葛根中一種具有清除自由基效果的異苯並呋喃類化合物及其菸草用途的製作方法

2023-12-05 20:02:07 2

本發明屬於植物化學技術領域，具體涉及一種從中藥材葛根中首次提取得到的異苯並呋喃類化合物及其製備方法和應用。

背景技術：

葛根為豆科植物野葛的乾燥根，習稱野葛。秋、冬二季採挖，趁鮮切成厚片或小塊；乾燥。甘、辛，涼。有解肌退熱，透疹，生津止渴，昇陽止瀉之功。常用於表證發熱，項背強痛，麻疹不透，熱病口渴，陰虛消渴，熱瀉熱痢，脾虛洩瀉。同時葛根也是一種重要的保健食品，其藥用價值極高，素有「亞洲人參」之美譽，葛粉稱之為「長壽粉」，在日本被譽為「皇室特供食品」。

葛根中的主要化學成分為黃酮類，主要活性成分為大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，也含有萜類、內酯、甾醇等其它結構類型的化合物。內酯是指同一分子中的羧基與羥基相互作用脫水而形成的酯類化合物，該類化合物在天然植物中普遍存在，在天然植物中也有廣泛存在該類化合物的文獻報導。除具有廣泛的藥理作用外，內酯還是一類重要的香氣化合物，天然存在於各種水果和香料植物中,該類化合物現已廣泛用於各種飲料、焙烤食品等食用香精的配方中。

本發明從葛根中分離得到了一種苯並內酯類化合物，活性研究表明該化合物具有較好的抗氧化活性，尤其是將其用作菸草添加劑，具有很好的清除自由基抗氧化活性的效果，對提高捲菸品質具有積極意義。目前葛根中發現內酯類化合物的清除捲菸煙氣自由基效果還未見相關文獻報導過。

技術實現要素：

本發明的第一目的在於提供一種異苯並呋喃類化合物；第二目的在於提供所述異苯並呋喃類化合物的製備方法；第三目的在於提供所述異苯並呋喃類化合物作為抗氧化劑的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，所述的異苯並呋喃類化合物是從傳統中藥材葛根中分離得到，其分子式為C14H14O4，具有下述結構：

該化合物為淺黃色膠狀物，命名為：化合物命名為5-甲氧基-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-8(6H)-酮，英文名為：5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen-8(6H)-one。

本發明的第二目的是這樣實現的，所述異苯並呋喃類化合物的製備方法，是以葛根塊為原料，經浸膏提取、有機溶劑萃取、MCI脫色、矽膠柱層析、高效液相色譜製備分離步驟，具體為：

A、浸膏提取：將葛根的根塊粉碎到20~40目，用有機溶劑超聲提取2~5次，每次30~60分鐘，合併提取液、過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉澱物，濃縮成浸膏a；

B、有機溶劑萃取：在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，然後用與水等體積的有機溶劑萃取3~5次，合併有機溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

C、MCI脫色：在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用90%-95%甲醇水洗脫，合併有機相，減壓濃縮成浸膏c;

D、矽膠柱層析：浸膏c上矽膠柱層析，裝柱矽膠為160~200目，用量為浸膏c重量6~10倍量；以體積配比為1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經TLC監測，合併相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將以體積含量將8:2的氯仿-丙酮洗脫得到的洗脫液經高效液相色譜分離純化，即得所述的異苯並呋喃類化合物。

以上述方法製備得到的異苯並呋喃類化合物的結構通過以下方法進行測定；本發明化合物為淺黃色膠狀物；HRESI-MS 顯示其準分子離子峰為269.0783 [M+Na]+(計算值269.0790), 結合 1H NMR和 DEPT 譜確定其分子式為C14H14O4，不飽和度為8。紅外光譜中顯示了羰基 (1742 cm-1) 和芳環 (1610, 1558 和 1462 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光譜在 210、282、320 nm 有最大吸收也說明了化合物中可能存在芳環結構。化合物的1H和13C NMR譜（表-1）顯示其含有14個碳和14個氫，包括1個1,2, 3，4,5-五取代的苯環 (C-4~C-7、C-4a和C-7a；H-7)，1個諧二甲基色烯環(C-1'~C-5'，H-1'、H-2'和H6-4',5')，一個酯羰基 (δC 168.9 s)，一個氧化的亞甲基 (δC 73.8 t，δH 5.25 s)，以及一個甲氧基(dC 61.3 q，dH3.87 s)。進一步分析其HMBC相關信號，根據 H2-3 和C-1、C-4、C-4a、C-7a，以及H-7 和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相關(圖3) 可推測化合物為苯並呋喃內酯結構。化合物的HMBC譜中可觀察到H-1'和 C-4、C-5、C-6；H-2'和 C-5的遠程相關，可推測諧二甲基色烯環取代在化合物的C-5和C-6位，並且C-1'位碳連接在苯環的C-5位。根據甲氧基氫(dH 3.87)和C-4的HMBC相關，可證實甲氧基取代在苯環的C-4位。至此，化合物的結構得到確定，並命名為：5-甲氧基-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-8(6H)-酮。

化合物的紅外、紫外和質譜數據： UV (甲醇)，λmax (log ε) 320 (3.20)、282 (3.77)、210 (4.03) nm；IR (溴化鉀壓片)：νmax 3062、2948、1742、1610、1558、1462、1351、1260、1176、1060、910、795 cm-1；1H 和 13C NMR 數據 (500 和125 MHz, (CDCl3)，見表-1；正離子模式 ESIMS m/z 269 [M+Na]+；正離子模式HRESIMS m/z 269.0783 [M+Na]+ (計算值C14H14NaO4，269.0790)。

表-1. 本發明化合物的1H NMR 和13C NMR 數據 (CDCl3)

本發明的第三目的是這樣實現的，所述的異苯並呋喃類化合物作為抗氧化劑的應用。所述的異苯並呋喃類化合物應用於捲菸生產中，用於清除捲菸煙氣中的自由基。

本發明異苯並呋喃類化合物是首次被分離出來的，通過核磁共振和質譜測定方法確定為異苯並呋喃類化合物，並表徵其結構為：

該化合物經抗氧化活性和清除自由基活性測試，，其半數清除濃度IC50測定結果為4.20 µg/L，具有良好的抗氧化活性；捲菸中的添加實驗表明，添加該化合物的捲菸氣相自由基降低率為15~22％，粒相自由基降低率在18~23％之間，具有很好的清除自由基活性。本發明化合物結構簡單活性好，可作為抗氧化劑應用，同時該化合物應用於捲菸生產中，對捲菸主流煙氣中的自由基具有確切的清除效果，有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明異苯並呋喃類化合物的核磁共振碳譜（13C NMR）；

圖2為本發明異苯並呋喃類化合物的核磁共振氫譜（1H NMR）；

圖3為本發明異苯並呋喃類化合物的關鍵HMBC相關圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護範圍。

本發明所述的異苯並呋喃類化合物，是從傳統中藥材葛根中分離得到，其分子式為C14H14O4，具有下述結構：

命名為：化合物命名為5-甲氧基-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-8(6H)-酮，英文名為：5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromen-8(6H)-one。

本發明所述異苯並呋喃類化合物的製備方法，是以葛根的根塊為原料，經浸膏提取、有機溶劑萃取、MCI脫色、矽膠柱層析、高效液相色譜製備分離步驟，具體為：

A、浸膏提取：將葛根的根塊碎到20~40目，用有機溶劑超聲提取2~5次，每次30~60分鐘，合併提取液、過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉澱物，濃縮成浸膏a；

B、有機溶劑萃取：在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，然後用與水等體積的有機溶劑萃取3~5次，合併有機溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

C、MCI脫色：在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解，上MCI柱，用80%-90%甲醇水洗脫，合併有機相，減壓濃縮成浸膏c；

D、矽膠柱層析：浸膏c上矽膠柱層析，裝柱矽膠為160~200目，用量為浸膏c重量6~10倍量；以體積配比為1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經TLC監測，合併相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將以體積含量為將（8:2）的氯仿-丙酮洗脫得到的洗脫液經高效液相色譜分離純化，即得所述的異苯並呋喃類化合物。

所述A步驟的有機溶劑為70~100%的丙酮、90~100%的乙醇或90~100%的甲醇。

所述B步驟的有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。

所述D步驟中浸膏c在經矽膠柱層析前，用重量比1.5~3倍量的丙酮或者甲醇溶解，然後用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目矽膠拌樣。

所述D步驟的氯仿和丙酮混合有機溶劑的體積配比為20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 和 1:1。

所述E步驟的高效液相色譜分離純化是以52-60%的甲醇為流動相，流速15~25 ml/min，以21.2×250 mm，5µm 的Zorbax PrepHT GF反相製備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為320 nm，每次進樣10~100 µL，收集30~45 min的色譜峰，多次累加後蒸乾。

本發明化合物添加到捲菸過濾嘴中，具有較好的增香效果；而且和對照相比較，捲菸抽吸的潤感有提升、生津作用明顯，抽吸舒適性得到明顯改善。

本發明所述的決明屬植物不受地區和品種限制，均可以實現本發明。

實施例1

取乾燥的葛根塊4.4 kg，粗粉碎至30目，用70%的丙酮超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合併；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉澱物，濃縮成120 g的浸膏a；在浸膏a中加入250 g水，用與水等體積的氯仿萃取5次，合併萃取相，減壓濃縮成80 g浸膏b；浸膏b用MCI裝柱，在浸膏b中加入240 g的80%甲醇水溶解，然後上柱，用90%甲醇水2至6升洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到62 g浸膏c；浸膏c在浸膏c中加入120 g的丙酮溶解，然後加入100目矽膠62 g拌樣，拌樣後，用200目矽膠400 g裝柱；用體積比分別為20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4和 1:1的氯仿-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經TLC監測，合併相同的部分，得到6個部分A-F，其中，對收集到的樣品C (8:2)部分12 g，再以55%的甲醇為流動相，流速20 ml/min，21.2×250 mm，5 µm 的Zorbax PrepHT GF反相製備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為320 nm，每次進樣50 µL，收集37.2 min的色譜峰，多次累加後蒸乾，即得所述異苯並呋喃類化合物。

實施例2

取乾燥的葛根塊10 kg，粗粉碎至40目，用80%的甲醇冷浸提取4次，每次3天，提取液合併；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉澱物，濃縮成300 g浸膏a；在浸膏a中加入350 g水，用與水等體積的乙酸乙酯萃取5次，合併萃取相，減壓濃縮成210 g浸膏b；浸膏b用MCI裝柱，在浸膏b中加入600 g的80%甲醇水溶解，然後上柱，用90%甲醇水5至15升洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到150 g浸膏c；浸膏c中加入300 g的丙酮溶解，然後加入100目矽膠150 g拌樣，用200目矽膠1 Kg裝柱，拌樣後上柱；用體積比分別為20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4和 1:1的氯仿-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經TLC監測，合併相同的部分，得到6個部分A-F，其中，對收集到的樣品B (8:2) 部分32 g，再以55%的甲醇為流動相，流速20 ml/min，21.2×250 mm，5 µm 的Zorbax PrepHT GF反相製備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為320 nm，每次進樣80 µL，收集37.2 min的色譜峰，多次累加後蒸乾，即得所述新化合物。

實施例3

取實施例1製備的化合物，為淺黃色膠狀物。測定方法為：用核磁共振，結合其它波譜技術鑑定結構。HRESI-MS 顯示其準分子離子峰為269.0783 [M+Na]+(計算值269.0790), 結合 1H NMR和 DEPT 譜確定其分子式為C14H14O4，不飽和度為8。紅外光譜中顯示了羰基 (1742 cm-1) 和芳環 (1610, 1558 和 1462 cm-1) 的共振吸收峰。而紫外光譜在 210、282、320 nm 有最大吸收也說明了化合物中可能存在芳環結構。化合物的1H和13C NMR譜（表-1）顯示其含有14個碳和14個氫，包括1個1,2, 3，4,5-五取代的苯環 (C-4~C-7、C-4a和C-7a；H-7)，1個諧二甲基色烯環(C-1'~C-5'，H-1'、H-2'和H6-4',5')，一個酯羰基 (δC168.9 s)，一個氧化的亞甲基 (δC 73.8 t，δH 5.25 s)，以及一個甲氧基(dC 61.3 q，dH3.87 s)。進一步分析其HMBC相關信號，根據 H2-3 和C-1、C-4、C-4a、C-7a，以及H-7 和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相關(圖3) 可推測化合物為苯並呋喃內酯結構。化合物的HMBC譜中可觀察到H-1'和 C-4、C-5、C-6；H-2'和 C-5的遠程相關，可推測諧二甲基色烯環取代在化合物的C-5和C-6位，並且C-1'位碳連接在苯環的C-5位。根據甲氧基氫(dH 3.87)和C-4的HMBC相關，可證實甲氧基取代在苯環的C-4位。至此，化合物的結構得到確定，並命名為：5-甲氧基-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-8(6H)-酮。

實施例4

取實施例2製備的化合物，為淺黃色膠狀物。測定方法與實施例3相同，確認實施2製備的化合物為所述異苯並呋喃類化合物——5-甲氧基-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯-8(6H)-酮。

實施例5

取實施例1~2所製備的任一異苯並呋喃類化合物進行抗氧化活性試驗，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示，試驗情況如下：

以50 µg/mL為初篩濃度，測定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar 96孔板，加入新鮮配製的DPPH乙醇溶液(6.5 ×10 5 mol/L) 190 µL/孔，加入待測樣品l0µL/孔，空白孔加l0 µL生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板後室溫下避光靜置30分鐘，於 UV2401分光光度計上測定儀上測定各孔吸光度值，測定波長為517 nm；樣品對脂性自由基DPPH清除率按下式計算:

DPPH 清除率 (%) = (A 空白 -A樣品) / A空白×100%

A空白：空白對照組吸光度值；A樣品：加樣品組吸光度值。

樣品平行5次檢測，計算半數清除濃度IC50測定結果為4.20 µg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

實施例6

取實施例1~2所製備的任一異苯並呋喃類化合物進行清除捲菸煙氣自由基效果測試：

(1) 捲菸的葉組為：上部菸葉為15％，中部菸葉為48％，下部菸葉為23％，膨脹梗絲8％，菸草薄片6％；採用醋酸纖維嘴棒，嘴棒成型紙透氣度為4500 CU；捲菸紙克重為50 g/m2、透氣度為80 CU 的，水松紙透氣度為 200 CU。成品捲菸煙支的重量為0.93+0.02 g，圓周為24.5 mm，長度為84 mm (其中嘴棒長度為25 mm)。

（2）將所述化合物添加到捲菸過濾嘴絲束中，每支捲菸添加量為0.5 ～5.0 mg，並以未添加試驗化合物的捲菸為對照。

(3) 捲菸用RM200型20孔道自動吸菸機在標準條件下吸菸，主流煙氣粒相物用44 mm劍橋濾片捕集，氣相部分用採樣管捕集；粒相自由基用含0.05 mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為萃取劑從劍橋濾片溶出，並洗滌劍橋濾片，定容得粒相自由基測試液。氣相自由基用自由基採樣管，以0.05 mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為吸收劑採集，捲菸抽吸完後取出氣相自由基採樣管，同時用少量吸收劑分3次衝洗通氣內管外部和採樣管內壁，合併吸收液和洗滌液，得氣相自由基樣品液。

(4) 用順磁共振儀測定自由基，ESR分析實驗條件：中心磁場 = 3.385 T，掃寬 = 0.500 T，微波頻率 = 1.5 GHz，掃描時間 = 2 min，掃描次數 = 5，放大倍數=103 ～105 （根據峰高進行調整），樣品用量 20 µL；根據ESR圖譜中峰面積計算氣相及粒相自由基數量的變化。

（5）實驗結果：

實驗結果表明：進行5次實驗，和對照樣相比，添加該化合物的捲菸氣相自由基降低率為15~22％，粒相自由基降低率在18~23％之間，該化合物對捲菸主流煙氣中的自由基具有確切的清除效果。