用於生產治療用B型肝炎疫苗或藥物的免疫原及其製備方法和用途的製作方法

2023-12-05 18:22:21 2

專利名稱：用於生產治療用B型肝炎疫苗或藥物的免疫原及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及B型肝炎治療用免疫原及其製備方法和應用，以及含有該免疫原的B型肝炎疫苗或藥物及其生產方法和應用。
背景技術：
乙型病毒性肝炎是一種全球性疾病。據WHO報告全球B型肝炎病毒感染者約佔人群的30％，約18億；慢性感染者約0.35億。後者表現為持續性病毒血症，其病毒水平是愛滋病毒(HIV)和C肝病毒(HCV)的100-1000倍以上。在全球範圍內，中國屬高流行區，B型肝炎病毒攜帶者約佔人口的10％(1.2億)、慢性肝炎患者約0.3億。乙型病毒性肝炎多為圍產期傳播、青春期發病、青壯年惡化。因此，其危害的人群多為青壯年。大部分病人感染後通過自然病程痊癒，而部分病人則遷延不愈並發展為肝硬化、肝癌。據估計全球每年至少有50萬慢性感染患者死於肝硬化和肝癌。B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是已知僅次於菸草的人類致癌原。
目前，控制B型肝炎流行的主要手段是由WHO推行的全球免疫接種計劃。但是由於(1)該計劃採用的預防性疫苗，對已感染者無效；(2)在未感染的新生兒人群，有5-15□不應答；(3)接種普及率仍不高，具1999年的統計，全球高發區新生兒的接種率只有62□。因此，在今後一個相當長的時期內，B型肝炎仍將是危害人類健康的重要問題之一。
HBV核心抗原(HBcAg)在肝癌及其癌旁組織中的陽性率分別為62.5％和29.2％。目前已證實(1)HBV作為一種嗜肝病毒，並不能直接引起肝細胞損傷，其感染的病理和臨床後果取決於免疫機制。(2)作為細胞內感染，慢性持續性感染狀態主要與機體細胞免疫應答太弱有關。其中，HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應決定了HBV感染的最終結果。感染HBV後CTL活性高者體內病毒被清除而痊癒；CTL活性低或測不到的感染者則發展為慢性持續感染狀態，並進一步發展為肝硬化或/和肝癌。因此，克服HBV持續感染患者的免疫耐受狀態，在體啟動HBV特異性CTL反應，可治療HBV慢性感染持續狀態及防止其相關的繼發性肝硬化、肝癌等疾病。
美國Scripps研究所的F V Chisari在自己研究的基礎上分別申請了4項美國專利(專利號US6235288，US5932224，US5840303US，US5788969)。這些專利的主要內容均是關於在HBV抗原上所確定的CTL表位，這些表位分別來源於核心抗原、表面抗原、多聚酶和X抗原。這些部位或結構，是HBV所誘導的CTL所識別的部位。中國江西南昌醫學院申請了一種含Pre-S2和HBsAg的質粒DNA疫苗，以激發細胞免疫和體液免疫反應，用於B型肝炎的預防和治療。
當前，對HBV慢性持續感染狀態(包括病毒攜帶者、慢性遷延性肝炎和慢性活動性肝炎)尚無特效治療手段。幹擾素(IFN-α/β，IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF-α)被證明能下調感染細胞HBV的複製和基因表達，它對複製中的DNA中間體和轉錄模板等具有敏感性，但並不能清除病毒。拉米呋定(3TC)是第一個用於臨床的核苷類抗病毒複製藥物，能減低病毒血症達2倍log。但卻很難清除病毒，因為e抗原陽性攜帶者的血清中病毒滴度達108以上。實際上，臨床研究也未發現HBsAg轉陰的經治病人。因此，急需發展有效治療HBV慢性持續感染狀態的手段。
本發明的概述本發明的第一個目的在於提供一種能誘導HBV特異性CTL的免疫原，以及含有該免疫原的治療用B型肝炎疫苗；本發明本發明的第二個目的在於提供了所述免疫原的製備方法和所述治療用B型肝炎疫苗的製備方法；本發明第三個目的在於提供了所述免疫原用於製備治療用B型肝炎疫苗或藥物的用途；本發明另一目的是提供了所述免疫原用於製備治療HBV慢性感染持續狀態及其相關的繼發性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物的應用。
本發明的詳細描述本發明提供了以下幾方面的內容一種免疫原，其特徵在於該免疫原含有一個多肽序列，該多肽序列含有胺基酸序列1、胺基酸序列2和胺基酸序列3，其中胺基酸序列1、胺基酸序列2與胺基酸序列3之間分別由若干個胺基酸殘基組成的連接肽段共價連接，所述胺基酸序列1是Th細胞表位序列，所述胺基酸序列2是B型肝炎病毒來源的CTL表位序列，所述胺基酸序列3是B型肝炎病毒來源的B細胞表位序列。
上述胺基酸序列1是破傷風類毒素來源的Th細胞表位上的第830-843胺基酸序列或其變異序列、通用Th細胞表位PADRE；所述胺基酸序列2是HBV核心抗原上第18-27胺基酸序列或其變異序列、141-151胺基酸序列或其變異序列、117-125胺基酸序列或其變異序列、88-94胺基酸序列或其變異序列、88-96胺基酸序列或其變異序列，HBV表面抗原上第183-191胺基酸序列或其變異序列、201-210胺基酸序列或其變異序列、204-212胺基酸序列或其變異序列、370-379胺基酸序列或其變異序列、251-259胺基酸序列或其變異序列、260-269胺基酸序列或其變異序列、335-343胺基酸序列或其變異序列、338-347胺基酸序列或其變異序列、348-357胺基酸序列或其變異序列、378-387胺基酸序列或其變異序列；Pre S1抗原上第10-17胺基酸序列或其變異序列，Pre S2抗原上第109-123胺基酸序列或其變異序列、抗原上第152-161胺基酸序列或其變異序列；HBx抗原上第92-100胺基酸序列或其變異序列、99-108胺基酸序列或其變異序列、115-123胺基酸序列或其變異序列、133-141胺基酸序列或其變異序列；Pol抗原上第61-69胺基酸序列或其變異序列、455-463胺基酸序列或其變異序列、575-583胺基酸序列或其變異序列、773-782胺基酸序列或其變異序列、803-811胺基酸序列或其變異序列、756-764胺基酸序列或其變異序列、816-824胺基酸序列或其變異序列、655-663胺基酸序列或其變異序列、551-559胺基酸序列或其變異序列、772-780胺基酸序列或其變異序列、502-510胺基酸序列或其變異序列、538-546胺基酸序列或其變異序列、642-650胺基酸序列或其變異序列、646-654胺基酸序列或其變異序列；所述胺基酸序列3是HBV Pre-S2來源的B細胞表位上的第14-24胺基酸序列或其變異序列、HBS抗原上a決定簇。
上述胺基酸序列1是QYIKANSKFIGITE或其變異序列、PADRE或其變異序列；所述胺基酸序列2是PLGFFPDH或其變異序列、MQWNSTALHQALQDP或其變異序列、SILSKTGDPV或其變異序列、VLQAGFFLL或其變異序列、FLLTRILTI或其變異序列、FLGGTPVCL或其變異序列、LLCLIFLLV或其變異序列、LLDYQGMLPV或其變異序列、WLSLLVPFV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列、KVLHKRTLGL或其變異序列、VLHKRTLGL或其變異序列、GLSAMSTTDL或其變異序列、CLFKDWEEL或其變異序列、VLGGCRHKLV或其變異序列、FLPSDFFPSV或其變異序列、STLPETTVVRR或其變異序列、EYLVSFGVW或其變異序列、GLYSSTVPV或其變異序列、GLSRYVARL或其變異序列、FLLSLGIHL或其變異序列、ILRGTSFVYV或其變異序列、SLYADSPSV或其變異序列、KYTSFPWLL或其變異序列、SLYADSPSV或其變異序列、ALMPLYACI或其變異序列、YMDDVVLGA或其變異序列、WILRGTSFV或其變異序列、KLHLYSHPI或其變異序列、FTQAGYPAL或其變異序列、SLNFLGGTTV或其變異序列、LLDYQGMLPV或其變異序列、LLVPFVQWFV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列、LLPIFFCLWV或其變異序列、YVNTNMG或其變異序列，YVNTNMGLK或其變異序列、SILSKTGDPV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列，SIVSPFIPLL或其變異序列；所述胺基酸序列3是DPRVRGLYFPA或其變異序列、CTKPTDGNCT或其變異序列。
上述免疫原，其特徵在於所述連接肽段是由三至七個胺基酸殘基組成。
上述免疫原，其特徵在於所述連接肽段是AAA、SSS或GGG。
上述的免疫原，其特徵在於胺基酸序列1、胺基酸序列2與胺基酸序列3之間的連接次序是胺基酸序列1-胺基酸序列2-胺基酸序列3，胺基酸序列1-胺基酸序列3-胺基酸序列2，胺基酸序列2-胺基酸序列1-胺基酸序列3，胺基酸序列2-胺基酸序列3-胺基酸序列1，胺基酸序列3-胺基酸序列1-胺基酸序列2，或著胺基酸序列3-胺基酸序列2-胺基酸序列1。
上述免疫原，其特徵在於所述免疫原還含有若干個修飾基團，該修飾基團是烷基羰基、鏈烯基羰基。
上述免疫原，其特徵在於所述免疫原含有兩個修飾基團。
上述免疫原，其特徵在於所述免疫原含有一個修飾基團。
上述免疫原，其特徵在於所述烷基羰基選自由CH3(CH2)10CO-，CH3(CH2)12CO-，CH3(CH2)14CO-和CH3(CH2)16CO-組成的一組烷基羰基中的一個至五個；所述鏈烯基羰基選自由CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7CO-，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO- 和CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7CO-組成的一組鏈烯基羰基中的一個至五個。
上述免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的任意一個胺基酸殘基共價連接。
上述免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的N末端α氨基、C末端α羧基或胺基酸殘基的任何一個側鏈基團共價連接。上述免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的N末端α氨基之間通過連接肽段KSS連接，其中，所述多肽序列的N末端α氨基與連接肽段KSS的C末端通過肽鍵連接，所述修飾基團與連接肽段KSS的ε氨基共價連接。
上述免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述側鏈基團上的氨基、羧基或羥基等基團共價連接。
上述免疫原，其特徵在於所述修飾基團與N末端賴氨酸的ε氨基共價連接。
上述免疫原，其特徵在於所述連接肽段KSS的α氨基上還共價連接一個所述的修飾基團。
上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)10CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)-CO，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO7-KSSQYIKANSKFIGITEGGG上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA
上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3CH2＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA上述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAALLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGLK GGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAA PLGFFPDHGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDPGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA上述免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT一種設計、篩選和合成上述的免疫原的方法，包括基於表位的疫苗設計(EBVD)，分子模擬、分子設計、篩選體系和多肽固相合成，其中多肽固相合成中樹脂與每種胺基酸或棕櫚酸投料的摩爾比為1∶2-1∶8，精氨酸、天醯胺以及棕櫚酸組分的連接採用雙偶聯，反應溫度為20-40℃。
上述投料的摩爾比為1∶4，上述反應溫度為30℃。
一種製備上述免疫原的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)多肽固相合成所述免疫原-樹脂，所述免疫原-樹脂表示與樹脂結合的免疫原；(2)對免疫原-樹脂進行裂解，得到裂解液；(3)將步驟(2)的裂解液採用體積排阻層析進行初步分離純化；(4)通過反相層析純化得到免疫原。
如上述的方法，其特徵在於所述步驟(2)選用TFA裂解液；裂解條件是免疫原-樹脂的濃度小於100mg/ml，反應溫度15-50℃，反應時間0.5-3小時。
如上述的方法，其特徵在於所述TFA裂解液為0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去離子水、10.0ml TFA；所述裂解條件是免疫原-樹脂的濃度40.00mg/ml，反應溫度25℃，反應時間1.5小時。
如上述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的體積排阻層析採用的柱填料為Sephadex LH20，流動相為二甲基亞碸。
如上述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中的反相層析採用的柱填料為POROS 50 R1、POROS 50 R2、SOURCE 30 RPC或Dleta Pak C18。
如上述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中的反相層析採用梯度洗脫，流動相採用乙腈/TFA、乙腈/HCl、乙醇/TFA、乙醇/HCl或乙醇/磷酸的水溶液。
如上述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是20-60℃。
如上述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是28-40℃。
如上述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是32-36℃。
如上述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是34℃。
上述的免疫原在製備治療HBV慢性感染持續狀態及其相關的繼發性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物的用途。
一種如上述的用途，其特徵在於所述HBV慢性感染持續狀態為慢性B型肝炎或B型肝炎病毒攜帶者。
一種治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗含有上述的免疫原。
一種治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗含有上述的免疫原以及藥學上可接受的輔料、佐劑和/或載體。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗是藥學上可接受的任意一種劑型。
如上述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗的製劑是注射劑、透皮劑、口服劑、吸入劑或栓劑。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗的劑型為乙醇溶液劑型、混懸液劑型、液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型。
如上述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型含有磷脂。
如上述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有膽固醇。
如上述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有維生素E。
如上述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有棕櫚酸。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.1-0.5∶40-80∶0-40∶0-10∶0-10。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.2-0.4∶60∶20∶6∶6。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.3-0.36∶60∶20∶6∶6。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述磷脂為大豆磷脂或卵磷脂。
一種製備上述的治療用B型肝炎疫苗的方法，其特徵在於所述方法包括採用二次乳化法製備脂質體。
如上述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述凍幹脂質體劑型還含有人白蛋白、甘露醇和磷酸鹽。如上所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述凍幹脂質體劑型含上述述免疫原、磷脂、膽固醇、棕櫚酸、維生素E、甘露醇、人血白蛋白、KH2PO4、Na2HPO4，其摩爾比為0.01-0.1∶5-15∶1-7∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶70-150∶0.1-0.3∶1-10∶1-10。
本發明的目的也在於提供一種設計、篩選、製備本發明的如上所述免疫原或疫苗的方法。
本發明首次建立了基於表位的疫苗設計技術路線(英文譯名為EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD)。採用EBVD，以B型肝炎抗原表位圖譜為基礎，按照不同類型表位、不同抗原來源表位、不同的連接順序、不同的化學修飾基團等，採用EBVD方案進行設計、篩選。首次確定了具有前述骨架結構的免疫原。該種分子一方面能刺激人外周血淋巴細胞產生增殖反應、Th1極化反應、HBV特異性CTL反應、抑制HBV的複製；比採用單表位多肽提高200倍以上效率。另一方面，在HBV轉基因小鼠體內有效激發Th1極化反應、HBV特異性CTL反應、抑制HBV的複製。實驗結果表明上述免疫原可開發成為一種新型B型肝炎及其繼發性肝硬化、肝癌的治療用疫苗或藥物。
採用固相化學合成方法製備該種分子。確定了反應體系的最佳溫度、投料比、肽樹脂裂解方法和時間、純化條件等因素。在本發明方法中，最佳反應溫度30-40℃；採用HOBT/DCC偶聯策略，α、β、γ、δ四各組分連續合成，R、N、α採用雙偶聯，原料和樹脂的最佳摩爾投料比是4∶1，每個胺基酸或組分平均偶聯效率達99.5％以上；肽樹脂裂解採用三氟乙酸法，最佳裂解時間90分鐘。
在本發明的方法中，純化採用兩步法(1)採用體積排阻層析法初步純化，二甲基亞碸(DMSO)為流動相，最佳柱溫20-40℃。(2)採用反相層析法高度純化。研究了其最佳上樣條件、最佳層析填料、最佳柱溫度等因素。在本發明中，最佳層析填料是POROS 50 R1，最佳柱溫度22-34℃。
經乙醇溶液、脂質體混懸液體劑型、凍幹劑型的比較，證明脂質體劑型在誘導Th1極化、誘導CTL活性方面優於乙醇溶液劑型、皮下注射疼痛感明顯減輕。脂質體凍幹劑型在穩定性方面明顯優於脂質體混旋液劑型。
本發明採用L9(34)正交設計、篩選獲得所述免疫原脂質體注射劑最佳處方。其中，含有上述免疫原、大豆磷脂、棕櫚酸、維生素E和/或膽固醇。
進一步比較了各種不同條件下，對脂質體形成、包封率、粒度分布等影響。確定了脂質體的製備條件和工藝流程。
脂質體製備工藝流程圖見附圖7。
附圖7是脂質體製備條件和工藝流程圖。
本發明的第三個目的是提供將本發明的這些免疫原製成治療HBV慢性感染持續狀態及其相關的繼發性肝硬化、肝癌的疫苗或藥物的應用。
上述免疫原及其劑型，使用任何一種公知的免疫方式，例如皮下注射、皮內注射、腹腔注射、靜脈注射等進行免疫。免疫劑量可以是0.01nmol至20nmol。可以不使用另外的佐劑。用於免疫小鼠或HLA轉基因小鼠可刺激淋巴細胞活化和增殖、Th1極化和CTL應答；用於免疫HBV轉基因小鼠可以劑量依賴性方式激淋巴細胞活化和增殖、Th1極化和CTL應答，並抑制HBV複製、血中HBV DNA拷貝數下降、HBsAg、HBeAg滴度下降或消失。該效應為單獨使用單表位多肽或多表位多肽所不能達到。在體外刺激人外周血單個核細胞可以劑量依賴性方式激淋巴細胞活化和增殖、Th1極化和CTL應答，後者可殺傷HepG2.2.1.5細胞、E6細胞，抑制HBV複製、HBV DNA拷貝數下降、HBsAg、HBeAg滴度下降或消失。該效應比單獨使用單表位多肽高200倍以上。
附圖簡要說明

圖1是基於表位的疫苗設計(英文譯名為EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EBVD)示意圖。首先選擇靶抗原，通過高解析度的免疫識別研究獲得表位圖譜。基於表位圖譜，採用分子設計、分子模擬技術設計免疫原。通過化學或基因合成得到該分子，進行功能篩選和毒理、藥代初步評價，通過構效關係分析，對分子進行改造、優化，而後合成、評價，進入下一循環。通過200個循環左右，可獲得先導結構。
附圖2是誘導淋巴細胞增殖效應圖，其中取HLA-A2+健康人新鮮外周血，Ficoll-Hypaque法分離外周血單個核淋巴細胞，用RPMI1640培養基(含10％胎牛血清)於96孔細胞培養板內(106細胞/孔)體外培養。設受試藥物組為(CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA)、Pre-S2對照組、空白對照組，分別加IL-2(5IU)和受試藥物，繼續培養6天，再用相同劑量的IL-2和受試藥物再次刺激48小時，並加3H-TdR(1μCi/ml)，繼續培養18h後收集細胞，測γ-記數值。結果表明受試藥物可顯著誘導淋巴細胞的增殖反應。最低有效劑量為0.1ng，在0.1-10ng劑量範圍內呈劑量依賴性反應。
附圖3是誘導Th1極化的效應圖，其中取HLA-A2+健康人新鮮外周血，Ficoll-Hypaque法分離外周血單個核淋巴細胞，用RPMI1640培養基(含10％胎牛血清、100U/ml青鏈黴素)分組培養(106/孔，24孔細胞培養板)，分別加IL-2(30IU)和受試藥物(不同劑量CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA)，繼續培養6天，再用相同劑量的IL-2和受試藥物每周刺激1次，共3次，末次刺激24小時後，取培養上清，用ELISA方法檢測其中的IL-4和IFN-γ分泌情況。結果表明受試藥物可誘導IFN-γ分泌，劑量-效應顯著；而誘導IL-4分泌的效應不明顯。提示受試藥物誘導Th1型T細胞極化的功能較強，而誘導Th2型T細胞極化的功能較弱。
附圖4是誘導細胞毒效應圖，其中取HLA-A2+健康人新鮮外周血，Ficoll-Hypaque法分離外周血單個核淋巴細胞，用RPMI1640培養基(含10％胎牛血清)分組培養(106/孔，24孔細胞培養板)，分別加IL-2(30IU)和受試藥物(10ngCO，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO7KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA)，繼續培養6天，再用相同劑量的IL-2和受試藥物每周刺激1次，共3次，末次刺激3天後，獲得抗原特異性效應CTL細胞。採用標準51Cr釋放試驗檢測比較細胞毒活性。靶細胞分別為2215(HBV感染的人肝細胞癌細胞系，可模擬HBV感染肝細胞的功能)、E6(人HLA-A*0201轉染P815細胞，CTL表位肽抗原預孵)、T2(HLA-A2+人T、B淋巴細胞瘤細胞系，CTL表位肽抗原預孵)；效靶細胞比例分別為(E/T)12.5、25、50、100。結果表明受試藥物可誘導人PBMC產生CTL效應，特異性溶破靶細胞(A)。上述HLA-A2+人PBMC末次刺激24小時後，用ELISPOT方法檢測比較受試藥物誘導IFN-γ分泌型CTL細胞在外周血淋巴細胞中的增殖效應。結果表明受試藥物可誘導人PBMC中IFN-γ分泌細胞的增殖，並有顯著的劑量-效應關係(B、C)。
附圖5是抗病毒效應圖，其中取HLA-A2+HBV攜帶者、急性肝炎患者、慢性肝炎患者新鮮外周血單個核淋巴細胞，做病毒抑制實驗，取上清，測定HBV-DNA拷貝數(A)、HBeAg、HBsAg分泌量(B、C)。結果表明隨著共培養時間的增長，HBV-DNA、HBsAg、HBeAg的表達/複製被抑制，有明顯的劑量-效應關係。表明受試藥物(CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT)誘導HLA-A2+人PBMC活化有顯著的劑量-效應關係。
附圖6是劑量-效應關係圖HBV-DNA轉基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)轉染昆明種小鼠)為模型。將動物隨機分組，每組5隻，於雙側脅下和後足掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3個劑量給藥，每周加強免疫一次，共3次。設IFN-α2b(15000U/鼠)為陽性對照藥、設生理鹽水為陰性對照藥。給藥結束後30天，取小鼠脾臟，分離脾臟淋巴細胞，用試品10ng/ml體外刺激3天，取上清，用ELISA法檢測培養上清中IFN-γ、IL-4等細胞因子的分泌情況，分析受試藥物(CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA)體內誘導T細胞Th1/Th2型極化的功能。結果可檢測到較強的IFN-γ分泌；IL-4的檢測未見明顯的劑量-效應關係(A、B、C)。上述上清液，用ELI-SPOT法檢測IFN-γ分泌細胞在外周血淋巴細胞中的表達頻率。結果表明，在結束免疫後第30天，隨著原免疫劑量的升高，外周血淋巴細胞中IFN-γ分泌細胞的表達頻率升高，其中100、1000U/鼠的免疫劑量，體內誘導外周血淋巴細胞中IFN-γ分泌細胞的表達頻率升高明顯，最高可檢測到3660IFN-γ分泌細胞/106PBMC。IFN-α2b給藥組最高可檢測到1250IFN-γ分泌細胞/106PBMC(D)。於三次免疫結束後的第10、20、30天，取血分離血清，分別用ELISA法、定量PCR法檢測血清中HBsAg、HBV-DNA的含量。結果表明該品可以劑量依賴性的方式導致表面抗原分泌(C)水平、HBV-DNA複製(F)水平的明顯下降。
下面通過實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明實施例的製備方法僅僅是用於說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明製備方法的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。
實施例1.採用EBVD對三表位治療用(合成肽)B型肝炎疫苗表位數目及其排列組合的設計和篩選以B型肝炎抗原表位圖譜為基礎，按照不同類型表位、不同抗原來源表位、不同的連接順序、不同的化學修飾基團等，採用EBVD方案進行設計、篩選表位組分的來源範圍包括HBV之s抗原、e抗原、c抗原來源的優勢B細胞表位、T輔助細胞(Th)表位、細胞毒性T細胞(CTL)表位、其它抗原來源的通用Th細胞表位、表位修飾基團。在表位修飾基團中考慮了有文獻證明可促進免疫活性的單鏈脂肪酸和本發明人證明的糖類基團。採用了線形單表位修飾類、單表位分枝類(2、4、8分枝)、CTL表位-Th細胞表位嵌合體類、CTL表位-Th細胞表位嵌合體修飾類、B細胞表位-CTL表位-Th細胞表位嵌合體類、B細胞表位-CTL表位-Th細胞表位嵌合體修飾類等6類。表位間的聯結順序採用已證明對抗原性(免疫原性)無影響的-A-A-A-或-G-G-G-。由此獲得200餘種結構。在O2工作站採用分子模擬方法(InsightII軟體)比較所設計抗原多肽的結構與天然抗原的相似形、與MHC結合的位阻情況等，並對抗原多肽進行免疫原性、理化、生化特性分析，進行排序。
採用化學合成法合成所設計的免疫原。首先合成計算機排序和理論上可能性最大的結構，而後進入體外功能篩選。體外功能篩選包括對人外周血單個核細胞誘導Th1極化、誘導HBV特異性CTL、多肽抗原特異性CTL對HepG2.2.1.5細胞HBsAg、HBeAg的抑制作用等。根據體外功能實驗，對所設計的結構進行優化、改進、合成，進入下一輪實驗。對體外實驗所篩選到的結構，進入體內實驗篩選，包括在Balb/C小鼠誘導Th1極化、在HBV轉基因小鼠抑制病毒複製、小鼠急性毒性實驗等。經過大量初步篩選和比較分析發現有3個表位是較好的侯選組分。進一步的篩選表明3表位的多肽抗原較單表位或雙表位多肽抗原為優，而與四個以上表位的效果無明顯差別(見表3)；三表位分子中表位間不同的排列組合以εPA44的組合效果最好(見表4)；經體內實驗和體外實驗證明化學修飾中以棕櫚酸共價修飾的效果較好；經單克隆抗體和肽探針技術檢測證明聯結順序的選擇保證了表位在免疫原中的表位成分的免疫特異性未發生改變。篩選結果見表1和表2。
*所列表位數目為由三類表位組成的免疫原(含不同的排列方式)。其中，CCTL表位；BB細胞表位；TTh細胞表位。數字表示該表位的個數。表內所示為體外實驗篩選結果。
表1 治療用(合成肽)B型肝炎疫苗表位數目的篩選*表位數目 分子模擬Th1極化淋巴細胞增殖CTL應答 病毒抑制效應1C +++ ± + ++++1C-1T +++ ++ +++ +++ +++1C-1B ++ ++ +++1B-1T -+++ - -1C-1B-1T+++ ++ ++++++++ +++2C-1B-1T± ++ +++++++ +++2T-1B-1C± ++ +++ +++ +++表2 三表位分子中不同排列組合的篩選*排列方式分子模擬Th1極化淋巴細胞增殖CTL應答病毒抑制效應T-C-B +++ ++ ++++++++ +++T-B-C ++ ++ +++ ++ ++C-T-B ++ + ++ + ±C-B-T + ++ +++ ++ +B-T-C +++ ++ +++++++++B-C-T +++ + ++ ++ +*排列方式指從N-末端向C-末端的表位排布。其中，CCTL表位；BB細胞表位；TTh細胞表位。表內所示為體外實驗篩選結果實施例2.CH3(CH2)10CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，天冬醯胺、精氨酸和棕櫚酸採用雙偶聯，棕櫚酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例3.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，天冬醯胺、精氨酸和棕櫚酸採用雙偶聯，棕櫚酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在85％左右。
實施例4.CH3(CH2)16COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，天冬醯胺、精氨酸和棕櫚酸採用雙偶聯，棕櫚酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例5.CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)-CO，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO7KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為Ser(tBu)，Thr(tBu)，Tyr(tBu)、His(Trt)、Gln(Trt)、ASP(OtBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例6.
CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例7.CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPARGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例8.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例9.CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例10.CH3(CH2)14COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在75％左右。
實施例11.CH3(CH2)14COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在78％左右。
實施例12.CH3(CH2)16COKSSPADREAAALLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例13.CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在83％左右。
實施例14.
CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例15.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例16.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGLKGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在81％左右。
實施例17.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAPLGFFPDHGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在81％左右。
實施例18.
CH3(CH2)14COKSSYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDP GGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在86％左右。
實施例19.CH3(CH2)14COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在78％左右。
實施例20.CH3(CH2)16COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在83％左右。
實施例21.CH3(CH2)16COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在80％左右。
實施例22.CH3(CH2)16COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在74％左右。
實施例23.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在78％左右。
實施例24.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在79％左右。
實施例25.CH3(CH2)16COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在82％左右。
實施例26.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT的固相化學合成採用Fmoc固相化學合成方案。固定羧基端由C端向N端延伸肽鏈。在Applied Biosystems 431A多肽合成儀上進行。Fmoc胺基酸為原料，上樣量1mM，側鏈保護為同實施例3。選用HMP-樹脂為固相載體，上樣量0.25mM，原料/樹脂比4∶1。偶聯到樹脂上的胺基酸(多肽羧基端第一個胺基酸)採用對稱酸酐活化法活化，其餘胺基酸和棕櫚酸的活化採用HOBt/DCC活化法。其中，採用雙偶聯，脂肪酸偶聯後無脫Fmoc保護基團步驟。
切割與脫保護用TFA、EDT、苯甲硫醚、結晶苯酚和超純水按一定比例混合液將肽從樹脂上、側保護性基團從胺基酸上切下，乙醚沉澱、旋轉轉蒸發得粗肽產物，經HPLC鑑定，此粗肽產物純度穩定在85％左右。
實施例27.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT肽樹脂的裂解選用TFA裂解液(0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去離子水、10.0ml TFA)，可最大限度地抑制副反應的發生。首先，比較εPA44肽樹脂裂解反應濃度，對其裂解液分離純化的影響。反應條件，裂解液體積1.5ml；反應溫度25℃；反應時間2.0小時。反應結束後濾除樹脂，收集的濾液在20℃水浴下，緩慢加入1.0ml二甲基亞碸(DMSO)並及時搖動散熱。採用體積排阻層析(SEC)，加上述樣品2.0ml進行εPA44的分離純化。層析條件，層析系統P-6000泵及AKTAexplorer 100；層析柱直徑10mm，柱長250mm，填料Sephadex LH20；流動相DMSO；流速0.4ml/min。收集εPA44組分並進行反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析，測定純度和含量並計算「肽/肽樹脂(□)」。
表3 肽樹脂裂解反應濃度對其裂解液分離純化的影響肽樹脂濃度(mg/ml) 加入DMSO 肽/肽樹脂(％)※26.67 無沉澱 28.1740.00 無沉澱 29.8053.33 有沉澱 26.03※注以「肽/肽樹脂(％)」間接反映出「收率」的變化。
表3的結果顯示，當εPA44肽樹脂濃度過高(53.33mg/ml)時，裂解液加入DMSO可產生沉澱，分離的εPA44佔肽樹脂26.03□，收率較低；當εPA44肽樹脂濃度為40mg/ml時，裂解液加入DMSO不產生沉澱，分離的εPA44佔肽樹脂29.80□，收率較高。因此，將εPA44肽樹脂裂解反應濃度確定為40mg/ml。
採用上述方法及確定的εPA44肽樹脂裂解反應濃度下，進一步觀察裂解反應時間對肽樹脂裂解液分離純化的影響。
表4 裂解反應時間對肽樹脂裂解液分離純化的影響裂解時間(h) εPA44純度(％)肽/肽樹脂(％)※0.5 55.4419.901.0 64.7429.721.5 66.1629.892.0 64.9229.802.5 61.8022.753.0 60.7820.86※注以「肽/肽樹脂(％)」間接反映出「收率」的變化。
由表4可以看出，將裂解反應時間控制在1～2小時，肽樹脂裂解液經SEC分離後，收集的εPA44純度和收率均較高。因此將裂解反應時間確定為1.5小時。
實施例28.CH3(CH2)16COKSSPADREAAASTLPETTVVRRGGGDPRVRGLYFPA肽樹脂裂解液的初步純化在DMSO中εPA44溶解性好且穩定，而在其它溶液中溶解度及穩定性均不夠理想，詳見表5。因此選用DMSO作為SEC的流動相。
表5 在不同溶液體系中的溶解度和穩定性液液體系 溶解度(mg/ml) 穩定性0.1mol/L PB(pH6.8) 0.01 --2□吐溫80-0.1mol/L 0.08 --PB(pH6.8)
50□乙氰-0.1□TFA 1.67 不穩定50□甲醇-0.1□TFA 1.54 -50□乙醇-10mmol/L HCl 2.48 不穩定50□乙醇-10mmol/L磷酸 2.43 不穩定DMSO 11.7 穩定※50□DMSO 2.53 -※注室溫下放置1個月，經RP-HPLC分析εPA44純度和含量無變化。
在上述確定的裂解反應條件下進行批量製備。採用SEC加樣55.0ml，進行εPA44肽樹脂裂解液的初步純化。層析條件，層析系統P-6000泵及AKTAexplorer 100；層析柱直徑25mm，柱長850mm，填料Sephadex LH20；流動相DMSO；流速2.0ml/min。收集εPA44組分並進行RP-HPLC分析，測定純度和含量並計算「肽/肽樹脂(□)」。
表6 肽樹脂裂解液的初步純化效果及重複性觀察批號 純度(％) 肽/肽樹脂(％)※1 52.96 47.272 50.58 47.213 55.76 46.31x±Sx 53.10±2.5946.93±0.54※注以「肽/肽樹脂(％)」間接反映出「收率」的變化。
結果見表6及層析圖譜。採用DMSO作為流動相以及上述SEC對樹脂裂解液進行初步純化，收集的εPA44，純度為53.10±2.59□，佔肽樹脂的46.93±0.54□。得到了較好的初步純化效果及重複性。
實施例29.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA精製方法採用層析技術作為εPA44的精製方法。比較凝膠過濾、離子交換層析和反相層析對εPA44的純化效果，收集εPA44洗脫峰峰尖並進行RP-HPLC分析純度。
凝膠過濾層析不能達到精製的要求；離子交換層析未見到明顯的洗脫峰，非特異性吸附嚴重，不宜採用；而反相層析儘管成本較高，卻能夠滿足精製的要求。
表7 不同層析方法純化的純度比較精製方法 純度(％)凝膠過濾 78.12離子交換層析 --反相層析 99.18實施例30.反相層析填料的篩選採用不同的反相層析填料裝柱，分別對CH3(CH2)16COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA進行精製，收集洗脫峰峰尖並進行RP-HPLC分析純度。
表8 不同反相層析填料固定相的純化比較反相層析填料 純度(％)Dleta Pak C1897.69SOURCE 30 RPC94.26POROS 50 R2 96.24POROS 50 R1 98.73結果見表8。選擇疏水性較弱的反相層析填料POROS 50 R1作為固定相，收集的洗脫峰峰尖純度較高。表明採用反相層析對疏水性較強的本品進行純化時，不宜選用疏水性較強的反相層析填料(Dleta PakC18、SOURCE 30 RPC和POROS 50 R2)作為固定相。
實施例31.離子對試劑對CH3(CH2)16COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA反相層析的影響採用層析柱SR 10/450 POROS 50 R1進行反相層析，比較了採用不同的流動相進行純化對純度的影響。層析條件，層析系統AKTAexplorer 100；樣品及加樣量2.0ml；層析柱直徑10mm，柱長450mm，填料POROS 50 R1；柱溫25℃；流動相(A、B)詳見表6-07；梯度0～100□B，10CV(柱體積)；流速4.0ml/min。收集εPA44洗脫峰峰尖並進行RP-HPLC分析純度。
表9 離子對試劑對反相層析中純度的影響流動相 純度AB(％)30□乙醇 90□乙醇 —30□乙醇-10mmol/L90□乙醇-10mmol/L81.73NaOH NaOH30□乙醇-20mmo /L90□乙醇-20mmol/L98.73HCl HCl由表9可以看出，以乙醇溶液作為流動相，當不加入任何離子對試劑時，未見明顯的本品洗脫峰；當加入離子對試劑時，可以使本品被完全洗脫下來。其中，加入酸(HCl)比鹼(NaOH)更有利於ε本品純化。
實施例32.反相層析柱溫的確定選用磷酸代替鹽酸作為離子對試劑(可避免將來對大規模不鏽鋼層析製備系統的腐蝕作用)，並採用層析柱SR 10/200 POROS 50 R1，進一步觀察柱溫對CH3(CH2)16COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA在反相層析中純度和收率的影響。層析條件，層析系統AKTAexplorer100；樣品及加樣量εPA44(10.34 mg/ml)，0.5ml；層析柱直徑10mm，柱長200mm，填料POROS 50 R1；柱溫詳見表6-08；流動相A30□乙醇-10mmol/L磷酸，流動相B90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速4.0ml/min。收集洗脫峰並進行RP-HPLC分析，測定純度和含量並計算收率。
表10 柱溫對反相層析中純度和收率的影響柱溫(℃)純度(％) 收率(％)22 95.796.3328 96.7440.6932 97.5346.5136 97.7145.9840 97.6135.32表10中的結果顯示，當柱溫為22℃時，由於樣品中的本品溶解於DMSO，此溫度下樣品溶液的粘度較大，不利於本品的擴散以及同固定相的結合，使其大部分隨溶劑峰穿過柱子，造成了純化後的本品收率降低；當柱溫升高到28～40℃時，收率較室溫(22℃)有顯著的提高。其中，確定的優化後反相層析柱溫為32～36℃。
實施例33.CH3(CH2)14COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA反相層析加樣量及載量的確定由於本品溶解在DMSO中，加樣量和樣品中本品濃度，都可能成為影響層析過程的重要參數。因此進一步觀察了加樣量及載量，對本品在反相層析中純度和收率的影響。層析條件，層析系統AKTAexplorer100；樣品及加樣量本品(10.34mg/ml)，見表6-09；層析柱直徑10mm，柱長450mm，填料POROS 50 R1；柱溫34℃；流動相A30□乙醇-10mmol/L磷酸，流動相B90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速4.0ml/min。收集本品洗脫峰並進行RP-HPLC分析，測定純度和含量並計算收率。
表11 樣品量對本品在反相層析中純度和收率的影響加樣量加樣量/柱體積載量 純度(％)收率(％)(ml) (％) (mg/ml)0.50 1.41 0.14 99.37 68.960.75 2.12 0.22 99.08 68.241.00 2.83 0.29 97.88 65.66
由表11看出，當加樣量低於0.75ml時，純化後本品純度達到99□以上，收率接近70□；當加樣量為1.00ml時，收率降低且純度僅為97.88□，達不到精製的要求。因此，通常加樣量和載量控制在柱體積的2□和0.2mg/ml左右。
實施例34.
CH3(CH2)14COKSSYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDPGGGDPRVRGLYFPA原液的批量精製效果及重複性觀察採用層析柱AP5 50/275 POROS 50 R1進行批量製備。肽樹脂經過裂解和初步純化後，收集的εPA44樣品分成7次進行高度純化，進一步觀察了εPA44原液的批量精製效果及重複性。層析條件，層析系統AKTAexplorer 100；樣品詳見表6-10，加樣量11.0ml；層析柱直徑50mm，柱長275mm，填料POROS 50 R1；柱溫34℃；流動相A30□乙醇-10mmol/L磷酸，流動相B90□乙醇-10mmol/L磷酸；梯度0～50□B，5CV、50～100□B，0.5CV、100～100□B，0.5CV；流速100.0ml/min。將收集的εPA44洗脫峰合併液混勻後，取樣經檢定合格即為原液，存放於-20℃備用。並且根據檢定結果計算出本品的產量、收率和比活性。
結果見表12。經過反相層析高度純化批量精製的原液，本品的產量為694.88±12.71mg，純度為98.66±0.14□，收率為86.89±0.43□，比活性為11689.76±1503.57U/mg。達到了較好的精製效果及重複性。
表12.本品原液的批量精製效果及重複性觀察批 樣品 次εPA44號純度 濃度 數 產量 純度 收率 比活(％) (mg/ml)(mg) (％) (％) (U/mg)1 52.9610.52 7707.0098.5487.2813261.422 50.5810.44 7695.9798.6386.5811542.773 55.7610.21 7681.6698.8186.7110265.08
x53.10 10.39 - 694.88 98.66 86.8911689.76±±2.59±0.16 ±12.71±0.14±0.43 ±1503.57Sx實施例35.
凍幹CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAA PLGFFPDH GGGDPRVRGLYFPA脂質體注射劑工藝流程見附圖8的實施例35的脂質體注射劑工藝流程圖實施例38.凍幹CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAA YVNTNMGLK GGGDPRVRGLYFPA脂質體注射劑製備工藝工藝過程中通入無菌高純氮氣，以防磷脂氧化並促使乙醚揮發。採用超濾方法反覆對脂質體混懸液進行濃縮和透析，最終的體積濃縮倍數和透析倍數分別達到8倍和200倍以上，以除去液體中殘留的有機溶劑。工藝過程中各物料及其體積變化詳見表16-1。
表13 工藝過程中的物料名稱及其體積比物料名稱 體積比本品濃縮液 1
類脂質(乙醚)溶液 1乳化液(W/O) 2注射用水 50脂質體濃縮液 2～6半成品分裝液 4～8實施例39 一種B型肝炎治療用疫苗處方選用最常用的大豆磷脂和膽固醇構成磷脂雙分子層膜。其中，前者是主要的類脂質成分，後者兼有穩定磷脂雙分子層膜的作用。另外添加少量棕櫚酸和維生素E，前者能夠增加負電荷數量，增強脂質體對CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA(pI8.1)的結合能力；後者是為了防止磷脂氧化分解。甘露醇和人血白蛋白可作為凍幹脂質體的保護劑和賦形劑。磷酸緩衝液(pH6.5)可減緩大豆磷脂的水解，並調節滲透壓至等滲。
實施例40.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA治療性疫苗製劑類脂質成分及脂質體形成條件的確定採用二次乳化法製備脂質體，將類脂質成分溶解於乙醚溶液中，再與本品濃縮液混合，形成乳化液(W/O)，注入磷酸緩衝液(PB)或水中，同時控制溫度和攪拌，二次形成乳化液(W/O/W)，隨著乙醚的揮發逐步形成脂質體。通過超濾裝置濃縮和透析(透析倍數須達到200倍以上)以及10μm微孔濾膜過濾，以除去液體中可能游離的和可能發生聚集沉澱的本品。取樣進行反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析，測定包封量並與投藥量比較計算脂質體包封率。試驗設計採用L9(34)正交表。
表14 乙醚溶液成分及脂質體形成條件對其包封率的影響編大豆磷脂/膽固 棕櫚酸 溫度 PB濃度包封率號醇 B C(℃)D (％)A(mmol/L) (mmol/L) (mmol/L)1 40/40 0 40 0 93.162 40/40 2 50 1554.75
340/40 6 607544.92460/20 0 507569.48560/20 2 600 97.27660/20 6 401579.26780/0 0 601553.75880/0 2 407579.29980/0 6 500 109.4I ｜192.83216.39 251.71299.83D I 影II ｜246.01231.31 233.63187.76C I 響III↓242.44233.58 195.94193.69A II 遞R53.18 17.19 55.77 112.07B III 減P□ 0.10 - 0.10 0.05注1～9編號乙醚溶液中均含6mmol/L維生素E。
表14中結果表明，影響的主要因素依次為D、C、A和B，因素與水平的最佳組合為A II B III C I D I。
實施例41.免疫原濃度對脂質體包封率的影響在上述正交試驗確定的配方和條件基礎上，比較了免疫原溶液的濃度對脂質體包封率的影響。
結果見表，當免疫原濃度在1.0～2.0mg/ml之間時，脂質體包封率均在90％以上(P＞0.05)；當濃度增加至2.5mg/ml時，包封率降至80％以下(P＜0.001)。因此在製備脂質體時，將免疫原原液超濾濃縮至1.5～2.0mg/ml。
表15不同濃度εPA44溶液對脂質體包封率的影響εPA44濃 脂質體包封率(％)度 123X±Sx(mg/ml)1.0 92.1292.8093.6292.85±0.751.5 94.3892.6793.9693.67±0.892.0 92.9491.9390.7091.86±1.122.5 79.9479.3075.2378.16±2.55
實施例41.
CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA一種凍幹εPA44脂質體注射劑處方的確定在表16中，編號1～11配方均含5％甘露醇/10mmol/L磷酸緩衝液(KH2PO4/Na2HPO4為60/40)。
表16 脂質體濃縮液和賦形劑及其濃度對凍幹的影響編脂質體濃縮液※賦形劑及其濃度脂質體凍幹後號(％，V/V) (％，W/V) 外形收縮程度1 50- ++++2 25- +++3 50聚維酮K30(1.0)+++4 25聚維酮K30(1.0)++5 50聚維酮K30(0.5)+++6 25聚維酮K30(0.5)+++7 50人血白蛋白(1.0) -8 25人血白蛋白(1.0) -9 50人血白蛋白(0.5) +1025人血白蛋白(0.5) +11- - -※注濃縮後的脂質體濃縮液體積等於乳化液(W/O)體積(參見表16-1)。
當脂質體濃縮液加量為半成品分裝液的25～50％(V/V)時，選擇加入1％人血白蛋白為賦形劑能得到很好的凍幹效果。因此，當濃縮後的脂質體濃縮液體積等於乳化液(W/O)體積時，將脂質體濃縮液體積確定為分裝液體積的37.5％(V/V)，即脂質體濃縮液加量的平均水平。此時，分裝液中各輔料濃度應符合表16-4的要求，分裝量為1ml且符合凍幹脂質體注射劑處方的要求。實際操作時，經常由於脂質體濃縮液體積大於乳化液(W/O)體積，可能使分裝液體積增大，需按以下公式計算實際分裝量，即
給藥時均加入1ml注射用水懸浮。
實施例42.凍幹CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA注射劑的批量製備結果及重複性觀察在上述試驗確定的工藝條件下，經本品原液的超濾濃縮及脂質體的製備，加入輔料液分裝、凍幹和輻射滅菌，進行本品凍幹注射劑成品的批量製備。
表17 本品凍幹注射劑的批量製備結果及重複性觀察批號脂質體包封率脂質體粒度分布(μm)※εPA44含量 比活性(％) D50 D90 D99 (μg/瓶)(U/mg)1 90.08 0.25 0.72 2.74 294.76 14173.512 88.38 0.30 0.75 2.06 309.14 13798.853 90.83 0.33 0.94 3.69 305.43 12910.01x 89.76 0.29 0.80 2.83 303.11 13627.46±Sx±1.26±0.04±0.12±0.82±7.47 ±648.95※注D50、D90和D99分別指10□、50□和90□的粒子其粒徑均小於該值。
表17的結果顯示，批量製備的本品脂質體包封率為89.76±1.26□；本品注射劑成品中，脂質體的D50、D90和D99分別為0.29±0.04、0.80±0.12和2.83±0.82，εPA44含量為303.11±7.47μg/瓶，比活性為13627.46±648.95 U/mg。達到了較好的重複性。
實施例43.CH3(CH2)16COKSSPADREAAA LLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA的淋巴細胞轉化實驗2-3月齡Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8個劑量組，雙側後足掌免疫εPA30，每周一次，共3次。脫頸處死小鼠，無菌條件下取雙側月國窩淋巴結，用3H-TdR摻入法檢測，結果證明0.01nmol起效，在0.01nmol至20nmol的劑量範圍內呈劑量依賴性反應。
實施例44.CH3(CH2)14COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA中和性抗體檢測及特異性鑑定2-3月齡Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8個劑量組，雙側後足掌免疫εPA44，每周一次，共3次。免疫結束後3周，取眼球放血，收集血清，用雙抗體夾心法檢測抗體。採用國際上全部的10株單抗，通過抗體競爭抑制實驗檢測其特異性。證明0.01nmol可誘發抗體產生，在0.01nmol至20nmol的劑量範圍內呈劑量依賴性反應。此抗體為HBV中和性抗體。
實施例45.CH3(CH2)14COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA誘導Th1極化檢測2-3月齡Balb/c小鼠，雌雄均可。0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8個劑量組，雙側後足掌免疫εPA44，每周一次，共3次。免疫結束後3周，取眼球放血，收集血清。採用ELISA法檢測Th1/Th2細胞因子。結果證明本品0.01nmol劑量可在體誘導IFN-γ、IL-2為優勢的細胞因子產生，且在0.01nmol--10nmol劑量範圍內呈劑量依賴性反應。
實施例46.ELISPOT法檢測CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA誘導的細胞毒活性2-3月齡Balb/c小鼠，雌雄均可。分0.001nmol，0.01nmol，0.1nmol、0.5nmol、1nmol、10nmol、20nmol、40nmol共8個劑量組，雙側後足掌免疫本品，每周一次，共3次。分別在免疫後第6、12、18、24天，自小鼠眼眶後無菌採取抗凝血，Ficoll-Hypaque法分離PBMC，用RPMI1640培養基(含10％小牛血清、100μ/ml青鏈黴素)體外培養(106/ml，96孔細胞培養板)一天，待其恢復原生長狀態後，用作待測細胞。ELISPOT 96孔細胞培養板用IFN-γ包被抗體預包被過夜，每孔設3個復孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室溫封閉1小時，空幹後，加入待測細胞(5×104細胞/100ul/孔，含RPMI1640培養基、10％小牛血清、100μ/ml青鏈黴素、1ug/ml肽)，其中以melan A27-35肽免疫的小鼠PBMC為陰性對照，培養15小時後，洗滌6次，空幹板，加生物素標記的檢測抗體，於37℃溫育1小時，再次洗滌，空幹後，加底物顯色，計數斑點數目。結果表明最低有效劑量為0.01nmol，在0.01nmol--20nmol劑量範圍內呈劑量依賴性反應。
實施例47.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA誘導健康人外周血單個核細胞(PBMC)增殖實驗無菌取正常人的抗凝外周血，常規Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養基(含10％小牛血清、100u/ml青鏈黴素、L-穀氨醯胺)，在24孔細胞培養板中體外培養，細胞濃度為106/ml。設空白對照組、試驗組、Pre-S(2)對照組，分別加IL-2(30IU/ml)和受試藥物(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)，繼續培養6天後，再用相同劑量的IL-2和受試藥物同劑量下再次刺激1次，並加3H-TdR(1uCi/ml)，繼續培養18h後收集細胞，液閃檢測。結果表明在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml劑量範圍內，本品以劑量依賴方式刺人PBMC增殖。
實施例48.
CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA誘導健康人外周血單個核細胞(PBMC)Th1/Th2極化分析無菌取正常人的抗凝外周血，常規Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養基(含10％小牛血清、100u/ml青鏈黴素、L-穀氨醯胺)，在24孔細胞培養板中體外培養，細胞濃度為106/ml。設正常對照組、含受試藥物組，分別加IL-2(30IU/ml)和受試藥物(0.1μg/ml、1μg/ml)，培養6天後，再用相同劑量受試藥物再次刺激1次，3天後，離心取上清，用Endogen試劑盒檢測Th1/Th2極化。結果表明，Pre-S(2)可誘導較強的Th2型的T細胞轉化，但基本不能誘導T淋巴細胞向Th1型轉化；受試藥物能夠誘導T淋巴細胞向Th1、Th2型轉化，尤以Th1型轉化明顯。
實施例49.
CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA誘導HBV特異性效應CTL的誘導及細胞毒活性檢測人PBMC用RPMI1640培養基(含10％小牛血清、100μ/ml青鏈黴素)分組培養(106/ml，24孔細胞培養板)一天，待其恢復原生長狀態後，分別加IL-2(30IU/ml)和受試藥物(0.1μg/ml、1μg/ml)，繼續培養6天後，再用相同劑量的IL-2和受試藥物每周刺激1次，共3次，末次刺激3天後，獲得抗原特異性效應CTL細胞。採用標準51Cr釋放試驗檢測比較細胞毒活性。靶細胞(肽預包被的T2細胞和HepG2.2.1.5細胞)培養至狀態良好，用前10小時在培養液中加入受試藥物10μg/ml，繼續培養。106靶細胞置於1ml RPMI1640培養基(含20％小牛血清)中，加100μCi51Cr(NEN)，於37℃水浴中標記2小時。標記後的靶細胞用無菌PBS緩衝液離心洗滌3次(500rpm/5min)，然後以104靶細胞/50ul/孔的數量鋪於96孔V-型底細胞培養板中，每孔做3個復孔。按效靶比(E/T)12.5、25、50、100∶1分別加入效應細胞，輕輕振蕩混勻，500rpm離心3-5分鐘，然後置於37℃，5％CO2培養箱中共培養4小時。取上清檢測γ計數值。最大釋放值為104靶細胞置於1mol/L鹽酸中培養所得上清的γ計數值，最小釋放值為104靶細胞置於含20％小牛血清的RPMI1640培養基中4小時所得上清的γ計數值。其中，最小釋放值應低於最大釋放值的30％。51Cr釋放百分數計算公式為[(樣本cpm-最小釋放cpm)/(最大釋放cpm-最小釋放cpm)]×100％。
51Cr釋放試驗結果表明人PBMC體外培養、經累次刺激誘導產生並擴大抗原特異性效應CTL細胞的數量，並做對HepG2.2.15細胞、肽抗原預包被的T2細胞和E6細胞的細胞毒殺傷試驗，結果受試藥物誘導的T淋巴細胞均能夠特異性殺傷肽預包被的T2細胞、E細胞和HepG2.2.15，靶細胞特異性溶破率可達62.8％.
實施例50.CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)-CO，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO7KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLY之ELISPOT法檢測細胞毒活性人PBMC，經首次刺激6天後，作為待測細胞。ELISPOT 96孔細胞培養板用IFN-γ包被抗體預包被過夜，每孔設3個復孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室溫封閉1小時，空幹後，加入待測細胞(5×104細胞/100ul/孔，含RPMI1640培養基、10％小牛血清、100μ/ml青鏈黴素、1ug/ml肽)，其中以未刺激的正常PBMC為陰性對照，培養15小時後，洗滌6次，空幹板，加生物素標記的檢測抗體，於37℃溫育1小時，再次洗滌，空幹後，加底物顯色。在倒置顯微鏡下觀察、計數斑點數目。結果證明本品在0.01nmol--20nmol劑量範圍內以劑量依賴性方式誘導細胞毒反應。
實施例51.CH3(XH2)16COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA誘導的HBV抗原抑制試驗24孔細胞培養板，HepG2.2.1.5細胞單層培養，加入無毒濃度以下2倍稀釋的7個濃度藥物激活的PBMC，按效靶比10∶1，同時設正常對照和藥物對照。培養第3、5、7、10、14天，取上清，測定HBsAg、HBeAg。結果表明本品在0.01nmol--20nmol劑量範圍內以劑量依賴性方式抑制HBsAg、HBeAg的濃度。
實施例52.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA誘導急性B型肝炎病人PBMC之淋巴細胞增殖實驗無菌取急性肝炎恢復期病人和的抗凝外周血，常規Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640培養基(含10％小牛血清、100u/ml青鏈黴素、L-穀氨醯胺)，在24孔細胞培養板中體外培養，細胞濃度為106/ml。設空白對照組、試驗組、Pre-S(2)對照組，分別加IL-2(30IU/ml)和受試藥物(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)，繼續培養6天後，再用相同劑量的IL-2和受試藥物同劑量下再次刺激1次，並加3H-TdR(1uCi/ml)，繼續培養18h後收集細胞，液閃檢測。結果表明在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml劑量範圍內，本品以劑量依賴方式刺急性肝炎恢復期病人PBMC增殖。
實施例53.CH3(CH2)10CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA誘導的肝炎病人PBMC之淋巴細胞極化分析設急慢性肝炎空白對照組、急肝含受試藥物組、慢肝受試藥物組，用Endogen試劑盒或EELISPOT法檢測Th1/Th2極化情況。結果ELISA法檢測病人PBMC的培養上清中IL-4、IL-10、IFN-γ等細胞因子濃度及變化情況，結果表明，Pre-S2可誘導較強的Th2型的T細胞轉化，但基本不能誘導T淋巴細胞向Th1型轉化；受試藥物能夠誘導T淋巴細胞向Th1、Th2型轉化，以Th1型轉化最為明顯。
實施例54.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA誘導肝炎病人PBMC之淋巴細胞的HBV特異性效應CTL的產生及細胞毒活性檢測設急慢性肝炎空白對照組、急肝受試藥物組、慢肝受試藥物組，病人PBMC體外培養、經累次刺激誘導產生並擴大抗原特異性效應CTL細胞的數量，並做對肽預包被的T2、E6細胞和HepG2.2.15細胞的細胞毒殺傷試驗，結果受試藥物誘導的T淋巴細胞均能夠特異性殺傷上述三種靶細胞系，對急肝恢復期病人PBMC而言，靶細胞特異性溶破率可達68.6％.而慢性肝炎病人PBMC，靶細胞特異性溶破率略低，可達42.6％.
實施例55.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA誘導B型肝炎病人ELISPOT法檢測細胞毒活性人PBMC，經首次刺激6天後，作為待測細胞。ELISPOT 96孔細胞培養板用IFN-γ包被抗體預包被過夜，每孔設3個復孔，用含5％小牛血清的RPMI1640室溫封閉1小時，空幹後，加入待測細胞(5×104細胞/100ul/孔，含RPMI1640培養基、10％小牛血清、100μ/ml青鏈黴素、1ug/ml肽)，其中以未刺激的正常PBMC為陰性對照，培養15小時後，洗滌6次，空幹板，加生物素標記的檢測抗體，於37℃溫育1小時，再次洗滌，空幹後，加底物顯色。在倒置顯微鏡下觀察、計數斑點數目。結果證明ε-PA30在0.01nmol--20nmol劑量範圍內以劑量依賴性方式誘導細胞毒反應。
實施例56.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV轉基因小鼠誘導Th1極化採用HBV-DNA轉基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)轉染昆明種小鼠)。將動物隨機分組，每組10隻，於雙側脅下和後腳掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3個劑量給藥，每周加強免疫一次，共3次。設IFN-α2b(15000U/鼠)為陽性對照藥、設生理鹽水為陰性對照藥。給藥前、最後一次給藥結束後10、20、30天。給藥結束後30天，取小鼠脾臟，分離脾臟淋巴細胞，用試品10ng/ml體外刺激3天，取上清，用ELISA法檢測培養上清中TNF-α、IFN-γ、IL-4等細胞因子的分泌情況，分析受試藥物體內誘導T細胞Th1/Th2型極化的功能。結果可檢測到較強的IFN-γ分泌；IL-4的檢測未見明顯的劑量-效應關係。
實施例57.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV轉基因小鼠誘導CTL活性採用HBV-DNA轉基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)轉染昆明種小鼠)。將動物隨機分組，每組15隻，於雙側脅下和後腳掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3個劑量給藥，每周加強免疫一次，共3次。設IFN-α2b(15000U/鼠)為陽性對照藥、設生理鹽水為陰性對照藥。給藥前、最後一次給藥結束後10、20、30天。給藥結束後30天，取小鼠脾臟，分離脾臟淋巴細胞，用試品10ng/ml體外刺激3天，用ELI-SPOT法檢測IFN-γ分泌細胞在外周血淋巴細胞中的表達頻率。結果表明，在結束免疫後第30天，隨著原免疫劑量的升高，外周血淋巴細胞中IFN-γ分泌細胞的表達頻率升高，其中100、1000U/鼠的免疫劑量，體內誘導外周血淋巴細胞中IFN-γ分泌細胞的表達頻率升高明顯，最高可檢測到3660±IFN-γ分泌細胞/106PBMC。
實施例58.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV轉基因小鼠抑制病毒表面抗原(HBsAg)採用HBV-DNA轉基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)轉染昆明種小鼠)。將動物隨機分組，每組15隻，於雙側脅下和後腳掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3個劑量給藥，每周加強免疫一次，共3次。設IFN-α2b(15000U/鼠)為陽性對照藥、設生理鹽水為陰性對照藥。給藥前、最後一次給藥結束後10、20、30天。於三次免疫結束後的第10、20、30天，取血，分離血清，分別用ELISA法血清中HBsAg。結果表明血清HBsAg明顯降低，且呈劑量依賴性和時間依賴性。
實施例59.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA在HBV轉基因小鼠抑制病毒複製採用HBV-DNA轉基因小鼠(ayw型HBV全基因(1.3Kb)轉染昆明種小鼠)。將動物隨機分組，每組15隻，於雙側脅下和後腳掌皮下注射，按10、100、1000U/鼠的3個劑量給藥，每周加強免疫一次，共3次。設IFN-α2b(15000U/鼠)為陽性對照藥、設生理鹽水為陰性對照藥。給藥前、最後一次給藥結束後10、20、30天。於三次免疫結束後的第10、20、30天，取血，分離血清，分別用定量PCR法檢測血清中HBV DNA拷貝數。結果表明血清HBV DNA拷貝數明顯降低，且呈劑量依賴性和時間依賴性。
實施例60.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的等電點測定採用載體兩性電解質PH梯度等電聚膠。預處理8N尿素和2％TritonX-114，同時在聚丙烯醯胺凝膠中也要加入相應濃度的尿素和0.5％的T(itonX-114。染色採用常規的考馬斯亮蘭染色。結果表明本品等電點為pH7.2。
實施例61.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的紫外光譜測定採用紫外分光光度計，對B型肝炎治療性多肽ε-PA44半成品進行紫外光譜掃描，並確定最大紫外吸收值對應的波長。將送檢樣品稀釋至儀器的測定範圍內，取樣進行紫外光譜掃描，掃描波長為190nm-500nm；空白對照為50％乙醇。結果表明其紫外光譜最大特徵吸收峰在實施例62.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA的肽圖測定稱重1mg胰蛋白酶於1.5ml離心管，並溶於0.1M NaHCO3中，終濃度為1mg/ml，即為胰蛋白酶儲液。加10μl胰蛋白酶液於εPA44樣品管。蓋緊離心管，反應混合物於37℃孵育2小時。在消化反應正在進行的同時，置剩餘的胰蛋白酶儲液於冰上。2小時後補加10μl胰蛋白酶於消化混合物。蓋緊離心管，再繼續在37℃下孵育4.5小時。反應結束時加10μl TFA終止反應。直接取樣20μl進行RP-HPLC分析[HP1100高效液相色譜儀；色譜柱Waters Symmetry C18分析柱(粒度5μm，孔徑100柱直徑3.9mm柱長150mm)]。結果獲得其特徵性肽圖。
實施例63.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA純度分析(一)採用有效的分子量線性範圍為1000----80000的高效凝膠分析柱對分子量約為4947.37道爾頓的εPA44純度進行分析，以214nm紫外波長檢測肽鍵的吸收，根據面積歸一化法積分計算本品主峰的百分純度。儀器與色譜條件Waters Delta 600高效液相色譜儀；WatersMillennium32色譜軟體；Waters Ultrahydrogel 250高分辨凝膠分析柱(粒度6μm，孔徑250，柱直徑7.8mm柱長300mm)；CH3CN(乙腈，HPLC級，浙江臨海)；TFA(三氟乙酸，HPLC級，美國Sigma公司)。流動相選用40％CH3CN 0.1％TFA；濃縮後的半成品取樣2ul上樣；流速0.5ml/min；紫外檢測波長214nm。結果表明該品純度在99.8％。
實施例64.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA純度分析(二)採用梯度反相高壓液相色譜的方法分離本品，以214nm紫外波長檢測肽鍵的吸收，根據面積歸一化法積分計算主峰εPA44的百分純度。儀器與色譜條件HP 1100高效液相色譜儀；色譜注Waters Symmetry C18分析柱(粒度5μm，孔徑100柱直徑3.9mm柱長150mm)及保護柱(粒度5μm，孔徑100柱直徑3.9mm柱長20mm)；CH3CN(乙腈，HPLC級，浙江臨海)；TFA(三氟乙酸，HPLC級，美國Sigma公司)。流動相A相為100％H2O-0.1％TFA；B相為100％CH3CN-0.1％TFA；線性梯度10％B～70％B 30min；流速1ml/min；紫外檢測波長214nm。結果表明本品純度為99.9％。
實施例65.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA含量測定採用外標法和反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析技術，測定組分收集液、半成品、濃縮液及其脂質體濃縮液等樣品中本品的含量。
將送檢樣品稀釋至本品標準曲線的定量範圍內，取樣進行RP-HPLC分析，根據建立的定量標準曲線線性回歸方程Y(峰面積)＝12.362×(濃度)+80.702和樣品的稀釋倍數，計算送檢樣品的本品含量。
儀器與色譜條件HP 1100高效液相色譜儀；色譜注WatersSymmetry C18分析柱(粒度5μm，孔徑100，柱直徑3.9mm，柱長150mm)及保護柱(粒度5μm，孔徑100，柱直徑3.9mm，柱長20mm)；柱溫25℃；CH3CN(乙腈，HPLC級，浙江臨海)；TFA(三氟乙酸，HPLC級，美國Sigma公司)。流動相A100％H2O-0.1％TFA；流動相B100％CH3CN-0.1％TFA；線性梯度30％～60％B 15min；流速1ml/min；紫外檢測波長214nm。結果表明本品含量4.5mg/ml。
實施例66.
CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA分子量測定運用電噴霧質譜(ESI-MS)軟電離使多肽及蛋白質分子帶多個電荷，形成不同質量電荷比，從而根據相鄰兩個峰的質荷比聯立方程(n＝m1-H/m2-m1)得到的所帶電荷數來達到準確測定εPA44分子量的目的。儀器與質譜條件PE ABI 2000質譜儀；PE SCIEX Analyst 1.0b3質譜分析軟體；掃描Q1正離子，GAS120 GAS20 CUR20 TEM50℃CAD0 IS5500 NC2 DP30 FP350 EP-10 DF0 CEM1800。檢測結果4929.12u，與理論分子量相符。
實施例67.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA脂質體的粒徑分布測定採用雷射粒度分析儀(Laser Particle Sizer「Analysette 22」；德國FRITSCH)、用微量池(德國FRITSCH)檢測εPA44脂質體的粒徑分布。檢測範圍0.1μm-100.25μm，解析度62道(9mm/38mm)。將凍幹εPA44脂質體成品隨機抽樣，用水溶解、稀釋、混允後檢測。結果表明本品D50為0.25μm，D90為0.72μm，跨距小於3。
實施例68.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA半成品的效價/比活性測定將送檢的原液半成品，稀釋至本品效價測定的範圍內，進行酶聯板的包被、封閉、酶標抗體的結合及顯色。在酶標儀450nm下檢測吸光值(A450nm)，並與本品參考品比較，測定萃取樣品中εPA44的效價，計算出本品半成品的比活性。
將本品參考品用50％乙醇稀釋10倍，再進行倍比稀釋；分別吸取100μl稀釋液加入96孔酶標板，均重複3孔，置4℃冰箱包被20-24小時。εPA44原液按照參考品的操作進行稀釋和包被。陰性對照孔加入50％乙醇100μl。包被結束後，每孔加1％小牛血清200μl，放置4℃冰箱封閉2小時。將酶聯板空幹，每孔加入酶標抗體80μl，置於37℃孵育40分鐘；將酶聯板用洗液清洗4次，空幹後每孔加入底物液A、B各50μl，置37℃避光顯色15分鐘；每孔加終止液50μl。在550型酶標檢測儀上測定A450nm。，根據εPA44參考品的半效值(半數最大吸光值)，採用程序或直線回歸方法處理，分別計算參考品和樣品的半效稀釋倍數；將其代入以下面公式，計算出待檢樣品效價和本品成品比活性。 SA=AC.]]>檢測結果表明本品比活性為13985.31U/mg；每瓶效價為4085.53U。
實施例69.
CH3(CH2)-14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA脂質體效價/比活性測定經洗滌、離心、萃取和乾燥處理，再溶解並取樣進行RP-HPLC分析測定εPA44的含量。依據測定的含量將樣品稀釋至效價測定的範圍內，進行酶聯板的包被、封閉、酶標抗體的結合及顯色。在酶標儀450nm下檢測吸光值(A450nm)，並與本品參考品比較，測定萃取樣品中本品的效價，計算出本品成品的比活性。將參考品用50□乙醇稀釋10倍，再進行倍比稀釋；分別吸取100μl稀釋液加入96孔酶標板，均重複3孔，置4℃冰箱包被20-24小時。本品成品經上述預處理樣品，按照本品參考品的操作進行稀釋和包被。陰性對照孔加入50□乙醇100μl。包被結束，每孔加1□小牛血清200μl，放置4℃冰箱封閉2小時。將酶聯板空幹，每孔加入酶標抗體80μl，置於37℃孵育40分鐘；將酶聯板用洗液清洗4次，空幹後每孔加底物液A、B各50μl，置37℃顯色15分鐘；每孔加終止液50μl。在550型酶聯儀上測定A450nm。根據εPA44參考品的半效值(半數最大吸光值)，採用程序或直線回歸方法處理，分別計算本品參考品和樣品的半效稀釋倍數；將其代入以下面公式，計算出待檢樣品效價和本品成品比活性。
SA=AC]]>檢測結果表明本品比活性為14173.51U/mg；每瓶效價為4177.78U。
權利要求
1.一種免疫原，其特徵在於該免疫原含有一個多肽序列，該多肽序列含有胺基酸序列1、胺基酸序列2和胺基酸序列3，其中胺基酸序列1、胺基酸序列2與胺基酸序列3之間分別由若干個胺基酸殘基組成的連接肽段共價連接；所述胺基酸序列1是Th細胞表位序列；所述胺基酸序列2是B型肝炎病毒來源的CTL表位序列；所述胺基酸序列3是B型肝炎病毒來源的B細胞表位序列。
2.根據權利要求1所述的免疫原，其特徵在於所述胺基酸序列1是破傷風類毒素來源的Th細胞表位上的第830-843胺基酸序列或其變異序列、通用Th細胞表位PADRE；所述胺基酸序列2是HBV核心抗原上第18-27胺基酸序列或其變異序列、141-151胺基酸序列或其變異序列、117-125胺基酸序列或其變異序列、88-94胺基酸序列或其變異序列、88-96胺基酸序列或其變異序列，HBV表面抗原上第183-191胺基酸序列或其變異序列、201-210胺基酸序列或其變異序列、204-212胺基酸序列或其變異序列、370-379胺基酸序列或其變異序列、251-259胺基酸序列或其變異序列、260-269胺基酸序列或其變異序列、335-343胺基酸序列或其變異序列、338-347胺基酸序列或其變異序列、348-357胺基酸序列或其變異序列、378-387胺基酸序列或其變異序列，Pre S1抗原上第10-17胺基酸序列或其變異序列，Pre S2抗原上第109-123胺基酸序列或其變異序列、抗原上第152-161胺基酸序列或其變異序列，HBx抗原上第92-100胺基酸序列或其變異序列、99-108胺基酸序列或其變異序列、115-123胺基酸序列或其變異序列、133-141胺基酸序列或其變異序列，Pol抗原上第61-69胺基酸序列或其變異序列、455-463胺基酸序列或其變異序列、575-583胺基酸序列或其變異序列、773-782胺基酸序列或其變異序列、803-811胺基酸序列或其變異序列、756-764胺基酸序列或其變異序列、816-824胺基酸序列或其變異序列、655-663胺基酸序列或其變異序列、551-559胺基酸序列或其變異序列、772-780胺基酸序列或其變異序列、502-510胺基酸序列或其變異序列、538-546胺基酸序列或其變異序列、642-650胺基酸序列或其變異序列、646-654胺基酸序列或其變異序列；所述胺基酸序列3是HBV Pre-S2來源的B細胞表位上的第14-24胺基酸序列或其變異序列、HBS抗原上a決定簇。
3.根據權利要求1或2中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述胺基酸序列1是QYIKANSKFIGITE或其變異序列、PADRE或其變異序列；所述胺基酸序列2是PLGFFPDH或其變異序列、MQWNSTALHQALQDP或其變異序列、SILSKTGDPV或其變異序列、VLQAGFFLL或其變異序列、FLLTRILTI或其變異序列、FLGGTPVCL或其變異序列、LLCLIFLLV或其變異序列、LLDYQGMLPV或其變異序列、WLSLLVPFV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列、KVLHKRTLGL或其變異序列、VLHKRTLGL或其變異序列、GLSAMSTTDL或其變異序列、CLFKDWEEL或其變異序列、VLGGCRHKLV或其變異序列、FLPSDFFPSV或其變異序列、STLPETTVVRR或其變異序列、EYLVSFGVW或其變異序列、GLYSSTVPV或其變異序列、GLSRYVARL或其變異序列、FLLSLGIHL或其變異序列、ILRGTSFVYV或其變異序列、SLYADSPSV或其變異序列、KYTSFPWLL或其變異序列、SLYADSPSV或其變異序列、ALMPLYACI或其變異序列、YMDDVVLGA或其變異序列、WILRGTSFV或其變異序列、KLHLYSHPI或其變異序列、FTQAGYPAL或其變異序列、SLNFLGGTTV或其變異序列、LLDYQGMLPV或其變異序列、LLVPFVQWFV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列、LLPIFFCLWV或其變異序列、YVNTNMG或其變異序列，YVNTNMGLK或其變異序列、SILSKTGDPV或其變異序列、GLSPTVWLSV或其變異序列，SIVSPFIPLL或其變異序列；所述胺基酸序列3是DPRVRGLYFPA或其變異序列、CTKPTDGNCT或其變異序列。
4.根據權利要求1至3中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述連接肽段是由三至七個胺基酸殘基組成。
5.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述連接肽段是AAA、SSS或GGG。
6.根據權利要求1至5中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於胺基酸序列1、胺基酸序列2與胺基酸序列3之間的連接次序是胺基酸序列1-胺基酸序列2-胺基酸序列3，胺基酸序列1-胺基酸序列3-胺基酸序列2，胺基酸序列2-胺基酸序列1-胺基酸序列3，胺基酸序列2-胺基酸序列3-胺基酸序列1，胺基酸序列3-胺基酸序列1-胺基酸序列2，或胺基酸序列3-胺基酸序列2-胺基酸序列1。
7.根據權利要求1至6中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述免疫原還含有若干個修飾基團，該修飾基團是烷基羰基、鏈烯基羰基。
8.根據權利要求1至7中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述免疫原含有兩個修飾基團。
9.根據權利要求1至7中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述免疫原含有一個修飾基團。
10.根據權利要求7至9中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述烷基羰基選自由CH3(CH2)10CO-，CH3(CH2)12CO-，CH3(CH2)14CO-和CH3(CH2)16CO-組成的一組烷基羰基中的一個至五個；所述鏈烯基羰基選自由CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7CO-，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO-和CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7CO-組成的一組鏈烯基羰基中的一個至五個。
11.根據權利要求7至10中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的任意一個胺基酸殘基共價連接。
12.根據權利要求7至11中任一項權利要求中所述的免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的N末端α氨基、C末端α羧基或胺基酸殘基的任何一個側鏈基團共價連接。
13.根據權利要求12中所述的免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述多肽序列的N末端α氨基之間通過連接肽段KSS連接，其中，所述多肽序列的N末端α氨基與連接肽段KSS的C末端通過肽鍵連接，所述修飾基團與連接肽段KSS的ε氨基共價連接。
14.根據權利要求12或13中任一項權利要求所述的免疫原，其特徵在於所述修飾基團與所述側鏈基團上的氨基、羧基或羥基等基團共價連接。
15.根據權利要求1 2所述的免疫原，其特徵在於所述修飾基團與N末端賴氨酸的ε氨基共價連接。
16.根據權利要求13中所述的免疫原，其特徵在於所述連接肽段KSS的α氨基上還共價連接一個所述的修飾基團。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)10CO KSSPADREGGGSLNFLGGTTVSSSDPRVRGLYFPA。
18.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAALLCLIFLLVGGGDPRVRGLYFPA。
19.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAALLDYQGMLPVGGGDPRVRGLYFPA。
20.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)-CO，CHD3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7CO7KSSQYIKANSKFIGITEGGGDPRVRGLYFPA。
21.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COFLPSDFFPSVAAADPRVRGLYFPA。
22.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)CH＝CH(CH2)7COKSSPADREGGGWLSLLVPFVSSSDPRVRGLYFPA。
23.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA。
24.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPADREAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA。
25.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3-(CH2)14COKSSPADREGGGLLVPFVQWFVSSSDPRVRGLYFPA。
26.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPADREAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA。
27.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3-(CH2)16COKSSPADREAAA LLPIFFCLWVGGGDPRVRGLYFPA。
28.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAYVNTNMGGGGDPRVRGLYFPA。
29.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3-(CH2)16COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGDPRVRGLYFPA。
30.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEGGGFLPSDFFPSVSSSDPRVRGLYFPA。
31.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAA YVNTNMGLK GGGDPRVRGLYFPA。
32.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAA PLGFFPDH GGGDPRVRGLYFPA。
33.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSYIKANSKFIGITEAAAMQWNSTALHQALQDPGGGDPRVRGLYFPA。
34.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSPDAREAAASILSKTGDPVGGGDPRVRGLYFPA。
35.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH3)16COKSSPADREAAAVLQAGFFLLGGGDPRVRGLYFPA。
36.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADRESSSFLLTRILTIGGGDPRVRGLYFPA。
37.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAAFLGGTPVCLGGGDPRVRGLYFPA。
38.根據權利要求1-16中所述的免疫原，其特徵在於一級結構是.CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAGLSPTVWLSVGGGDPRVRGLYFPA
39.如權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAASIVSPFIPLLGGGDPRVRGLYFPA。
40.根據權利要求1-16中任一項所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)16COKSSPADREAAASILPEIIVVRRGGGDPRVRGLYFPA。
41.根據權利要求1-16中所述的免疫原，其特徵在於一級結構是CH3(CH2)14COKSSQYIKANSKFIGITEAAAFLPSDFFPSVGGGCTKPTDGNCT。
42.一種設計、篩選和合成權利要求1至41中任一項權利要求所述的免疫原的方法，包括基於表位的疫苗設計(EBVD)，分子模擬、分子設計、篩選體系和多肽固相合成，其中多肽固相合成中樹脂與每種胺基酸或棕櫚酸投料的摩爾比為1∶2-1∶8，精氨酸、天冬醯胺以及棕櫚酸組分的連接採用雙偶聯，反應溫度為20-40℃。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述投料的摩爾比為1∶4，所述反應溫度為30℃。
44.一種製備權利要求1至41中任一項權利要求所述免疫原的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)多肽固相合成所述免疫原-樹脂，所述免疫原-樹脂表示與樹脂結合的免疫原；(2)對免疫原-樹脂進行裂解，得到裂解液；(3)將步驟(2)的裂解液採用體積排阻層析進行初步分離純化；(4)通過反相層析純化得到免疫原。
45.根據權利要求44所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)選用TFA裂解液；裂解條件是免疫原-樹脂的濃度小於100mg/ml，反應溫度15-50℃，反應時間0.5-3小時。
46.根據權利要求44或45中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述TFA裂解液為0.75g苯酚、0.25ml乙二硫醇、0.5ml苯甲硫醚、0.5ml去離子水、10.0ml TFA；所述裂解條件是免疫原-樹脂的濃度40.00mg/ml，反應溫度25℃，反應時間1.5小時。
47.根據權利要求44所述的方法，其特徵在於所述步驟(3)中的體積排阻層析採用的柱填料為Sephadex LH20，流動相為二甲基亞碸。
48.根據權利要求44所述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中的反相層析採用的柱填料為POROS 50 R1、POROS 50 R2、SOURCE 30 RPC或Dleta Pak C18。
49.根據權利要求44或47中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述步驟(4)中的反相層析採用梯度洗脫，流動相採用乙腈/TFA、乙腈/HCl、乙醇/TFA、乙醇/HCl或乙醇/磷酸的水溶液。
50.根據權利要求44或47或48中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是20-60℃。
51.根據權利要求50所述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是28-40℃。
52.根據權利要求51所述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是32-36℃。
53.根據權利要求52所述的方法，其特徵在於所述反相層析純化的柱溫是34℃。
54.根據權利要求1至41中任一項權利要求所述的免疫原在製備治療HBV慢性感染持續狀態及其相關的繼發性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物的用途。
55.根據權利要求54所述的用途，其特徵在於所述HBV慢性感染持續狀態為慢性B型肝炎或B型肝炎病毒攜帶者。
56.一種治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗含有權利要求1至41中任一項權利要求所述的免疫原。
57.一種治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗含有權利要求1至41中任一項權利要求所述的免疫原以及藥學上可接受的輔料、佐劑和/或載體。
58.權利要求56或57中任一項所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗是藥學上可接受的任意一種劑型。
59.根據權利要求56-58中任一項所述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗的製劑是注射劑、透皮劑、口服劑、吸入劑或栓劑。
60.根據權利要求58所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗的劑型為液體劑型、混懸液劑型、液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型。
61.根據權利要求60所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於液體劑型為乙醇溶液劑型。
62.根據權利要求60所述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型含有磷脂。
63.根據權利要求62所述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有膽固醇。
64.根據權利要求62或63中任一項所述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有維生素E。
65.根據權利要求62至64中任一項所述治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述液體脂質體劑型或凍幹脂質體劑型還含有棕櫚酸。
66.根據權利要求60或65中任一項權利要求所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.1-0.5∶40-80∶0-40∶0-10∶0-10。
67.根據權利要求66所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.2-0.4∶60∶20∶6∶6。
68.根據權利要求67所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於該疫苗中的免疫原、磷脂、膽固醇、維生素E和棕櫚酸的摩爾比為0.3-0.36∶60∶20∶6∶6。
69.權利要求60或62中任一項所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述磷脂為大豆磷脂或卵磷脂。
70.根據權利要求60或62任一項所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述凍幹脂質體劑型還含有人白蛋白、甘露醇和磷酸鹽。
71.根據權利要求60或62-71中任何一項所述的治療用B型肝炎疫苗，其特徵在於所述凍幹脂質體劑型含權利要求1至41所述免疫原、磷脂、膽固醇、棕櫚酸、維生素E、甘露醇、人血白蛋白、KH2PO4、Na2HPO4，其摩爾比為0.01-0.1∶5-15∶1-7∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶70-150∶0.1-0.3∶1-10∶1-10。
72.一種製備權利要求60或62任一項權利要求所述的治療用B型肝炎疫苗的方法，其特徵在於所述方法包括採用二次乳化法製備脂質體。
全文摘要
本發明涉及一種免疫原，其特徵在於該免疫原含有一個多肽序列，該多肽序列含有胺基酸序列1、胺基酸序列2和胺基酸序列3，其中胺基酸序列1、胺基酸序列2與胺基酸序列3之間分別由若干個胺基酸殘基組成的連接肽段共價連接；所述胺基酸序列1是Th細胞表位序列；所述胺基酸序列2是B型肝炎病毒來源的CIL表位序列；所述胺基酸序列3是B型肝炎病毒來源的B細胞表位序列。本發明還涉及該免疫原的製備方法及其作為製備治療用B型肝炎疫苗或藥物的用途。
文檔編號C07K14/02GK1483736SQ02130738
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月18日 優先權日2002年9月18日
發明者吳玉章, 邊疆, 周偉, 賈正才, 石統東, 鄒麗雲 申請人:中國人民解放軍免疫學研究所, 重慶佳辰生物工程有限公司