包含有機酸的前藥的囊狀製劑及其製備工藝的製作方法

2023-12-09 23:39:01 1

專利名稱：：包含有機酸的前藥的囊狀製劑及其製備工藝的製作方法
技術領域：
：本發明涉及包含有機酸的抗分枝桿菌的酯前藥的嚢狀脂質體(liposomal)製劑、其製備工藝及其藥物組合物。這些製劑有效地保護前藥使之免受血漿降解且在治療結核病和其它的分枝桿菌病中是有用的。
背景技術：
：許多有機酸因其抗分枝桿菌的作用而眾所周知。這些化合物經常遇到在實質上限制它們的治療用途的細胞吸收或細胞穿透方面的問題。已知的實例是吡嗪酸、吡嗪醯胺的活化劑和對氨基水楊酸。最近，例如苯曱酸和水楊酸的大量的其它弱有機酸對抗結核分枝桿菌的菌抹的藥理活性在專利申請WO2004/062607中被證實了，這樣強調了克服有機酸的上述缺點的需要。將要克服與有機酸相關聯的藥代動力學問題的一個替代的路線將會是使用藥理上活性化合物的前藥。前藥是指由藥理上活性分子結合到第二個化學個體而獲得的新分子。得到的化合物顯示出與祖分子(progenitormolecule)不同的理化性質。該前藥可以本身是活性的、或其可以是無活性的且在產生活性分子的酶分解或化學分解之後變成活性的。以前藥的形式，該化合物可以祐二吸收、穿過各種屏障和進入分枝桿菌。一旦進入內部，該化合物就被活化以產生可以接著在作用位點上起作用的有機酸。為了成為有效的，該前藥必須能夠經受住吸收和輸送的過程，且在通過分枝桿菌酶(mycobacterialenzyme)活化之後產生活化劑。藥物吡溱醯胺是有機酸的前藥的典型實例。這一化合物在通過分枝桿菌活化之後用於吡溱酸的細胞內釋放。然而，因為吡。秦醯胺活化僅通過一種酶，即吡噢醯胺酶(pyrazinamidase)來進行，所以由於形成分枝桿菌突變而產生的抗藥性的發生是普遍的，導致了嚴重的治療問題。為了預防如上面對於吡溱醯胺所述的由於抗藥性產生的問題，提議吡溱酸的酯作為前藥。一些專利說明書顯示了對在結核病和其它的分枝桿菌病(mycobacterioses)的治療中使用這些化合物的普遍興趣。Welch,J.T.和Cynamon,M.H.的美國專利4962lll涉及作為抗結核病藥劑的吡嚷酸(pirazinoicacid)的酯。要求保護了使用吡溱酸的短鏈的吡溱酸的酯作為抗結核病藥劑。然而，所要求保護的化合物顯示了在血漿中的高度減少的穩定'性(Bergamnn,K.E.，Cynamon，M.H.,Welch,J.T.,"Quantitativestructureactivityrelationshipsfortheinvitroantimycobacteralactivityofpyrazoinicacidesters(他。秦酸的酯的體外抗分4支桿菌活性的定量的結構-活性關係)",JournalofMedicinalChemistry,1996,39:3394-3400)且由於在到達它們各自的作用位點之前它們將水解而不能被使用。這些作者說明在血漿中的吡溱酸的酯的穩定性隨著烷氧基(alcoxy)鏈的長度按指數規律地降低。在同一發明人的美國專利5643912中，也描述了使用類似的類型化合物來對抗由鳥分枝桿菌引起的感染。然而，由於這些化合物對血漿是不穩定的，所以它們的治療應用是不可能的。專利申請WO2004/062607也涉及利用弱有機酸或其前體的用於結核病的治療方法。然而，有機酸的酯在血漿中的低穩定性的問題尚待解決。由於酯酶在分枝桿菌中是充足的，所以這些化合物的優勢將變得明顯，且由此，可以在原位容易地進行前藥活化。然而，這不能被研究結果所支持，由於存在於人血漿中的酯酶在前藥能夠到達靶細胞之前就水解前藥，因此使前藥不起作用。在將脂質體和其它嚢狀製劑施用至鼠的文獻中所廣泛描述的試驗，已經顯示出這些嚢泡優先地聚集在包含網狀內皮系統(RES)的大量的細胞的器官中，即肝、脾、骨髓和肺中。這是由於發生了局部巨噬細胞的吞噬作用。巨噬細胞是來自形成有機體的第一道防護線的RES的細胞，且具有吞噬作用以及破壞外來物的功能。由於脂質體系統經歷巨噬細胞的吞噬作用，所以它們可以用作到被感染的巨噬細胞的藥物載體，由此增加在最需要治療的那些靶點中的藥物濃度。關於這些感染的問題是分枝桿菌可以幹擾巨噬細胞的殺菌機制，以潛伏形式長時間保留在細胞內且，隨後成為造成再感染的原因。例如那些與藥物的脂質體製劑相關聯的治療上活性的細胞內的藥物濃度的成功產生，因此在治療這些分枝桿菌病中是關鍵性的。結核病的病原體(結核分枝桿菌)的主要的宿主是人(智人)。但是，在某些情況下，牛(牛結核分枝桿菌)也可以構成重要的宿主。某些分枝桿菌病對動物有特異性且只感染那些免疫低下的人。在這一類型的分枝桿菌病的公共衛生方面，在免疫低下的個體中由鳥分枝桿菌引起的感染是單個最重要的實例。發明概述在合成用於包封到脂質體中的長鏈酯的過程中，我們出乎意料地發現它們不僅顯示出高抗分枝桿菌活性，而且對血漿水解極其穩定且，特別是在它們包封到脂質體中之後。確實，將前藥包封入例如脂質體或微胞的嚢泡中使化合物免受血漿水解同時保留了化合物的活性。我們推斷通過將具有適當的結構的前藥與脂質體或微胞嚢狀製劑結合，獲得在作用位點中釋放弱酸的藥物產品將是可能的，從而使前藥免受血清酯酶的水解。本發明的上下文內，術語"嚢狀的"包括含有通常充滿流體的內腔的任何封閉結構，如脂質體。在研究許多有機酸的酯的水解之後，我們進一步發現具有長的烷氧基(alcoxyl)鏈的苯甲酸的酯尤其耐受被血漿水解。這表明增加有機酸的前藥對被血漿水解的耐受性確實是可能的，從而可能解決上述問題。本發明由此涉及包含與能夠是脂質體或微胞的嚢狀載體結合的弱有機酸的前藥的新的嚢狀製劑，還涉及該新的嚢狀製劑的製備工藝、新的弱有機酸的前藥和所述製劑的藥物組合物。脂質體是由脂類微粒或脂類納米微粒構成的嚢狀系統。將前藥包封在脂質體中當它們於體內循環時保護前藥。其他的即使不是脂質的由微粒或毫微粒構成的嚢狀系統，例如微乳劑也在本發明的範圍內，因為它們代表了在藥物循環過程中有效保護藥物的方式。這種系統(特別是微胞系統)具有附加的優勢，即自然地經歷網狀內皮系統細胞的細胞的吞噬作用，以及使得能夠在包含大量此系統的細胞的器官中積聚高濃度前藥。本發明的前藥是衍生於具有以下通式的有機酸R!COOH(1)或RiS02H(II)其中Ri是優選地選自包含苯環、吡啶環、吡溱環或嘧啶的芳環(pyrimidinicaromaticring),或取的或未取的、々包和的或不々包和的直鏈，例如苯曱酸、苯亞磺酸(benzenesulphinicacid)、肉桂酸、水楊酸、p比嗪酸、煙酸、噠嚷羧酸和嘧咬曱酸(pyrimidinecarboxylicacid)、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和^J旨酸(estearicacid)的組。通常，這些酸具有在l至5之間的pKa。能夠在活化之後釋放羧酸的許多類型的羧酸的前藥為本領域技術人員所知。一些實例是酯衍生物、醯胺和醯氧基烷基酯(acyloxyalkylicester)。對於新的嚢狀製劑，特別優選的合適的前藥是在本發明的嚢狀製劑中使用的弱酸的酯，其具有以下通式R!COOR2(III)或RiSOA(IV)其中R!是如前面對於式(I)和(II)所定義的；以及R2選自取代的或未取代的芳基，或選自飽和的或不飽和的、直鏈的或支鏈的烷基鏈。對於Ri的取代基優選吡溱酸、苯曱酸和肉桂酸，而對於R2的取代基優選辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和苯基。用於本發明的嚢狀製劑的前藥優選一類在烷氧基鏈中具有許多的碳原子，使得前藥的辛醇/水的分配係數的對數值至少大於3的前藥。分配係數的對數可以由本領域技術人員容易地計算出來。分配係數是對於保持與嚢泡的親脂部分相關聯的前藥以及阻止其擴散到水介質中的重要的因素。沒有上述缺點的具體的新的前藥，例如吡溱酸十二烷酯、吡嗪酸十四烷酯、吡溱酸十六烷酯、吡溱酸癸酯、苯曱酸癸酯和肉桂辛酯也構成9本發明的目的。由於其親脂特性，有機酸的前藥特別適於以高的量包封到通常用於藥物轉運的脂質體、膠態系統中，帶有不必分離所包封的藥物的優勢。這是非常重要的，尤其是對於工業化製備來說。本發明的前藥還適於在藥物轉運的其它的膠態系統中使用，所述其它的膠態系統例如大分子絡合物、微膠嚢、微球和膠嚢。這些膠態系統具有直徑通常在50nm至2/xm之間的尺寸的範圍內變化的微粒，且其還是生物可降解的和無毒的。本發明的優選運輸系統是脂質體系統。脂質體是由磷脂分散在水介質中而形成的。磷脂具有稱為頭部(head)的極性部分和稱為尾部(tail)的非極性部分。頭部由於其極性特性而具有對於水和其他極性物質的親合力，而非極性的尾部具有對於非極性部分的親合力，所述非極性部分諸如例如在直接鄰近的其它磷脂的尾部。這個特徵意味著，當分散於過量的水中時，磷脂將把自身布置為雙分子層。極性的頭部將向外轉，在這裡其可以與水分子接觸，而尾部向內轉，偏向彼此。脂質體是由封住內部含水空間的一個或多個磷脂雙分子層形成的嚢泡。因此，脂質體的治療作用可歸因於這些嚢泡結合親水和疏水物質的能力。親水分子包含在水合的內部空間中，同時疏水分子結合在質膜中。根據製備方法，脂質體可以在薄片尺寸和數量上有很大的變化。一般地，脂質體可以被分為單層(unilamellar)嚢泡(當它們僅具有一個磷脂雙分子層時)以及多層嚢泡(如果他們具有多個磷脂雙分子層時)。這些類型的嚢泡都可以根據其直徑尺寸來分類為，即小嚢泡(0.025-0.1]Lim)和大嚢泡(X).l]tmi)。脂質體的分類還可以根據製備過程來進行，且這導致每種類型的囊泡包括幾種細分。最普通的脂質體是多層嚢泡(MLV)，其包括包圍內部含水空間的幾個磷脂層。這些系統通常具有在100nm和4/mi之間的範圍內的直徑，但它們的尺寸可以被控制，例如，通過使它們在壓力下通過校準孔。當使用探針對MLV系統進行超聲處理時，形成更小的嚢泡，即通常所說的小單層嚢泡(SUV)。這些嚢泡只包含封住含水空間的單個磷脂雙分子層。本發明的脂質體的製備通常利用磷脂、膽固醇及其衍生物和其它的10脂類或非脂類分子。實例包括以下脂類，氫化的或未被氫化的、單獨地或在混合物中的磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯甘油(PG)、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、膽固醇或其衍生物(Choi)、鞘磷脂(SM)、花生四烯酸(araquidonicacid)、鞘氨醇、神經節苷脂、神經醯胺、磷脂醯肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。脂類或非脂類物質可以加入到脂質體，以便促進脂質體與靶細胞的締合、通過巨噬細胞的脂質體的內化，或甚至增加脂質體循環的半衰期。這些化合物的一些實例包括抗體、神經醯胺、聚乙二醇、和聚乙二醇-脂類共軛物。所述微胞能夠使用脂肪酸和用作表面活性劑的藥物載體的混合物來製備，所述用作表面活性劑的藥物載體優選地是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、乙氧基脫水山梨糖醇酯、聚乙烯乙二醇-脂類扼合物或十二烷基磺酸鈉，以及許多其他類似的化合物。羧酸的前藥可以使用本領域技術人員已知的方法採用這些相同的化合物來製備。酯書f生物可以例如通過4吏弱酸與亞闢b醯氯或其它適當的試劑反應以得到相應的醯卣且隨後使醯卣與醇或苯酚反應以得到前藥來合成。這些酯衍生物還可以以令人滿意的收率由其它的官能團獲得，例如，通過使酸與醇在酸性介質中反應。這些可替代的反應是普遍已知的，且無需另外的試驗就可以容易地進行。根據本發明的用於將有機酸的前藥包封到脂質體中的一個優選的方法包括凍幹包含前藥和脂類組分的溶液，以及隨後水合該凍乾物(lyophilisate)。該方法用於生產無菌的脂質體，快速提高至工業化規模以及容易製備可以在使用前以凍幹形式長期保存的製劑，從而有助於儲藏和運輸。可替代地，脂質體可以通過水合包含磷脂和前藥的膜來方便地獲得。簡要地，根據本發明的用於脂質體製劑的製備工藝優選地包括以下步驟a)酯化具有以下通式的弱有機酸R4COOH(I)或R!S02H(II)其中Rl是優選地選自包含苯環、吡啶環、吡嗪環或嘧啶的芳環，或取代的或未取代的、飽和的或不飽和的直鏈，例如苯曱酸、苯亞石黃酸、肉桂酸、水楊酸、吡。秦酸、煙酸、噠。秦羧酸和嘧啶曱酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的組。b)在適當的溶劑中，製備包含脂類和在步驟a)中所獲得的前藥的溶液；c)通過蒸發或凍幹除去溶劑；以及d)水合在c)中所獲得的產物。製備根據本發明的微胞嚢狀系統，有機酸前藥和微胞載體的組合物包括脂肪酸和藥物載體表面活性劑，所述表面活性劑優選地是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、乙氧基脫水山梨糖醇酯、聚乙烯乙二醇-脂類軛合物或十二烷基磺酸鈉，以及其他類似的化合物。然而，可以使用本領域技術人員已知的用於製備脂質體嚢狀系統的任何工藝，而不背離本發明的精神和範圍。包括本發明的前藥的嚢狀系統可以以包括靜脈內的、肌肉內的、腹膜內的5^線或通過吸入的許多方式來施用。我們試驗了本發明的有機酸的前藥對於分枝桿菌的活性，且發現它們被賦予了甚至比最初的有機酸更高的體外活性。我們還用實驗方法驗證了將前藥包封在嚢泡中使前藥免受血漿降解(plasmaticdegradation)以及免受由肝酉旨酶(hepaticesterase)引起的P爭解。使用被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞，我們發現本發明的前藥，以其脂質體嚢狀的形式，對細胞內的分枝桿菌是有活性的。考慮到通過SRE細胞進行的脂質體的正常吞噬作用，這使得嚢狀前藥尤其適於治療結核病和其它分枝桿菌病。有機酸的前藥與嚢狀載體的結合增加了所述前藥在血漿中的穩定性且改善了所述化合物的藥代動力學，從而提供了具有提高化合物的活性的特性的製劑。由於正被討論的分子顯示出對抗分枝桿菌的活性，所以製劑可以用於治療結核病和其它傳染病。因此，本發明的另一個目的是包括足以產生治療有效量的具有上面所定義的式(I)或(II)的弱有機酸的、如上面所定義的嚢狀製劑的量的藥物組合物。因此，在另外的目的中，本發明涉及用作藥物的製劑。期望使用本發明的製劑來製備藥物組合物以用於治療與分枝桿菌感染相關聯的疾病。特定的感染是由結核分枝桿菌引起的感染或鳥分枝桿菌引起的感染。一種用於治療在動物中的結核病感染或其它分枝桿菌病的方法，包括向所述動物施用足以產生治療有效量的具有通式(I)或(II)的弱有機酸以治療所述感染的量的本發明的製劑。所述製劑是通過吸入、靜脈內、肌肉內、或皮下來施用的。優選地，將本發明的製劑施用至需要其的哺乳動物。更優選地，所述哺乳動物是人。根據本發明的方法或用途，其包括以藥物組合物或如在此所描述的混合物的形式施用所述製劑。如在整個說明書和權利要求中所使用的，術語"治療"包含相關領域技術人員已知的所有不同的形式或方式的治療，且特別包括預防治療、延遲進展治療(delayofprogression)禾口治癒'l"生治療(curativetreatment)。體外MIC(肉湯分析(brothassay))的劑量是在10]Lig/ml和40/xg/ml之間以及劑量為20]iig/ml(被感染的巨噬細胞分析)。體內治療有效量可以根據化合物和給藥途徑變動。本發明的說明，與對照或PZA和POA治療相比，在體內致死活性(killingactivity)方面，根據本發明的以游離態或以脂質體包封形式的C12製劑的活性(表X)顯示出增加5倍至10倍。將C12包封在脂質體中相對於游離態的同一化合物增加了約50%的殺菌效果。附圖簡述現將參考附圖描述本發明，其中，圖1A是清晰地顯示出以游離態或被包封在脂質體中的形式的化合物C12表現出與吡。秦醯胺(pirazinamide)(PZA)或吡口秦酸(POA)相比，在體內致死活性方面增加5倍至10倍的圖。圖1B是顯示與圖1A相同的結果的棒圖。圖2A顯示出以游離態和以脂質體形式的化合物相對於對照和相對於用PZA或POA治療的結果。圖2B顯示出本發明的三種新的化合物，即吡溱酸十二烷酯、吡嗪酸十四烷酯(tetracylpyrazinoate)和吡。秦酸十六烷酯，以游離態和以脂質體形式的殺菌效果。發明詳述下面的實施例闡明了弱酸的前藥的合成、包含弱酸的前藥的脂質體製劑的製備和表徵、製劑在血漿和肝勻漿中的穩定性、以及還有以游離態和以嚢狀形式的前藥的活性。實施例l-吡溱酸十二烷酯的合成將25ml的亞硫醯氯加入到26.5mmol的吡嚷酸(3.3g)中並在回流下加熱溶液兩小時。最初觀察到粉紅色，其逐漸地變得較暗。蒸發過量的亞硫醯氯且接著獲得明顯的白色結晶的形式的升華的吡嗪酸氯化物(pyrazinoicacidchloride)。將結晶立即溶於13ml的二氯曱烷中，隨之將混合物放入水浴中，且緩慢加入26.5mmol的十二烷醇和3.70ml的蒸餾過的三乙胺。該反應在水浴中進行約半小時，且此後處於室溫。然後加熱反應混合物並回流一'卜時，且接著在室溫下放置過夜約12小時。然後再次加熱並回流另外的40分鐘，隨後使用己烷乙酸乙酯(5:1)作為洗脫液進行薄層色譜(TLC)分析。接著過濾反應混合物且相繼地用20ml的蒸餾水和20ml的飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。用無水闢u酸4美處理溶液且蒸發溶劑。通過使用己烷乙酸乙酯(5:1)作為洗脫液的柱色譜法純化該化合物兩次。在通過核磁共振(NMR)和紅外光譜法(IR)鑑別和確認結構之後，獲得蠟狀的白色固體形式的純的產物，其具有m.p.二33-34。C,以及46%的收率。Vmax(cm")=1723。NMR表徵在表1中示出。實施例2-吡溱酸十四烷酯的合成遵循與用於實施例l的吡喚酸十二烷酯的合成相同的方法，但是改為使用26.5mmol的l-十四烷醇。化合物通過使用己烷乙酸乙酯(1:1)作為洗脫液的柱色譜法純化。獲得蠟狀的白色固體形式的純化的產物，其具有m.p.-43-44。C，以及42%的最終收率。Vmax(cm")=1722。NMR表徵在表l中示出。實施例3-吡噪酸十六烷酯的合成遵循與用於實施例l的吡。秦酸十二烷酯的合成相同的方法，但是改為使用26.5mmol的l-十六烷醇。化合物通過使用己烷乙酸乙酯(1:1)作為洗脫液的柱色譜法純化。獲得蠟狀的白色固體形式的純化的產物，其具有m.p^53-54。C,以及41%的最終收率。Vmax(cm")=1723。NMR表徵在表l中示出。實施例4-苯曱酸癸酯的合成向在25ml幹乙醚中的12mmo1的1-癸醇的溶液中加入25mmo1的新近蒸餾過的三乙胺。將混合物置於攪拌下且一滴一滴地加入12.8mmol的苯曱醯氯。回流冷凝器被包括在內且反應置於攪拌下兩個小時。隨後加入30ml的水同時繼續攪拌另外15分鐘。有機相用5。/。HC1的水溶液(2x30ml)洗滌，並隨後用飽和的碳酸氫鈉溶液(2x30mL)洗滌。最後，有機相用硫酸鎂乾燥並通過真空蒸發除去溶劑。苯曱酸癸酯通過使用己烷乙酸乙酯(5:2)作為洗脫液的矽膠柱色譜法純化。獲得無色液體的形式的最終產物，具有74%的收率。實施例5-肉桂酸辛酯的合成遵循與用於實施例4的苯曱酸癸酯的合成相同的方法，但是使12mmo1的辛醇與12.8mmol的肉桂醯氯反應。獲得油的形式的最終產物，具有71%的最終收率。實施例6-N-十四烷基吡喚醯胺的合成遵循與實施例2的吡溱酸十四烷酯的合成的方法相類似的方法，但是改為使用26.5mmol的十四烷胺。對於通過柱色譜法的產物純化，使用的洗脫液是己烷乙酸乙酯(1:1)。獲得白色固體形式的純的產物，其具有m.p.=80-8rC,以及28%的最終收率。表I吡喚酸酯衍生物的^i3CNMR化學位移Sc(ppm)(在CDCl3中，參照物(CH3)4Si)。C12-吡,酸十二烷酯，C14-吡嗪酸十四烷酯以及C16-吡。秦酸十六烷酯。tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18實施例7-通過脂類和藥物的膜的水合製備脂質體稱出不同的脂類(20/miol)和前藥(2Mmo1),將它們轉移至圓底燒瓶，溶於氯仿且使用旋轉蒸發器蒸發有機溶劑以形成脂膜(lipidfilm)。接著在真空高壓容器(bomb)中乾燥該膜來除去氯仿殘留物並在比所使用的脂類的相轉變溫度(TC)高至少10。C的溫度下加入lml的等滲的pH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)。攪拌混合物另外的五分鐘以完成脂膜的水合併且，在靜止幾分鐘之後，再次攪拌混合物另外的五分4^為了確定包封率(incorporationefficiency)(EE)，收集水合後的脂質體懸浮液和離心分離後獲得的脂質體懸浮液的等分部分、除去的上清液和在初始體積(在被離心分離之前)中的沉積物的再懸浮液。EE計算為再懸浮的脂質體懸浮液中的前藥濃度與初始的脂質體懸浮液中的前藥濃度之間的比率。表2至表6顯示不同的前藥的幾種製劑所獲得的EE值。使用設置為400x放大倍數的光學相差顯微鏡(opticalphasecontrastmicroscope)來檢查所有的製備的懸浮液。tableseeoriginaldocumentpage19表III在具有不同的脂類組合物的脂質體中的吡嗪酸十四烷酯的包封率(EE)tableseeoriginaldocumentpage20表IV在具有通過脂類和藥物的膜的水合而獲得的不同的脂類組合物的脂質體中的吡,酸十六烷酯的包封率(EE)tableseeoriginaldocumentpage20表v在具有通過脂類和藥物的膜的水合而獲得的不同的脂類組合物的脂質體中的肉桂酸辛酯(CO)和苯甲酸癸酯(BD)的包封率(EE)脂類製劑I被包封的化合物IEE(%)DMPCjCO!92,2DPPCl'CO94,5DMPC;BD94,1DPPCIBD;93,4表VI在具有通過脂類和藥物的膜的水合而獲得的不同的脂類組合物的脂質體中的N-十四烷基吡嗪醯胺(A14)和十六烷基吡嗪醯胺(A16)的包封率(EE)脂類製劑被包封的化合物EEDMPCA1495,2DPPCA1496,4DMPC:DMPG9:1A1498,6DMPCA1697,0DPPMA1698,1DMPG:DMPG9:1A1698,4實施例8-通過脂類和前藥凍乾物(lyophilisate)的水合法製備脂質體製備在10ml的叔丁醇中包含有20/miol的脂類和2^mo1的前藥的溶液，通過無菌過濾器過濾溶液。這些溶液接著在液氮中被凍結且被凍幹24小時。在凍幹之後，通過在比脂類的相轉變溫度(TC)高至少l(TC的溫度下添力口lml的PBS來使溶液水合，使用超聲波水浴兩分鐘。包封率(EE)如上面對於通過脂膜的水合進行的脂質體製備所述的來計算，且在表7中顯示。使用設置為400x放大倍數的光學顯微鏡來檢查所有的製備的懸浮液。表VII在通過脂類和前藥凍乾物的水合獲得的不同的脂類組合物的脂質體中的吡。秦酸十二烷酯(C12)、吡溱酸十四烷酯(C14)和吡。秦酸十六烷酯(C16)的包封率(EE)。脂類製劑J被包封的化合物EESDMPC1C1295,6DMPC5C1498,2DMPCC1697,3DPPCi:C1497,4比較的實施例以游離態和以被包封在脂質體中的形式的吡嗪酸十二烷酯、吡溱酸十四烷酯和吡溱酸十六烷酯在人血漿中的穩定性。向在試管中的每一種游離態的試^Mt合物中加入750]Ld的血漿、700/xl的PBS和50/xl的化合物的儲備溶液(3.6x10—3M)。於37。C在攪拌下培育試管，且每五分種取出150jid等分部分，該等分部分用600/d的乙腈(ACN)稀釋，並隨後離心分離。上清液被取出且注入到HPLC系統中。使用對於每個色譜圖所獲得的的面積值來確定每種前藥的半衰期。向試管中的每種脂質體懸浮液中加入750/xl的血漿且用PBS稀釋至最終體積3000jLd。在每個試管中的最終藥物濃度是2x10-3M。接著在37。C帶攪拌下培育試管，且隨後在設定的時間間隔取出150inl等分部分，該等分部分用600pl的乙腈(ACN)稀釋，並隨後離心分離。對於此方法的剩餘部分，遵循與上面對於游離態情況所述的相同的過程。表vm以游離態和以嚢狀(DMPC的MLV)形式的前藥在血漿中的半衰期的比較。C12-吡嗪酸十二烷酯，C14-p比。秦酸十四烷酯，C16-p比。秦酸十六烷酯。22半衰期(min)化合物游離態囊狀形式(DMPC)C121578C1419158C1668214分離的藥物在肝勻漿中的穩定性對於每種游離態的化合物，在試管中加入50/xl的鼠肝勻漿、1400/xl的PBS和50/xl的化合物儲備溶液(3.6xl(T3M)。於37。C在攪拌下培育試管，且每分種取出150Ail等分部分，該等分部分用600/xl的乙腈(ACN)稀釋，並隨後離心分離。上清液被取出且放入自動進樣器的小瓶中並用HPLC分析。向試管中的每種脂質體懸浮液，加入50/il的勻漿且用PBS稀釋至最終體積1500]Ld。最終藥物濃度是2xl(T3M。於37。C在攪拌下培育試管，且通過與用於確定脂質體藥物在血漿中的穩定性的相同的過程進行試樣收集和分析。nx以游離態和以嚢狀(DMPC的MLV)形式的前藥在鼠肝勻漿中的半衰期的比較。C12-吡口秦酸十二烷酯，C14-p比n秦酸十四烷酯，C16-吡。秦酸十六烷酯。半衰期(min)■化合物I_遊禽態_I蠹狀形式(DMPC)C122C144C1621活性1-最低抑菌濃度(MIC)的確定結核分枝桿菌H37Ra用作參照菌抹。酯C12、C14和C16,吡。秦醯胺(PZA)和吡口秦酸(POA)在二曱亞碸(DMSO)的儲備溶液中製備為8mg/ml的濃度。最低抑菌濃度通過逐步稀釋的方法來確定。使用補充OADC(Difco)的培養基Myco(營養素Broth-Difco,10g/L;Middlebrook7H9-Difco，10g/L,0.05%的葡萄糖和0.01%的吐溫80)，且調節pH至5.5。向試驗化合物的逐步稀釋的每一階段的每個試管加入充足體積的細菌培養液以便提供10"CFU/ml(CFLN菌落形成單位)的最終濃度。在37。C培育試管約21天。定期檢查對照試管中(不含藥物)的渾濁的出現。一旦在對照試管中出現渾濁，就記錄結果，其中MIC值定義為能夠抑制分枝桿菌的生長的藥物的最低濃度(注意，在逐步稀釋順序的第一個試管中完全沒有渾濁)。對於每個試驗化合物，進行三份這樣的試驗。如所預期的，PZA的MIC為100jug/ml。結果在表X中顯示。表X對於每種藥物的最低抑菌濃度(MIC)。POA-吡。秦酸，PZA-吡。秦醯胺，C12-吡溱酸十二烷酯，C14-吡,酸十四烷酯，C16-吡，秦酸十六烷酯tableseeoriginaldocumentpage24如在表X中所顯示的，化合物C12、C14和C15表明在體外，其MIC值比PZA和POA的MIC值低10倍，顯示出在pH5.5直接與M.tb接觸時更高的殺菌效果。2-以游離態和以被包封的形式的化合物的抗分枝桿菌的(Antimycobaterial)活性，使用被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞在評價抗分枝桿菌的活性中，利用常規方法(Anes等人，NatCellBiol，2003),該方法使用鼠巨噬細胞(細胞系J774.A1)的細胞培養物。簡要地，於37。C在5。/。二氧化碳氣氛下在24井細胞培養皿中，將巨噬細胞覆蓋在具有高葡萄糖濃度的DMEM培養基中並補充10o/。的胎牛血清。一旦獲得約80%的融合，細胞就以獲得每個井l(^分枝桿菌/ml的細菌培養液的濃度的速率感染上結核分枝桿菌H37Ra。在細菌攝取(uptake)3小時之後，預期每個井每個被感染的細胞有1個至5個桿菌且總計為約10E4-5細菌/ml。然後用pH7的緩衝液PBS對被感染的培養物進行三次清洗，以便除去未被巨噬細胞內化的所有細菌。與試驗化合物一起以及不與試驗化合物一起加入新鮮的DMEM培養基。培養期是7天，每3天使用新鮮的培養基。內化3小時後加入化合物，且保持化合物與被感染的細胞接觸，直至加入新鮮的培養基DMEM。從感染開始的3小時、l天、3天、5天和7天之後，用在水中的1%IGEPAL溶液(Sigma)溶解一皮感染的巨噬細胞來重新獲得細胞內細菌。在此濃度下，巨噬細胞被溶解而對分枝桿菌的存活率沒有影響。在用水逐步稀釋溶解產物之後，在補充有OADC(Difco)的Middlebrook7H10培養基中培養存活的細菌。在37。C下培育約2星期後，計算菌落形成單位(UnityFormingColony)(UFC)。在獨立的實驗中，每個試驗進行一式三份。如在圖1A中可以看到的，與對照或PZA和POA治療相比，在體內致死活性方面，以游離態或以脂質體包封形式的化合物C12顯示出增加5倍至10倍。在感染7天後這一效應增強了，其中，在前3個例子中，細菌恢復了它們的細胞內生長的能力，然而在包含C12的那些化合物中觀察到了潛伏狀態。在以棒圖的形式顯示相同的結果的圖1B中，這一效應更明顯。相對於游離態的相同化合物，將C12包封在脂質體中增加了約50。/。的殺菌效果。然而，使用DPPC和DMPC製劑沒有觀察到這樣的顯著性差異。圖2A相對於對照、PZA治療和POA治療，比較了以游離態或以嚢狀形式的所有化合物所獲得的結果。以游離態或以嚢狀形式的所有這些前藥，比參照的前藥更能殺菌。在所有新的前藥中，以游離態或以嚢狀形式的C12,顯示出最大的殺菌效果(圖2B)。權利要求1.一種包含前藥的囊狀製劑，其特徵在於包括弱有機酸的前藥和脂質體或微胞囊狀載體的混合物，所述弱有機酸具有以下通式R1COOH(I)或R1SO2H(II)其中R1優選地選自包含苯環、吡啶環、吡嗪環或嘧啶的芳環，或取代的或未取代的、飽和的或不飽和的直鏈，例如苯甲酸、苯亞磺酸、肉桂酸、水楊酸、吡嗪酸、煙酸、噠嗪羧酸和嘧啶甲酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的組。2.根據權利要求l所述的製劑，其特徵在於所述前藥是以下通式的弱有機酸的酯衍生物R^COOR2(III)或R4S02R2(IV)其中Ri是如在前面的權利要求l中所定義的；以及R2是選自取代的或未取代的芳基，或選自直鏈的或支鏈的、飽和的或不飽和的烷基鏈。3.根據權利要求1或2所述的製劑，其特徵在於RW尤選吡。秦酸、苯曱酸或肉桂酸。4.根據前述權利要求所述的製劑，其特徵在於R2優選地選自辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和苯基的組。5.根據前述權利要求所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選吡嗪酸十二烷酯。6.根據權利要求1至4所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選吡。秦酸十四糹克酯。7.根據權利要求1至4所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選吡溱酸十六烷酯。8.根據權利要求1至4所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選苯曱酸癸酯。9.根據權利要求1至4所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選肉桂酸辛酯。10.根據權利要求1至4所述的製劑，其特徵在於所述前藥優選地具有大於3.0的辛醇/水的分配係數的對數(LogP)。11.根據權利要求1至IO所述的製劑，其特徵在於所述嚢狀載體包括至少一種氫化的或未被氫化的脂類、或脂類的混合物，所述脂類選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯甘油、二油烯基磷脂醯膽鹼、二油烯基磷脂醯甘油、膽固醇或其衍生物、鞘磷脂、花生四烯酸、鞘氨醇、神經節苷脂、神經醯胺、磷脂醯肌醇和磷脂酸。12.根據前述權利要求中任一項所述的製劑，其特徵在於所述脂質體嚢狀製劑是以凍幹的或水合的形式存在。13.根據權利要求1至10所述的製劑，其特徵在於所述微胞載體還包括脂肪酸和藥物載體表面活性劑的混合物，所述表面活性劑優選地是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、乙氧基脫水山梨糖醇酯、聚乙烯乙二醇-脂類軛合物或十二烷基磺酸鈉。14.根據前述權利要求所述的製劑，其特徵在於所述嚢狀載體包括非脂類或非表面活性劑種類的另外的中性的或帶電的分子。15.用於製備根據權利要求l至12和14所述的脂質體製劑的方法，其特徵在於包括以下步驟a)酯化具有下述通式的弱有機酸formulaseeoriginaldocumentpage4其巾Rj是優選地選自包含苯環、吡啶環、吡。秦環或嘧啶的芳環，或取代的或未取代的、飽和的或不飽和的直鏈，例如苯曱酸、苯亞石黃酸、肉桂酸、水楊酸、吡溱酸、煙酸、噠溱羧酸和嘧啶曱酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的組；b)在適當的溶劑中，製備包含脂類和在步驟a)中所獲得的前藥的溶液；c)通過蒸發或凍幹除去所述溶劑；以及d)水合所獲得的產物。16.具有下述通式的有^/L酸醇類或酚類的酯前藥R!COOR2(III)或RiS。2R2(IV)其中優選地，Ri選自苯類或吡噪醯胺類的芳香環；以及R2選自辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和苯基。17.根據前述一個權利要求所述的前藥，其特徵在於所述前藥選自吡噪酸十二烷酯、吡溱酸十四烷酯、吡嗪酸十六烷酯、苯曱酸癸酯或肉桂酸辛酯。18.—種藥物組合物，其特徵在於包括根據權利要求5至14所述的嚢狀製劑，該嚢狀製劑用於產生治療特定結核病中的分枝桿菌有效量的具有所述通式(I)或(II)的弱有機酸。19.一種用於治療在動物內的結核病感染或其它分枝桿菌病的方法，所述方法包括向所述動物施用足以產生治療有效量的具有所述通式(I)或(II)的弱有機酸以治療所述感染的量的權利要求1至14所述的製劑。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述製劑是通過吸入、靜脈內、M^肉內或皮下來施用的。21.根據權利要求19所述的方法，其中所述動物是人。22.根據權利要求19所述的方法，其中所述感染是結核分枝桿菌的感染。23.根據權利要求19所述的方法，其中所述感染是鳥分枝桿菌的感染。全文摘要一種包含前藥的囊狀製劑，其特徵在於包括弱有機酸的前藥和保護前藥使之不被血漿降解的脂質體或微胞囊狀載體的混合物，所述弱有機酸具有以下通式R1COOH(I)或R1SO2H(II)；其中R1優選地選自包含苯環、吡啶環、吡嗪環或嘧啶的芳環，或取代的或未取代的、飽和的或不飽和的直鏈，例如苯甲酸、苯亞磺酸、肉桂酸、水楊酸、吡嗪酸、煙酸、噠嗪羧酸和嘧啶甲酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的組。本發明還涉及製備脂質體製劑的方法，新的前藥和藥物組合物用於治療結核疾病和其他分歧桿菌病。文檔編號A61K9/127GK101460146SQ200780021029公開日2009年6月17日申請日期2007年6月4日優先權日2006年6月5日發明者瑪爾諾·菲利佩·熱蘇斯·德·弗雷塔斯·西蒙斯,艾爾莎·瑪麗亞·裡貝羅·桑託斯·安尼斯,艾米利亞·艾麗斯·多·雷斯·託倫安斯·瓦倫特,路易斯·菲利佩·文森特·康斯坦丁諾申請人:裡斯本大學