血液25-羥基維生素d3腺癌檢測試劑盒及其製備方法

2023-11-03 08:14:52

專利名稱：血液25-羥基維生素d3腺癌檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，尤其是涉及一種血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其製備方法。
背景技術：
早在100多年前，維生素D作為維持骨骼健康的基本成分而被發現後便廣泛用於監測佝僂病、軟骨症等骨性疾病的發生。目前，研究者又發現維生素D還和其它多種慢性疾病相關，尤其是癌症。I、維生素D來源與代謝維生素D(Vitamin D，VitD)是脂溶性類固醇衍生物，有五種形式，與健康關係較密切的是VitD2和VitD3。其中，前者來源於酵母細胞中的麥角固醇，後者則來源於動物皮下 7-脫氫膽固醇。通常只要我們每天接受充足的陽光，就可以獲得滿足人體90%的VitD3需求量， 而一些食物如牛奶、魚肝油等則會補給VitD2和VitD3，以滿足人體餘下的10%需求。然而 VitD是沒有活性的，在人體內與VitD結合蛋白或脂蛋白結合運送到肝臟，經VitD-25-羥化酶(也稱為CYP27A1，CYP3A4, CYP2R1, CYP2J3)催化形成25_(0H)VitD。它是血漿中維生素 D的主要循環形式，常作為評估個體VitD營養狀況的檢測指標(最佳參考值為75-150nmol/ L，儘管許多實驗室採用的參考值為50-250nmol/L)。但25-(OH) VitD無生物活性，需在 25-(OH) VitD-I α -羥化酶作用下，代謝成具有生物活性的1，25_(0H) 2VitD來發揮效應。 研究發現25-(0H)2VitD_l α -羥化酶不僅存在於腎中，也存在於前列腺、乳腺、直腸等多種細胞中，故VitD主要通過兩條途徑在體內發揮作用一條是內分泌途徑，通過血液中的l，25-(0H)2VitD調節全身性的鈣穩定狀態；另一條是自分泌或旁分泌途徑，通過局部的1，25-(0H)2VitD和維生素D受體發揮作用，且不依賴全身性的鈣穩定狀態，涉及細胞增殖、分化以及免疫調節等。此外，l，25-(0H)2VitD的存在能誘導25-(0H)VitD-24-羥化酶 (CYP24)的表達，從而催化25-(OH) VitD和1，25-(OH) 2VitD形成水溶、無活性的膽骨化醇外排出去。2、維生素D在癌症預防中的分子機制維生素D 受體(vitamin D receptor, VDR),作為 1，25-(OH) 2VitD 的受體,不僅存在於腎、甲狀旁腺中調節鈣磷平衡，在前列腺，直腸，乳腺，胰腺，免疫系統的各種細胞及其惡性細胞中也均表達。1，25- (OH) 2VitD與VDR結合後，促使VDR與RXR形成異二聚體，最終所形成的複合物作用於祀基因上的維生素D反應元件(vitamin D - responsive elements, VDREs)，調節靶基因的表達。
目前，研究人員(Sreeram V. Ramagopalan, Andreas Heger, Antonio J. Berlangaj et al. A ChlP-seq defined genome-wide map of vitamin D receptor binding:Associations with disease and evolution. Genome Res，2010，20:1352-1360) 發現，維生素D可以直接或間接地影響229個基因的活性。這些基因已經被證明與一系列疾病有關，其中最引人矚目的就是與癌症發生發展相關的基因表達調節。例如，抑制細胞由 G期向S期轉變的蛋白Rb，pl07和pl30等；抑制EGFR及其介導的細胞生長調節信號通路； 降低抗凋亡因子(Bcl-2，Bcl-XL)表達，增加促凋亡因子(Bax，Bak)的表達等來促進惡性細胞凋亡；調節VEGF和E-cadherin等表達，抑制血管生成，阻止惡性細胞轉移；並抑制與癌症形成相關的炎症反應等，從而降低癌症的罹病風險。3、維生素D與腺癌流行病學研究1980年代，Cedric Garland和Frank Garland兩兄弟通過比較美國不同地理上的直腸癌致死率和陽光照射量，首次提出紫外照射和VitD在降低癌症風險中的角色。隨後， 更多流行病學研究開始聚焦於癌症發生率/死亡率與VitD之間的關係。目前，VitD的這一重要作用在多種腺癌中已經廣泛接受，其中尤屬乳腺癌、結腸癌、前列腺癌研究最多。一項預期和回復性流行病學研究表明25-(OH) VitD水平在50nmol/L以下時，乳腺癌，結腸癌，以及前列腺癌的患病風險增至30% 50%。Grant調查發現，歐洲乳腺癌中25% 死亡率是由於居住在高緯度地區缺失維 生素D造成的。而乳腺癌血清中25-(0H)VitD水平在130nmol/L時，與其含量在25nmol/L相比，以及結腸癌中25-(OH) VitD水平在85nmol/L 與15nmol/L相比時，兩種腺癌發生風險均降低50%。一項前瞻性研究表明，在1954個男性對象中維生素D攝入量與結腸癌風險呈直接關係(即當維生素D攝入量為6 94IU/天， 相對風險為I. O ;維生素D攝入量為233 652IU/天，相對風險為O. 53，P < O. 05)。一項八年的追蹤研究則發現婦女參與者血清中25-(OH) VitD的基本水平低於30nmol/L時其結腸癌發生風險升高25%[3]。William B. Grant [10]綜合多篇研究數據分析表明VitD與乳腺癌和結腸癌的劑量-反應關係呈J形，25-(OH) VitD的最佳量似乎是lOOnmol/L以上，而其水平升至250nmol/L時，對於癌症的作用可能發揮更大。另有研究對比室外工作與室內工作的男性，發現前者患前列腺癌相對晚3 5年，因為室外男性的VitD水平要高於室內工作男性。綜合表明25-(OH) VitD水品在lOOnmol/L以上時，乳腺癌，結腸癌，直腸癌發生風險會降低。因此，依據個體陽光照射，年齡，性別，體重以及VitD基本水平，建議每日補充 2000-4000IUVitD可以維持 25-(OH) VitD水品在 100nmol/L 以上(JoEllen Welsh. Cellular and molecular effects of vitamin D on carcinogenesis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2011, doi : 10. 1016/ j. abb. 2011. 10. 019)。VitD對於不同癌症的發生率和致死率的效應是不同的。近來一 篇綜述(E. R.Bertone-Johnson,Vitamin D and breast cancer, Ann. Epidemiol. 2009，19(2009)462-467)表明，有很多因素會引起VitD效應的不同，其中包括年齡，女性絕經狀況，腫瘤特徵以及VDR基因多態性。研究發現VDR基因上Fok I ff與FF 基因型相比，乳腺癌患病風險顯著的增加了 14% (Raimondi S，Johansson H, Maisonneuve P, Gandini S:Review and meta-analysis on vitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinogenesis, 2009, 30:1170 - 1180)o 另有方差分析表明 BsmI Bb 與 bb 基因型相比，其前列腺癌患病風險顯著的降低了 17%。顯然，無論維生素D水平缺失或基因變異，l，25-(0H)2VitD對於細胞生長的正常調控都受到了抑制，促進了惡性細胞生長，從而提高了腺癌的發生風險。4、維生素D在腺癌中的臨床應用4. I腺癌生物標記物
世界衛生組織指出，如能早期診斷並及時治療，95%的腫瘤將可以治癒。這使得生物標記物的發現成為癌症研究的主流。隨著新興的基因組學、蛋白組學技術的飛速發展，如 DNA和組織微矩陣、SELDI-T0F、質譜、ELISA、RT-PCR、FISH等，許多有應用前景的腺癌分子標誌物被發現。依據其生物化學和免疫學特性大致分為以下幾種(I)基因類標誌物微衛星不穩定，DNA超甲基化以及單核苷酸多態性等基因不穩定性是致癌作用的一個基本因素，造成一些癌基因及其產物的異常表達，作為個體差異， 有助於作為癌症風險評估，檢測及擬定治療方案的分子標記物。目前人們已發現近100 種與腫瘤發生、發展相關的癌基因及其產物，部分已應用於腫瘤標誌物，涉及原癌基因(如 Her-2)和抑癌基因(如BRCAl, MTSl )，它們在多數癌症中都呈現異常表達，是較佳的廣譜腫瘤分子標記物。另外，一些轉移相關基因(如μι23)和凋亡相關基因(如Bcl-2)則與癌症侵襲、凋亡相關，可作為預後指標。MLH1，MSH2或者MSH6這些基因錯配突變而引起的微衛星不穩定證明與直腸癌預後相關，但由於直腸癌標誌物的低特異性以及微衛星不穩定性，其使用並不廣泛。(2)酶類標記物酶及同工酶是最早出現和使用的腫瘤標誌物之一，表現為在腫瘤發生過程中，與細胞分化或增生相關組織特異性酶或同工酶類量或(和)活性改變。例如前列腺特異性抗原PSA、人類腺體激肽釋放酶2(hk2)、基質金屬蛋白酶MMPs、溶酶體半胱氨酸蛋白酶Cath印SinB和L，絲氨酸蛋白酶類uPA和其抑制劑PAI-1，2等。(3)抗原類標記物主要分為腫瘤抗原(CEA、PCNA、Ki-67等)以及糖類抗原 (CA125、CA15-3 等)。(4)激素及其受體類標記物如降鈣素Calcitonin、雌激素受體ER以及孕酮受體 PR、胸腺素 thymosin β -15 等。(5)其它蛋白類如骨橋蛋白0ΡΝ，在轉移性乳腺癌，前列腺癌以及肺癌病人的血液中呈高水平表達，可作為腺癌預後標誌物。近來，FDA批准了一些新的基於尿液的生物標記物，其中包括核基質蛋白ΝΜΡ22，作為膀胱癌的診斷標記。這些腫瘤標誌物在腺癌發生風險評估、診斷、判斷預後、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都發揮著較大的實用價值。4. 2VitD檢測在腺癌診斷中的應用目前已經命名的腫瘤標誌物已有100多種，臨床應用的標誌物達到20左右，但因單項腫瘤標誌物敏感度和特異度較低，無法準確診斷腫瘤和預測預後。國內外研究表明，多腫瘤標誌物聯合動態檢測是提高腫瘤診斷可行性策略。因此，我們旨在發現更多的生物標記物，希望使診斷結果更加可靠。綜上VitD與腺癌的流行病學概述以及與癌症相關的分子機制研究來看，VitD與多種腺癌的發生發展有著不可切割的關係。而VitD作為個體物質代謝所必需的小分子有機化合物，與基因和蛋白類等大分子類標記物相比在體內代謝生成的無活性的25-(0H)VitD半衰期為2周，比較穩定，相對而言更能實時的反映人體狀況，具有較好的指示性；研究人員發現將血液中的VitD代謝物儲存於24°C、 72h 仍保持完整(Bruce W Hollis. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr, 2008，88 (suppl) : 507S - 10S),故保證了樣品儲存時其穩定性；檢測實驗中避免了基因或蛋白汙染、降解等造成的結果偏差，具有可靠地預測性；同時也簡化了樣本處理步驟，易於檢測；且在多種腺癌中其水平都呈現明顯變化，有一定的敏感性；因此，若將VitD作為癌症發生風險的預測因子之一將推動癌症的診斷治療發展更邁進一步。VitD在體內並不穩定，會代謝成25- (OH) VitD和1，25- (OH) 2VitD。血清中25- (OH) VitD半衰期為2周，在人體內水平穩定，而1，25- (OH) 2VitD半衰期為15h，是VitD的活性形式，受多種因素調控，在許多靶組織中都會產生，即使VitD缺失，I, 25-(OH) 2VitD水平也常處於正常或增高狀態，所以用它來決定VitD是否缺失是沒有意義的，(Michael F. Holick. High Prevalence of Vitamin D Inadequacy and Implications for Health. Mayo Clin Proc, 2006, 81 (3) :353-373)故臨床上以血清中1，25-(OH) VitD含量作為個體VitD狀況的晴雨表。目前，檢測人體內25_(0H)VitD方法主要有理化檢驗方法和免疫學方法。理化檢驗方法液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)，高效液相色譜技術(HPLC)。這兩種方法都可分別檢測25-(0H) VitD2和25-(0H) VitD3含量，具有高重複性，通常將HPLC作為「黃金標準」 方法。但這些方法繁瑣費時，要求樣本相對大，需要專業培訓的技術人員準確操作，且LC-MS 無法區分25-(0H)VitD3和其非活性同分異構體，而這個問題在新生兒含量檢測時尤其需要注意，因此並不適用於臨床實驗室。免疫學方法放射免疫測定(RIA)、競爭蛋白結合測定(CPBA)、放射受體測定(RRA)和酶聯免疫測定(EIA)，由於具有靈敏、快速、特異、簡便等優點，在市場上應用已成為一種必然的趨勢，如羅氏Elecsys25-羥基維生素D3，檢測使用了抗VitD3多克隆抗體，診斷成人體內維生素VitD3是否充足，與其它臨床數據結合，作為輔助手段來判定骨代謝狀況。
然而目前的檢測方法都只應用於臨床上評價個體骨質疾病發生情況，故我們希望研究一個用以預測腺癌發生風險的25-(OH) VitD檢測方法。基於免疫學靈敏，快速，特異， 簡便等特點，本實驗室建立一種可定量檢測25-(0H)VitD3的免疫學方法。25-(0H)VitD3是一種脂溶性小分子化合物，結構簡單，屬於半抗原，不具備免疫原性，需將其連接到大分子蛋白質載體上，才能製備人工完全抗原。故本實驗室製備出25-輕基維生素D3-半琥拍酸酯-BSA抗原，已用其製備出多克隆抗體，目前正進行單克隆抗體的製備，期待未來能裝配成可供臨床應用的25-(0H)VitD3檢測試劑盒，用以估測腺癌的發生風險性，使其成為檢測腺癌病人的第一道門檻。目前，越來越多的研究表明，25-羥基維生素D3可以作為腺癌的一項指標，但是， 目前，一套可行的將25-羥基維生素D檢測應用到腺癌檢測的商品化產品仍然比較缺乏。大多數技術載體蛋白與25-羥基半琥珀酸酯偶聯的過程使用了水相，相比有機相來說，偶聯的效率不高，操作過程複雜，抗原的免疫效果較差。在維生素D的檢測方面也有商品化的產品，例如羅氏25-羥基維生素D3電化學發光免疫測定「ECLIA」，英國idas25_羥基維生素D檢測試劑盒(酶聯免疫法)，試劑盒用於維生素D缺乏狀況的評估，並且尚未進行關於腺癌方面的診斷性的研究的說明。

發明內容
本發明的目的在於提供一種血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其製備方法。所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒包括不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清。所述25-羥基維生素 D3 濃度可米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板(抗體的酶標板記為AbPLAT):孔內包被抗-25羥基維生素D3的抗體，所述酶標板可採用12X8條，包裝到帶乾燥劑的錫箔袋中。標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3(標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素 D3 記為 VD3+HRP)。質控品(質控品記為CTRL):含25-羥基維生素D3和疊氮化鈉的人血清凍幹品，所述疊氮化鈉的百分含量為O. 07% O. 09%。底物顯色液包括底物A (底物A記為SUBSA)和底物B (底物B記為SUBSB)，所述底物A為四甲基聯苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液。反應終止液(反應終止液記為STOP):採用O. 35 O. 5M的氫氯酸。
衝洗液(衝洗液記為WASHBUF):採用含有吐溫_20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫_20 的百分含量為O. 1%。所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟I)配製不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清,25-輕基維生素 D3 濃度分別為，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)製備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(I)用0. 05M pH9. O的碳酸鹽包被緩衝液將抗_25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每個96孔酶標板的反應孔中加0. Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液， 4°C過夜。(3)次日，棄去孔內溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝水溶洗3次，每次3min。3)製備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(I)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解於Iml蒸餾水中，再加入0. 2ml 0. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I 0. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩衝水溶液，調節pH值至
9.O 9. 5，然後加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml 0. OlM碳酸鹽緩衝水溶液中；(3)加入0. Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h後裝入透析袋中， 對0. 15MpH7. 4磷酸鹽緩衝水溶液透析，4°C過夜後，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih, 再3000rpm離心0. 5h，棄上清，沉澱物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最後沉澱物溶於2. 5ml
0.15M pH7. 4的磷酸鹽緩衝水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩衝液(0. 15M，pH7. 4)透析， 去除銨離子後，10，OOOrpm離心30min去除沉澱，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝後，冰凍保存；4)配製質控品(質控品記為CTRL):將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍乾燥後，稱重。為便於長期儲存，按照0.07% 0.09%百分含量加入疊氮化鈉；
5)配製底物A:稱取TMB 17. 2mg(固體)，加DMSO Iml溶解，然後加入醋酸鈉緩衝液(O. 1M, pH5. 5) 66ml ；6)配製底物B :取一水合檸檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配製反應終止液(反應終止液記為STOP):取O. 5M的氫氯酸水溶液。8)配製衝洗液(衝洗液記為WASHBUF):取含有吐溫_20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。本發明的有益效果如下本發明採用一系列的化學修飾，最終將25-羥基維生素D3修飾為25-羥基維生素 D3半琥珀酸脂。通過改良碳二亞胺法與蛋白載體BSA蛋白偶聯，最終由半抗原變為完全抗原。並且結合酶聯免疫吸附測定的方法開發出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒。本發明的實際應用是用於臨床上癌症的檢測，並且癌症的血液學檢測到目前為止仍然是個技術難題，商品化血液檢測產品的開發也是具有極其重要的意義。



圖I為血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒實施例的結構組成示意圖。圖2為未偶聯25-羥基維生素D的BSA的MALDI-T0F質譜圖。圖3為25-羥基維生素D在有機相中偶聯BSA的MALDI-T0F質譜圖。圖4為25-羥基維生素D在水相中偶聯BSA的MALDI-T0F質譜圖。在圖2 4中，橫坐標為荷質比m/z，縱坐標為強度Intensity。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。參見圖1，所述血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒實施例包括I、不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清，25-羥基維生素 D3 濃度分別為 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L，分別記為 CAL-I, CAL-2，CAL-3，CAL-4，CAL-5，CAL-6，CAL-7。2、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板(抗體的酶標板記為AbPLAT):孔內包被抗-25羥基維生素D3的抗體，酶標板12X8條，包裝到帶乾燥劑的錫箔袋中。3、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3(標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3記為VD3+HRP)。4、質控品(質控品記為CTRL,簡與為C):含25-輕基維生素D3和置氣化納的人血清凍幹品，所述疊氮化鈉的百分含量為0. 07% 0. 09%。5、底物顯色液包括底物A (底物A記為SUBSA)和底物B (底物B記為SUBSB)，所述底物A為四甲基聯苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液。6、反應終止液(反應終止液記為STOP) 0. 35 0. 5M的氫氯酸。7、衝洗液(衝洗液記為WASHBUF):含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫-20的百分含量為0. 1%。所述不同濃度的校準品、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3、質控品、底物顯色液、反應終止液和衝洗液設在盒體H內。以下給出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的製備方法I)配製不同濃度的校準品(校準品記為CAL):含25-羥基維生素D3的人血清,25-輕基維生素 D3 濃度分別為，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)製備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(I)用O. 05M pH9. O的碳酸鹽包被緩衝液將抗_25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每個96孔酶標板的反應孔中加O. Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液， 4°C過夜。(3)次日，棄去孔內溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝水溶洗3次，每次3min。 3)製備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(I)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解於Iml蒸餾水中，再加入O. 2ml O. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩衝水溶液，調節pH值至
9.O 9. 5，然後加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸鹽緩衝水溶液中；(3)加入O. Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h後裝入透析袋中， 對O. 15MpH7. 4磷酸鹽緩衝水溶液透析，4°C過夜後，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih, 再3000rpm離心O. 5h，棄上清，沉澱物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最後沉澱物溶於2. 5ml
O.15M pH7. 4的磷酸鹽緩衝水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩衝液(O. 15M，pH7. 4)透析， 去除銨離子後，10，OOOrpm離心30min去除沉澱，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝後，冰凍保存；4)配製質控品(質控品記為CTRL):將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍乾燥後，稱重。為便於長期儲存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入疊氮化鈉；5)配製底物A :稱取TMB 17. 2mg(固體)，加DMSO Iml溶解，然後加入醋酸鈉緩衝液(O. 1M, ph5. 5) 66ml ；6)配製底物B :取一水合檸檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配製反應終止液(反應終止液記為STOP):取O. 5M的氫氯酸水溶液。8)配製衝洗液(衝洗液記為WASHBUF):取含有吐溫_20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。實施例I25-羥基維生素D3-3-半琥珀酸酯-BSA的合成本合成方法中，化學活化25-羥基維生素D3的3位，並與作為載體的BSA蛋白偶聯。這個合成經過25-羥基維生素D3-半琥珀酸酯和25-羥基-維生素D3-3-半琥珀醯亞胺酯等中間步驟。25-羥基維生素D3結構式如下
權利要求
1.血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特徵在於包括不同濃度的校準品含25-羥基維生素D3的人血清；包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板孔內包被抗-25羥基維生素D3的抗體；標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3 ；質控品含25-羥基維生素D3和疊氮化鈉的人血清凍幹品，所述疊氮化鈉的百分含量為 O. 07% O. 09% ；底物顯色液包括底物A和底物B，所述底物A為四甲基聯苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液；反應終止液採用O. 35 O. 5M的氫氯酸； 衝洗液採用含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫-20的百分含量為O. 1%。
2.如權利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特徵在於所述 25-輕基維生素 D3 濃度米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。
3.如權利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特徵在於所述酶標板採用12X8條，包裝到帶乾燥劑的錫箔袋中。
4.如權利要求I所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)配製不同濃度的校準品含25-羥基維生素D3的人血清，25-羥基維生素D3濃度分別為，Onmol/L，6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L ；2)製備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下(1)用O.05M pH9. O的碳酸鹽包被緩衝液將抗-25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為 I 10 μ g / ml的混合液；(2)在每個96孔酶標板的反應孔中加O.Iml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液，4°C 過夜；(3)次日，棄去孔內溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝水溶洗3次，每次3min；3)製備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下(1)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解於Iml蒸餾水中，再加入O.2ml O. IM高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；(2)將混合溶液裝入透析袋中，對ImMpH4. 4的醋酸鈉緩衝液透析，4°C過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩衝水溶液，調節pH值至9. O 9. 5，然後加入IOmg 25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸鹽緩衝水溶液中；(3)加入O.Iml 4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4°C 2h後裝入透析袋中，對O.15MpH7. 4磷酸鹽緩衝水溶液透析，4°C過夜後，加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih,再 3000rpm離心O. 5h，棄上清，沉澱物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最後沉澱物溶於2. 5mlO.15M pH7. 4的磷酸鹽緩衝水溶液中；(4)將步驟(3)得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩衝液透析，去除銨離子後， 10，OOOrpm離心30min去除沉澱，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝後，冰凍保存；4)配製質控品將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍乾燥後，稱重。為便於長期儲存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入疊氮化鈉；5)配製底物A:稱取TMB 17. 2mg，加DMSO Iml溶解，然後加入醋酸鈉緩衝液66ml ；6)配製底物B:取一水合檸 檬酸2. lg、無水磷酸氫二鈉2. 82g和O. 75%的過氧化氫尿素O. 64ml,用雙蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配製反應終止液(反應終止液記為STOP):取O.5M的氫氯酸水溶液；8)配製衝洗液取含有吐溫-20的磷酸鹽緩衝液，所述吐溫-20的百分含量為O.1%。
全文摘要
血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其製備方法，涉及一種檢測試劑盒。試劑盒包括不同濃度的校準品、包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板、標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3、質控品、底物顯色液、反應終止液和衝洗液。採用一系列的化學修飾，最終將25-羥基維生素D3修飾為25-羥基維生素D3半琥珀酸脂。通過改良碳二亞胺法與蛋白載體BSA蛋白偶聯，最終由半抗原變為完全抗原。並且結合酶聯免疫吸附測定的方法開發出血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒。可用於臨床上癌症的檢測。
文檔編號G01N33/82GK102692514SQ20121020688
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者萬巍巍, 葉輝銘, 呂曉楠, 曾驥孟, 蔡良良, 鄭立謀 申請人:廈門大學