一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法
2023-12-05 03:43:36 1
一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法
【專利摘要】本發明涉及一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法。該方法包括如下步驟：（1）單細胞的獲取：選擇鐵線蓮植株葉片，消毒後研磨，過濾得到沉澱的單細胞；（2）初代培養：把單細胞加入到液體MS培養基中，培養基中抗生素和抗真菌農藥，放入搖床中培養；（3）固體培養：將細胞懸浮培養液用篩網過濾，得到單細胞懸浮液，將單細胞懸浮液與固體MS培養基混合，混合液倒入培養皿中，培養皿置於培養箱中培養；（4）繼代培養：挑取生長良好的單細胞團接入液體MS培養基中培養；（5）發酵培養：繼代培養15±3天後，將培養物置於4-10℃冷處理8-12小時，再常規培養7±2天。該方法能將細胞培養物中的總黃酮含量提高5倍左右。
【專利說明】一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞培養法生產天然產物【技術領域】，具體為一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法。
【背景技術】
[0002]湖州鐵線蓮為毛茛科Ranuncul aceae鐵線蓮屬植物，別名:吳興鐵線蓮，河邊威靈仙，金剪刀，金剪刀草，銅腳威靈仙等。形態特徵為:草質藤本，莖有6稜，疏生彎曲的短柔毛或後變無毛；葉為單數羽狀複葉，小葉9片，最下面的小葉長1.2~~1.5寸，3深裂或3全裂，裂片狹卵形，全緣，上面無毛，下面有貼生的短粗毛，而葉脈上的毛較密，其他小葉逐漸變小，2或3裂，或不裂；莖上部的葉較少，小葉7片，卵形至圓卵形，花I至3朵成腋生的聚傘花序，花梗有對生的苞片2片，3裂或不裂；萼片4，白色，短圓狀倒披針形，外面有毛；雄蕊多數，花絲短而寬；雌蕊約12枚，密生長柔毛；花期7月。湖州鐵線蓮主要分布在浙江東北部平原地區，常生溝邊、河岸潮溼地方，夏、秋季採全草鮮用，或曬乾備用，性辛、溫，具有祛風溼，通絡止痛，抗癌，天灸等功效，可以用於治療腦瘤、深部膿腫、風溼關節痛等。
[0003]野生湖州鐵線蓮在湖州的分布範圍很窄，自然繁殖緩慢，加上生長環境不斷惡化，野生資源已瀕衰竭，人工栽培方法雖然能解決數量問題，但是人工栽培過程中，沒有辦法控制藥材中有效成分的含量，造成藥材質量的不穩定，採用細胞懸浮培養技術生產藥用活性成分，不僅可以解決中藥野生資源和土地匱乏問題，也可以有效控制有效成分含量。
[0004]利用植物細胞懸浮培養雖然能夠生產天然活性成分，但是往往由於培養物中目標次生代謝產物量少而成為制約工業化應用的主要因素，常用的提高產量的方法有培養條件優化，加前體物質，添加酵母提取物、重金屬、紫外線等刺激因子。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法。
[0006]實現上述發明的技術解決方案是:一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法，包括如下步驟，
[0007](1)單細胞的獲取:選擇生長旺盛的鐵線蓮植株葉片，消毒，放入研缽中，加入緩衝液，研磨，篩網過濾，取濾液，離心得到沉澱的單細胞；
[0008](2)初代培養:把單細胞加入到液體MS培養基中，培養基中另加入常規劑量的抗生素卡那黴素或氨苄黴素，再加入常規劑量的抗真菌農藥代森錳鋅或多菌靈或惡黴靈或甲基硫菌靈或氟喹唑，放入搖床中培養，培養條件:光照時間16h/d，光照強度1500-20001x，溫度25 °C ±1°C，搖床轉速120r/min ；
[0009](3)固體培養:將細胞懸浮培養液用篩網過濾，濾液離心處理後棄去上清液，得到單細胞懸浮液，將單細胞懸浮液與固體MS培養基混合，混合液倒入培養皿中，混合前固體MS培養基的溫度為40°C ±3°C，培養皿置於培養箱中在25°C ± 1°C的條件下光照培養12d ;[0010](4)繼代培養:挑取生長良好的單細胞團接入液體MS培養基中培養，培養條件:光照時間16h/d，光照強度1500-20001x，溫度25°C ±1°C，搖床轉速120r/min ；
[0011](5)發酵培養:繼代培養15±3天後，將培養物置於4-10°C冷處理8_12小時，再常規培養7±2天。
[0012]作為進一步的技術方案，所述步驟(3)中，將單細胞懸浮液與固體MS培養基混合前，將單細胞懸浮液中的單細胞密度調整至104-105個/ml。
[0013]作為再進一步的技術方案，所述步驟(3)中，單細胞懸浮液與固體MS培養基以1:1的體積比混合。
[0014]本發明的主要有益效果有:
[0015](1)提高了細胞培養物中總黃酮的含量，相比同等條件下不進行冷處理的培養物，總黃酮的含量可以提高5倍；
[0016](2)相比通過物理方法提高次生代謝產物的途徑，如紫外線照射等，本方法具有操作簡便，容易實施的優點；
[0017](3)相比通過生物學方法提高高次生代謝產物的途徑，如添加糖蛋白、多糖、真菌等，本方法具有成本低等優點。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:
[0019]一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法，包括如下步驟，
[0020](1)單細胞的獲取:選擇生長旺盛的鐵線蓮植株葉片若干，作為外植體備用；將鐵線蓮葉片先用清水衝洗60分鐘，剪除枝幹再用蒸餾水洗3次，在酒精70%-75%消毒15-30s，無菌水衝洗3次,抗真菌農藥浸泡25min,最後用無菌水衝洗5次,用無菌濾紙吸乾材料表面水分；將消毒過的外植體放入研缽中，加入緩衝液，研磨數分鐘，然後用61μπι不鏽鋼篩網過濾，棄濾渣，取濾液，得到細胞懸浮液；將懸浮液用1000 μ L移液槍吸入1.5ml規格的EP管中，在5500r/min的轉速下離心20min,得到沉澱的單細胞；
[0021](2)初代培養:在超淨臺上用槍將單細胞加入到液體MS培養基中，培養基中另加入常規劑量的抗生素卡那黴素或氨苄黴素，每100ml液體MS培養基中加入100 μ L卡那黴素，或每100ml液體MS培養基中加入50 μ L氨苄黴素；再加入常規劑量的抗真菌農藥代森錳鋅或多菌靈或惡黴靈或甲基硫菌靈或氟喹唑，抗真菌農藥的加入量為每100ml液體MS培養基中加入20 μ L ;之後放入搖床中培養，培養條件:光照時間16h/d,光照強度1500-20001x，溫度 25 0C ±1°C，搖床轉速 120r/min ；
[0022](3)固體培養:將細胞懸浮培養液用61 μ m不鏽鋼篩網過濾，濾液離心處理後棄去上清液，得到單細胞懸浮液，將單細胞懸浮液中的單細胞密度調整至104-105個/ml，之後將單細胞懸浮液與固體MS培養基以1:1的體積比混合，混合液倒入無菌的直徑為9cm的培養皿中，水平放置，待瓊脂冷卻凝固後，密封皿口 ；混合前固體MS培養基的溫度為400C ±3°C，培養皿置於培養箱中在25°C ±1°C的條件下光照培養12d ;
[0023](4)繼代培養:挑取生長良好的單細胞團接入液體MS培養基中培養，每7天繼代I次，培養條件為:光照時間16h/d，光照強度1500-20001x，溫度25°C ±1°C，搖床轉速120r/min ；[0024] (5)發酵培養:繼代培養15±3天後，將培養物置於4-10°C冷處理8_12小時，再常規培養7±2天，之後收穫細胞，提取黃酮。
[0025]經檢測，相比同等條件下不進行冷處理的培養物，總黃酮的含量可以提高5倍左右。
【權利要求】
1.一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法，其特徵在於:包括如下步驟， (O單細胞的獲取:選擇生長旺盛的鐵線蓮植株葉片，消毒，放入研缽中，加入緩衝液，研磨，篩網過濾，取濾液，離心得到沉澱的單細胞； (2)初代培養:把單細胞加入到液體MS培養基中，培養基中另加入常規劑量的抗生素卡那黴素或氨苄黴素，再加入常規劑量的抗真菌農藥代森錳鋅或多菌靈或惡黴靈或甲基硫菌靈或氟喹唑，放入搖床中培養，培養條件:光照時間16h/d，光照強度1500-20001x，溫度25 0C 土 1°C，搖床轉速 120r/min ； (3)固體培養:將細胞懸浮培養液用篩網過濾，濾液離心處理後棄去上清液，得到單細胞懸浮液，將單細胞懸浮液與固體MS培養基混合，混合液倒入培養皿中，混合前固體MS培養基的溫度為40°C ±3°C,培養皿置於培養箱中在25°C ±1°C的條件下光照培養12d ; (4)繼代培養:挑取生長良好的單細胞團接入液體MS培養基中培養，培養條件:光照時間 16h/d，光照強度 1500-20001x，溫度 25°C ±1°C，搖床轉速 120r/min ； (5)發酵培養:繼代培養15±3天後，將培養物置於4-10°C冷處理8-12小時，再常規培養7±2天。
2.如權利要求1所述的一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，將單細胞懸浮液與固體MS培養基混合前，將單細胞懸浮液中的單細胞密度調整至104-105個/ml。
3.如權利要求1所述的一種提高湖州鐵線蓮懸浮細胞培養物中總黃酮的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，單細胞懸浮液與固體MS培養基以1:1的體積比混合。
【文檔編號】A01H4/00GK103636497SQ201310618930
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】錢坤, 周國慶, 張海洋, 徐秀芳, 葛海霞, 孫來玉, 肖莉, 文良柱 申請人:錢坤