一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法與流程
2023-12-03 06:35:16
本發明涉及一種光譜檢測方法，具體是一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法。
背景技術：
胱氨酸(cystine，Cys) (C6H12N2O4S2，Mr=240.30)是兩分子半胱氨酸經氧化得到的胺基酸，是一種含硫胺基酸，屬於二硫化物類，學名「二(β-硫-α-氨基丙酸)」；是構成蛋白質的基本單位，廣泛存在於頭髮、骨、角蛋白中，人發中的含量約為5％（以質量計），人體中的正常值為4.40～11.52μmol/L。
胱氨酸在醫藥上作為營養強化劑，有促進機體細胞氧化和還原功能，改善肝臟功能、促使白細胞增生等作用，並可中和毒素、阻止病原菌生長；由於胱氨酸在生理學研究中的重要性，是應用廣泛的胺基酸類藥物；胱氨酸片劑收載在《中華人民共和國藥典》（2015年版）（二部）（化學藥品1896），採用的是傳統的溴酸鉀滴定比色法，操作繁瑣且誤差較大；隨著技術發展，相關儀器分析方法研究甚多，目前報導的有原子發射光譜法（ICP-AES ）、胺基酸分析儀測定法（AA）、高效液相色譜法（HPLC） 、分光光度法(UV)、高效毛細管電泳法(HPCE) 、電化學法（EC）、流動注射螢光光度法(FI-FL)、高效液相色譜－質譜法（HPLC-MS）等；這些方法常受到共存胺基酸的幹擾，對非單一胱氨酸體系選擇性不好；電化學分析法通常採用不同種類的胺基酸選擇性電極對各種胺基酸進行測定；利用胱氨酸在電極上發生氧化反應時所呈現出的電活性，可不經衍生化處理，利用胱氨酸與金屬離子配位反應可間接測定其含量，但是存在幹擾較大的問題；高效液相色譜法特別是對柱前衍生-反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析方法更加靈敏（可測知<1pmol水平）和快速（完成一種蛋白質的水解、分離和測定只需12～30min）；但RP-HPLC要求將胺基酸在柱前轉化為適於反相色譜分離並能被靈敏檢測的衍生物，因此，存在儀器設備昂貴，衍生化試劑較難選擇且衍生化時間長衍生化產物組分複雜等問題；其他儀器分析方法均需通過顯示劑對胱氨酸進行衍生化後間接測定，存在衍生化時間長、衍生化產物組分複雜和穩定性差等問題。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法，該方法包括以下步驟：
步驟一：胱氨酸標準溶液的配製，用電子天平稱取1.2015g的L-胱氨酸，用適量的氫氧化鈉溶解，調節pH，並用蒸餾水定容至50mL的容量瓶中，配製成0.1mol∕L的溶液，之後可以根據需要將儲備液進行稀釋，臨用配製作為操作液；
步驟二：稱取0.6057g的三羥甲基氨基甲烷（Tris），用蒸餾水溶解並定容至50mL的容量瓶中，配製成0.1mol/L的溶液；將50mL0.1mol/L Tris溶液與7.0mL0.1mol/L的鹽酸混勻並稀釋至100mL，配製成0.05mol/L的Tris-HCl緩衝溶液；
步驟三：螢光光譜的實驗，準確移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸標準溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl緩衝溶液，再加蒸餾水定容L，搖勻，室溫靜置15 min；在水浴加熱後，於Cary Eclipse 和F-7000螢光分光光度計上測量；設置各項螢光光譜測量參數如下：激發波長：410 nm；狹縫比5.0nm/5.0nm；發射光譜波長範圍：415～700 nm；掃描速度：中速； 將反應後胱氨酸溶液在FLS920螢光光譜儀上測定其螢光量子產率，在FS5螢光光譜儀上測定螢光壽命；
步驟四：胱氨酸片樣品的螢光光譜測定；準確移取市售胱氨酸片10片，用研缽研細，用電子天平準確稱取0.1g，加到10mL潔淨乾燥的比色管中，加少量鹼溶後加水定容超聲溶解後，過濾；取1mL於10mL潔淨乾燥的比色管中，加的Tris-HCl緩衝溶液，再加蒸餾水定容，搖勻，室溫靜置15 min；水浴加熱後，製成溶液；於螢光分光光度計上，設置狹縫5.0nm/5.0nm，最佳激發波長Ex=410nm，在415～700nm掃描範圍內進行螢光光譜分析；同時用二次水進行空白實驗。
作為本發明進一步的方案：所述Tris-HCl緩衝溶液的pH=8.9。
作為本發明再進一步的方案：所述Tris-HCl緩衝溶液用量為5mL。
所述水浴加熱時間為12小時。
作為本發明再進一步的方案：所述水浴加熱的加熱溫度為90℃。
作為本發明再進一步的方案：按實驗方法中的步驟，取反應後鹼性胱氨酸溶液於螢光分光光度計上連續測定標準溶液螢光9次，取其螢光強度計算其標準偏差為6.119，則RSD值為1.08%，偏差較小，說明該螢光體系有較好的精確性。
作為本發明再進一步的方案：所述螢光強度在一定範圍內隨著胱氨酸濃度的增加而增強，線性範圍為1×10-4mol/L -1×10-3 mol/L，相關係數r=0.9927擬合的線性方程為：Y=-19.02+4.524×104C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10-5mol/L，K為工作曲線的斜率。
作為本發明再進一步的方案：取1支25mL潔淨乾燥的比色管，按實驗方法中的步驟，在水浴溫度90℃下加熱12小時，於2小時內在螢光分光光度計上每隔10min測定其螢光強度，結果表明，在後100min內螢光強度基本不變。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明精密度高，準確度好；反應條件溫和，所用儀器成本較低；無需複雜前處理過程，操作過程簡單，省時省力；所用溶劑簡單易得，對操作人員傷害小，汙染少。
附圖說明
圖1為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法的胱氨酸螢光光譜圖。
圖2為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法的螢光壽命圖。
圖3為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法中不同pH值螢光強度的影響示意圖。
圖4、5為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法的緩衝溶液的用量對螢光強度的影響示意圖。
圖6為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法中加熱時間對螢光強度的影響示意圖。
圖7、8為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法的加熱溫度對螢光強度的影響示意圖。
圖9為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法中體系的穩定性實驗示意圖。
圖10、11為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法的胱氨酸標準溶液的工作曲線示意圖。
圖12為一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法中胱氨酸片含量測定結果（n=6）。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
請參閱圖1～12，本發明實施例中，一種胱氨酸片中胱氨酸含量的直接螢光光譜檢測方法，該方法包括以下步驟：
步驟一：胱氨酸標準溶液的配製，用電子天平稱取1.2015g的L-胱氨酸，用適量的氫氧化鈉溶解，調節pH，並用蒸餾水定容至50mL的容量瓶中，配製成0.1mol∕L的溶液，之後可以根據需要將儲備液進行稀釋，臨用配製作為操作液；
步驟二：稱取0.6057g的三羥甲基氨基甲烷（Tris），用蒸餾水溶解並定容至50mL的容量瓶中，配製成0.1mol/L的溶液；將50mL0.1mol/L Tris溶液與7.0mL0.1mol/L的鹽酸混勻並稀釋至100mL，配製成0.05mol/L的Tris-HCl緩衝溶液；
步驟三：螢光光譜的實驗，準確移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸標準溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl緩衝溶液，再加蒸餾水定容L，搖勻，室溫靜置15 min；在水浴加熱後，於Cary Eclipse 和F-7000螢光分光光度計上測量；設置各項螢光光譜測量參數如下：激發波長：410 nm；狹縫比5.0nm/5.0nm；發射光譜波長範圍：415～700 nm；掃描速度：中速； 將反應後胱氨酸溶液在FLS920螢光光譜儀上測定其螢光量子產率，在FS5螢光光譜儀上測定螢光壽命；
步驟四：胱氨酸片樣品的螢光光譜測定；準確移取市售胱氨酸片10片，用研缽研細，用電子天平準確稱取0.1g，加到10mL潔淨乾燥的比色管中，加少量鹼溶後加水定容超聲溶解後，過濾；取1mL於10mL潔淨乾燥的比色管中，加的Tris-HCl緩衝溶液，再加蒸餾水定容，搖勻，室溫靜置15 min；水浴加熱後，製成溶液；於螢光分光光度計上，設置狹縫5.0nm/5.0nm，最佳激發波長Ex=410nm，在415～700nm掃描範圍內進行螢光光譜分析；同時用二次水進行空白實驗。
所述Tris-HCl緩衝溶液的pH=8.9。
所述Tris-HCl緩衝溶液用量為5mL。
所述水浴加熱時間為12小時。
所述水浴加熱的加熱溫度為90℃。
按實驗方法中的步驟，取反應後鹼性胱氨酸溶液於螢光分光光度計上連續測定標準溶液螢光9次，取其螢光強度計算其標準偏差為6.119，則RSD值為1.08%，偏差較小，說明該螢光體系有較好的精確性。
所述螢光強度在一定範圍內隨著胱氨酸濃度的增加而增強，線性範圍為1×10-4mol/L -1×10-3 mol/L，相關係數r=0.9927擬合的線性方程為：Y=-19.02+4.524×104C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10-5mol/L，K為工作曲線的斜率。
取1支25mL潔淨乾燥的比色管，按實驗方法中的步驟，在水浴溫度90℃下加熱12小時，於2小時內在螢光分光光度計上每隔10min測定其螢光強度，結果表明，在後100min內螢光強度基本不變。
對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。