於所述的免疫應答調控核苷酸序列是未甲基化的胞苷磷酸鳥苷(CpG)序列。
23.根據權利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的抗原包含胺基酸序列為SEQ ID NO5的e1a2融合多肽。
24.根據權利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的核苷酸序列包含微型e1a2融合基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO3。
25.根據權利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特徵在於所述的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO4的微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列。
26.生產核苷酸和細胞疫苗組分的方法，包含以下步驟-提供編碼抗原的核苷酸序列；-提供修飾的表達免疫應答調控分子的抗原呈遞細胞；以及-混合所述的編碼抗原的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細胞。
27.根據權利要求26所述的方法，其特徵在於還包含孵育所述的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細胞以增強其結合的步驟。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其特徵在於所述的提供核苷酸序列的步驟包括-提供MHC結合的抗原蛋白或多肽；-克隆編碼所述的抗原蛋白或抗原多肽的核苷酸序列進人所述的載體；以及-在擴增系統中擴增所述的載體。
29.根據權利要求26至28之一所述的方法，其特徵在於所述的提供抗原呈遞細胞的步驟包括-從對象分離所述的抗原呈遞細胞；以及-改造抗原呈遞細胞至可表達所述的免疫應答調控分子。
30.根據權利要求29所述的方法，其特徵在於所述的分離步驟包括分離表達Toll-like受體9和能生產α幹擾素和/或β幹擾素的樹突狀細胞子類。
31.根據權利要求30所述的方法，其特徵在於所述的樹突狀細胞子類在對象中充當先天性和獲得性免疫應答的重要角色。
32.根據權利要求30或31所述的方法，其特徵在於所述的樹突狀細胞子類是血漿細胞狀樹突狀細胞。
33.根據權利要求1或2的疫苗組分作為藥物的用途。
34.根據權利要求1或2的疫苗組分用於製備治療或防治傳染病的藥物的用途，其特徵在於所述的核苷酸序列編碼在所述疾病中的與傳染物質相關的抗原。
35.根據權利要求1或2的疫苗組分用於製備治療或防治癌症的藥物的用途，其特徵在於所述的核苷酸序列編碼在癌症中表達的腫瘤相關抗原。
36.誘導免疫應答的方法，包括對對象引入根據權利要求1或2所述的疫苗組分的步驟。
37.對對象治療或防治疾病的方法，包括對對象引入根據權利要求1或2所述的疫苗組分的步驟，所述的抗原是與所述疾病的致病物質相關的抗原。
38.根據權利要求36或37所述的方法，其特徵在於所述的抗原呈遞細胞適合於呈遞至少一個所述抗原的片段到對象的免疫系統的細胞。
39.根據權利要求36到38之一所述的方法，其特徵在於所述的對象是哺乳動物。
40.根據權利要求39所述的方法，其特徵在於所述的哺乳動物是人類。
41.根據權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述的疾病至少選自下列之一-傳染病；-癌症；-白血病；-淋巴瘤；-自身免疫疾病/紊亂-炎症；-血液疾病；-過敏；-遺傳性疾病；-移植所需疾病；和-糖尿病。
42.試劑盒，包括-編碼抗原的核苷酸序列；與-修飾的表達免疫應答調控分子的抗原呈遞細胞。
43.根據權利要求42所述的試劑盒，其特徵在於所述的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細胞為混合物。
全文摘要
本發明涉及核酸和細胞的疫苗組分和藥物組分的一個新穎的組合以及其用於治療和/或防治包括傳染病、癌症、自身免疫性疾病、過敏、糖尿病和血液病等疾病的用途。疫苗組分包含編碼抗原分子的核酸序列和基因修飾的抗原呈遞細胞(APCs)，更好的方式為相互混合物。APCs被修飾為可表達免疫調控分子。用本發明的疫苗組分對對象免疫接種，導致宿主免疫系統應答和引發起高效率的免疫性對抗已存在的疾病或保護宿主對抗疾病。
文檔編號A61K39/00GK1805758SQ200480016461
公開日2006年7月19日 申請日期2004年4月14日 優先權日2003年4月14日
發明者黃冉陽 申請人:黃冉陽