微生物發酵生產豆豉溶栓酶的方法

2023-12-09 21:49:51

專利名稱：微生物發酵生產豆豉溶栓酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種豆豉溶栓酶微生物發酵生產方法。該方法生產的低溫豆豉溶栓酶在溶解血栓、激活體內纖溶酶原方面有獨特優勢，可以廣泛應用於溶栓藥物和溶栓保健品的生產。
背景技術：
豆豉溶栓酶(Nattokinase，簡稱NK)是一種鹼性絲氨酸蛋白酶，無毒性，可口服(李江偉等，中國藥學雜誌，1999)，易被人體吸收，能直接溶解纖維蛋白，具有強烈溶栓功能(郝徵紅等，農業工程學報，2008 ;彭勇等，高技術通訊，2002)，且溶栓作用時間長，作為新一代理想的預防和治療血栓的生化藥物，具有廣闊的應用前景(陶琳，胺基酸和生物資源，2004)。早期臨床上應用最多的溶栓劑是鏈激酶、尿激酶等，雖可以促進血液中血纖維蛋白溶酶的形成或可以直接對血栓進行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性強、副作用較大等，很難成為一種大眾藥品(盧露，中國調味品，2011)。國內外關於微生物發酵NK研究處於起步階段，我國主要集中在菌株選育、發酵條件優化、酶學性質，酶分離純化以及工程菌構建等(陶琳，胺基酸和生物資源，2004 ;豆孝偉，現代食品科技，2006)。微生物發酵生產NK產業化，規模化生產及作為口服溶栓劑應用還未見報導。微生物發酵生產的NK具有安全性好、不會引起免疫反應、作用迅速、持久、成本低、口服亦有效的優點，彌補了臨床溶栓藥物的不足。本發明微生物發酵生產NK可以形成一定規模化，生產周期短，成本低，產量高，促使快速治癒腦血栓、肺血栓、急性心肌梗塞等血栓性疾病成為可能。微生物發酵NK具有廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產NK的方法。該方法主要是微生物經過產物定向馴化後，在26°C 32°C液體發酵生產NK的方法，這種生產方法獲得的NK粗酶液活性可以達到180U/ml，如再經過系列分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶製劑。當該酶活性為5000U/ml或5000U/mg，口服2000U 4000U每日用量應用於量小鼠實驗，22 37天表現出明顯的溶栓效果。該酶製劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免其它溶栓劑應用的弊端。本發明所述的一種微生物發酵生產NK的方法具體包括以下步驟(I)將產生NK的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(2)按常規方法將NK產生菌在26 32°C逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在26 32°C培養72 144h時，即微生物發酵生產NK結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(3)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。本發明中使用的菌種來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。NK產生菌(例如，CGMCC菌種編號1. 354或I. 769)，菌株先活化、定向馴化後，按本發明產酶條件發酵生產NK。產酶馴化後的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油製成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施方式
/實施例一(I)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水I. 0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種產物定向馴化培養基蛋白腖3.0 7.0g，牛肉膏3.0 7.0g，纖維蛋白10. 0 20. 0g, NaCl 5. 0 15. 0g，瓊脂20g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基胰蛋白腖8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白腖13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3
0.7g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將產生NK的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的NK產生菌在26 32°C培養48 72h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入10L的產酶培養基中，在26 28°C培養120 144h時，即微生物發酵生產NK結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的NK製劑。實施例二 (I)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種產物定向馴化培養基蛋白腖3. 0 7. 0g，牛肉膏3. 0 7. Og,纖維蛋白10.0- 20. 0g，NaCl 5. O 15. Og，瓊脂20g，蒸餾水I. 0L pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液 體種子培養基胰蛋白腖8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白腖13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3
0.7g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將產生NK的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的NK產生菌在26 32°C培養48 72h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養基中，在28 30°C培養96 120h時，即微生物發酵生產NK結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的NK製劑。實施例三(I)培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 2 7. 4，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種產物定向馴化培養基蛋白腖3. 0 7. 0g，牛肉膏3. 0 7. Og,纖維蛋白10. 0 20. 0g, NaCl 5. 0 15. 0g，瓊脂20g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基胰蛋白腖8.0 12. 0g，酵母粉4.0 6. 0g，NaCl 8. 0
10.Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖13. 0 17. 0g，蛋白腖13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. lg, CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3
0.7g,自來水1. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將產生NK的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的NK產生菌在26 32°C培養48 72h而後按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入100L的產酶培養基中，在30 32°C培養72 96h時，即微生物發酵生產NK結束；
(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離 純化，製備成不同活性、純度和劑型的NK製劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產豆豉溶栓酶(簡稱NK)的方法，其包括以下步驟 (1)將產生NK的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好； (2)按常規方法將NK產生菌在26 32°C逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在26 32°C培養72 144h時，即微生物發酵生產NK結束； (4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(5)之後進一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種產物定向馴化培養基、液體種子培養基、發酵產酶培養基分別為 (1)菌種產物定向馴化培養基蛋白腖3.0 7.0g，牛肉膏3.0 7.0g，纖維蛋白.10. 0 20. 0g, NaCl 5. 0 15. 0g，瓊脂20g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養基胰蛋白腖8.0 12. 0g，酵母粉4. 0 6. OgjNaCl 8. 0 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基葡萄糖13.0 17. 0g，蛋白腖13. 0 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g，CaCl2 2H20 0. I 0. 3g, K2HP042. 0 3. 0g,，MgSO4 5H20 0. 3 0. 7g, KH2PO4O. 3 0. 7g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產豆豉溶栓酶(簡稱NK)的方法是將產生NK的微生物進行6～10次活化，再經過產物定向馴化4～6次，使其在26～32℃環境條件下生長良好；將產物定向馴化的NK在26～32℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在26～32℃培養72～144h時，即微生物發酵生產NK結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
文檔編號C12N9/50GK102653750SQ20121010658
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者於爽, 張慶芳, 王曉輝, 王貴鵬, 竇少華, 遲乃玉 申請人:大連大學