防治家禽呼吸道疾病的中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑的製作方法
2023-12-10 07:55:47
本發明涉及獸藥與飼料添加劑領域，具體地涉及一種防治家禽呼吸道疾病的新型中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑和氣霧劑。
背景技術：
雞上呼吸道感染是指雞上呼吸道受病原微生物侵襲所致的疾病。雞常見呼吸道病主要由病毒、細菌和敗血黴形體等引起，其臨床的主要特徵為流淚、流鼻涕、咳嗽、氣喘、羅音和呼吸困難、眼腫。常見有傳染性喉氣管炎和傳染性支氣管炎(冠狀病毒屬傳染性支氣管炎病毒引起)等，該病多發生於春季的3～6月份，病傳播快，感染率高，死亡率與環境、管理及雞的個體健康狀況有關，一般其死亡率一般在10％～40％，繼發性感染死亡率則更高，產蛋率下降20％左右，甚者下降50％，此類疾病對雞的生產性能，甚至對養雞業的發展危害極大。據國外學者的一項專題調查統計，南美北部的養雞戶中，呼吸道疾病的治療支出費用佔雞所有疾病總支出的59％，其中死亡支出為46.56％，藥物支出佔治療費用的65％。中獸醫認為，造成呼吸道病主要是外感病邪所致，治療原則:清熱解毒、通利咽喉、止咳化痰。
家禽呼吸道病主要是指家禽呼吸道感染性病症，如家禽慢性呼吸道病、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、麴黴菌病等。這些常見、多發的傳染性疾病，嚴重的影響了家禽生長發育，以至造成大批死亡，給家禽生產帶來巨大損失。防治此類疾病，由於多採用抗生素和化學藥物，且由於應用的不規範、不合理，經長期應用後，除了藥物毒性較大容易造成藥物中毒以外，還導致抗藥性和藥物在禽蛋產品中的殘留，被人攝食後，屢有中毒事件發生，以至造成人群慢性中毒、致畸、致癌等不良後果。對此，國內外均越來越引起高度重視。2001年，國家農業部頒發的《無公害食品標準》中明確規定減少化學藥品和抗生素的使用，禁止使用激素或其他有激素作用的物質及催眠鎮靜類藥物等等，因此，以高效、低毒、低殘留為主攻方向，研製微生物製劑、開發現代中獸藥及發展和充分利用生物技術搞好畜禽疾病防治已成為當前獸藥界的努力方向和熱門話題。運用中獸藥不但可防治雞病毒性呼吸道疾病，而且對細菌性疾病、真菌性疾病等也具有顯著療效。今後應繼續開展中獸藥防治雞呼吸道疾病的研究，通過分析、分離和提取其主要有效成分，為人工合成提供研究基礎。對中獸藥抗病毒、抗菌以及防治機理方面進行進一步的研究。
野馬追為菊科植物輪葉澤蘭(eupatorium)多年生草本，分布於華東、華南、華北、東北及臺灣等地。盛產於江蘇、安徽等地區，其它各省也有分布，藥源豐富，並可引種野生為家種。中醫藥理論認為野馬追有化痰止咳、清熱解毒、利尿消腫、降壓的功能，用於感冒、咳嗽多痰、頭疼、扁桃體炎、菌病、高血壓。常用於治療慢性氣管炎，支氣管炎，高血壓等疾病。野馬追中含有豐富的微量元素，主要以fe、al、si為主，其次為sr、ti、mn、ba，再次為zn、b、pb、v、cu。據報導，中藥中的微量元素常與有機酸、胺基酸、肽等成分絡合，產生協同作用而增強其療效。另外，儘管微量元素在人的機體內只佔總質量的萬分之一以下，但它們在整個生命活動中卻發揮了巨大作用。微量元素參與機體各種酶及活性物質的代謝，維持機體內環境的平衡。經過對野馬追活性篩選提示乙酸乙酯提取部位為主要活性部位，並從中分離得到6種黃酮類化合物，結構鑑定為：棕矢車菊素、山奈酚、槲皮素、黃芪苷、三葉豆苷、金絲桃苷。
卵黃免疫球蛋白(eggyolkimmunoglobulin,lgy)具有增強機體抗菌、免疫功能，採用生物技術從產蛋雞卵黃中製備特異性多克隆免疫球蛋白，具有成本低，產量高的特點。igy能夠凝聚、吞噬和中和細菌及毒素成分，增強免疫系統功能，預防呼吸道等疾病，促進營養吸收，用於家禽的保健和疾病治療等。
近年來，在畜禽呼吸道疾病防治方面，中獸藥的研究開發和生物技術的應用取得了明顯的進展。但大多藥物作用重在治標，呼吸道疾病又多有反覆發作，往往呈現防不勝防之勢。有些生物製品能增強動物免疫功能，然而目前應用還不廣。利用中獸藥防治家禽呼吸道病或者利用免疫球蛋白等生物製劑增強家禽自身免疫功能的研究只見於單項研究報告，而中獸藥與免疫球蛋白有機結合治療禽呼吸道病鮮有報導。
由於家禽呼吸道病的血清型較多，臨床免疫預防效果不好，治療上也沒有特效藥物。採取被動免疫不失為一種有效的措施，為此發明人進行了中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑對蛋雞傳染性支氣管炎治療效果的應用試驗。使用中獸藥與卵黃免疫球蛋白結合治療家禽呼吸道疾病，能達到低毒、低殘留甚至無毒無殘留的目的，其禽蛋產品可為綠色和無公害食品，從而保證了食品的安全性，有利於衝破一些國家對我國禽蛋產品出口的制約，贏得國際市場，擴大對外貿易。
技術實現要素：
本發明提供了一種防治家禽呼吸道疾病的中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑，所述製劑由中獸藥粉劑或中獸藥提取物粉劑和卵黃免疫球蛋白組成。
優選地，所述中獸藥包括但不限於野馬追。
優選地，所述中獸藥包括但不限於野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子和茯苓。
在一個實施方案中，野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子和茯苓的質量比為1～10:1:1:1:1:1:1:1:1。
在一個實施方案中，所述中獸藥粉劑是通過微粉碎機粉碎後混合製備的。
在一個實施方案中，所述中獸藥提取物粉劑是通過乙酸乙酯浸泡、超聲、濃縮和冷凍乾燥後製備的。
優選地，所述卵黃免疫球蛋白是使用市購或自製的呼吸道病原微生物單價或多價疫苗(如雞新城疫－傳染性支氣管炎－禽流感三聯滅活疫苗或雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯疫苗)免疫蛋雞後得到的，將免疫蛋雞得到的雞蛋經乙酸-乙酸鈉緩衝液提取水溶性成分，超濾和離子交換純化，再經冷凍乾燥即可得到卵黃免疫球蛋白粉劑。
優選地，所述製劑中中獸藥粉劑或中獸藥提取物粉劑與卵黃免疫球蛋白的質量比為1：1。
在一個實施方案中，所述複合製劑可以為粉劑、水劑、顆粒劑、氣霧劑或其他劑型。
在一個實施方案中，所述複合製劑為粉劑，可以配製為水溶液或其他適合的載體溶液以灌服方式給藥。
在一個實施方案中，所述複合製劑為氣霧劑，可以通過噴灑以吸入方式給藥，適於大規模的給藥。
發明人篩選了中藥處方，製備了特異性卵黃免疫球蛋白，確定了卵黃免疫球蛋白與中獸藥最佳配比，製備了氣霧劑；進行了抑菌、抑病毒實驗，進行了呼吸道病臨床治療試驗。
雞傳染性呼吸道疾病主要有雞傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、慢性呼吸道病、傳染性鼻炎以及禽大腸桿菌病等。目前治療病毒引起的呼吸道疾病尚沒有特效的西藥，對細菌引起的呼吸道疾病，主要使用抗菌素如高力米先、綠消炎寶、紅黴素、卡那黴素等，可根據不同的病因，採用不同的治療方法對症治療。但細菌對抗菌素易產生抗藥性，且抗菌素毒副作用較大。近年來，我國獸醫工作者根據傳統獸醫學的理論，運用中獸藥防治雞呼吸道疾病，尤其是病毒性呼吸道疾病取得了顯著成績。
中獸藥具有清熱解毒類、固澀類、補虛類、理血類、瀉下類等功效，中獸藥多數對畜禽病原體具有一定的抑制作用。在對一些中獸藥及其方劑進行體外抑菌及抗病毒實驗中，發現許多中獸藥對細菌有一定的抑制作用，其中包括許多對西藥已產生耐藥性的菌株。中獸藥含有豐富的免疫活性物質，如維生素和高級不飽和脂肪酸兼有營養和促進免疫的作用。中獸藥主要機制就是對動物機體的免疫機能進行調節，調節機體自身的抗病機制。中獸藥是免疫促進劑，在疫苗接種前後或同時應用時，可使機體的免疫應答及早出現，維持時間延長，免疫水平提高，增強機體抗病力的中藥製劑或提取物。
中獸藥製劑採用純天然草藥配製而成，卵黃免疫球蛋白是利用高免雞蛋作為抗體生產原料，利用蛋雞作為適於蛋黃抗體生產的反應器，研究卵黃免疫球蛋白對雞的免疫治療，保證抗體來源的持續廣泛性和規模生產的經濟性。雞蛋黃作為特異卵黃免疫球蛋白的來源有許多優點。如：母雞易於飼養，費用不高；收集雞蛋方便，無需抽動物血，無損傷，符合現代動物保護規則；產生有效免疫反應所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳動物蛋白質對種系發生學上距離較遠的禽類通常有較強的免疫原性。
試驗表明，中獸藥與卵黃免疫球蛋白配合使用後，肉雞對傳染性支氣管炎的抵抗力有明顯增強。抗體消長規律同時表明這類複合製劑與氣霧劑在肉雞體內的有效期為18～21d。在疫病流行地區，商品肉雞使用一次中獸藥與卵黃免疫球蛋白複合製劑與氣霧劑，即可控制傳染性支氣管炎的發生和流行，同時相應雞肉也能符合衛生檢疫要求。
中獸藥卵黃免疫球蛋白製劑及其氣霧劑均具有無毒副作用、無耐藥性、無藥物殘留等優點，為抗生素替代品。利用該製劑生產的家禽產品，具有無汙染、無殘留、安全、優質的特點。同時，該項技術在生產中應用不僅解決了在集約化、高密度飼養環境下雞群防病、治病的難題，減少了機體的藥物殘留和飼養過程中有害物質對環境的汙染，而且能向市場提供安全優質的產品，提高了禽類胴體的品質，使消費者吃上放心禽產品，確保市民飲食的安全，社會效益和生態效益十分顯著。
中獸藥與卵黃免疫球蛋白複合製劑與氣霧劑是一種高效安全的綠色添加劑。
中獸藥與卵黃免疫球蛋白複合製劑與氣霧劑效果確實，安全性良好，無副作用，可用於預防傳染性支氣管炎，降低死亡率，提高經濟效益。在食品安全日益重視的情況下，迫切需要能夠有效代替抗生素等的綠色添加劑。中獸藥與卵黃免疫球蛋白複合製劑與氣霧劑正滿足這樣的要求，符合發展綠色畜牧業的需要。因此，中藥卵黃免疫球蛋白複合製劑與氣霧劑必將具有廣闊的開發應用前景。
附圖說明
圖1示出了本發明的技術路線。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明進行詳細說明。但應理解，以下實施例僅是對本發明實施方式的舉例說明，而非是限定本發明的範圍。
實施例
實施例1：中獸藥的提取物和粉劑製備
發明人對治療家禽呼吸道病的中獸藥進行篩選、臨床驗證，確定了基礎的處方為野馬追，最優選為野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子和茯苓的質量比為1～10:1:1:1:1:1:1:1:1。利用超聲波技術與真空冷凍乾燥工藝對中藥成分進行濃縮、提取，製備了中獸藥提取物。
將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，置於具塞三角瓶中，加入5倍體積量的提取溶劑乙酸乙酯，再利用超聲波提取其有效成分，提取前浸泡時間是60-90min。超聲波頻率採用20-40khz，超聲波處理30min，過濾後，濾液減壓濃縮，再加入5倍體積量的提取溶劑，超聲波處理15min，過濾，濾液減壓濃縮，如此重複2次，合併3次提取物的濃縮物，即得到粗提物，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成野馬追提取物粉劑。
將野馬追烘乾後，用微粉碎機粉碎後混合，製備野馬追粉劑。
按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子和茯苓等中草藥1～10:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機粉碎後混合，置於具塞三角瓶中，加入5倍體積量的提取溶劑乙酸乙酯，再利用超聲波提取其有效成分，提取前浸泡時間是60-90min。超聲波頻率採用20-40khz，超聲波處理30min，過濾後，濾液減壓濃縮，再加入5倍體積量的提取溶劑，超聲波處理15min，過濾，濾液減壓濃縮，如此重複2次，合併3次提取物的濃縮物，即得到粗提物，經過低溫冷凍乾燥機或噴霧乾燥製成中獸藥提取物粉劑。
按照野馬追、板藍根、麻黃、桔梗、穿心蓮、魚腥草、黃芪、葶藶子和茯苓等中草藥1～10:1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合，利用微粉碎機粉碎後混合，製成中獸藥粉劑。
實施例2：雞卵黃免疫球蛋白粉劑的研製
選擇健康產蛋母雞，使用市購或自製的呼吸道病原微生物單價或多價疫苗(如雞新城疫－傳染性支氣管炎－禽流感三聯滅活疫苗或雞新城疫一傳染性法氏囊一傳染性支氣管炎三聯疫苗)對蛋雞胸部肌肉分別多點注射，0.5ml/只，每周免疫一次，三次免疫後，免疫球蛋白水平達到高效價後，收集雞蛋。
提取卵黃免疫球蛋白(以乙酸-乙酸納緩衝液方法為例)，雞蛋先用清水洗去蛋殼表面的汙物，浸入0.5％新潔爾滅溶液中，浸泡10分鐘，再用75％的酒精衝洗，無菌打破蛋殼，倒入消毒好的容器中，用滅菌勺分離出卵黃放入無菌容器。1體積蛋黃加9體積的乙酸-乙酸納緩衝液(0.05mol/l,ph為5.2)，攪拌15min，4℃，靜置10小時。離心(4℃，10000g，25min)，取上清液，即取水溶性成分(含有卵黃免疫球蛋白的水溶性蛋白組分water-solublefraction，wsf)，提取液中蛋白質分子量在3.6kda-338kda。
應用平板式膜超濾技術與deae離子交換層析法對上述上清液中的卵黃免疫球蛋白(igy)進行分離純化。首先用平板式膜組件對其超濾，分析了各種因素的影響，確定分子截留量為100kda，操作壓力差為0.12mpa、進料溫度為30℃，ph5.2，截留液抗體回收率達到91.89％，純度為86％；最後，經deae離子交換層析得到高純度的igy。
將所分離的卵黃免疫球蛋白進行真空冷凍乾燥，製備了卵黃免疫球蛋白粉劑。
實施例3：中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑最佳配比選擇
按不同配比，進行中獸藥與雞卵黃免疫球蛋白最佳配比的研究。
按完全隨機設計，將5周齡未免疫aa肉公雞200隻按體重隨機分為4個試驗組和1個對照組，每組40隻雞。按照實施例1所述的中獸藥提取物粉劑與實施例2所述的卵黃免疫球蛋白的不同配比(質量比)分為試驗組i、ii、iii和ⅳ，配比分別為1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2。試驗組每隻雞每天灌服1.5ml中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑的水溶液，對照組灌服1.5ml生理鹽水作安慰劑。
試驗表明，試驗組每天灌服1.5ml中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑，對傳染性支氣管炎的保護率可達到87.5％～97.5％。而灌服生理鹽水的對照組肉雞的保護率僅為12.5％。中獸藥卵黃免疫球蛋白配合使用後，肉雞對傳染性支氣管炎的抵抗力有明顯增強。抗體消長規律同時表明這類複合製劑在肉雞體內的有效期為18～21d。在疫病流行地區，商品肉雞使用一次中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑，即可控制傳染性支氣管炎的發生和流行，同時相應雞肉也能符合衛生檢疫要求。
中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑有提高肉雞生長性能的潛力。在有效防治傳染性支氣管炎的同時，中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑對肉雞的生長有一定的促進作用。試驗結果表明，各組間生長性能指標沒有顯著差異，但試驗各組飼料轉化率都要高於對照組。這也揭示使用複合製劑能提高肉雞生產的經濟效益。卵黃免疫球蛋白和中獸藥在提高機體抗病能力的同時，也有效保證了肉雞的正常生長。中獸藥能作為促生長添加劑使用也已被很多研究所證明。
綜合考慮抗傳染性支氣管炎和促生長的能力，四種配比的中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑中以1：1比例的效果最佳。中獸藥卵黃免疫球蛋白以1：1配比後，對傳染性支氣管炎的保護率高達97.5％，飼料轉化效率也最高(3.52±0.21)，抗體效價水平也較高。1：0.8配比的效果次之，1：0.5，1：0.2的效果相對較差。
實施例4：中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑對肉雞禽流感的保護效果
為研究中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑的效用，觀察不同配比中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑在aa肉公雞日糧中的應用。按照實施例1所述的中獸藥提取物粉劑與實施例2所述的卵黃免疫球蛋白的不同配比分為試驗組i、ii、iii和ⅳ，配比(質量比)分別為1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2。試驗組每隻雞每天灌服1.5ml中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑的水溶液，對照組灌服1.5ml生理鹽水作安慰劑。
試驗表明，經禽流感病毒攻毒後每天灌服1.5ml中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑，對禽流感的保護率可達到87.5％～97.5％。而沒有灌服複合製劑的肉雞的保護率僅為12.5％。中獸藥卵黃免疫球蛋白配合使用後，肉雞對禽流感的抵抗力有明顯增強。抗體消長規律同時表明這類複合製劑在肉雞體內的有效期為18～21d。在疫病流行地區，商品肉雞使用一次中獸藥卵黃免疫球蛋白複合製劑，即可控制禽流感的發生和流行，同時相應雞肉也能符合衛生檢疫要求。
實施例5：中獸藥與雞卵黃免疫球蛋白二聯組合藥物新劑型一氣霧劑的研製
使用實施例1所述的中獸藥提取物粉劑與卵黃免疫球蛋白粉劑按照其乾粉質量比1：1，1：0.8，1：0.5，1：0.2的比例製成複合氣霧劑，分別為樣品i、ii、iii和ⅳ，以及二個對照組，包括全部為中獸藥提取物粉劑的氣霧劑，全部為免疫球蛋白的氣霧劑。
實施例6：不同配比的中獸藥卵黃免疫球蛋白氣霧劑體外抑菌試驗
本試驗利用實施例5所製備的不同配比的中獸藥卵黃免疫球蛋白氣霧劑對禽大腸桿菌分離株(0422)、大腸桿菌(c84010)、大腸桿菌o2型(c84002)、大腸桿菌o78型(c84008)菌株等進行藥敏試驗。結果表明，4種配比的複合製劑對各型禽大腸桿菌都有一定的抗菌活性，mic(最低抑菌濃度，minimuminhibitorycontentration)在15.63g/l至125g/l之間，中獸藥卵黃免疫球蛋白為1：1時禽大腸桿菌敏感性最高，其餘各組對不同血清型的禽大腸桿菌也有較高的敏感性，而兩個對照組效果都明顯不如複合製劑組。
試驗證明：中獸藥卵黃免疫球蛋白氣霧劑可減弱或制止大腸桿菌培養平板上該菌的生長。其防止大腸桿菌附著於腸細胞的這類特性，在抗沙門氏菌方面也得到了證實。卵黃免疫球蛋白與中獸藥之間表現出協同作用，各組都有較好的抑菌作用，其中中獸藥與卵黃免疫球蛋白按1：1進行配合顯示出最大的配伍優勢。卵黃免疫球蛋白和中獸藥複合氣霧劑是一種新型、高效的綠色製劑，將具有廣闊的應用前景。
實施例7：中獸藥卵黃免疫球蛋白複合氣霧劑的體外抑制病毒實驗
對實施例5所製備的不同配比的中獸藥卵黃免疫球蛋白氣霧劑體外抑制病毒的能力進行比較，以確定中獸藥卵黃免疫球蛋白的最佳配比。抑病毒實驗採用兩種方法：病毒致細胞病變抑制實驗和血凝抑制實驗，以產生50％細胞病變的最高藥物稀釋度或不產生凝血的最小藥物濃度為其最小抑病毒的濃度。樣品i對腺病毒7型(adv7)的最小抑制濃度為1/640，作用弱於樣品ii，而對其它病毒的作用都最強。樣品iv除對腺病毒3型(adv3)的最小抑制濃度為1/640，對其餘病毒的抑制作用在4種樣品中最弱。
體外抑制病毒實驗表明，中獸藥卵黃免疫球蛋白配比為1：1的複合氣霧劑對各病毒的抑制效果最強，最能有效防治呼吸道疾病。急性上呼吸道感染有70％～80％由病毒引起，實驗所選7種病毒為呼吸道感染最常見的病毒，尤其是合胞病毒，對呼吸道病毒感染具有一定代表性。
本實驗是相同條件下的體外抑病毒試驗，在臨床實際應用中，因給藥途徑、劑量、作用方式的不同，療效自然有一定差異，但早期能及時氣霧吸入，繼之靜點粉針劑，療效應當很好。
實施例8：中藥免疫球蛋白複合氣霧劑治療傳染性支氣管炎試驗
本試驗研究觀察實施例5所製備的不同配比的中獸藥卵黃免疫球蛋白氣霧劑對蛋雞傳染性支氣管炎的治療效果。選用體重相近的20周齡伊莎蛋雞200隻，採用單因素隨機試驗，隨機分為5個組，每個組設5個重複，每個重複8隻雞。5個組分別作為試驗組i、ii、iii和ⅳ與對照組，試驗組分別吸入中獸藥卵黃免疫球蛋白配比為1：1，1：0.8，1：0.5，1：0.2的複合氣霧劑，連用7天觀察後對免疫器官指數的影響，經雞傳染性支氣管炎病毒攻毒後觀察各組免疫保護效果，並在臨床上加以觀察利用。試驗結果表明，中獸藥卵黃免疫球蛋白複合氣霧劑(配比1：1)能促進蛋雞法氏囊發育，對傳染性支氣管炎有很好的免疫保護效果。吸入複合氣霧劑對傳染性支氣管炎有較好的保護作用，保護率在85％～100％範圍內。其中，以試驗組i(配比1：1)效果最優，保護率達100％。利用複合氣霧劑(配比為1：1)進行緊急治療，結果對三個雞場發病雞的治癒率分別為91.16％、96.02％、91.22％，表現出較好的治療效果。