維管束特異表達profilin2啟動子不同區段的表達功能的製作方法
2023-12-10 04:39:06
專利名稱：維管束特異表達profilin2啟動子不同區段的表達功能的製作方法
技術領域：
本發明涉及profilin2啟動子的維管束特異表達及profilin2啟動子不同區段驅動外源基因在植物中表達的特性及其在植物抗維管束病害基因工程中的潛在應用。
真菌、細菌、病毒病是植物的三大類主要病害，在世界作物生產中造成巨大的經濟損失。其中有些真菌和細菌病原在侵入植物後可特異地在維管束中繁殖，造成典型的維管束病害，目前已在近百種植物上發現維管束病害。維管束病害的典型症狀為植株生長緩慢，維管束變色，莖、葉失水萎蔫或青枯。此類病害病原潛伏期長，發病初期不易察覺，一旦表現症狀，病株即迅速枯死，因而造成巨大的產量損失。例如50年代以來，非洲已暴發過3次香蕉Verticillium萎蔫病大流行，曾對當時的香蕉主栽品種Gros Michel造成毀滅性危害(Ploetz等，Proceeding of a Research Coordination Meeting held at Cotonou，Benin，12～14 Nov.1991.1993，312～323)。在我國農業生產中，維管束病害造成的經濟損失亦相當嚴重，真菌性的棉花枯、黃萎病及細菌性的馬鈴薯青枯病即是典型的例子。維管束病害防治的根本措施是培育抗病品種，因病原寄生在維管束中，藥劑防治相當困難。抗源缺乏是困擾抗該類病害育種的主要問題。七十年代重組DNA技術的建立及八十年代植物基因工程的興起，為植物抗病育種提供了一條新途徑。針對維管束病害的抗病基因工程，除需要有合適的抗病基因、調控序列以及高效的轉基因技術外，使基因特異地表達在維管束中也顯得十分重要。與基因的組成型表達相比，維管束特異表達可使抗病基因產物直接在維管束中對病原體建立防禦體系，同時節省能量。
本發明的目的是通過profilin2啟動子的維管束特異表達及不同區段驅動β-葡糖醛酸苷酶(GUS)報告基因在轉基因植物中表達的特性，從而為抗維管束病害的植物基因工程提供更佳的啟動元件。
本發明涉及擬南芥profilin2啟動子，其特徵在於在轉基因植物中，-1667bp～-1bp區段驅動目的基因維管束特異表達；-1380bp～-1bp區段、-597～-1bp區段驅動目的基因組成型表達，表達強度強於CaMV35S啟動子；-1153～-1bp、-969～-1bp區段不能驅動目的基因表達。
按照本發明的啟動子，其中所說的擬南芥profilin2啟動子包括具有擬南芥profilin2啟動子-1667～-1bp區段間任何長度核苷酸序列的啟動子。
按照本發明的啟動子，其中所說的啟動子具有如序列表中序列編號1、2、3、4、5所示任一核苷酸序列或其截短的功能等同物或變異體或以任何組合方式(包括置換、加入、重複、缺失)形成的、或與其他啟動子連接形成的融合啟動子。
按照本發明的啟動子，其中所說的轉基因植物為任何一種裸子植物和被子植物，包括單子葉植物或雙子葉植物，包括植物細胞、愈傷組織、完整植株及其部分。
按照本發明的啟動子，其中所說的目的基因包括但不限於抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或品質性狀有關的結構和調控基因。
本發明還涉及攜帶按照本發明的啟動子的重組表達載體。
按照本發明的重組表達載體，其中所說的重組表達載體包括任何可用於轉化真核生物的重組表達載體。
本發明進一步涉及由本發明的重組表達載體轉化所形成的轉基因真核生物，以及由此產生的外源基因表達產物，其中首選轉基因植物及其產品。
按照本發明，其中所說的植物包括由轉基因植物作為親本雜交或轉育所產生的植物。
附圖簡要說明
圖1為pPfn/Profilin 2啟動子的酶切鑑定；
圖2為亞克隆pPfk/Profilin 2啟動子1.2kb的酶切鑑定；圖3為表達載體pPfn1.7的酶切鑑定；圖4為pPfn1.4(a)、pPfn1.0(b)、pPfn0.6(c)的酶切鑑定；圖5為pPfn1.2的酶切鑑定；圖6為pBI121、pPfn1.7、pPfn1.4、pPfn1.2、pPfn1.0、pPfn0.6驅動GUS基因在伽藍菜中的短暫表達；圖7為GUS基因在轉基因伽藍菜莖中的表達，其中，a為GUS基因在莖中的組成型表達，b為pPfn1.7驅動GUS基因維管束特異表達，c為非轉基因對照；圖8為GUS基因在轉基因伽藍菜根中的表達，其中，c為GUS基因在根中的組成型表達，b為pPfn1.7驅動GUS基因維管束特異表達，a為非轉基因對照；圖9為GUS基因在轉基因伽藍菜葉中的表達，其中，a為GUS基因在葉中的組成型表達，b為pPfn1.7驅動GUS基因維管束特異表達，c為非轉基因對照；圖10為克隆載體pPfn的構建圖；圖11為亞克隆載體pPfk的構建圖；圖12為表達載體pPfn1.7的構建圖；圖13為Profilin2-deletion表達載體pPfn1.4、pPfn1.0、pPfn0.6的構建圖；圖14為Profilin2-deletion表達載體pPfn1.2的構建圖。
下面結合附圖對本發明進行詳細說明。
按照本發明的一個方面，本發明根據已知的profilin2啟動子序列，用PCR方法，從擬南芥基因組中擴增出profilin2啟動子，並將其克隆到植物表達載體上，以農桿菌介導的葉盤法轉化伽藍菜葉片外植體，獲得轉基因植株。通過檢測GUS基因的表達，發現profilin2啟動子驅動GUS基因在轉基因伽藍菜根、莖、葉維管束中特異表達，從而驗證了Christensen等(PlantJ.10(2)269～279，1996)的結論。
根據本發明這一方面的一個優選實施方案，其中所說的profilin2啟動子指擬南芥(Arabidopsis thaliana，生物型Coloumbia)profilin21667 bp全長啟動子，具有如序列編號2的核苷酸序列或其功能等同物或變異體。
根據本發明這一方面的這一優選實施方案，其中所說的植物表達載體為pPfn1.7(圖1 2)，農桿菌介導的伽藍菜葉盤轉化法及轉基因植株的GUS檢測見(賈士榮等Plant Cell Rep.8336～340，1989；賈士榮，Biotechnology in Agriculture and Forestry，Vol.22234～243，1993)。
對根據本發明這個方面的這一優選實施方案，所用轉基因植物為伽藍菜，但並不限於伽藍菜，可以是任一裸子植物或被子植物如單子葉植物和雙子葉植物，並包括植物細胞、愈傷組織、整株植株及其部分。
迄今為止，國內外尚無人對profilin2啟動子不同區段作功能分析。為此，本發明除構建了1667 bp全長啟動子外，還分別構建了1380、1153、969、597bp的5』端缺失型profilin2啟動子，通過檢測其驅動GUS基因的表達發現1380bp、597bp profilin2啟動子驅動GUS基因在轉基因伽藍菜中組成型表達，表達強度與CaMV35S啟動子相當(圖7，8，9)；1153bp、969bp profilin2啟動子在短暫表達、穩定表達中均不能驅動GUS基因表達。
根據本發明這個方面的一個優選實施方案，其中所說的1380、1153、969、597bp的5』端缺失型profilin2啟動子，分別具有如序列編號1、3、4、5所示的核苷酸序列或其功能等同物或其變異體。
根據本發明這個方面的這一優選實施方案，其中所說的1380、1153、969、597bp的5』端缺失型profilin2啟動子均以PCR法擴增獲得，構建的相應植物表達載體分別為pPfn1.4、pPfn1.2、pPfn1.0及pPfn0.6(見圖13、圖14)。
再一方面，本發明通過分析profilin2全長啟動子及不同的5』端缺失型啟動子驅動GUS基因在轉基因伽藍菜中的表達，推測在-1667～1380 bp區段間存在維管束特異表達的元件和基因表達的負調控序列；在-1380～-1153bp間存在正調控序列；-1153～-597bp區段強烈抑制基因表達，即存在負調控因子；-597～-1bp區段則是profilin2的基本啟動子。
在本發明這個方面的一個優選實施方案中，其中所說的基因為GUS基因，但不限於GUS基因，可以是抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或質量性狀有關的任一目的基因。
再一方面，本發明根據以上實驗推測通過對profilin2啟動子的進一步修飾(包括置換、加入、重複、缺失)，或與其他啟動子融合，可望獲得對植物抗病基因工程具有重要意義的高效的維管束特異表達啟動子。
本發明根據已發表的Profilin 2啟動子序列，(見序列編號1)，設計引物，用PCR方法從擬南芥(Arabidopsis thaliana生物型Coloumbia)總DNA中擴增並克隆了Profilin2啟動子(見序列編號2)。經測序發現擴增所得profilin2啟動子有5處密碼子改變-13及-661bp處各插入一個G，-1185bp處缺失鹼基A，-931及-1609bp處均由T→ C。分析Profilin2啟動子的序列，可見在-139～123bp處存在一個TATA box，在-199～-190處有一個CAAT box，在Christensen(Plant J.10(2)269～279，1996)文章中並未報導。鑑於擴增所得profilin2啟動子在-199～-190bp處的CAATbox區並無鹼基改變，以及在以後的GUS檢測中發現pPfn1.7、pPfn1.4、pPfn0.6均可驅動GUS基因在伽藍菜中表達，故推測-13、-1185及-1609bp處的鹼基改變不會對表達產生明顯影響。
為進一步分析profilin2啟動子及其不同區段的功能，分別構建了pPfn1.7(1667bp profilin2啟動子/GUS)、pPfn1.4(1380bp profilin2啟動子/GUS)、pPfn1.2(1153bp profilin2啟動子/GUS)、pPfn1.0(969bp profilin2啟動子/GUS)、pPfn0.6(597bp profilin2啟動子/GUS)等5種不同長度的Profilin2啟動子驅動GUS基因的植物表達載體(見實施例4、5)。用農桿菌介導的葉盤法轉化伽藍菜葉片外植體(見實施例6)，共培養6d後檢測不同啟動子驅動GUS基因的短暫表達情況。鏡檢觀察發現，pPfn1.4、pPfn0.6驅動GUS基因表達的強度與pBI121(CaMV35S/GUS相當，pPfn1.7的表達弱於35S啟動子，pPfn1.2及pPfn1.0未檢測到GUS基因的表達。檢測不同啟動子驅動GUS基因在轉基因植株中的穩定表達發現pPfn1.7驅動GUS基因在轉基因伽藍菜的根、莖、葉中均呈維管束特異表達，但表達強度弱於CaMV35S啟動子；pPfn1.4、pPfn0.6在轉基因植株的根、葉、莖中均為組成型表達，強度與CaMV35S啟動子相當；pPfn1.2、pPfn1.0不能驅動GUS基因表達。由此推測profilin2啟動子-1667～1380 bp區段間存在維管束特異表達的元件和基因表達的負調控序列；在-1380～-1153bp間存在正調控序列；-1153～-597bp區段強烈抑制基因表達，即存在負調控因子；-597～-1bp區段則是profilin2的基本啟動子。
由於pPfn1.2、pPfn0.6在轉基因伽藍菜中驅動GUS基因組成型高表達，因此可以預見-1380及-597bp片段至少在雙子葉植物中有可能與35S啟動子一樣地有用。此外通過對profilin2啟動子的進一步修飾(包括插入、缺失、置換、重複等)可望獲得良好的維管束特異表達啟動子，對植物抗維管束病害基因工程具有重要意義。
實施例實施例1Profilin2全長啟動子的PCR擴增、克隆及酶切鑑定本實施例描述Profilin2全長啟動子的PCR擴增、克隆及酶切鑑定。
本實施例以擬南芥總DNA為模板，根據已發表的profilin2啟動子序列設計PCR引物A1、A2，擴增獲得profilin2全長啟動子，用Hind III/PstI雙酶切，將其連接到pUC19(Hind III/Pst I)上，得到pPfn，酶切鑑定連接正確，見圖1。
5』端引物A1CCCAAGCTTCTTACAATGTTCCHind III3』端引物A2AACTGCAGCTTTCTTCTTCTCCPstI
PCR擴增條件為94℃， 30″，56℃，30″，72℃，1′。
實施例2Profilin 2啟動子的亞克隆本實施例描述Profilin 2啟動子的亞克隆本實施例提取pPfn質粒DNA，利用profilin 2啟動子-1153 bp處的EcoR I位點，回收EcoR I/PstI雙酶切約1.2 kb的目的片段，克隆到載體pBluescript KS(本實驗室保存)上，得到pPfk，經酶切鑑定連接正確，見圖2。
實施例3Profilin2啟動子的測序本實施例描述Profilin2啟動子的測序本實施例對pPfn、pPfk測序，測序結果表明PCR擴增所得profilin2啟動子的序列與已報導的序列基本一致，有5處發生鹼基改變，即在-13及-661 bp處均插入一個鹼基G；-931及-1609 bp處T均改為C；-1185 bp處缺失一個鹼基A，見圖3。
根據真核生物基因啟動子結構的一般特徵，CAAT box的序列為C(T)A2～5G (T)NGA2～4TT；TATA box的序列為TC(G)TATAT(A)A1～3C(T)A。據此推測在Profilin2啟動子的-139～123處存在一個TATAbox，在-199～-190處有一個CAAT box，見序列編號2。
實施例4植物表達載體pPfn1.7的構建本實施例描述植物表達載體pPfn1.7的構建本實施例提取pPfn質粒DNA，用HindIII/BamHI雙酶切，回收1.7kb片段，連接到pBI121(HindIII/BamHI)上，得到pPfn1.7，酶切鑑定正確，見圖3。
實施例5Profilin2不同長度缺失啟動子表達載體的構建本實施例描述Profilin2不同長度缺失啟動子表達載體的構建1)pPfn1.4、pPfn1.0、pPfn0.6的構建本實施例以pPfn質粒DNA為模板，利用所設計的引物B/E、C/E、D/E(見材料與方法)，分別進行PCR擴增，回收目的片段，用HindIIl/BamHI雙酶切，連接到pBI121(HindIII/BamHI)上，即以不同長度的Profilin2啟動子取代CaMV35S啟動子，獲得pPfn1.4、pPfn1.0、pPfn0.6，酶切鑑定連接正確，見圖4。
profilin2啟動子5』端不同長度缺失的引物pPfn1.4、pPfn1.0、pPfn0.6的3』端引物均為E。
3`端引物ECGGGATCCTTCTTCTTCTCCGGCGAGBamHIpPfn1.45`端引物BGAGAAGCTTGCATTATCATAATCTHindIIIPCR擴增條件為94℃， 30″，56℃，30″，72℃，1′。
pPfn1.05`端引物CCACAAGCTTCACTTTGAATCAATHindIIIPCR擴增條件為94℃， 30″，57℃，30″，72℃，1′。
pPfn0.65`端引物DTGTAAGCTTCATTTGTTCCAATHindIIIPCR擴增條件為94℃， 30″，52℃，30″，72℃，1′。
(2)pPfn1.2的構建本實施例提取pPfk質粒DNA，用Hind III/BamHI雙酶切，回收約1.2kb目的片段，連接到pBI121上，得到pPfn1.2，酶切鑑定連接正確，見圖5。
至此獲得了profilin2啟動子全長1667 bp(pPfn1.7)及1380(pPfn1.4)、1153(pPfn1.2)、969(pPfn1.0)、597bp(pPfn0.6)等五種不同長度啟動子/GUS的植物表達載體。
實施例6伽藍菜的轉化及GUS基因的短暫和穩定表達本實施例描述以pPfn1.7、pPfn1.4、pPfn1.2、pPfn1.0、pPfn0.6、pBI121(35S啟動子，用作對照)六種雙元表達載體轉化伽藍菜葉片外植體，研究不同長度profilin2啟動子驅動GUS基因的短暫表達和穩定表達本實施例以Promega公司WizardTMPlus Minipreps DNA純化Kit提取質粒DNA，轉入根癌農桿菌LBA4404，並以卡那黴素篩選轉化子，分別獲得上述pPfn1.7、pPfn1.4、pPfn1.2、pPfn1.0、pPfn0.6、pBI121(35S啟動子，用作對照)六種雙元表達載體。用伽藍菜頂部1～3片展開葉作外植體，在C1培養基上共培養6 d後，取部分外植體檢測GUS基因的短暫表達，其餘外植體轉至含卡那黴素(Kan)40、羧苄青黴素(Carb)500mg/L的C2培養基上誘導芽分化，6周後開始有芽出現，將芽轉至伸長培養基上繼續選擇培養，待芽長出2～3片葉後轉至生根培養基上進行生根選擇。取再生植株頂部的1～2葉，徒手切成約0.5mm薄片，浸入適量X-gluc溶液中(96孔板)，用parafilm封口，37℃避光放置過夜。鏡檢前，以FAA固定15min，之後分別用75％、85％、95％、100％乙醇脫色，除去葉綠素。
6.1 Profilin2/GUS基因的短暫表達用pPfn1.7、pPfn1.4、pPfn1.2、pPfn1.0、pPfn0.6以及pBI121等6種雙元表達載體轉化伽藍菜葉片外植體，共培養6d後檢測不同啟動子驅動GUS基因的短暫表達情況，鏡檢觀察發現，pPfn1.4、pPfn0.6驅動CUS基因表達的強度與CaMV35S相當，pPfn1.7的表達弱於35S啟動子，pPfn1.2及pPfn1.0未檢測到GUS基因的表達，見圖6。
6.2 Profilin2/GUS基因的穩定表達1)獲得pBI121轉基因植株20株，均呈組成型表達(圖7、8、9)。
2)獲得pPfn1.7轉基因植株49株，檢測了19株，發現GUS基因在轉基因伽藍菜的根、莖、葉中均呈維管束特異表達(圖7、8、9)。
3)獲得pPfn1.4轉基因植株21株，在根、莖、葉中均為組成型表達(圖7、8、9)。
4) pPfn1.2，31株；pPfn1.0，23株。經全部檢測，未檢測到GUS基因的表達。
5)獲得pPfn0.6轉基因植株20株，在根、莖、葉中均為組成型表達(圖7、8、9)。序列表(1)序列編號1資料(i)序列特徵(A)名稱profilin2啟動子(B)長度1667bp(C)類型核苷酸(D)鏈型單鏈(E)拓撲結構線型(F)分子類型profilin2啟動子核苷酸序列(ii)假定的非(iii)反義非(iv)片段類型5』端(v)序列描述序列編號1AATCTTCTTACAATGTT CCACCACCTA-1641CATTTTTTTA TAAGGCCATTGTTTCTCCTA TTTTTTTCCT-1601TTGGGTGATT TGCATCTCTTTCTCTAATTG ATATTATAAG-1561TTTTGGGCTA ATGGACCTTCCTGGTTTCTC CCCATAGCAA-1521ACTTTTAAGA AAGCTGAAGCCTAAAAGGCT TTTACTCTCT-1481TTGCCTTGGT TTCTTATTTATATGCATGTT TTAGTTGTTT-1441TCTCTTTGCT TTTTTGTCAATTGCATTCTG TCTACTACAC-1401TAAATATTAA CGTATTGATTGAGAAAATTG CATTATCATA-1361ATCTATAGAA AATTGTATGTAGTGTAGTAG AGACATTAAT-1321CTCACAATAC TAAAAACACTTTCAAAATTT ACACGAGCAT-1281TTAACACATA CATCAACACTCATTATTTAC AACAGAAGAA-1241AAAACTGATA CGCAACGCAATCTTTCCTAG TGATTTCATT-1201CGTAAGAAAG AAAAAATGAACATGAGAAAG AAAAATGGCA-1161ACAGGCAGAA TTCATTCATCAACTTTAATC TTTAATAGGA-1121AAGTAATAAT AGTACAATTATGTCGGAAAA TCATTCCCAT-1081CCCATCTGTC TTTATTATGTGCTAATCTAA CAGCTCATCG-1041AGAAATCGAA TCTCAGTCTT TTTTCCCTAT TATTACATTA -1001TCACTTAGAT ATAAGGAAAT TTTTGTTATC 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權利要求
1.擬南芥profilin2啟動子，其特徵在於在轉基因植物中，-1667bp～-1bp區段驅動目的基因維管束特異表達；-1380bp～-1bp區段、-597～-1bp區段驅動目的基因組成型表達，表達強度強於CaMV35S啟動子；-1153～-1bp、-969～-1bp區段不能驅動目的基因表達。
2.根據權利要求1的啟動子，其中所說的擬南芥profilin2啟動子包括具有擬南芥profilin2啟動子-1667～-1bp區段間任何長度核苷酸序列的啟動子。
3.根據權利要求1和2，其中所說的啟動子具有如序列表中序列編號1、2、3、4、5所示任一核苷酸序列或其截短的功能等同物或變異體或以任何組合方式(包括置換、加入、重複、缺失)形成的、或與其他啟動子連接形成的融合啟動子。
4.根據權利要求1至3，其中所說的轉基因植物是指任何一種裸子植物和被子植物，如單子葉植物或雙子葉植物，包括植物細胞、愈傷組織、完整植株及其部分。
5.根據權利要求1至4，其中所說的目的基因包括但不限於抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或品質性狀有關的結構和調控基因。
6.攜帶根據權利要求1至3任何一項中的啟動子的重組表達載體。
7.根據權利要求6，其中所說的重組表達載體包括任何可用於轉化真核生物的重組表達載體。
8.由權利要求1至7的重組表達載體轉化所形成的轉基因真核生物，以及由此產生的外源基因表達產物，其中首選轉基因植物及其產品。
9.根據權利要求1～8，其中所說的植物包括由轉基因植物作為親本雜交或轉育所產生的植物。
全文摘要
本發明涉及擬南芥profilin2啟動子,其特徵在於:在轉基因植物中,－1667bp～－1bp區段驅動目的基因維管束特異表達;－1380bp～－1bp區段、－597～－1bp區段驅動目的基因組成型表達,表達強度強於CaMV35S啟動子;－1153～－1bp、－969～－1bp區段不能驅動目的基因表達。本發明還涉及攜帶上述啟動子的重組表達載體以及由所述的重組表達載體轉化所形成的轉基因真核生物,以及由此產生的外源基因表達產物。
文檔編號C12N15/113GK1262328SQ9910039
公開日2000年8月9日 申請日期1999年1月28日 優先權日1999年1月28日
發明者賈士榮, 劉昱輝 申請人:中國農業科學院生物技術研究中心