包括加熱處理步驟的人血清白蛋白的製造方法

2023-12-05 18:46:51

專利名稱：包括加熱處理步驟的人血清白蛋白的製造方法
技術領域：
本發明是關於人血清白蛋白的製造方法。具體指的是關於在由基因重組技術得到的重組型的人血清白蛋白(以下稱之為「rHSA」)的製造步驟中，包括在來自宿主的夾雜物(主要是蛋白質)的等電點附近，進行加熱處理步驟的rHSA的製造方法。
最初，根據低溫乙醇分級法或者以這種方法為基準的方法，從人血漿得到HSA組分(HSA組分分級為V)後，進一步利用各種純化方法進行HSA的製備。並且，近年來，作為不依賴人血漿為原料的方法，應用基因重組技術開發了在酵母和大腸桿菌、枯草桿菌中生產人血清白蛋白的技術。
參考在酵母中(1)Production of Recombinant Human SerumAlbumin from Saccharomyces cerevisiae；Quirk，R.et.al，Biotechnology and Applied Biochemistry 11，273-287(1989)、(2)Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in theYeast，Saccharomyces cerevisiae；Ken.Okabayashi et.al，J.Biochemistry，110，103-110(1991)、(3)Yeast Systems for theCommercial Production of Heterologous proteins；Richard G.Buckholz and Martin A.G.Gleeson，Bio/Technology 9，1067-1072(1991)、在大腸桿菌(4)Construction of DNA sequences and theiruse for microbial production of proteins，in particular humanserum albumin；Lawn，R.M.，European Patent Appl.73，646(1983)、(5)Synthesis and Purification of mature humanserum albumin from E.coli；Latta，L.et.al.Biotechnique5，1309-1314(1897)、在枯草桿菌(6)Secretion of human serumalbumin from Bacillus subtilis；Saunders，C.W.et.al，J.Bacteriol.169，2917-2925(1987)。
人血清白蛋白的純化方法一般使用蛋白質化學中常規使用的純化方法，例如使用鹽析法、超濾法、等電點沉澱法、電泳法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析方法等。實際上，在純化人血清白蛋白時，由於其中混有來自生物組織、細胞、血液等的多種夾雜物，所以採用上述方法的複雜組合進行純化。例如特開平5-317079中記載了將產生人血清白蛋白的重組酵母的培養上清通過超濾、加熱處理、酸處理，再次超濾後供給陽離子交換體、疏水性層析、陰離子交換體、鹽析的各種處理構成的這種人血清白蛋白的製造方法。
該製造方法採取在還原劑存在的情況下，進行加熱處理抑制著色。另外，有幾份報告報導了包括加熱處理步驟的人血清白蛋白的製造方法。確認了基於加熱處理的種種效果。
例如特公平6-71434以及特開平8-116985中記載了，在乙醯基色氨酸或有機羧酸存在的情況下，將通過基因操作製備的人血清白蛋白的培養上清於50℃～70℃加熱1～5小時使蛋白水解酶失活的報導。
此外，在特開平7-126182中還記載了將重組人白蛋白製劑通過在50～70℃加熱30分鐘以上使汙染的微生物失活的報導。
此外，本發明的另外目的是提供安全性高的作為藥品的人血清白蛋白。
本發明者等人就以上目的進行了刻苦研究，最終將生產重組人血清白蛋白酵母的培養物進行稀釋，通過陽離子交換、鹼性處理將白蛋白多聚體單體化，並且，進行超濾後，將得到的含rHSA溶液在其宿主來源汙染蛋白質的等電點附近的pH進行加熱處理，發現能夠有效的去除宿主來源的汙染蛋白質，本發明是基於此發現完成的。
本發明提供的是以包括將含有夾雜物的人血清白蛋白溶液在這種夾雜物等電點附近的pH進行加熱處理步驟為特徵的人血清白蛋白的製造方法。本發明還包括提供根據這種方法得到的不含有汙染蛋白質的高純度的rHSA。下面，就本發明進行詳細說明。
實施本發明的最佳方式本發明的方法是以在人血清白蛋白的製造步驟中，將混有宿主來源的汙染蛋白質的人血清白蛋白溶液在宿主來源的汙染蛋白質的等電點附近的pH進行加熱處理為特徵的方法。通過實施這種方法，能夠容易的去除來自酵母的夾雜物，製造高純度的人血清白蛋白。
作為供給本發明加熱處理的對象，如例所示混有通過基因重組技術得到的rHSA產生宿主來源的汙染蛋白質的rHSA溶液。所用的宿主沒有特殊的限制，例如使用酵母、大腸桿菌、枯草桿菌以及動物細胞等，優選酵母，例如使用糖酵母屬和畢赤氏酵母屬，最好使用啤酒糖酵母AH22株或者它的變異株。本發明的方法，不限於用於產生rHSA的重組體宿主，對於含有血漿來源的蛋白夾雜物的情況也同樣適用。
本發明的加熱處理能夠用於rHSA(或者血漿來源的人血清白蛋白)製造步驟的任何階段。例如本發明的方法有望用於生產人血清白蛋白的重組酵母的培養液上清或者酵母的破碎液、將上述上清或者破碎液進行適當的前處理後的含有rHSA溶液、以及經離子交換體、吸附層析、凝膠過濾、鹽析等處理的進一步純化步驟。本發明的方法優選用於將rHSA產生酵母的培養上清用純水稀釋2～3倍後，陽離子交換體、鹼性處理以及超濾後。
所說的陽離子交換體處理按照常規的方法進行。所用的陽離子交換體如例所示有磺基瓊脂糖、磺基纖維素、磺丙基瓊脂糖、磺丙基右旋糖酐、磺丙基聚乙烯、羧甲基瓊脂糖、羧甲基右旋糖酐以及羧甲基纖維素。其中任何一種都可以用作載體。例如可以採用如下方法，向用含有50mM的氯化鈉的50mM醋酸緩衝液(pH4.5)平衡的陽離子交換柱上添加調整至同一pH的人血清白蛋白溶液，洗滌後，用含有300mM氯化鈉的50mM磷酸緩衝液(pH9.0)進行洗脫，得到HAS組分。
之後，開始將培養或者製造步驟中生成的人血清白蛋白的多聚體進行達到單體化的鹼性處理。多聚體進行單體化時，採用pH8～11，優選採用pH8.5～9.5範圍的鹼性水溶液。
進行鹼性處理的溫度，不限定為室溫，只要是HSA以及rHSA不發生變性的溫度即可。例如可以採用0～65℃的範圍進行處理，優選在室溫(25℃)下放置的方法。
人血清白蛋白的多聚體進行單體化，將含有多聚體的水溶液和鹼性溶液混合後，放置15分鐘以上。優選放置3個小時以上，放置時間上限沒有特殊限定。
用於使鹼性處理液的pH鹼性化的化學物質沒有特殊的限定。例如鹼性有機化合物、鹼性無機化合物，具體指的是氨、氨鹽、鹼性金屬的氫氧化物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)、硼酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、三羥氨基甲烷以及由上述2種以上的混合物組成的組中選用的物質。
所加入的化學物質，在使人血清白蛋白不能夠發生變性的範圍內使用。
進行鹼性處理時，向鹼性處理液中添加具有SH基化合物，用來抑制HSA分子內以及/或者HSA分子間、進一步HSA和夾雜物(主要認為是蛋白質)之間的錯誤交聯，進而有效的實現單體化。
在這一處理中所用的含SH基化合物，只要是含有SH基官能團的化合物即可，沒有特殊的限制。較好的是含有SH基的低分子量的化合物。具體指的是半胱氨酸、巰乙胺、胱胺和蛋氨酸等。優選採用半胱氨酸。
含有SH基化合物的添加量，針對1～100mg/mL的rHSA濃度，添加SH基化合物0.1～50mM為較好，0.2～15mM更好，0.5～5mM最好。
然後，用超濾膜(分級分子量1萬)濃縮含有HSA溶液，調整pH到夾雜物的等電點附近，進行加熱處理。
優選在50℃～70℃，尤其優選55℃～60℃，最優選60℃進行加熱處理。加熱時間優選30分鐘～5小時，尤其優選1小時。
加熱處理時的pH優選在夾雜物的等電點附近。例如當用啤酒糖酵母AH22株或其變異株作為人血清白蛋白產生宿主時，優選pH4～7，尤其優選pH5～6，最優選pH5.5。
此外，加熱處理時的人血清白蛋白濃度，只要是能夠溶解這種人血清白蛋白的濃度即可，沒有特殊的限制，優選10～250mg/ml，尤其優選80～120mg/ml。
加熱處理步驟後的人血清白蛋白的純度可以通過凝膠過濾HPLC分析進行測定。所用的柱子，例如可以使用TSKgel G300 SW(Tosoh公司製備)柱子，用0.1M KH2PO4/0.3M NaCl緩衝液洗脫，在280nm測定吸光度，用通過相同的方法得到的未加熱處理的人血清白蛋白溶液作為對照。
此外，用和本發明同樣的方法處理人血清白蛋白非產生酵母培養液，將粗提物免疫兔子，用得到的抗血清，通過酶免疫測定法(EIA)測定純化的rHSA溶液中存在的酵母由來成分。
表1

產業上利用的可能性根據本發明，通過將混有來自宿主的汙染蛋白質的含有人血清白蛋白溶液在這種夾雜物的等電點附近pH進行加熱處理，能夠簡單並且有效的除去這種汙染蛋白質。
此外，根據本發明，能夠提供降低在人體用藥是導致過敏反應等的副作用的可能的原因的來自宿主物質的含量的、高純度的人血清白蛋白。通過將本發明與其他的純化方法相組合，能夠製造純度更高的人血清白蛋白。
權利要求
1.人血清白蛋白的製造方法，其特徵在於包括將含有夾雜物的人血清白蛋白溶液在夾雜物的等電點附近的pH進行加熱處理的步驟。
2.權利要求1記載的方法，其中在50～70℃進行加熱處理。
3.權利要求2記載的方法，其中在55～60℃進行加熱處理。
4.權利要求1至3中任何1項所記載的方法，其中進行0.5～5小時加熱處理。
5.權利要求4所記載的方法，其中進行1小時加熱處理。
6.權利要求1至5中任何1項所記載的方法，其中在pH4～7進行加熱處理。
7.權利要求6所記載的方法，其中在pH5.0～6.5進行加熱處理。
8.權利要求7所記載的方法，其中在pH5.5～6.0進行加熱處理。
9.權利要求1至8中任何1項所記載的方法，其中夾雜物是酵母來源的蛋白質。
全文摘要
以將含有夾雜物的人血清白蛋白溶液在該夾雜物的等電點附近的pH進行包括加熱處理步驟為特徵的人血清白蛋白的製造方法。
文檔編號C07K14/765GK1406246SQ01805646
公開日2003年3月26日 申請日期2001年10月24日 優先權日2000年10月24日
發明者野內俊伸, 溝上寬, 田嶋義高, 宮津嘉信, 坂口正浩, 屋宜和成 申請人:財團法人化學及血清療法研究所