分子開關及其使用方法

2023-11-03 08:03:37 2

專利名稱：：分子開關及其使用方法
技術領域：
：本發明涉及允許操作多組分核酸(MNA)複合體催化活性的組合物和方法。本發明還提供使用這些組合物的方法和產生如下物質的方法自催化的自我複製級聯與其它迭代過程的分子傳感器、分子開關、和/或調節劑或傳播物。更具體地，本發明涉及允許活性和無活性多組分核酸複合體自組裝的組合物、製備這些組合物的方法及使用方法。發明背景核酸除了其進化優化功能外，它特別的物理性能和功能特性為過多的新生物分子裝置和方法提供了可能。設計者核酸涉及治療實體、生物傳感器、納米級裝置和分子計算的工具。所述方法利用DNA自組裝特性、導電性、信息元件、放大、開關、分子檢測和催化活性。而且，由於DNA是強健的、穩定的和耐熱的，因此它為手工和計算裝置的分子設計提供了理想材料。單鏈核酸如DNA和RNA具有摺疊成複雜三維結構的能力，所述三維結構能以高特異性受體(適體)和催化劑(核酶和DNAzymes)起作用。而且，核酸鏈之間雜交的互補性要求形成了廣泛技術的基礎，它允許耙標4企測(例如微陣列分析、Northern印跡或Southern印跡)，和/或靶標擴增(例如聚合酶鏈式反應)。而且，雜交為核酸納米級構建和基於DNA的計算策略提供了基礎。自我複製是個體通過其能複製(拷貝)自身的方法。在所述方法中，每個反應的產物指導從組成部分形成所述個體的新拷貝(複製子)。已開發了用於核酸序列自我複製的廣泛多樣的技術。靶標核酸序體外複製(靶標擴增)的方法是本領域熟知的。這些方法中的許多使用靶標作為模板指導合成，其需要能與靶標DNA或RNA特異性雜交的寡核苷酸引物，所述靶標DNA或RNA通過DNA或RNA聚合酶被延伸以產生所述耙標的新拷貝(擴增子)。這樣的技術(綜述在SchweitzerandKingsmore，2001)包括聚合酶鏈式反應、鏈置換擴增、滾環擴增和環介導的等溫擴增、轉錄介導的擴增、基於自主序列複製和核酸序列複製的擴增。被稱為連接酶鏈式反應("LCR")的可選方法使用蛋白連接酶擴增核酸靶標。所述反應取決於每輪連接產物作為模板指導所述靶標的新拷貝的連接的能力(Barany,1991)。靶標擴增技術如上述的那些已廣泛用於研究和/或臨床診斷中。然而，每個方法儘管有其能力，但都有內在的缺點。它們都需要使用蛋白酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶和或連接酶)。蛋白酶包涵體增加了試劑製造的複雜性和成本，並降低了含有試劑的試劑盒的貯藏壽命。其它相關技術挑戰包括導致假陽性信號的反應前的複製子(靶標擴增子)汙染，和/或引物序列複製(引物二聚物)引起的背景信號或獨立於靶標連接引起的背景信號。最近20年已發現具有酶活性或催化活性的廣泛多樣的核酸分子。RNA酶("核酶")存在於自然界中，但能被設計為特異性識別和修飾耙標RNA底物(HaseloffandGerlach,1988)。體外演化技術已經促進了許多催化核酸的發現和開發，所述催化核酸包括通常被稱為"DNA酶"或"DNAzymes"的脫氧核糖核酸(綜述在EmilssonandBreaker,2002)。已發現體外演化的DNAzymes和/或核酶具有催化大範圍的反應的能力，所述反應包括核酸切割(Carmietal.,1996;RaillardandJoyce,1996;Breaker,1997;SantoroandJoyce,1998)、鬥亥酸的連才妻(CuenoudandSzostak,1995,Prioretal,2004)、吟啉金屬化(LiandSen,1996)，以及碳-碳鍵(Tarasowaa/.,1997)、酯鍵(Illangasekareda/.，1995)或醯胺鍵(LohseandSzostak,1996)的形成。具體地，已經表徵出在通過WatsonCrick鹼基配對雜交之後特異性切割不同核酸序列的DNAzymes和核酶。DNAzymes能夠切割或者RNA(BreakerandJoyce,1994;SantoroandJoyce,1997)或者DNA(Carmi"a/.，1996)分子。核酶也能夠切割RNA(HaseloffandGerlach,1988)和DNA(RaillardandJoyce,1996)耙標序列兩者。許多核酸酶的催化切割速率取決於二價金屬離子如Ba"、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn"和Pt)2+的存在和濃度(SantoroandJoyce,1998;Brown"a/.,2003)。"10:23"和"8:17"DNAzymes能夠在特定的RNA磷酸二酯4建處切割核酸底物以產生具有2，，3，-環磷酸酯和5，-羥基基團的反應產物(SantoroandJoyce,1997;綜述在EmilssonandBreaker,2002)。能連接2，，3，-環磷酸酯和5'-羥基產物的脫氧核酶(DNAzymes)的實例包括"7Z81"和"7Z48"連接酶(Prior,2004)。包括錘頭核酶、10:23和8:17DNAzymes以及"7Z81"和"7Z48"連接酶的一些催化核酸具有相似的基本結構，具有多個結構域。這些核酸酶具有保守的催化結構域(催化核心)，其側鄰有兩種非保守的底物結合結構域("臂")，所述底物結合結構域特異性識別並雜交底物。雖然這些核酸酶能作為真正的多周轉酶起作用，但每種酶僅具有識別一種分子的能力，所述一種分子即所述酶能隨後催化修飾的底物。已表明催化核酸僅容許在形成催化核心的區域內的某些修飾(Perreaultetal，1990;Perreaultetal,1991;Zaborowskaetal,2002;Cmzetal，2004;Silverman,2004))。取決於反應條件的嚴緊性，在底物臂內可允許一些錯配度。然而WatsonCrick鹼基配對的要求是足夠嚴格的，使得能夠開發使用催化核酸以促進辨別緊密相關的序列的實驗方案(Cairnsetal.,2000)(WO99/50452)。"適體"是DNA、RNA或肽序列，由於它們的高水平結構，例如三維結合結構域或口袋，其具有以高親和性和特異性識別一種或多種配體的能力。許多適體因其與配體結合的能力而被體外演化，所述配體包括例如核酸、蛋白、朊、有機小化合物和/或完整有機體。"適體酶"具有由適體和催化核酸序列(核酶或DNAzymes)兩者組成的序列。配體與適體的結合誘導適體酶的構象變化，這活化了核酶或DNAzyme。Sando和同事(2003)使用傳感分子(靶標輔助的自我切割(TASC)探針)開發了信號放大策略，它包含組成靶標傳感序列的多結構域、DNAzyme結構域和用於連接DNAzyme的雙標記DNA/RNA嵌合底物。雖然該方法避免了使用蛋白酶，但TASC探針是複雜和昂貴的分子，其必須對每個新靶標進行定製。幾個組已報導對於核酸把標和具有比色讀出的其它分析物的檢測(Elghanian"a/.,1997,MirkinWfl/.,1996，以、及LiuandLu,2004)。i亥策略使用與寡核苷酸連接的納米金粒。所述金粒隨後通過添加"橋連寡核香酸"被聚集，引起顏色從紅到藍的變化(Mirkine"/.，1996)。LiuandLu(2004)通過將DNAzyme底物併入橋連寡核香酸延展了該策略，使得DNAzyme的活化導致切割、金粒分散和顏色從藍到紅的變化。該組使用所述方法採用鉛敏感DNAzyme檢測鉛，並釆用適體酶檢測腺苷。/DzyNA方法將靶標擴增(例如PCR)與DNAzyme複製結合。與靶標一起被共擴增的DNAzymes切割一種或多種通用的報告分子底物，允許對一種或多種靶標的一舶L;險測(US6,140,055;US6,201,113;US6365724;WO99/45146，Toddetal,2000)。放大級聯策略已被設計使用催化核酸而不是蛋白酶介導擴增。在另外的方法中，信號放大級聯使用兩種無活性的環狀10:23DNAzymes，所述酶通過交叉切割能彼此活化導致線性化。PaulandJoyce(2004)描述了由具有連接酶活性的核酶介導的複製級聯。在該反應中，第一核酶連接含有寡核苷酸的兩種RNA形成第二核酶。第二核酶隨後連接含有寡核苦酸的兩種其他RNA形成新的第一核酶，這樣觸發複製級聯，其產生第一和第二核酶兩者的新拷貝。核酸級聯已被考慮用於一系列的生物技術應用尤其在診斷中。它們通過促進信號放大允許檢測用於疾病診斷的蛋白和核酸。催化核酸和/或級聯反應能被用於除診斷外的一些應用中，例如計算分析領域和可在治療中使用的納米級裝置和開關的生物分子工程領域中。根據有限的步驟將信息從一種形式轉換成另一形式的裝置被稱為自動機。使用蛋白酶(限制性內切酶和連接酶)和雙鏈DNA已產生能解決計算問題的可編程的有限自動機(Benensonetal,2001)。所述酶用作"石更件"，所述DNA編碼"軟體"。輸入和自動機通過選4奪的合適的DNA軟體被編程。自動機經由切割、雜交和連接循環的級聯進行，產生可檢測的輸出分子，其編碼自動機的最終狀態和由此的計算結果。使用生物分子作為輸入數據和生物活性分子作為輸出的筒單分子規模的可編程計算機能被用於產生邏輯調控生物過程的系統(Benensonetal，2004)。作為體外概念的證據，Benenson等人開發了生物分子計算機，其能夠(i)測量許多特異性信使RNA種類，和(ii)通過釋放能夠影響基因表達的單鏈DNA反義分子進行響應。使用DNAzyme網產生分子規模的邏輯門的另外的分子自動機被編程進行"井字遊戲(tic-tac-toe)，，(Stoja辦icandStefanovic，2003)。近來，具有連"l妻酶活性的二元DNAzyme祐沒計以識別並雜交("讀")一種序列，以及連接("寫")單獨的不同的序列，其依次通過PCR能被擴增(Taboretal,2006)。DNA計算與生物學接口的方法具有廣泛的應用。例如，簡單的DNA邏輯門基於生理學信號的組合例如高血糖和低胰高血糖素能調節胰島素的釋放(CoxandEllington2001)。同時，在發現新功能性核酸中的進展提供了一系列工具，如適體和催化核酸，以及允許產生新納米級分子"機器"組分的新結構組分。幾個步驟已用於操縱納米裝置和自動機，包括(i)雜交步驟，其包括支鏈遷移、二級結構形成如髮夾形成的互補鏈之間雜交的抑制，(ii)使用限制性核酸內切酶的切割和(iii)諸如圍繞中心DNA軸的旋轉、收縮/延伸和平移運動的構象變化的誘導。用於通過適體可調控釋放蛋白的才莫塊化DNA信號解碼器使用任意DNA序列作為"輸入"(BeyerandSimmel，2006)。因此，本領域亟需簡單、快速、有成本效益的方法用於靶標的檢測和納米級裝置的組裝，包括能使用穩定的核酸組分進行的可編程裝置。發明概述本發明一方面提供了包含至少一種寡核苷酸部件酶(partzyme)和至少一種另外的寡核苷酸組分的分子開關，其中所述部件酶包含至少一種催化核心部分、感應臂部分、和底物臂部分，所述另外的寡核苷酸組分選自組裝易化子寡核苷酸、底物寡核苷酸、活性抑制劑和組裝抑制劑或其任何組合，其中所述分子開關能形成多組分核酸(MNA)複合體。在一個實施方案中，所述開關可包含解組裝的複合體、部分組裝的複合體、完全組裝的MNAzyme、或完全組裝的無催化活性MNA複合體。所述開關還可包含MNAi。在另一實施方案中，活性抑制劑包含與至少一種所述寡核苷酸基本上不互補的核苷酸序列。在另一實施方案中，所述部件酶感應臂、所述部件酶底物臂、所述組裝易化子寡核苷酸和所述底物寡核苷酸中的一種或多種包含至少兩種分子。所述部件酶感應臂、所述部件酶底物臂、所述組裝易化子寡核苷酸、所述底物寡核苷酸、所述活性抑制劑或組裝抑制劑中的一種或多種還包含至少一種自身互補區。在另一實施方案中，所述部件酶感應臂、所述部件酶底物臂、所述組裝易化子寡核苷酸和所述底物寡核苷酸中的一種或多種還包含至少一種適體和至少一種組裝抑制劑。在另一實施方案中，所述開關的至少一種組分能夠被適應以增加或減少複合體對輸入事件的敏感性和/或改變輸出信號的強度。在另外的實施方案中，活性抑制劑可包含組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域、底物結構域中的至少一種、或其任意組合。在另一實施方案中，所述開關還包含至少一種穩定因子臂。在另一實施方案中，所述開關的至少一種組分可包含核酸。在另外的實施方案中，所述開關的至少一種組分還可包含至少一種納米顆粒、微粒、或其組合。在本發明的另一方面，提供了MNA複合體作為分子開關的用途，其中所述複合體從無活性轉變為活性MNA複合體響應輸入事件。在一實施方案中，無活性複合體可包含解組裝的複合體、部分組裝的複合體、或完全組裝的無催化活性複合體。無催化活性MNA複合體還可包含組裝抑制劑。無催化活性MNA複合體還還可以是MNAi。在另一實施方案中，MNAi可包含活性抑制劑，所述活性抑制劑包含活性抑制劑結構域、活化劑組裝易化子結構域、報告分子結構域、底物結構域中的至少一種，或其任意組合。在另一實施方案中，向活性MNAzyme的轉變可包含從所述MNAi移出至少所述活性抑制劑或活性抑制劑結構域。所述移出還可包含對連接所述活性抑制劑結構域和所述活化劑組裝易化子結構域的可切割底物的切割。在另一實施方案中，輸入事件可包含抑制劑的去除或其抑制功能的失活。輸入事件還可導致催化活性MNAzyme的組裝。輸入事件還可進一步包含活化劑的供應，所述活化劑(i)由外源供應提供或(ii)是在MNA複合體的環境中反應的產物。本發明另一方面，提供了MNA複合體作為分子開關的用途，其中所述複合體從活性轉變為無活性MNA複合體響應輸入事件。在一個實施方案中，所述活性複合體可以是MNAzyme。在另一實施方案中，向無活性MNA複合體的轉變可與活性MNA複合體的解組裝相關。向無活性MNA複合體的轉變還可與無活性MNA複合體的組裝相關。在另一實施方案中，所述輸入事件可以是抑制劑的添加或其抑制功能的活化。所述輸入事件還可以是對抑制劑的結合。所述抑制劑還可以是組裝抑制劑。所述抑制劑還進一步可以是活性抑制劑或活性抑制劑結構域。在另一實施方案中，所述無活性MNA複合體可以是MNAi。供應提供或(ii)是在MNA複合體的環境中反應的產物。在前述兩方面的任一方面的另一實施方案中，所述轉變可導致輸出信號的變化。在前述兩方面的任一方面的另一實施方案中，輸入事件可選自在溫度，鹽濃度，離子強度，pH，二價陽離子的存在或不存在、類型或濃度，電荷，磁荷，物理操作上的變化，在MNA或調節劑組分或微環境組分的濃度上的變化，或其任意組合。在前述兩方面的任一方面的另一實施方案中，輸出信號的變化可包含先前不存在的信號的出現、先前存在的信號的消失、或輸出信號的增強或減弱。在前述兩方面的任一方面的另一實施方案中，所述輸出信號可取^決於底物修飾的程度，其中所述修飾選自切割，連接，叫、啉金屬化，碳-碳鍵、酯鍵或醯胺鍵的形成，或其任意組合。在前述兩方面的任一方面的另一實施方案中，所述輸出信號可通過如下測定螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色譜法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法或其任意組合。所述測定還可以允許以定量輸出信號的方式進行。所述輸入事件的量還可進一步由所述定量的輸出信號測定。所述輸入事件或所述輸出信號任一者或兩者還可進一步被放大。所述輸出信號放大還可進一步由信號級聯產生。在本發明另一方面，提供了包含兩種或多種寡核苷酸組分和至少一種活性抑制劑分子的MNAi。在一個實施方案中，MNAi還包含至少一種組裝易化子。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可包含活化劑組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域、底物結構域中的至少一種，或其任意組合。所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種可位於活性抑制劑的不同結構域。所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種還進一步可被不穩定的連接子或可切割的底物連接。所述底物還可進一步包含活化劑組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域中的至少一種，或其任意組合。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可包含與所述兩種或多種寡核苷酸組分中的至少一種基本上不互補的核苷酸序列。在另一實施方案中，所述組裝易化子可以是靶標。所述核酸還可以選自DNA、曱基化DNA、烷基化DNA、RNA、曱基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、腦A、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體孩i小RNA和初始孩i小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA,其衍生物、擴增子或其任意組合。在另一實施方案中，MNAi的至少一種組分還可包含適體。在本發明的另一方面，提供了MNAi組合物，其包含至少兩種或多種寡核苷酸組分，其中至少第一寡核苷酸組分和第二寡核普酸組分在至少一種MNA複合體活性抑制劑存在的情況下能自組裝，其中所述至少第一和第二寡核苷酸組分各自包含底物臂部分、催化核心部分和感應臂部分；其中當自組裝時，所述第一和第二寡核苷酸組分的所述感應臂部分作為感應臂，所述第一和第二寡核苷酸組分的所述底物臂部分作為底物臂，所述第一和第二寡核苷酸組分的所述催化核心部分形成非功能的催化核心；和其中當自組裝時，至少一種感應臂與所述活性抑制劑相互作用，所述第一和第二寡核苷酸組分的鄰近維持它們各自的催化核心部分締合以形成非功能的催化核心。在一個實施方案中，MNAi組合物還可包含至少一種組裝易化子。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可包含活化劑組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域、.底物結構域中的至少一種，或其任意組合。在另一實施方案中，所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種可位於所述活性抑制劑的不同結構域。所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種還可被不穩定的連接子或可切割的底物連接。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可以是底物。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可包含與所述兩種或多種寡核苷酸組分中的至少一種基本上不互補的核苷酸序列。在另一實施方案中，所述複合體的至少一種組分可包含至少一種適體或其部分，其中所述適體或其部分結合選自如下的配體核酸、蛋白、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任意衍生物、部分或組合。在本發明的另一方面，提供了使用信號級聯檢測組裝易化子的方法，包括第一MNAzyme、最初以基本上無催化活性形式存在的MNA複合體(MNAi)、能被所述第一MNAzyme修飾以提供可檢測作用的活性抑制劑，其中所述活性抑制劑既是活性抑制劑又是潛在的底物；和其中在允許所述第一MNAzyme的催化活性的條件下所述組裝易化子與所述第一MNAzyme的部件酶的結合促進了所述第一MNAzyme的催化活性，由此提供了對所述活性抑制劑修飾，以釋放所述活性抑制劑的活化劑組裝易化子結構域和活性抑制劑結構域，其中所述釋放提供所述可檢測作用；和其中所述釋放的活化劑組裝易化子結構域促進從所述MNA複合體的組分組裝第二MNAzyme;和其中所述第二MNAzyme的催化活性修飾所述活性抑制劑以釋放更多的活性抑制劑結構域和更多的活化劑組裝易化子結構域，其中所述釋放提供了更多的可檢測作用，和；其中所述更多的活化劑組裝易化子結構域促進另外的第二MNAzyme的組裝，由此提供更多的所述催化活性的第二MNAzyme,由此提供指示所述組裝易化子存在的更多的可檢測作用。在一個實施方案中，所述活性抑制劑可以是報告分子-抑制劑-易化子。在另一實施方案中，所述活性抑制劑、所述第一MNAzyme或所述第二MNA複合體組分中的一種或多種可以連接在不溶性載體上。在另一實施方案中，所述活性抑制劑、所述第一MNAzyme或所述第二MNA複合體組分中的一種或多種在溶液中可以是游離的。在另一實施方案中，所述活性抑制劑可包含組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域、底物結構域中的至少一種，或其任意組合。活性抑制劑還可包含可檢測部分和淬滅劑，其中當通過所述第一或所述第二MNAzyme對所述活性抑制劑進行修飾時，通過所述可4企測部分提供的可4企測作用淨皮增加或降低。可糹企測作用還可通過以下;f企測螢光光語，表面等離子體共振，質譜，NMR，電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色i普法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法，或其任意組合。所述可檢測作用還可被測定，所述測定的量指示組裝易化子的量。在另一實施方案中，所述組裝易化子可以是耙標。所述靶標可以是選自如下的核酸DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、曱基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體微小RNA和初始微小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA,其衍生物、擴增子或其任意組合。在另一實施方案中，所述第一MNAzyme和/或第二MNA複合體的組分中的至少一種還可包含適體，其中所述方法提供了對與所述適體結合的配體的檢測。所述配體還可包含蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任意衍生物、部分或組合。在另一實施方案中，組裝易化子可以是作為輸入事件的合成寡核苷酸。在另一實施方案中，催化活性MNAzyme的組裝可^皮選自如下的輸入事件調節在溫度，鹽濃度，離子強度，pH，二價陽離子的存在或不存在、類型或濃度，電荷，磁荷，物理操作上的變化，和在MNA或調節劑組分或微環境組分的濃度上的變化，或其任意組合。本發明另一方面提供了使用級聯檢測靶標的方法，其中所述級聯包含在所述靶標存在的情況下形成的起始MNAzyme;在所述起始MNAzyme的產物存在的情況下形成的第一MNAzyme;在所述第一MNAzyme的產物存在的情況下形成的另外的MNAzyme,其中所述方法包括如下步驟(i)用所述起始MNAzyme修飾第一底物以產生第一組裝易化子；(ii)用所述第一組裝易化子組裝所述第一MNAzyme;(iii)用所述第一MNAzyme修飾另外的底物以產生另外的組裝易化子；(iv)用所述另外的組裝易化子組裝所述另外的MNAzyme;(v)用所述另外的MNAzyme^f務飾所述第一底物以產生所述第一組裝易化子；(vi)用從(v)釋放的所述第一組裝易化子組裝所述第一MNAzyme，由此形成放大級聯；和其中所述第一或所述另外的底物的至少一種的所述修飾產生指示所述靶標存在的可4企測作用。在一個實施方案中，所述第一或所述另外的組裝易化子的任一或兩者可以是活化劑組裝易化子。在另一實施方案中，所述第一底物可以是所述第一MNAzyme的活性抑制劑。在另一實施方案中，所述放大級聯可以是反饋放大級聯。在另一實施方案中，所述另外的底物可以是所述另外的MNAzyme的活性抑制劑。在另一實施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含兩種部件酶，所述兩種部件酶在至少一種組裝易化子存在的情況下變得有催化活性。在另一實施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含兩種部件酶，所述兩種部件酶在至少兩種組裝易化子組分存在的情況下變得有催化活性。在另一實施方案中，第一和/或所述另外的MNAzyme可以包含兩種部件酶，所述兩種部件酶在三種或更多種組裝易化子組分存在的情況下變得有催化活性。在另一實施方案中，所述靶標可以是待檢測的、鑑定的或量化的組裝易化子分子。所述靶標還可以包含核酸。所述核酸還可以選自DNA、曱基化DNA、烷基化DNA、RNA、曱基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體孩l小RNA和初始微小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA，其衍生物、擴增子或其任意組合。所述核酸的來源還可進一步選自合成、哺乳動物、人、動物、植物、真菌、細菌、病毒、古細菌或其任意組合。在另一實施方案中，至少一種所述MNAzyme還可包含至少一種適體。所述適體還可結合至少一種配體。所述配體還可選自蛋白、多肽、肽、核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任意衍生物、部分或組合。在另一實施方案中，所述MNAzyme或所述底物中的至少一種組分可被連接在不溶性載體上或在溶液中是游離的。在另一實施方案中，所述一種或多種底物可包含可檢測部分和淬滅劑部分，其中當通過至少一種所述MNAzyme對所述底物修飾時，通過可檢測部分提供可檢測作用。在另一實施方案中，可;f企測作用可以通過下述的至少一種;f企測螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色譜法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法或其任意組合。所述可檢測作用還可被測定，其中所述測定的量指示靶標的量。本發明另一方面提供了使用信號放大級聯檢測靶標的方法，所述信號放大級聯包含第一MNAzyme的部件酶、第一底物、第二MNAzyme的部件酶、DNAzyme連接酶、第二底物、另外的部件酶和另外的MNAzyme的組裝易化子和另外的底物，所述方法包括下述步驟(i)在可檢測的靶標分子存在的情況下從第一MNAzyme的所述部件酶形成所述第一MNAzyme(11)用所述第一MNAzyme切割所述第一底物以產生多個切割底物31(iii)通過所述DNAzyme連接酶將至少一種所述切割產物與所述第二底物連接以產生所述另外的MNAzyme的連接的部件酶；(iv)通過與至少一種所述切割產物的組裝從第二MNAzyme的所述部件酶形成所述第二MNAzyme;(v)用所述第二MNAzyme切割所述第一底物以產生更多的所述多個切割產物；(vi)通過與至少一種所述更多的所述多個切割產物的組裝形成更多的所述第二MNAzyme,其中更多的所述第二MNAzyme的組裝由此形成放大級聯，導致更多的所述多個切割產物的積累，其中至少一種所述更多的所述多個切割產物作為所述DNAzyme切割酶的底物；(vii)用所述另外的部件酶和所述連4妻的部件酶以及所述組裝易化子形成所述另外的MNAzyme;(viii)用所述另外的MNAzyme^f多飾所述另外的底物，導致指示所述靶標存在的可4企測作用。在一個實施方案中，所述放大級聯可以是反饋放大級聯。在另一實施方案中，與所述第二底物連接的所述切割產物在其3，端具有2',3，-環磷酸酯。在另一實施方案中，至少一種所述切割產物可以是活化劑組裝易化子。在另一實施方案中，所述靶標可以是待檢測的、鑑定的或量化的分子。所述靶標還可以是核酸。所述核酸還可以選自DNA、曱基化DNA、烷基化DNA、RNA、曱基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體微小RNA和初始微小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA,其書f生物、擴增子或其任意組合。所述核酸的來源還進一步可選自合成、哺乳動物、人、動物、植物、真菌、細菌、病毒、古細菌或其任意組合。在另一實施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme連接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶和另外的MNAzyme的所述組裝易化子和所述另外的底物中的至少一種還可包含至少一種適體。所述適體還可結合至少一種配體。所述配體還可選自蛋白、多肽、肽、核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任意衍生物、部分或組合。在另一實施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme連接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶、另外的MNAzyme的所述組裝易化子和所述另外的底物中的至少一種還可包含至少一種納米顆粒、微粒或其組合。在另一實施方案中，第一MNAzyme的所述部件酶、所述第一底物、第二MNAzyme的所述部件酶、所述DNAzyme酶連接酶、所述第二底物、所述另外的部件酶、另外的MNAzyme的所述組裝易化子和所述另外的底物中的至少一種可連接於不溶性載體或在溶液中是游離的。在另一實施方案中，至少一種所述底物可包含可檢測部分和淬滅劑部分，其中當通過所述MNAzyme對所述底物修飾時，通過可檢測部分^是供可檢測作用。在另一實施方案中，可4企測作用還可通過以下的至少一種檢測螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色i普法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法，或其任意組合。所述可檢測作用還可被測定，其中所述測定的量指示所述耙標的量。在前述方面的任一方面的一個實施方案中，所述靶標可以是待4企測的、鑑定的或量化的分子。所述靶標可以包含核酸。所述核酸可以選自DNA、曱基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、翻A、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體微小RNA和初始微小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA,其衍生物、擴增子或其任意組合。所述核酸的來源可選自合成、哺乳動物、人、動物、植物、真菌、細菌、病毒、古細菌或其任意組合。在前述方面的任一方面的一個實施方案中，所述方法或組合物可結合適體並能檢測結合適體的配體，包括但不限於蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任意衍生物、部分或組合，或任^r其它實體在前述方面的任一方面的一個實施方案中，MNA複合體的至少一種組分可包含核酸或蛋白。所述核酸可包含標記的核酸、RNA、DNA、核酸類似物、肽核酸、鎖核酸、肽-核酸嵌合體中的至少一種，或其任意組合。所述蛋白可包含抗體、多肽、糖蛋白、脂蛋白中的至少一種，或其任意組合。MNA複合體的至少一種組分還可包含至少一種納米顆粒或孩i粒，或其組合。所述組分可連接於不溶性載體或在溶液中是游離的。底物組分可包含可檢測部分和淬滅劑部分，其中當通過所述MNAzyme對所述底物修飾時，通過可檢測部分提供的檢測作用被增加或降低。在前述方面的任一方面的一個實施方案中，可檢測作用還可通過以下檢測螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，焚光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色語法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法，或其任意組合。所述可4企測作用還可被測定，其中所述測定的量指示把標的量。本發明另一方面提供了包含多個MNA複合體的全加器，其中所述全加器可包含三種輸入的八個可能的組合以產生兩種輸出的四個可能的組合，其中所述四個可能的組合是無輸出、第一輸出、第二輸出、或第一和第二輸出兩者。在一個實施方案中，所述無輸入的存在產生無輸出。在另一實施方案中，為了響應任意且恰好一種輸入，所述全加器可產生第一輸出。34在另一實施方案中，為了響應任意且恰好兩種輸入，所述全加器可產生第二輸出。在另一實施方案中，為了響應三種輸入，所述全加器可產生第一和第二輸出。在另一實施方案中，至少一種所述輸入可以是可檢測的事件。在另一實施方案中，至少一種所述輸出可以是通過下述的至少一種測定的可檢測事件或可檢測作用焚光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR，電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色譜法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法，或其任意組合。在另一實施方案中，所述第一或第二輸出作為另一個全加器的輸入。附圖簡述現在將僅通過舉例的方式參考附圖描述本發明的優選實施方案，其巾圖1:多組分核酸(MNAzyme)的一個示例性設計的描述。作為示例性/>開，MNAzyme由兩種部件酶(A和B)組成，其在組裝易化子存在下自組裝。當所述兩種部件酶在組裝易化子存在下組裝時，催化活性MNAzyme形式能^f奮飾例如切割底物。所述兩種組分部件酶具有(i)與組裝易化子結合的感應臂，(ii)結合底物的底物臂，和(iii)部分催化核心序歹'J。圖2:活性MNAzyme的另外的示例性設計。插圖(i):當MNAzyme形成需要多種組裝易化子組分時的MNAzyme的示例性設計描述。在該設計中，組裝易化子的一種組分(F1)與部件酶A和B兩者的感應臂區域互補，而第二組裝易化子組分(F2)僅與部件酶B(按照該圖解)或僅與部件酶A互補。所述兩種組裝易化子組分一起指導能修飾(如切割)底物的活性MNAzyme的組裝。插圖(ii):當部件酶A組分和兩部分構成的部件酶B組分在組裝易化子存在下組裝以產生能修飾(如切割)底物的活性MNAzyme時的示例性設計描述。在該示意圖中，部件酶B具有截短的感應臂(T),其在缺乏被稱為穩定因子臂組分(S)的第二組分的情況下不足以允許穩定的MNAzyme組裝。在鄰近部件酶截短的感應臂的位置，穩定因子臂與組裝易化子的雜交允許活性MNAzyme的組裝。圖3:存在活性和無活性多組分核酸複合體的情況下，輸出信號(螢光)隨時間的變化。在該實例中，第一部件酶(A)是標準的設計。第二部件酶(B)具有含有底物臂的一種組分、部分催化核心和截短的感應臂(T)、以及作為穩定因子臂(S)的第二組分。在反應(i)中觀察到螢光的增加，其含有部件酶A和B以及組裝易化子的全部組分。這與該反應中活性MNAzyme的組裝和底物的切割是一致的。省略部件酶B的穩定因子臂部分(反應(ii))導致信號不隨時間增加，表明該組分在該系統中對活性MNAzyme的組裝是必需的。缺乏組裝易化子的對照反應(反應(iii))也表明螢光不隨時間增加。圖4:MNAi(左邊)和活性MNAzyme(右邊)的示例性設計的描述。當部件酶A和B與組裝易化子組分和活性抑制劑(左邊)複合時形成MNAi。MNAi能與底物相互作用，^旦不催化性〗務飾底物。在一些實施方案中，活性抑制劑還包括不穩定的或可切割的連接子(由虛線箭頭所指)其在活性抑制劑中可分成兩種或多種結構域。這樣的結構域可包括例如(i)活性抑制劑結構域，其與部件酶組分基本上不互補，並通過破壞形成催化活性MNAzyme所需的二級結構起抑制作用，和(ii)活化劑組裝易化子結構域，其如果從活性抑制劑結構域分離，可作為組裝易化子組分起作用，並指導活性MNAzyme的組裝。圖5:不同的多組分核酸複合體催化活性的證明。所有反應包含部件酶A、部件酶B、和螢光團淬滅劑染料對標記的底物。此外，反應包含或者(i)組裝易化子F1/2,(ii)包含組分F1和F2(它們合起來的序列對應於組裝易化子F1/2的序列)的組裝易化子，(iii)組裝易化子部分Fl和含有兩種連接的結構域的活性抑制劑，所述兩種連接的結構域對應於活性抑制劑結構域和具有與F2相同的序列的結構域，或者(iv)無組裝易化子或活性抑制劑。監測螢光隨時間的變化，作為通過活性MNAzyme複合體對底物的催化性切割的量度(圖5)。在含有或者組裝易化子F1/2或者組裝易化子Fl和F2的反應中萸光快速增加，表明分別形成了活性MNAzymel和2，這兩者都能切割底物。相反，含有Fl和活性抑制劑的反應顯示隨時間沒有螢光增加，表明MNAi複合體的形成。在缺乏組裝易化子的情況下，沒有觀察到螢光的增加。圖6:使用DNA的信號級聯(SCUD)的圖示。圖示的試驗方案包括下述組分(i)含有多個結構域的雙標記的RIF(報告分子-抑制劑-易化子)組分；a.RI結構域，包含活性抑制劑對艮告分子結構域，其具有如下雙重功能首先作為活性抑制劑(當併入RIF中時)和其次當RIF被切割時提供螢光輸出信號，b.活化劑組裝易化子結構域F2b，其對活性MNAzyme2a複合體的組裝是必需的組分，和c.位於RI和F2b之間的底物序列，其當#皮或者MNAzymela或MNAzyme2a切割時，導致RI和F2b結構域的分離(ii)組裝易化子組分F2a(iii)僅在另一種組裝易化子(Fl)存在下能形成活性MNAzymela結構的部件酶組分，所述F1例如能夠是測試樣品中存在的靶標核酸；能夠切割RIF、由此通過去除RI結構域(接著能發焚光並產生輸出信號)釋放和活化F2b結構域的活性MNAzymela，(iv)僅當部件酶臂結合所釋放的鄰接於F2a結構域的F2b結構域時能形成活性MNAzyme2a的部件酶。MNAzyme2a依次能切割更多的RIF釋放更多的F2b,由此產生MNAzyme2a的自身催化的自主複製級聯。在完整的RIF存在下，MNAzyme2a的組分組裝成MNAi2i複合體。在缺乏Fl的情況下，MNAzyme2a部件酶會與完整的RIF形成MNAi2i複合體。存在F1的情況下，活性MNAzyme1a會形成並切割RIF釋放F2b，所述F2b隨後會自由地結合併促進活性MNAzyme2a的組裝。由於MNAzyme2a還能切割更多的RIF，這啟動了信號級聯。如果SCUD策略與適體-MNAzyme系統相結合(如圖7所示)，SCUD(圖6)能被核酸靶標(DNA和/或RNA)或者其他靶標分析物(蛋白、小分子等)啟動。圖7:調節MNAzyme活性的示例性策略。該系統的所述策略可以用作(i)採用配體作為活化劑分子的調控MNAzyme活性的方法，和/或(ii)採用適體-MNAzyme(apta畫MNAzyme)檢測非核酸靶標的方法。在該示例性適體-MNAzyme檢測策略中包括的核酸寡核苦酸包括a)標準部件酶b)適體部件酶(apta-partzyme),其是具有適體的部件酶，所述適體併入其末端之一；c)組裝易化子，其是與適體部件酶和部件酶兩者結合的寡核苦酸，能夠組裝活性MNAzyme;d)報告分子底物；和e)組裝抑制劑寡核苷酸，其與適體部件酶在如下區域雜交跨越至少部分適體序列和適體-部件酶序列的部分底物結合臂。在缺乏活化劑配體的情況下(左插圖)，組裝抑制劑寡核苷酸與適體-部件酶結合，由此與報告分子底物竟爭並阻斷與報告分子底物的結合。當活化劑配體存在時(右插圖)，活化劑配體與適體-部件酶的適體序列結合，阻斷組裝抑制劑寡核苷酸的結合，由此允許報告分子底物的結合和切割。同樣地，在能結合適體的配體存在下，MNAzyme僅能形成並引起螢光信號產生。該方法能用於開發分子開關，所述分子開關能開啟和關閉MNA系統的催化活性。可選地，所述方法能用於檢測核酸和非核酸耙標配體兩者。本領域技術人員應理解能將一種或多種適體併入任意寡核香酸組分，包括但不限於部件酶、組裝易化子或底物。還能將適體併入任一這些寡核苷酸的任一端。在一個實施方案中，所述適體與部件酶的至少一種感應臂連接。在另一實施方案中，所述適體與部件酶的至少一種底物臂連接。圖8:DNAzyme連接酶和MNAzyme介導的切割/連接級聯的實例諸如寡核苷酸1/2的寡核香酸能被MNAzyme切割為切割產物寡核苷酸1和寡核香酸2，由此產生2，，3，-環磷酸酯和5，-羥基產物，它們參與了隨後的連接反應。DNAzyme連接酶如7Z81(Prioretal,2004)能將第一寡核苷酸(寡核苷酸l)連接到第二寡核苷酸(寡核苷酸2)以產生具有相同的核苷酸序列寡核苷酸1/2的寡核普酸連接產物。圖9.MNAzyme和MNAii殳計的示例性結構活性MNAzyme結構的一些實例顯示在插圖A至D(左邊的結構)中。這些結構都能形成能切割底物(S)的催化活性酶。MNAi結構的實例顯示在插圖A至D(活性MNAzyme右邊的結構)中。這些MNAi結構含有活性活性抑制劑(I),其與活性MNAzyme中組裝易化子(F)佔據的位點相結合。所述圖解含有MNAzyme的示意圖，其包括一種組裝易化子Fl(插圖A)，兩種組裝易化子Fl和F2(插圖B和D)或三種組裝易化子Fl、F2和F3(插圖C)。顯示在插圖A中的MNA的實例包括在部件酶感應臂中具有自身互補性區域的感應臂。MNA結構還包括在插圖D中所示的一種或多種穩定臂(sA)。參考實施例7至10會更好地理解標記為a至h的具體的MNAzyme和MNAi結構。圖10:使用兩種底物級聯的示例性策略。在該策略中，存在靶標(T)的情況下形成起始MNAzyme(Mt)。起始MNAzyme(Mt)切割第一底物(Sl)產生第一活化劑組裝易化子組分(Slf)，其指導形成第一MNAzyme(級聯MNAzymeMcl)。在該實例中，第一MNAzyme(Mcl)包含兩種部件酶和命名為Fl、F2和Slf的三種組裝易化子組分。Mcl能切割另外的底物(S2)由此釋放另外的活化劑組裝易化子組分(S2f)，其指導形成第二MNAzyme(級聯MNAzymeMc2)。在該實例中，第二MNAzyme(Mc2)包含兩種部件酶和命名為F3、F4和S2f的三種組裝易化子組分。Mc2隨後能切割更多的第一底物(S1)由此產生更多的第一活化劑組裝易化子組分(Slf)。這導致形成進一步的第一MNAzyme(Mcl)，由此形成力文大級聯。圖11.使用起始MNAzyme的信號放大級聯、SCUD級聯放大和DNAzyme連接酶介導的MNAzyme切割讀出。在該圖中說明的所述策略具有如下特點(i)靶核酸(Fl)促進形成起始MNAzyme(MNAzymela)，其切割第一底物(底物A)並產生第一切割產物(產物Aa)和第二切割產物(活化劑組裝易化子)(產物Ab)，第一切割產物(產物Aa)是反應第(ii)方面中必需的組分，第二切割產物(產物Ab)是反應第(iii)方面中必需的組分。(ii)第一切割產物(產物Aa)在其3'端具有2，，3，-環磷酸酯，適合作為具有連接酶活性的DNAzyme2a的底物起作用。DNAzyme連接酶2a將第一切割產物(產物Aa)連接到第二底物(底物B)以產生另外的MNAzyme(MNAzyme4a)的連4妻的部件酶。(iii)第二切割產物(產物Ab)作為活化劑組裝易化子組分起作用以指導形成第二MNAzyme(MNAzyme3a)。第二MNAzyme(MNAzyme3a)修飾更多的第一底物(底物A)產生更多的第一切割產物(產物Aa)和第二切割產物(產物Ab)。更多的第二切割產物(產物Ab)接著指導形成更多的第二MNAzyme(MNAzyme3a)。這導致SCUD自身催化地自主複製反饋放大級聯。該SCUD級聯導致更多的第二切割產物(產物Ab)的進一步積累，所述更多的第二切割產物(產物Ab)組裝更多的第二MNAzyme(MNAzyme3a)，這導致更多的第一切割產物(產物Aa)的積累，所述更多的第一切割產物作為第(ii)方面中DNAzyme2a的底物起作用。(iv)在第(ii)方面通過將第一切割產物(產物Aa)與第二底物(底物B)連接產生的另夕卜的MNAzyme的連接的部件酶形成另夕卜的MNAzyme(MNAzyme4a)的殺斤咅M牛酶。另夕卜的MNAzyme(MNAzyme4a)和易化子F4—起形成，並修飾螢光團和淬滅劑染料對之間的底物C，導致指示靶標核酸F1存在的螢光信號的增加。圖12.使用MNAzyme的分子全加器。三種輸入FAC1、FAC2和FAC3以灰色顯示，指定為'綠色，和'藍色，的陰影線代表具有不同螢光團的底物，C寡核苷酸以黑色顯示。部件酶也以黑色顯示，其與C寡核苷酸和底物預先複合。定義在此使用具有如下闡述的含義的某些術語。術語"包含"("comprising")意思是"基本上包括，但不一定僅僅包括"。此外，單詞"包含，，("comprising，，)的變體，如"包含，，("comprise，，)和"包含"("comprises")具有相應地變化的含義。術語"多核苷酸"、"核酸"和"寡核芬酸"可以互換地使用並涉及下列物質的單鏈或雙鏈聚合體脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基或其類似物、衍生物、變體、片段或組合，包括但不限於DNA、曱基化DNA、烷基化DNA、RNA、曱基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前體孩i小RNA和初始樣吏小RNA、其它非編碼RNA、核糖體RNA，其書f生物、其擴增子或其任意組合。以非限制性實例的方式，所述核酸的來源可以選自合成、哺乳動物、人類、動物、植物、真菌、細菌、病毒、古細菌或上述的任意組合。術語"催化核酸分子"、"催化核酸"、"核酸酶"和"催化核酸序列"在此可互換使用，並表示DNA分子或含有DNA的分子(本領域中也稱為"DNA酶"、"脫氧核酶"或DNAzyme)或RNA或含有RNA的分子(本領域中也稱為"RNA酶"或"核酶")或上述的組合，是可以識別底物並催化所述底物的修飾的DNA-RNA雜交分子。所述催化核酸中的核苷酸殘基可以包括石成基A、C、G、T和U,及其書f生物和類似物。術語"多組分核酸複合體"、"多組分核酸"、"MNA"或"MNA複合體"指包含選自但不限於下述的兩種或多種組分的複合體部件酶、穩定因子臂、組裝易化子、底物、以及包括活性抑制劑、組裝抑制劑和其組分的調節劑組分。在一些實施方案中，所述MNA複合體是活性MNAzyme。在其他實施方案中，MNA複合體是無活性複合體如MNAi，MNAi在本文也可以稱為多組分核酸無活性酶原(MNAi)。還在其他實施方案中，MNA複合體可以缺少MNAzyme組裝和催化所必需的一種或多種組分，包括但不限於底物、組裝易化子、穩定因子臂和部件酶，或其組分。本文所用的術語"MNAzyme"是指兩種或多種寡核苦酸序列(例如部件酶)，其僅在MNAzyme組裝易化子(例如靶標)存在下才能形成能夠催化性修飾底物的活性核酸酶複合體。圖1描述了包含部件酶A和部件酶B的示例性MNAzyme。參考圖1,部件酶A和B各自與組裝易化子結合(例如，通過Watson-Crick鹼基配對)。僅當部件酶A和B的感應臂在組裝易化子上彼此鄰近雜交時形成所述MNAzyme。所述MNAzyme的所述底物臂接合所述底物，由部件酶A和B的所述催化結構域相互作用形成的所述MNAzyme的所述催化核心催化所述底物的修飾(例如切割)。附圖中例示了DNA/RNA嵌合報告分子底物的切割。所述MNAzyme在焚光基團和淬滅基團染色對之間切割所述底物，從而產生信號。術語"多組分核酸酶"和"MNAzyme"在此可以互換使用並包含由兩種分子組成的二分結構，或由三種核酸分子組成的三分結構，或其它多分結構，例如由四種或更多核酸分子形成的那些。圖2(ii)說明了由多於兩種分子組成的MNAzyme的實例。部件酶可包含多種組分，包括但不限於具有截短的感應臂的部件酶組分和穩定臂組分，所述穩定臂組分通過與任一組裝易化子(如圖2(ii)中所示)或與底物相互作用穩、定MNAzyme結構。本文所用的術語"MNAi"指無催化活性狀態的MNA複合體，其中催化活性被本文所定義的"活性抑制劑"抑制。在優選實施方案中，所述MNAi可以是由於例如圖4所示的活性抑制劑寡核苷酸的結合引起的無催化活性，圖4顯示了MNAi的示例性設計。例如，當部件酶A、部件酶B、組裝易化子和活性抑制劑結合形成無活性複合體時形成MNAi。圖9說明了MNAi結構的另外實例。本文所用的術語"無催化活性MNA複合體"、"無活性MNA複合體"、"無催化活性MNA"或"無活性MNA"指沒有催化活性狀態的多組分核酸複合體。在一個實施方案中，"無活性MNA複合體"是MNAi，其可以是由於活性抑制劑寡核苷酸的結合引起的無催化活性。在另一實施方案中，"無活性MNA複合體"是部分組裝的或部分解組裝的MNA複合體，其中催化MNAzyme活性所必需的一種或多種組分不與MNA複合體結合。在一個實施方案中，反應環境中MNAzyme活性所必需的一種或多種組分的缺乏可以導致"無活性MNA複合體"的形成。在另一實施方案中，微環境例如溫度可以不容許活性MNAzyme所必需的所有組分的結合。在另一實施方案中，"無活性MNA複合體"可以包含活性MNAzyme結構形成所必需的所有組分，但"無活性MNA複合體"由於缺少催化所需要的一種或多種必要成分(諸如例如二價陽離子)而缺乏活性。在另一實施方案中，無活性MNA複合體可以是由於存在組裝抑制劑而無活性。本文所用的"分子開關"或"開關"指任意MNA複合體，其能響應輸入事件，將無活性轉變為有活性複合體，反之亦然。在優選的實施方案中，所述無活性複合體是無催化活性複合體。無催化活性複合體可以包含解組裝的複合體、部分組裝的複合體或諸如MNAi的複合體或具有相關組裝易化子的複合體。催化活性複合體可以是MNAzyme。本文使用的術語"組裝易化子分子"、"組裝易化子"、"MNAzyme組裝易化子分子"、"易化子"、"MNAzyme組裝易化子"和"活化劑組裝易化子"指通過與MNAzyme的感應臂相互作用能促進部件酶組分自組裝以形成催化活性MNAzyme的實體。在優選實施方案中，組裝易化子是MNAzyme自組裝所必需的。在一實施方案中，組裝易化子可以由與一種或多種寡核芬酸"部件酶"的感應臂配對或結合的一種(圖1)或多種分子或組分(圖2(i)、圖4-6和9-10)組成。組裝易化子也可以與沒有催化活性的MNA複合體結合，所述沒有催化活性的MNA複合體包括但不限於MNAi和部分組裝的或解組裝的MNA複合體。MNA複合體的組分可以包含具有對所述整體組分分離功能的結構域。例如活化劑組裝易化子結構域可以包含在其他組分內，例如在活性抑制劑分子內，在這裡它們以如下狀態存在直到它們通過例如切割從所述組分釋放才有助於活性MNAzyme組裝。本文使用的"活化劑組裝易化子，，或"活化劑組裝易化子組分"指如下實體一旦從另一組分內釋放或外源提供，就能通過與MNAzyme的感應臂相互作用促進部件酶組分的自組裝以形成催化活性MNAzyme。組裝易化子如活化劑組裝易化子能用於調控活性MNAzyme的組裝或促進從無活性多組分核酸複合體轉變為活性MNAzyme。所述多組分核酸複合體由於例如活性抑制劑如MNAi的存在可以是無催化活性的。本文所用的"活化劑"是導致MNAzyme活化的任意MNA結構或調節劑寡核苷酸組分、任意"分子效應劑"、"配體"、"靶標"或"事件"。活化劑寡核苷酸包括但不限於作為組裝易化子、部件酶或其組分起作用的寡核苷酸，例如具有截短的感應臂或底物臂的那些和部件酶穩定因子臂組分。在其他實施方案中，活化劑通過除去起抑制作用的寡核苷酸可以活化MNAzyme。能通過這種機制活化的寡核苷酸實例包括能移去(除去)抑制組分的調節劑寡核苷酸，所述抑制組分包括但不限於"活性抑制劑"或"組裝抑制劑"。在其他實施方案中，"活化劑"可以是與MNA複合體組分的適體結構域相互作用的配體，其中所述相互作用的結果是MNA複合體的活化。本文所用的術語"穩定因子臂"指下述實體與至少一種組裝易化子在鄰接於部件酶感應臂的位置能相互作用，以允許包括但不限於活性MNAzyme的MNA複合體的組裝。本文使用的術語"靶標"包括採用或不採用另外的擴增步驟試圖通過特定MNAzyme檢測、鑑定或定量的任何天然或合成的實體、組分或分析物，所述放大步驟包括但不限於MNAzyme放大實驗方案，例如"使用DNA的信號級聯，，或"SCUD"反應。靶標因此包括最廣範圍的可檢測實體、組分或分析物，為此需要靈敏的檢測、鑑定和/或定量方法。某些示例性靶標包括但不限於蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、完整有機體、細胞、病毒、細菌、古細菌、酵母、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任何衍生物、部分或組合。本文也包括使用其它靶標。應理解所述靶標還可以是組裝易化子或活化劑。本文所用的"可檢測事件"、或"輸入"或"輸入事件"包括MNA複合體的糹鼓環境的變化，所述MNA複合體包括但不限於MNAzyme和/或無活性MNA複合體。所述變化可以是例如在溫度，鹽濃度，離子強度，pH,二價陽離子的存在或不存在、類型或濃度，電荷，磁荷，物理操作上的變化，和在MNA或調節劑組分或微環境組分的濃度上的變化，或其任意組合。應理解提及的"在濃度上的變化"包括濃度的增加或降低，也包括先前不存在或在MNA複合體微環境不可檢測濃度44的實體的出現，所述MNA複合體包括MNAzyme和/或無活性MNA複合體如MNAi。由於微環境的變化能用於操縱MNA複合體的催化活性，代表可;險測事件的實體也可用作MNAzyme的催化活性的"活化劑"或"抑制劑"。同樣地，這些實體允許MNAzyme的催化活性轉換"開"或"關"，例如通過促進從無活性MNA複合體轉變為活性MNAzyme,或反之亦然。在一些實施方案中，所述實體促進MNAzyme的組裝和活化。在一些實施方案中，所述事件或實體促進MNAzyme的解組裝和失活。在其他實施方案中，所述事件或實體可以指導MNAi或其他MNA複合體的組裝或解組裝。在優選的實施方案中，MNAzyme催化活性的活化和失活過程是可逆的。術語"活性抑制劑"指能結合MNA複合體的一種或多種組分並指導無催化活性的"MNAi"組裝的任意實體(例如圖4-6和9-11)。活性抑制劑對催化活性的抑制可由"活性抑制劑結構域"介導，所述"活性抑制劑結構域"也稱為"活性抑制劑組分"、"抑制劑結構域"或基本上不與部件酶互補的"活性抑制劑結構域"。在優選的實施方案中，活性抑制劑可包含幾種不同的功能結構域，例如包括但不限於選自如下結構域的任意組合的功能結構域活性抑制劑結構域、活化劑組裝易化子結構域、底物結構域、和/或報告分子結構域。這些不同的功能結構域可以與活性抑制劑內幾種不同的結構結構域一致或不一致。因此，在一些與部件酶組分互補並通過破壞形成催化活性MNAzyme所需的二級結構起抑制作用。活性抑制劑的存在驅動MNAi複合體的組裝，所述MNAi複合體能與底物相互作用，但不催化修飾底物。在一些實施方案中，活性抑制劑可以包含組裝易化子結構域。在一些實施方案中，活性抑制劑還可以包含不穩定的或可切割的連接子或底物，所述連接子或底物可以例如位於活性抑制劑內的兩種或多種結構域之間，例如活性抑制劑結構域和活化劑組裝易化子結構域。在底物或連接子位點的切割可以允許活性抑制劑結構域與活化劑組裝易化子結構域分離，所述活化劑組裝易化子結構域隨後作為組裝易化子組分起作用並指導活性MNAzyme的組裝。在一些實施方案中，活性抑制劑可以與其他實體偶聯。在一些實施方案中，活性抑制劑與結合到射頻磁場的金納米顆粒偶聯以允許雜交的遠程電子調控。在該方法中，射頻磁場起天線的作用，使得特定的寡核苷酸能夠可逆熱變性，同時使周圍分子相對地不受影響。在一些實施方案中，所述活性抑制劑能用生物素標記以促進活性抑制劑的捕獲和物理隔離。本文所用的"組裝抑制劑"是通過與活性MNAzyme複合體的必要組分互補性結合(例如通過與部件酶組分或組裝易化子或底物結合)抑制MNAzyme複合體組裝的組分。組裝抑制劑序列與第一MNAzyme複合體組分的結合導致組裝抑制劑和所述第一組分竟爭結合第二MNAzyme複合體組分。例如，組裝抑制劑可結合部件酶底物臂(其結合底物)或部件酶感應臂(其結合組裝易化子)。當所述組裝抑制劑與所述底物臂互補(和結合)時，其竟爭(和阻斷)底物與部件酶的結合(圖7)。當所述組裝抑制劑與所述感應臂互補(和結合)時，其竟爭(和阻斷)組裝易化子與部件酶的結合。組裝抑制劑以這種方式阻斷了MNAzyme複合體的組裝。所述組裝抑制劑分子能用於調控MNAzyme的組裝，並還允許開發一企測非核酸和核酸靶標分析物兩者的策略。本文使用的術語"底物"、"底物分子"和"化學底物"包括能夠被諸如MNA複合體的分子識別、作用或化學》務飾的任何分子。所述底物的修飾提供了用於監測MNA系統的活性的"輸出"信號或"可檢測作用"。在具體實施方案中，底物可以被酶識別並修飾。在其它實施方案中，底物可以-陂催化核酸分子識別並修飾。在優選的實施方案中，底物可以被MNAzyme識別並修飾。底物的化學修飾可以通過修飾反應產物的出現或增加或通過^f奮飾反應的底物的消失或減少來測量。本文使用的"報告分子底物"、"報告分子探針"或"報告分子寡核苦酸"是特別適合於促進測量與催化反應相關的底物的消失或產物的出現的底物。報告分子底物可以在溶液中游離或結合(或"附著，，)於例如表面或另一分子。報告分子底物能夠通過許多種手段中的任何手段進行標記，包括，例如，螢光基團(含有一種或多種另外的組分，如淬滅基團)、放射標記物、生物素標記(例如生物素化)或化學發光標記物。本文使用的"通用"或"普遍性"底物是被多種MNAzyme識別並對其起催化作用的底物，其中每一MNAzyme能夠識別不同的組裝易化子，例如報告分子底物。應用這樣的底物促進開發用結構上相關的MNAzyme4企測、鑑定或定量許多種組裝易化子的單獨測定，所有所述MNAzyme識別普遍性底物。這些普遍性底物各自能夠獨立地用一種或多種標記物標記。在優選實施方案中，4吏用可獨立4企測的標記物標記一種或多種通用底物以便為用MNAzyme獨立地或同時檢測多種組裝易化子創造方便的系統。在一些實施方案中，被MNAzyme切割的底物使用DNAzyme連接酶能再生，因此再循環。本文使用的術語"調節劑"是能增加或減少MNA系統催化活性的實體。調節劑可以是活化或轉換MNAzyme活性的"活化劑"。在一些實施方案中，調節劑是"抑制劑"，包括但不限於"組裝抑制劑"或"活性抑制劑"。本文使用的"適體"可以包含能夠識別一種或多種配體的結構。例如，所述識別可以由於所述適體的較高水平結構如三維結合結構域或口袋而具有高度特異性。因此，適體可以結合蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、細胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或其任何衍生物、部分或組合，或任何其它實體。本文優選的適體可以包括短的單鏈DNA或RNA寡聚體，所述寡聚體能夠通過吸附、回收和再擴增的重複過程從合成核酸的複合體庫中分離出來。因此，可以產生針對幾乎任何靶標的適體，所述靶標的範圍從小分子如胺基酸或抗生素到蛋白和核酸結構。在本發明中，適體用於使分子開關成為含有組裝抑制劑的MNA系統的一部分。活化劑配體的存在能打開MNAzyme活性(圖7右邊)，活化劑配體的除去或缺乏能關閉MNAzyme活性(圖7左邊)。而且，在本發明中適體還用於促進核酸和非核酸配體的檢測。配體的檢測還能用於觸發放大級聯，包括但不限於SCUD放大級聯。本文使用術語"部件酶"、"組分部件酶"、"部件酶組分"和"組分寡核苷酸"是指含有DNA或含有RNA或含有DNA-RNA的寡核苷酸，其中兩種或更多種所述寡核苷酸僅在如本文定義的MNAzyme組裝易化子的存在下能夠一起形成"MNAzyme"。在某些優選實施方案中，一種或多種組分部件酶，並優選至少兩種可以包含三種區域或結構域形成催化化學修飾的催化核心部分的"催化，，結構域；可以與組裝易化子締合和/或結合的"感應臂"結構域；以及可以和底物締合和/或結合的"底物臂"結構域。這些區域或結構域的示例描述顯示在圖1中。部件酶可以包含至少一種另外的組分，包括但不限於適體，所述適體在本文稱為"適體-部件酶"。本文使用的術語"全加器"指對三種二元輸入進行操作以產生兩種獨立二元輸出的邏輯元件。全加器搡作遵從下述規則i)任意且恰好一種輸入的存在僅產生第一輸出；ii)任意且恰好兩種輸入的存在僅產生第二輸出；iii)所有恰好三種輸入的存在產生第一輸出和第二輸出；和iv)所有三種輸入的缺乏產生無輸出。本文使用術語"級聯"是指在連續階段中發生的任何連續的過程或操作，在所述連續階段中每一階段的發生通常依賴於前一階段的發生。因此級聯可以包括但不限於酶促級聯或任何其它信號轉導級聯。在某些實施方案中，級聯可以包括因MNAzyme的催化活性而產生的信號;故大。在優選實施方案中，這樣的》文大級聯可以包括反覆並因此而循環的信號放大，其中第一MNAzyme的催化活性使得第二MNAzyme的催化活性所需要的分子可獲得，所述第二MNAzyme的催化活性進一步使得另外的第二MNAzyme的催化活性所需要的活化劑可獲得。在某些實施方案中，所述所需要的活化劑可以包含部件酶、酶、組裝易化子、底物、靶標、其部分或片段或上述的組合。在某些實施方案中，級聯可以因此包括累積效應的產生，從而通過使信號產生至可以檢測的水平來檢測低豐度靶標。在其它實施方案中，可以利用多於兩種的催化階段。所述級聯可以是線性的。在優選實施方案中，所述級聯可以是指數的。在優選的實施方案中，所述級聯可以包含通過去除活性抑制劑的影響來活化MNAi。在某些實施方案中，MNA複合體組分可以通過對其他MNA複合體組分的切割產生。在某些實施方案中，MNA複合體組分可以例如通過^f吏用DNAzyme連接酶對其他MNA複合體組分進行連接來產生。術語"寡核苷酸"通常代表DNA片段或含有DNA的核酸分子、或RNA或含有RNA的分子或上述的組合。寡核芬酸的實例包括核酸輩巴標；底物，例如，能夠被MNAzyme或DNAzyme修飾的那些；引物，如通過諸如PCR的方法進行體外靶標擴增所用的那些；和MNA複合體的組分。MNA複合體組分包括但不限於組裝易化子、組裝抑制劑、活性抑制劑、穩定因子臂和/或底物臂，在某些實施方案中，MNA複合體組分可以包含如本文所定義的寡核苷酸。本文使用的部件酶也可以包含寡核香酸。除非另有說明，術語"多核苷酸"、"核酸"和"寡核苦酸"包括提及的任何指定的序列以及與其互補的序列。寡核苦酸可以包含至少一種添加或取代，包括但不限於4-乙醯胞香、5-(羧基羥基曱基)尿芬、2，-0-曱基胞苷、5-羧基曱基氨基甲基硫代尿苷、二氫尿苷、2，-0-曱基假尿苷、/3-D-半乳糖基Q核苷、2'-0-曱基鳥苷、肌苷、N6-異戊烯基腺苷、1-曱基腺苷、1-曱基假尿苷、l-甲基鳥苷、l-曱基肌苷、2,2-二甲基鳥苷、2-曱基腺苷、2-曱基鳥苷、3-曱基胞苷、5-甲基胞苷、N6-曱基腺苷、7-甲基鳥苷、5-曱基氨基曱基尿苷、5-曱氧基氨基曱基-2-硫代尿苷、/5-D-甘露糖基甲基尿苷、5-曱氧基羰基曱基尿苷、5-曱氧基尿苷、2-硫代甲基-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-Z3-呋喃核糖基-2-硫代曱基。票呤-6-基)氨基曱醯)蘇氨酸、^((9-/3-呋喃核糖基。票呤-6-基戸-甲基-氨基曱醯)蘇氨酸、尿苷-5-氧基乙酸曱基酯、尿苷-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫代胞苷、5-曱基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-曱基尿苷、N-((9-Z3-D-呋喃核糖基。票呤-6-基)氨基曱醯)蘇氨酸、2'-0-曱基-5-曱基尿苷、2'-0-曱基尿香、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿香、/5-D-阿拉伯糖基尿苷、^-D-阿拉伯糖基胸苦。當術語"衍生物"用於本發明的核酸或核香酸時，其包括任何功能等同的核酸或核苷酸，包括完整地製備(例如，通過重組方法)或在合成後添加(例如，通過化學方法)的任何融合分子。這樣的融合可以包含其中添加了RNA或DNA或與多肽(例如，。票呤黴素或其他多肽)、小分子(例如，補骨脂素)或抗體偶聯的本發明的寡核苷酸。當術語"類似物"涉及核酸或核苷酸時，其包括具有與DNA或RNA分子或殘基相關的物理結構的化合物，並能夠與DNA或RNA殘基或其類似物形成氫4建(即，它能夠與DNA或RNA殘基或其類似物退火形成鹼基對)，但是這樣的成鍵並非為包括在術語"類似物"中的所述化合物所需。這樣的類似物可以具有與在結構上與之相關的核糖核芬酸或脫氧核糖核芬酸殘基不同的化學和生物學性質。曱基化、捵化、溴化或生物素化殘基是類似物的實例。已經描述了含有核苷酸類似物的活性DNAzyme，所述核香酸類似物包括脫氧月幾苷、C-5-咪唑脫氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-去氮-dATP、2，-0-曱基RNA、2，-0-曱基帽(Warashina"a/.,1999;CairnsWa/.,2003;Schuberta/.,2004;Sidorove/a/.，2004)。其它的類似物與DNAzyme的催化活性相適宜。催化核酸序列的變化，例如用一個i威基取代另一個、用類似物耳又代鹼基、或糖組分或磷酸二酯主鏈的變化，對本領域技術人員而言是顯而易見的。例如，能夠在合成期間進行改變，或通過在合成後修飾特定鹼基進行改變。引入諸如鹼基改變或鹼基類似物的變化的催化核酸的經驗性測試允許評價改變的序列或特定類似物對催化活性的影響。鹼基A、C、G、T和U的類似物為本領域已知，其亞類列於表l中。本X炎^的核奪凝類似敎豸辦tableseeoriginaldocumentpage50tableseeoriginaldocumentpage51tableseeoriginaldocumentpage52本文使用的術語"嚴緊性"是指兩種核酸可以雜交的條件，並且可以包括例如溶液中鹽和/或去垢劑的濃度、在兩種核酸雜交期間使用的溶液的溫度和雜交的時間段。因此，本文使用的術語"高度嚴緊性"是指有益於兩種核酸雜交的溶液條件，只有在該條件下所述核酸才具有高度的互補性。所述互補性的程度可以包括但不限於約55%到100%的範圍。因此，"高度嚴緊性"條件可以包括但不限於，使用變動的溫度和包含各種濃度的去垢劑、鹽和二價陽離子的緩沖液。下列縮寫在此使用並貫穿本說明書MM4:多組分核酸，或多部分核酸；MWJ複合體多組分核酸複合體，或多部分核酸複合體；MA^4矽me:多組分核酸酶，或多部分核酸酶；MA^4/:多組分核酸無活性酶原複合體，或多部分核酸無活性酶原複合體；DA^^yme:脫氧核糖核酸酶；屍Ci:聚合酶鏈式反應；LCR:連接酶鏈式反應；丄A^4:鎖核酸；屍A^:肽核酸；分析物或耙標；F:螢光基團；2:淬滅基團；FJ似-戈6-E4M:6-羧基螢光素。黑孔淬滅基團15//g麼'黑孔淬滅基團2s/LR7V丄短髮夾RNA虛亂短幹擾RNA信使RNA轉運RNA核仁小RNAWiA^;瞬時小RNAjw7A^,調節小iA^;re-microRNA:前體微小RNA;n'-iA^:初始孩i小RNASC"D:使用DNA的信號級聯TASC:靶標輔助的自我切割i/F:報告分子-抑制劑-易化子i/:報告分子-抑制劑結構域G7P:5，-三磷酸鳥苷C7P:5，-三磷酸胞苷t^7P:5，-三磷酸脫氧腺香爿7P:5，-三磷酸腺苷丄屍連4妻產物C屍切割產物o/z'go:寡核脊酸說明性實施方案詳述首先應當理解，本文提供的附圖和實施例是用於舉例說明而不是限制本發明及其各種不同的實施方案。根據本發明，提供了調節MNA複合體的組合物、方法和試劑盒。本方法通常包括使用包含多組分或多部分核酸複合體的組合物，所述多組分或多部分核酸複合體優選由多核酸組分形成，所述多核酸組分合體。才艮據本發明，可選地，將MNAzyme才企測與靶標擴增(例如PCR)聯合是將MNAzyme與信號放大結合，優選地僅使用核酸酶。這樣的信號級聯反應能取代諸如PCR的靶標擴增技術。此外，可以開發不需要任何蛋白酶的診斷方案，因此較為便宜並具有較長的適用期。根據本發明，已經包括了使用MNAzyme加或減DNAzyme的幾種信號級聯策略。/.逸合敎一AfAC4矽挑e;^尤活遂AfA^複合脊多組分核酸酶(Multi-componentNucleicJcidenzymes)(本文也稱為多部分核酸酶(niultipartitenucleic§cidenzymes)或"MNAzyme")已詳細描述於2005年10月13日提交的序列號為60/726,291和2005年10月7日提交的序列號為60/724,567的美國申請，以及國際申請PCT/AU2006/001473中，其內容通過引用全部併入本文。本文定義的MNAzyme是一類MNA複合體。MNAzyme能從兩種或多種寡核苦酸組分自組裝，本文也稱為部件酶。部件酶寡核苷酸在組裝易化子的存在下自組裝以形成MNA複合體。MNAzyme是催化活性MNA複合體。在某些實施方案中，MNAzyme的存在能被檢測，並指示靶標的存在，這是因為所述MNAzyme僅在所述靶標的存在下形成，其中所述靶標包含所述組裝易化子。本文提供了基於上述基本原理的多種測定。本文還提供了包含能夠形成MNAzyme的寡核香酸的組合物，以及各種序列的MNAzyme。在某些實施方案中，所述寡核苷酸組分、組裝易化子或底物中的至少一種可以包含能夠與活化劑或靶標結合的適體。圖l顯示了MNAzyme的示例性設計。所述組裝易化子分子提供"輸入"信號，其指導部件酶組分以遵從調節的高特異性方式組裝。在某些實施方案中，所述組裝易化子可以是例如在測試樣品中存在的靶標核酸序列。在其他實施方案中，所述組裝易化子可以是例如環境中包括的合成寡核苷酸，以指導部件酶組分在可檢測的實體或事件存在時自組裝。組裝的MNAzyme對底物的修飾能提供"輸出"信號，其可以被檢測和/或定量。僅作為例子，當底物用焚光團(F)和淬滅劑(Q)雙標記時，活性MNAzyme對底物的切割4吏焚光團和淬滅劑分離，導致伴隨的螢光增加。先前公開的MNAzyme涉及靶標分析物的檢測、鑑定和定量。本發明描述了MNA複合體的新方法、組合物和應用。本發明描述了提供寡核苷酸組分的新組合物，所述寡核苷酸組分通過形成缺乏催化活性的可選擇結構如解組裝的或部分組裝的複合體，能被用於操縱MNAzyme活性。本發明還公開了包含寡核芬酸組分的無活性MNA複合體，如MNAi，s，所述寡核苷酸組分在適當條件下能被組裝成活性MNAzyme,但當其與"活性抑制劑"組裝時導致形成無催化活性的複合體。這樣的無活性MNA複合體在本文定義為"MNAi"，這樣的無活性是由於活性抑制劑的抑制影響引起的。MNAi能通過部件酶組分的底物臂與底物相互作用，但不能催化修飾底物。所述活性抑制劑還可以包含組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域、報告分子結構域、底物結構域中的至少一種，或其任意組合。所述活性抑制劑可包含活化劑組裝易化子結構域和活"性抑制劑結構域。所述活性抑制劑可包含活化劑組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域和報告分子結構域。所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域、底物結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種可位於活性抑制劑的不同結構域。所述活性抑制劑的所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種可由不穩定的連接子或可切割的底物連接。所述活性抑制劑結構域可以包含與至少一種MNA組分包括部件酶基本上不互補的核苷酸序列。所述底物可包含活化劑組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域和報告分子結構域中的至少一種，或其任意組合。所述活性抑制劑還可包含至少一種組裝抑制劑。所述組裝易化子結構域可以是活化劑組裝易化子結構域。所述活性抑制劑還可包含活化劑組裝易化子結構域和活性抑制劑結構域。圖4所示的活性抑制劑說明了該方案。所述活性抑制劑可以包含活化劑55組裝易化子結構域、活性抑制劑結構域和報告分子結構域，例如圖6所示的RIF分子。就RIF分子而言，所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種可以位於活性抑制劑的不同結構域。關於圖6所示的RIF分子，所述活性抑制劑結構域、所述活化劑組裝易化子結構域和所述報告分子結構域中的至少兩種由不穩定的連接子或可切割的底物連接。本發明還公開了催化活性的抑制在特定事件發生時可被去除，所述特定事件例如包括但不限於活化劑如本文定義的組裝易化子的存在，或參數的變化，包括但不限於在溫度、波長、壓力、鹽濃度、去垢劑、陽離子或任何其他參數上的變化。此外，包括如活性抑制劑的的實體包括但不限於吸附的核酸、納米顆粒、微粒、蛋白、抗體、RNA、DNA、核酸類似物、生物素基團、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、鎖核酸、肽-核酸嵌合體、射頻部分，或其任意組合。無催化活性的MNA複合體代表"關"狀態，而催化活性MNAzyme代表"開"狀態。活化劑可直接或間接誘導活性狀態。例如當組裝易化子組分(活化劑)與部件酶相互作用時可發生活性狀態的直接誘導。例如通過一種或多種中間物的作用可發生活性MNAzyme狀態的間4妄誘導，例如其中活化劑包含如下試劑或由如下試劑組成其作用於抑制劑以引起活性抑制劑的去除，如通過釋放由抑制劑結構域和組裝易化子結構域組成的活性抑制劑的抑制劑結構域。在其他實施方案中，所述活化劑去除組裝抑制劑。在優選的實施方案中，MNA複合體，包括MNAzyme和無活性MNA複合體，基於一種或多種DNAzyme和/或核酶。MNAzyme的多個優選的部件酶組分和無活性MNA複合體基於特定的DNAzyme結構。目前的優選結構基於包括10:23和8:17DNAzyme的DNAzyme。在各種實施方案中所述MNAzyme和無活性MNA複合體包含核香酸鹼基和脫氧核糖核苷酸鹼基中的任一者或兩者都包含。在更優選的實施方案中，MNA複合體，包括MNAzyme和無活性MNA複合體，至少部分基於DNAzyme的結構。在其它優選實施方案中，MNA複合體，包括MNAzyme和無活性MNA複合體，包含至少一些脫氧核糖核苷酸石威基或其類似物。在更優選的實施方案中，組裝成MNAzyme和/或無活性MNA複合體的部件酶的催化核心部分包含一種或多種脫氧核糖核芬酸鹼基或其類似物。在更優選的實施方案中，一種或多種脫氧核糖核苷酸鹼基或其類似物參與通過MNAzyme對底物的催化。在其它實施方案中，所述催化核心中的至少一種脫氧核糖核苷酸鹼基或其類似物-提高了MNAzyme的催化活性。在其它實施方案中，在用於催化的MNAzyme的催化核心嚴格需要至少一種脫氧核糖核苷酸鹼基或其類似物，以在活性抑制劑的抑制影響一旦被去除時產生可測量的速率，所述速率相對於不存在脫氧核糖核苷酸鹼基的情況下可比較的MNAzyme的速率。如本文所提供的，MNA複合體，包括MNAzyme和無活性MNA複合體，可以含有本領域技術人員所熟知的一種或多種取代，如類似物，衍生物，修飾或改變的鹼基，核糖核苷酸，糖或磷酸主鏈的改變，各種刪除、插入、取代、重複或其它修飾，或這些的任意組合。這樣的修飾、取代、刪除、插入等可以在如本文所闡述的感應臂和/或底物臂和/或催化核心部分進行，使得所述分子保持催化活性。與所述底物或組裝易化子結合的臂的取代和修飾可以被良好耐受並且實際上是允許改變所述分子以適合不同底物/組裝易化子的基礎。例如，對所述感應臂的修飾會允許針對不同的組裝易化子進行調整，而對所述底物臂的修飾會允許針對不同的底物進行調整。對多個通用底物的分析允許同時^r測多個"輸出"信號。在某些優選實施方案中，本發明涉及具有催化活性的MNAzyme，所述MNAzyme由脫氧核糖核香酸組成或通過某些》務飾/置換等衍生自這樣的分子。作為通常規則，將整個分子用例如核糖核苷酸取代會使所述分子失活，因為它的活性依賴於某些關鍵的脫氧核糖核苦酸。在相應的方式中，核酶中的某些核苷酸可以用脫氧核糖核苷酸置換但是將整個分子用例如脫氧核糖核苷酸替代會使所述分子失活。本領域技術人員應當理解，MNA複合體，包括MNAzyme和無活性MNA複合體，包含脫氧核糖核香酸或核糖核苦酸中的任一者或甚至兩者都包括。目前優選的是包含至少一種和更優選全部脫氧核糖核苷酸組分的寡核苷酸的那些MNAzyme和無活性MNA複合體。在含有MNAzyme和/或無活性MNA複合體的所述部件酶的至少一部分催化核心中包含至少一種脫氧核糖核苷酸鹼基或其類似物的那些MNAzyme和無活性MNA也是優選的。甚至更優選的是其中這樣的石鹹基為MNAzyme催化活性所必需的那些實施方案。在某些優選的實施方案中，MNA複合體的至少一種組分可包含自身互補區域，其在某些條件下形成髮夾結構。在一個實施方案中，自身互補區域可位於部件酶感應臂的一者或兩者中。在另一實施方案中，自身互補區域可位於部件酶底物臂的一者或兩者中。在另一實施方案中，一種或多種自身互補區域可存在於組裝易化子、組裝抑制劑或活性抑制劑組分、或其任意組合中。在其他實施方案中，MNA複合體可結合含有自身互補區域的底物。本領域技術人員也應當理解，多部分DNAzyme比多部分核酶具有優勢，例如在穩定性和使用的容易程度方面。還應理解，在某些實施方案中，MNAzyme比單分子核酸酶如DNAzyem有優勢，所述單分子核酸酶僅能夠識別一種底物，而單一MNAzyme(和/或無活性MNA複合體)能夠識別兩種分子，即組裝易化子和底物。例如，MNAzyme的這些性質使它們適合於需要能"讀""輸入"信號和"寫""輸出"信號的組分的系統，例如在^f吏用邏輯門的系統中。MNAzyme的這些性質揭:供了轉換信號的能力，例如接受輸入信號和應答適當的輸出反應。丄源，AfA^複合脊催^話^^才法和它//7>^途的^眉。MNA複合體組裝和解組裝可被微環境的變化調控。這些變化的實例包括但不限於溫度，二價陽離子類型和濃度，鹽濃度，pH,添加劑，組裝所必要的關4建組分的的存在或不存在，和/或活性MNAzyme的活性。組裝的MNAzyme代表"開"狀態，而其解組裝的或部分組裝的組分代表"關，，狀態。組裝和解組裝能受溫度調控。通過將溫度轉換到適合MNAzyme的組裝和催化活性的溫度範圍中的一個溫度來誘導"開"58狀態。相反地，通過將溫度轉換到適合MNAzyme的組裝和/或催化活性的溫度範圍外來誘導"關"狀態。能將MNA複合體組分的熔融溫度調節至僅允許在限定的溫度範圍內組裝。特別用於本發明這方面的寡核苷酸包括但不限於穩定因子臂組分、具有截短的感應臂的部件酶組分和組裝易化子組分和/或調節劑寡核苷酸。MNA複合體提供了很大的柔性，其中基本設計的組分(圖l)還被分裂成較小組分的亞單位或部分，如圖2所示的截短的感應臂或穩定因子臂部分，其序列能依據熔解溫度、序列組成和與其他組分寡核苷酸的互補性或缺乏互補性被設計。關於圖2，本領域技術人員應理解被截短的部件酶臂可以是下述的任一種部件酶A感應臂、部件酶B感應臂(如圖2所示)、部件酶A底物臂或部件酶B底物臂，或其組合。能利用MNAzyme對溫度的敏感性建立熱敏元件和變阻器。如果溫度對於組分寡核苷酸的組裝(雜交)和/或催化活性過高或者過低，那麼MNAzyme底物不會被修飾(例如被切割)。如果溫度對MNAzyme活性是容許的，那麼底物會被修飾並將產生信號。溫度從與MNAzyme活性不相容的溫度升高或降低到與MNAzyme活性相容的溫度，會通過由MNAzyme對底物修飾後產生的信號被檢測。MNAzyme因此能提供能檢測溫度變化的裝置。本領域技術人員應理解，使用對溫度敏感的MNAzyme的本發明的簡單裝置能應用於許多工業，包括例如藥物、食品和農業工業。在其他實施方案中，磁力能調節陽離子濃度，並因此提供調節MNAzyme活性開和關的開關。帶正電的陽離子對某些MNAzyme的催化活性是必需的。可選擇地，磁力能通過將帶負電的部件酶組分與帶正電的陽離子如Mg"物理上分離來關閉MNAzyme活性。隨後，通過允許部件酶與陽離子恢復接觸，可以再打開MNAzyme活性。在某些實施方案中，使用與活性相容的範圍內的pH能誘導活性"開"狀態(MNAzyme)。相反，使用與活性相容的範圍外的pH能誘導"關"狀態。pH還通過誘導不穩定序列的水解被用於調控MNA複合體的活性，這樣產生或石皮壞MNAzyme的新組分和/或無活性MNA複合體。MNA複合體任意組分的存在或缺乏能提供"開"或"關"開關。改變例如寡核苷酸序列、熔解溫度和或濃度能獲得精細調節。對能組裝成MNA複合體的組分(例如兩部分組裝易化子和/或兩部分部件酶組分(具有截短的感應結構域和穩定因子臂))的廣泛設計將柔性引入如下系統能允許對與雜交和因此的MNA複合體組裝相容的條件的設計(細調)。此外，雜交強度和MNA複合體內特定寡核苷酸結合的嚴緊性受許多因素的影響，所述因素包括但不限於鹽濃度、陽離子濃度、溫度和添加劑(DMSO)的存在或缺乏。同樣地，影響雜交的實體能提供調控MNA複合體(包括活性MNAzyme和無活性MNA)的組裝和解組裝的工具。例如通過利用作為分子"鉤"的連接部分的物理特性，和/或通過利用寡核苷酸的固有性質如負電荷或序列互補性可以實現對組分的物理操作。在另一實施方案中，連接部分允許寡核苦酸被選擇性捕獲，例如使用生物素基團。在另一實施方案中，所述部分含有射頻磁場無線電以促進雜交的遠程電子控制。設計該方法以允許通過對MNA複合體內特定寡核苷酸的靶向熱變性來選擇性去除組分分子，因此允許依賴所述組分分子自身是否是活化劑或抑制劑序列來活化或抑制酶活性。例如，可以選擇地使來自MNAi複合體的活性抑制劑變性以允許向活性MNAzyme狀態的轉變。其他策略能被用於去除活化劑或抑制劑分子的影響，由此促進活性MNAzyme和無活性MNA複合體的組裝或解組裝。例如，在單鏈末端兩種寡核苷酸之間的雜交能引起分支遷移和雙鏈核酸區域的拉開拉鏈。在一個實施方案中，通過調節劑寡核苷酸能從MNAi複合體去除活性抑制劑，所述調節劑寡核苷酸通過支鏈遷移起作用。在其他實施方案中，互補性寡核苷酸可以用於在竟爭中勝過寡核苷酸組分，並由此"關"掉或關閉寡核苷酸組分，所述寡核苷酸組分本身包含活化的(MNAzyme)或無活性MNA複合體如MNAi。通過該方法抑制的所述組分可包含MNAzyme或無活性MNA複合體的活化劑或抑制劑組分。去除或抑制活化劑組裝易化子結構域可允許催化活性MNAzyme轉變為無活性MNA複合體如MNAi。去除活化劑組裝易化子結構域可包含由活性抑制劑取代MNAzyme的活化劑組裝易化子結構域。MNA複合體或多個MNA複合體在單一反應或測定中的組裝或活性。3.逸合浙#力#子矛^的^途本領域技術人員應認識到並理解本發明等同於分子或生物"開關"其應用也包括在本文。下表2列出了開和關MNAzyme活性的機制的示例性實例。表2.活性和無活性MNA狀態以及兩種狀態之間轉換的機制類型"開"活性狀態"關"無活性狀態能謙導活性和無活性狀態之間轉換的機制的實例MNAzyme複合體組裝和解組裝完全組裝完全或部分解組裝溫度可與組裝相容或不相容組分的物理去除或添加適體-MNAzyme複合體(具有組裝抑制劑)活化劑配體存在無活化劑配體活化劑配體通過去除組裝抑制劑提供開關去除了組裝抑制劑提供了組裝抑制劑例如通過支鏈遷移對組裝抑制劑的去除、取代或修飾可選的MNA複合體結構MNAzymeMNAi例如通過支鏈遷移或切割對活性抑制劑的去除、取代或修飾催化抑制MNAzyme力口陽離子如Mg2+MNAzyme減陽離子如Mg^使用例如磁力將正陽離子與帶負電的DNAMNA組分分離在這點上，多組分核酸複合體的任何組分的存在或缺乏都能提供"活化劑"或"開"轉換，或可提供抑制性"關"轉換。在某些實施方案中，穩定因子臂的存在或添加能提供"開"轉換。在一個實施方案中，在例如通過活性抑制劑或任何其他MNA組分的切割的反應過程中，能在系統中產生新的穩定因子臂。在其他實施方案中，穩定因子臂的缺乏、修飾或去除能提供"關"轉換。在某些實施方案中，組裝易化子或其組分的存在能提供"開"轉換。在某些實施方案中，通過MNAzyme對MNA複合體組分的切割，例如通過對SCUD過程中活性抑制劑的切割或通過對反應環境中提供的61其他組分的修飾，能產生新的組裝易化子。在某些實施方案中，組裝易化子能提供序列內編碼的特定"輸入"信號系統。在某些實施方案中，組裝易化子能被識別或"讀"。在某些實施方案中，部件酶感應臂能"讀"組裝易化子序列，包括在一種或多種單鹼基上不同的組裝易化子序列。在其他實施方案中，組裝易化子或其組分的缺乏或去除能提供"關"轉換。在某些實施方案中，通過連接反應環境中存在的組分可產生MNA複合體的組分。在某些實施方案中，通過連接寡核苷酸產生部件酶，由此產生新的部件酶組分，其伴隨形成例如活性MNAzyme。在某些實施方案中，通過連接寡核苷酸產生組裝易化子，由此產生新的易化子組分，其能促進MNA複合體的組裝。活化(MNAzyme)和失活(無活性MNA)狀態之間的轉換能提供產生分子開關的機制，所述分子開關能通過活性和無活性構象之間的改變被調節。這樣的分子開關可例如應用於核酸複製級聯的調控，或自主治療、診斷和計算分子規模裝置的調節。本發明提供了組合物，其包含用於自組裝MNAi複合體的組分，在一種或多種MNAzyme組裝易化子分子存在下的自組裝形成MNAi,其中至少一種組裝易化子分子包含活性抑制劑。參照附圖可以較好地理解本發明。圖l描述了使用組裝易化子組裝MNAzyme的基本方法的實例。更具體地，部件酶A和部件酶B顯示在圖1中，各自包含(i)感應臂部分、(ii)底物臂部分和(iii)催化核心部分。在組裝易化子的存在下，部件酶A和部件酶B的所述感應臂部分能夠與所述組裝易化子如DNA或RNA序列雜交並與其互補部分鹼基配對。當以這樣的方式與所述組裝易化子4妄觸時，所述MNAzyme自組裝形成的催化核心能夠修飾被底物臂結合的底物。優選地，所述MNAzyme的存在通過其催化活性的檢測或測量來檢測。因而組裝的MNAzyme的底物臂能夠通過所述底物臂和所述底物上互補序列的相互作用接合底物，例如圖1所示的^^艮告分子底物。一旦所述底物與所述底物臂這樣接合，所述催化核心能夠促進對所述底物的修飾(例如切割)，從而能夠直接或間接測量或檢測。可以使用各種方法選4奪性地組裝(開)和解組裝(關)所述MNAzyme。關於圖2,顯示了活性MNAzyme的另外的示例性設計。一種MNAzyme的示例性結構描述在插圖(i)中，其中多種組裝易化子組分對MNAzyme的形成是必需的。在該設計中，一種組裝易化子組分(Fl)與部件酶A和B兩者的感應臂區域互補，而另一種組裝易化子組分(F2)僅與部件酶B(按照圖2(i))或僅與部件酶A互補。所述兩種組裝易化子組分一起指導能修飾(例如切割)底物的活性MNAzyme的組裝。圖9(左邊結構)說明了用於MNAzyme組裝的易化子的其他設計。圖2的插圖(ii)描述了示例性設計，其中部件酶A與二分的部件酶B組分在組裝易化子存在下的組裝產生了能修飾(例如切割)底物的活性MNAzyme。在該設計中，部件酶B具有截短的感應臂(T),其在缺乏本文稱為穩定因子臂組分(S)的第二組分的情況下，不足以允許穩定的MNAzyme組裝。然而，當穩定因子臂組分與組裝易化子在鄰近部件酶截短的感應臂與組裝易化子結合的位置雜交時，這允許組裝成活性MNAzyme。由部件酶A、部件酶B組分與截短的感應臂和穩定因子臂組分在組裝易化子存在的情況下組裝形成的活性MNAzyme代表"開"狀態。部件酶穩定因子臂組分或組裝易化子組分的省略、去除或修飾導致催化活性"關"狀態。同樣地，MNAzyme催化活性的調節能通過各種寡核苷酸的存在或缺乏和/或通過這樣的寡核苷酸組分具有功能活性的能力，例如能夠與其他寡核苷酸組分雜交形成穩定的MNAzyme複合體。截短的臂被設計為不足以允許穩定的MNAzyme在反應條件下的組裝，除非伴隨有穩定因子臂組分。所述穩定因子臂組分和組裝易化子能對MNAzyme活性起"開"轉換的作用。圖3所示的反應代表MNA複合體的兩種可選才奪的狀態。活性MNAzyme反應(i))代表"開"狀態。其中部件酶穩定因子臂組分(反應(ii))或組裝易化子組分(反應(iii))被省略的那些反應是代表"關"狀態的無活性MNA複合體。同樣地，MNAzyme催化活性的調節能通過各種寡核苷酸的存在或缺乏和/或通過這樣的寡核苦酸組分具有功能活性的能力，例如能夠與其他寡核苷酸組分雜交形成穩定的MNAzyme。截短的臂被設計為不足以允許穩定的MNAzyme在反應條件下的組裝，除非伴隨有穩定因子臂組分。所述穩定因子臂和組裝易化子能對MNAzyme活性起"開"轉換的作用。本領域技術人員應理解截短的部件酶臂可以是下述的任一種部件酶A感應臂、部件酶B感應臂(如圖示的)、部件酶A底物臂或部件酶B底物臂。本領域4支術人員應i人識到MNAzyme能用於產生自催化自我複製級聯與其它迭代過程的分子傳感器、分子開關、和/或調節劑或傳播物的策略。應用的潛在領域包括但不限於醫學、獸醫、農業、食品技術、成像和生物恐怖應用。關於圖4,當部件酶A和B與組裝易化子和活性抑制劑複合時形成MNAi(左圖)。所述MNAi能與底物相互作用但不催化修飾底物。在某些實施方案中，活性抑制劑還包括不穩定的或可切割的連接子，其可以在活'性抑制劑中使兩種或多種結構域分離。這樣的結構域可包括例如(i)活性抑制劑結構域，其與部件酶組分基本上不互補，並通過破壞形成催化活性MNAzyme所需的二級結構起抑制作用，和(ii)活化劑組裝易化子結構域，其如果從活性抑制劑結構域分離，可作為另外的組裝易化子組分起作用，並指導活性MNAzyme的組裝。對活性抑制劑修飾後，如對切所述分子和使所述(i)抑制劑結構域和所述(ii)活化劑組裝易化子結構域分離，能從所述MNAi的組分得到活性MNAzyme(圖4，右邊)。所述釋放的活化劑組裝易化子結構域隨後能作為另一組裝易化子組分起作用，所述另一組裝易化子與第一組裝易化子組分一起能指導部件酶組分A和B組裝成為能催化修飾底物的活性MNAzyme。MNAi的其他示例性結構顯示在圖9中。所述MNAi和催化活性MNAzyme代表組裝組分的兩種可選4奪狀態，即分別為"關"狀態和"開"狀態。4.遂合參^"力iT禪/7W^途本領域技術人員應認識到本文所述的MNA複合體可以用作邏輯門。"開"狀態包括組裝的催化活性MNA複合體，包括但不限於64MNAzyme或在其活化劑配體存在下的適體-MNAzyme。"關"狀態包括無催化活性的MNA複合體，包括但不限於完全或部分解組裝的MNA複合體、活化劑配體不存在時的適體-MNA複合體以及MNAi。根據本發明的一個方面，提供了MNA複合體邏輯門，包括至少一種無活性MNA複合體、至少一種輸入和至少一種輸出，其中所述輸入的存在活化所述無活性MNA複合體邏輯門，其中所述活化提供所述輸出。所述門能是至少兩種不同的輸出狀態，其中所述狀態依賴於所述無活性MNA複合體邏輯門的活化。在本發明另一方面，MNA複合體門具有至少兩種輸入，和其中所述MNA複合體是無活性的第一輸出狀態，以及其中所述MNA複合體是活化的第二輸出狀態。其中所述MNA複合體不被活化的所述第一輸出狀態對應邏輯關，其中所述MNA複合體是活化的第二輸出狀態對應邏輯開。可選擇地，所述第一輸出狀態可對應邏輯開，所述第二輸出狀態可對應邏輯關。在本發明另一優選的方面，所述MNA複合體邏輯門的輸出可被以下的任一種或任意組合檢測螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，焚光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色譜法，輻射線測定，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法。還在本發明另一實施方案中，所述MNA複合體邏輯門可包含兩種輸入，並且可以是邏輯與門，其中所述MNA複合體被活化，由此只有當第一和第二輸入存在時提供對應於邏輯開的輸出。在存在單獨的輸入或缺乏輸入的情況下，所述MNA複合體保持無活性，對應於邏輯關。還在本發明另一實施方案中，所述MNA複合體邏輯門可包含一種輸入，並可以是邏輯感應門，其中所述輸入活化了無活性MNA複合體邏輯門，由此提供對應於邏輯開的輸出，在缺乏所述輸入的情況下，所述無活性MNA複合體邏輯門保持無活性，對應於邏輯關。在本發明另外的實施方案中，所述MNA複合體邏輯門可包含兩種輸入，並可以是邏輯或門，其中所述輸入的任一或兩者活化了MNA複合體邏輯門，由此提供對應於邏輯開的輸出，其中在無輸入存在的情況下，所述MNA複合體邏輯門保持無活性，對應於邏輯關。在本發明的另一實施方案中，所述所述MNA複合體邏輯門可包含兩種輸入，並可以是邏輯EX-OR(唯一的或)門，其中所述輸入的任一種而不是兩種活化了MNA複合體邏輯門，由此提供對應於邏輯開的輸出，其中如果存在無輸入，或如果兩種輸入都存在，所述MNA複合體邏輯門保持無活性，對應於邏輯關。本領域技術人員還應認識到MNAzyme的解組裝和組裝相當於提供了兩種狀態，開狀態和關狀態，兩種狀態之間的轉換能被許多實體和事件調節。這些狀態也能以與上述類似的的方式應用於邏輯門系統。在全加器中應用邏輯門的實例示例在圖12並描述於實施例12中。5.炎眉不溶遂戎伴和茵伴戎伴的才法還應理解，通常所述方法無論複合與否可應用於溶液中，或與不溶性載體或固體載體耳關合，其中底物、MNA複合體組分或其部分中的一種或多種可連接在所述不溶性載體或固體載體上。因此，部件酶組分、底物、組裝易化子、組裝抑制劑和/或活性抑制劑中的至少一種可以是結合的、連接的或系留的。此外，在提供本文示例性的方法和變化以及工作實施例的情況下，這樣的測定系統的特徵通常為本領域技術人員所理解。因此，本發明不應被認為局限於本文字面上的教導，而是能進行與本文提供的教導的原則和範圍以及本領域常識相一致的修飾和變化。包括"晶片"(又稱為陣列或微陣列)形式的不溶性載體的本發明的實施方案通常包括偶聯、系留或連接到晶片上的多個底物。在具體實施方案中，所述底物包含核酸。多個核酸可以通過本領域已知的任何適當方法定位在晶片上，例如，通過吸液管、噴墨列印、接觸列印或光刻法。晶片可以由至少一種元件組成，每一所述元件包含至少一種核酸。所述至少一種元件可以由具有相同序列的多個核酸組成。包含晶片的所述元件數可以是任何數量，並且在晶片上定位有多個所述元件時，所述元件可以以均一的距離隔開或以變化的距離隔開、或為其組合。在某些實施方案中，所述元件可以隨機定位，然後測定每一所述元件各自的位置。所述元件的大小和形狀會取決於本發明的具體應用，並且具有不同大小和形狀的所述元件可以組合成單一晶片。晶片表面可以基本平坦或可以具有如凹陷或突起的特徵，且所述元件可以定位在凹陷內或定位到突起上。這樣的凹陷可以為所述元件被浸入的溶液提供貯液器，或這樣的突起可以促使所述元件乾燥。例如，可以將所述元件;故在96孔^1的每一孔中。在某些實施方案中，所述晶片可以包括獨特的鑑定物如指示劑、射頻標記、整合裝置如微處理器、條形碼和其它標記以^更鑑定每一所述元件。獨特的鑑定物可以另外或可選擇地包含陣列表面上的凹陷或突起。此外，獨特的鑑定物能夠提供晶片的正確定位或鑑定。獨特的鑑定物可以通過數據捕獲裝置或通過光學掃描儀或檢測器直接讀取。6.才法—炎眉的孩普分子虞浙系鍵根據本發明，還提供了通用報告分子底物系統，通過輕易的設計改變以產生識別不同組裝易化子的新MNAzyme和無活性MNA複合體，所述通用報告底物系統可以用於快速系統的開發。如本文所"i侖述的，部件酶的底物臂部分和催化核心部分可以保持不變，僅改變新組裝易化子所必需要求的一種或多種部件酶的感應臂部分。提供通用底物序列並且因此能夠將相同底物引入許多不同應用的系統中。此外，可以將相同底物引入本文各種實施方案的方法中，包括其中底物在溶液中游離或拴系或連接在載體上的測定。可以將一系列通用底物用在可以同時檢測多種組裝易化子的複合反應中。被切割的底物能使用DNAzyme連接酶再生並因此再循環。7.才法#炎,順遊如下述更詳細的描述，諸如MNAzyme和無活性MNA複合體的MNA複合體在某些實施方案中具有能利用普遍性或通用底物的有利特性。圖1以目前優選的構型示出了這樣的底物，其中所述底物包含可檢測部分和淬滅劑部分兩者。淬滅劑部分適合於使來自所述底物可;險測部分的可4全測信號減少或消除，直到所述底物被MNAzyme切割。例如，淬滅劑部分可以包含"黑孔淬滅劑1"(BHQ1)或"黑孔淬滅劑2"(BHQ2)。因此，MNAzyme在可檢測部分和淬滅劑部分之間切割底物使這兩部分在溶液中分離，從而使得在遠離淬滅劑部分時或淬滅劑部分一皮從可;^測部分的局部環境有效去除時，可;f企測信號出現或增加。通過設計MNAzyme的組分部件酶，能夠使用通用或普遍性底物。通過僅改變部件酶的感應臂，但不改變底物臂，能夠設計特異性針對多種組裝易化子中的每一種的多種MNAzyme和無活性MNA複合體，其全部都利用普遍性底物產生輸出信號。本領域技術人員應當理解下述優勢，即這不再需要對每種輸入事件的反應都提供專門的或獨特的底物。每一新組裝易化子的;f企測只需要一種或多種感應臂部分的一種或多種改變；底物臂部分和催化核心部分可以保持不變。因此，可以使用MNA複合體如MNAzyme將單個4艮告分子底物用於單個組裝易化子或其他輸入事件，並使用改變的MNA複合體如MNAzyme將單個報告底物在一系列系統中用於多種組裝易化子。多個報告分子底物允許在一個系統中複合監測多個MNA複合體和MNAzyme。此外，所述底物可以包括另外的實體如標記核酸、納米顆粒、樣i粒、蛋白、抗體、RNA、DNA、核酸類似物、生物素基團、糖蛋白、脂蛋白、肽核酸、鎖核酸、肽-核酸嵌合體、射頻磁場部分，或上述的任意組合。底物可以被MNAzyme修飾從而提供"可檢測作用"或"輸出"信號。在檢測過程中，MNAzyme對底物的修飾可以包括，例如，切割、連接、卟啉金屬化，和碳碳鍵、酯鍵或醯胺鍵的形成。由於MNAzyme修飾底物，產生了可檢測作用並且該作用的強度因此可以指示輸入信號的量。可檢測作用可以通過多種方法檢測，包括螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR，電子自旋共振，螢光偏振光譜，圓二色譜，免疫測定，色譜法，輻射線測定，光度測定，閃爍掃描法，電子方法，紫外、可見光或紅外光譜，酶促方法或上述的任意組合。一些組已經報導了用比色讀數檢測核酸組靶標以及其它分析物(Elghaniane/a/"1997,Mirkinfl/.，1996,以、及LiuandLu，2004)。i亥策略包括批量製備金納米顆粒，每一所述顆粒表面附著有截然不同的DNA寡核苦酸序列。然後能夠通過加入與附著到金顆粒上的序列互補的"橋連寡核苷酸"使金顆粒聚集。顆粒聚集引起顏色從紅到藍的伴隨改變(Mirkin^a/.，1996)。在橋連寡核苷酸中引入DNAzyme底物序列能夠提供逆轉金顆粒聚集的機制(LiuandLu，2004)。對依賴鉛的DNAzyme通過加入鉛的活化引起橋連寡核普酸的切割、金顆粒的解離和顏色從藍到紅的改變。可以使用這樣的原理和MNA複合體如MNAzyme開發用於監測變化的筒易檢測器。溫度或其他實體或事件的變化能活化一種或多種MNA複合體形成一種或多種MNAzyme，其能切割橋連寡核香酸引起納米顆粒的解離和顏色的變化。&才法的說VA本領域技術人員會容易理解，本文描述的方法可以使用各種實驗參數進行優化。優化的具體實驗參數和該優化的水平會取決於採用的具體方法和/或待檢測的具體事件。這樣的參數包括但不限於時間、溫度，鹽濃度、去垢劑、陽離子和包括但不限於二曱亞碸(DMSO)的其它試劑，以及核酸的長度、互補性、GC含量和解鏈溫度(Tm)。實施這樣的方法的溫度可以是約20。C到約96。C、約20。C到約75。C、約20。C到約60°C或約20。C到約55。C。溫度可以是恆定的，或可以在與MNAzyme的組裝和催化活性相容的溫度和與催化活性不相容的溫度之間循環。此外或作為選擇，參數和/或微環境的變化可用於將MNA複合體從無活性轉換為活性狀態。因此，在微環境中的參數可包含本文定義的"活化劑"，包括但不限於事件，如在溫度，波長、鹽濃度，去垢劑，陽離子，結構和調節劑組分(包括但不限於組裝易化子或組裝易化子組分、部件酶或部件酶組分、底物、組裝抑制劑、活性抑制劑和活化劑寡核香酸組分)的濃度上的變化。因此，可進行對參數和/或微環境的所述最優化以實現MNA複合體作為分子開關的用途。在一優選的實施方案中，本文提供優化的反應以實踐使用MNA複合體的方法。在這樣的優化反應中，催化活性的活化比未優化的反應增加高達10%、20%或30%。更優選的反應條件使催化活性增加至少35%或40%，並優選高達50。/。或更多。在更優選的實施方案中，優化反應的催化活性的活化增加超過50%,並高達66%、75%或甚至100%。在更優選的實施方案中，被充分優化的反應方法會使催化活性的活化增加100%、200%或甚至300%或更多。其它優選的反應條件與以未優化的反應條件實踐的方法相比，能夠使催化活性的活化增加高達1000%或更多。用於優化在此提供的方法的高度優選的反應條件是引入某些二價陽離子。二價陽離子的濃度可以以濃度依賴方式影響大多數核酸酶的催化活性。優選的優化反應於Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn"和Pb2+中的一種或多種進行優化。9.炎^適伴^才法參考圖7,例示了如下方法藉此方法活化劑配體能用於轉換適體-MNAzyme的活性"開"或"關"。圖示了使用組裝抑制劑在缺乏活化劑的情況下阻斷適體-MNAzyme的活性的方法。這些方法使用適體，其可包含能夠識別一種或多種配體的核酸或蛋白、多肽或肽或上述的組合。適體可結合例如蛋白、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂質、脂蛋白、糹田胞、病毒、細菌、古細菌、真菌、抗體、代謝物、病原體、毒素、汙染物、毒物、完整有機體、小分子、聚合物、金屬離子、金屬鹽、朊或上述的任何衍生物、部分或組合，或任何其它實體(Leee/a/.,2004)。本文優選的適體可以包括短單鏈DNA或RNA寡聚體，其能夠通過吸附、回收和再擴增的反覆過程從合成核酸的複合體庫中分離出來。因此，可以產生針對幾乎任何靶標的適體，所述輩巴標的範圍從諸如胺基酸或抗體的小分子到蛋白和核酸結構。在優選的實施方案中，適體包括例如優選通過演化和選擇技術產生的核酸結合分子。優選地，適體可以包括DNA或RNA分子，或二者的組合，包括但不限於按照例如上述表1的核香酸類似物。本領域技術人員應當理解，可以將適體併入一種或多種組裝易化子分子和或活性抑制劑的任意端。此外，應當理解，能將一種或多種適體併入一種或多種部件酶寡核苷酸組分。還應理解，也能將一種或多種適體併入至少一種部件酶寡核苷酸組分。圖7所示的策略中的所述組裝易化子可包含例如DNA、RNA、LNA、PNA或含有一種或多種核苷酸鹼基類似物的序列。70在圖7所示的策略中，可將適體序列以存在活化劑時僅形成活性MNAzyme的構型並在部件酶(適體-部件酶)的末端。本領域技術人員也應當理解，能將一種或多種適體併入任何寡核苷酸組分中，包括部件酶、組裝易化子或底物。此外，能將適體併入這些寡核苷酸中任意一種的任意端。圖7所示的策略能用於(i)提供使用配體如活化劑分子調控MNA複合體活性的方法，和/或(ii)提供使用適體-MNA複合體^r測非核酸和核酸華巴標的方法，所述適體-MNA複合體當與配體活化劑4妻觸時形成MNAzyme。所述適體-MNAzyme糹全測策略需要的核酸寡核香酸包括(a)標準部件酶；(b)適體-部件酶，其是在其一端有適體併入的部件酶；(c)組裝易化子，其是與適體-部件酶和使活性MNAzyme組裝的部件酶兩者結合的寡核芬酸；(d)報告分子底物；和(e)組裝抑制劑寡核苷酸，其在跨越至少部分部件酶序列和適體-部件酶序列的部分底物結合臂的區域與適體-部件酶雜交。當缺乏活化劑配體時(左圖)，組裝抑制劑寡核苷酸與適體-部件酶結合從而與報告分子底物竟爭並阻斷報告分子底物的結合。這一結構代表無活性MNA複合體。當存在活化劑配體時(右圖)，活化劑配體與適體-部件酶的適體序列結合，阻斷組裝抑制劑寡核苷酸的結合，並因此允許底物的結合和催化活性MNAzyme的形成，所述催化活性MNAzyme接著在此情形下切割所述底物。同樣地，催化活性MNAzyme僅在能結合適體的活化劑存在下形成並引起螢光信號的產生。在一些實施方案中，使用核酸或非核酸靶標活化劑配體作為開關機制能實現對MNAzyme活性的調節。在其他實施方案中，通過其他手段操縱組裝抑制劑分子以調節活性。例如，通過以下幾種策略能去除組裝抑制劑包括選擇性熱變性或使用寡核苷酸竟爭結合的方法和/或使用支鏈遷移取代片段的方法。M炎勝贈才法本領域^支術人員應當理解，本文描述的方法可以用來實施在此定義的級聯。實施本文公開的方法的具體實施方案包括但不限於(l)僅在耙標或事件的存在下，活化無活性MNA複合體以形成MNAzyme來修飾底物，其中所述底物隨後可用於參與諸如產生可檢測信號的第二事件，或(2)僅在靶標或事件的存在下，活化無活性MNA複合體以形成MNAzyme來修飾底物，其中所述底物隨後可用於參與第二事件，其中所述第二事件的實施又可獲得參與任意數目的後續事件的更多的底物，使得後續事件可獲得參與實施較早事件的底物，從而產生循環級聯，如圖6、圖IO和圖ll(iii)所示，其中這樣的循環級聯可用於放大信號，例如，在輸入事件是低強度的應用中，例如當靶標是低豐度的並否則不能提供可檢測的輸出信號。設計用於靶標分析物4企測的產生MNAzyme複製級耳關的一個機制使用SCUD級聯策略。所述SCUD策略在所說明的各種設計中能被併入級聯，如在圖6中，其中併入了兩種MNA複合體；在圖10中，其中併入了三種MNA複合體；以及在圖11中，MNA複合體和DNAzyme連接酶都被併入級聯反應中。所述SCUD方法依賴於調控活性MNAzyme和MNAi從存在於混合物中的組分寡核香酸組裝的能力。圖6描述了SCUD的一種形式。該SCUD實例描述了j言號》丈大的通用方法。如圖6所示的稱為SCUD(使用DNA的信號級聯)的該方法的一個實施方案包含下述組分(i)含有三種區域的活性抑制劑(例如圖6所示的雙標記的RIF(報告分子-抑制劑-易化子》；a.活性抑制劑/報告分子(RI)結構域，其具有如下雙重功能首先當併入RIF中時作為活性抑制劑，和其次當RIF被切割時提供螢光信號，和b.活化劑組裝易化子組分F2b，其形成MNAzyme2a的必要組分，c.位於RI和F2b結構域之間的底物結構域，其可被MNAzyme1a或MNAzyme2a士刀害寸，(ii)組裝易化子組分Fh(iii)僅在組裝易化子(F1)存在下能形成活性MNAzymela結構的部件酶，所述F1例如可以是測試樣品中存在的靶標核酸；活性MNAzyme1a，其能夠將RIF切割成RI和F2b組分，由此產生螢光、消除MNAzyme活性抑制作用以及伴隨產生新的活化劑組裝易化子組分F2b。(iv)僅當部件酶臂將組裝易化子組分F2a鄰接於所釋放的活化劑組裝易化子組分F2b時能形成活性MNAzyme2a複合體的部件酶。MNAzyme2a依次能切割更多的RIF釋放更多的RI和F2b，由此產生MNAzyme2a自主複製級if關並伴隨螢光信號力文大。在缺乏F1的情況下，其例如能是靶標核酸，MNAzyme2a部件酶會與完整的RIF形成無活性複合體MNAi2i。完整的RIF作為形成MNAi2i的活性抑制劑起作用。存在靶標分析物的情況下，活性MNAzyme1a會形成，並由此切割RIF且釋》文活化劑組裝易化子組分F2b,所述F2b隨後會自由地結合併成為活性MNAzyme2a的組分。由於MNAzyme2a還能切割更多的RIF，這啟動了複製/信號放大級聯。MNAzyme2a每次切割RIF分子，就會產生新的MNAzyme2a形成所需的更多組分(活化劑F2b組裝易化子)。MNAzyme級聯導致MNAzyme2a複合體的組裝，所述MNAzyme2a複合體與採用下述組分的親本MNAzyme是完全相同的，所述組分是通過MNAzyme2a催化活性產生的產物。同樣地，所述MNAzyme切割的產物(F2b)在自身催化的自主複製系統中能指導新的(親本)MNAzyme分子的組裝。本文描述的所述結構和其他分子開關能形成包括自主複製級聯的級聯組分。關於圖10，這樣的級聯可包含MNA複合體，其在靶標的檢測中起作用，例如通過與靶標的相互作用。這樣，所述靶標作為組裝易化子起作用，並通過促進起始MNAzyme的形成啟動級聯。該起始MNAzyme(在圖10中的Mt)可修飾底物。所述修飾可以是例如切割。在該情形下，所述修飾導致產生第一組裝易化子以形成級聯第一MNAzyme(在圖10中的Mcl)。所述級聯第一MNAzyme隨後可修飾另外的底物以產生另外的組裝易化子來指導另外的MNAzyme的形成73(在圖10中的Mc2)。所述另外的MNAzyme隨後可修飾第一底物以產生更多的第一組裝易化子來級聯第一MNAzyme，由此產生反饋到所述級聯的較早階段。在某些實施方案中，所述組裝易化子可以是活化劑組裝易化子。本領域技術人員應認識到，在該級聯中所述第一底物在其未切割狀態時可以作為級聯第一MNAzyme的活性抑制劑起作用。也就是說所述級聯第一MNAzyme在所述第一底物被起始MNAzyme切割產生第一活化劑組裝易化子之前實際上是MNAi，所述第一組裝易化子隨後將所述級聯第一MNAi從"關，，狀態轉換為所述級聯第一MNAzyme的催化活性"開"狀態。同樣地，本領域技術人員應認識到，所述另外的底物在其未切割狀態時可以作為另外的MNAzyme的活性抑制劑起作用。也就是說所述另外的MNAzyme在所述另外的底物被級聯第一MNAzyme切割產生另外的活化劑組裝易化子之前實際上是MNAi，所述另外的活化劑組裝易化子隨後將另外的MNAzyme轉換為開。本領域技術人員應^人識到圖10顯示了促進活性MNAzyme組裝所需的三種組裝易化子組分。在類似的方案中能使用更多或更少的組裝易化子組分。關於圖11,本文所述的結構和其他分子開關能形成信號放大級Jf關，其中靶標分子促進第一MNAzyme的形成，導致切割第一底物產生兩種切割的產物(指定為Aa和Ab)。Aa作為連接步驟中的組分起作用(圖11中框ii所示)，Ab作為SCUD力文大中的組分起作用(圖11中框iii所示)。Aa通常在其3，端具有2',3，-環磷酸酯以允許其作為DNAzyme連接酶的底物起作用。在連接步驟中，DNAzyme連接酶將Aa連接到第二底物以產生另外的MNAzyme的部件酶(圖11中框iv顯示了另外的MNAzyme)。在SCUD放大步驟(圖11中框iii所示)中，Ab作為第二MNAzyme的組裝易化子起作用，所述第二MNAzyme修飾第一底物產生更多的Aa和Ab。所述更多的Aa和Ab被分別用於連接和SCUD放大步驟，由此形成導致Aa和Ab積累的反饋放大級聯。所述連接步驟的連接產物是另外的MNAzyme的部件酶，所述另外的MNAzyme修飾另外的底物導致指示靶標存在的可檢測作用。在本發明優選的實施方案中，對一種或多種所述底物的^f'務飾可通過以下的任一或任意組合檢測螢光光譜，表面等離子體共振，質譜，NMR,電子自旋共振，焚光偏振光譜，圓二色語，免疫測定，色譜法，輻射線測定，電子方法，UV、可見光或紅外光譜，酶促方法。本領域技術人員應認識到，在該級聯中所述第一底物在其未切割狀態時作為第二MNAzyme的活性抑制劑起作用。也就是說所述第二MNAzyme在所述第一底物被所述第一MNAzyme切割產生組裝易化子之前實際上是MNAi，所述組裝易化子隨後將所述第二MNAi轉換為開。如果所述策略與適體-MNAzyme系統聯合，那麼MNAzyme介導的放大級聯能通過核酸靶標(DNA/RNA)或其他的耙標配體(蛋白、小分子等)啟動。由於所述反應在配體或其他輸入事件存在的情況下僅被啟動，這提供了用於檢測和/或鑑定靶標分析物的技術。MNAzyme介導的放大級聯基於多組分核酸複合體的活化。不同於靶標擴增技術如聚合酶鏈式反應或連接酶鏈式反應，MNAzyme介導的複製和信號放大不需要蛋白酶促進該過程。這提供了優於這些常規使用方案的主要優勢。此外，使用一些寡核苷酸組分如穩定因子臂組分或組裝易化子組分調節和控制MNAzyme催化活性的能力使MNAzyme的組裝受到微環境中的條件和組分的緊密調控。MNAzyme介導的放大級聯能用於生物技術的範圍，尤其在診斷中。它們通過促進信號放大能允許用於疾病診斷的蛋白和核酸的檢觀'J。催化核酸和/或級聯反應能用於除了診斷以外的應用中，例如可用於治療的納米級裝置和開關的計算分析和生物分子設計領域。7丄^迎去綮諸如活^丼賴浙-戈逸襲《^子的i為、兌譯^MiVJ複合伴w活^和無活'/^炎在之河脊換的才法。在活性MNAzyme和無活性MNA複合體之間的轉換，或反之亦然，能通過供應或去除MNA複合體組分來實現，所述MNA複合體組分包括但不限於一種或多種活性抑制劑、組裝易化子、組裝抑制劑、部件酶、或穩定因子臂或其部分。在某些實施方案中，所述活性抑制劑可包括不穩定或可切割的連接子或底物，它們可位於活性抑制劑內的兩種或多種結構域之間，例如活性抑制劑結構域和活化劑組裝易化子結構域之間。在連接子部位的切割可允許將活性抑制劑結構域與活化劑組裝抑制劑結構域分離，所述活化劑組裝抑制劑結構域隨後可作為組裝易化子組分起作用，並指導活性MNAzyme的組裝。對所述連接子的切割能通過一些方法實現，所述方法包括但不限於MNAzyme切割、蛋白酶切割、或由pH和或溫度的變化誘導的水解。可選擇地，能使用包括分支遷移和/或與組分寡核苷酸互補性的方法選擇性去除所述組裝抑制劑和/或組裝易化子。通過互補性起作用的調節劑寡核苷酸可通過改變與他們結合的寡核苷酸的二級結構做到這一點。在某些實施方案中，這可以產生可選擇的構象，其中活化劑序列於能與其他組分組裝以形成活性MNAzyme。例如，這樣的調節劑寡核香酸可引起分子內結構如髮夾的破壞，這將活化劑分子限定於無功能構象。在某些實施方案中，MNA組分如抑制劑包括但不限於活性抑制劑或組裝抑制劑，其可與其他實體偶聯。在某些實施方案中，所述組分與結合了射頻磁場的金納米顆粒偶聯。這允許對雜交的遠程電子控制，所述射頻磁場作為天線起作用，能使特定的寡核苷酸可逆熱變性，同時使周圍的分子相對不受影響。在某些實施方案中，所述組分能用生物素標記以促進捕獲和物理分離所述組分。/麼試唐盒本發明也提供了用於實踐本文公開的方法的試劑盒。通常，實施本發明方法的試劑盒含有實施本方法的所有必需試劑。例如，在一實施方案中試劑盒可以包含含有無活性MNA複合體如MNAi的第一容器，其中所述無活性MNA複合體活化形成MNAzyme需要通過將無活性MNA複合體暴露於活化劑消除對催化活性的抑制，其中所述活化劑消除抑制劑的抑制影響。例如，在一實施方案中，試劑盒在單獨的容器內可包含用於形成無活性MNA複合體的一種或多種組分。在一實施方案中，試劑盒可包含含有用於無活性MNA複合體的第一容器，其中所述MNA複合體活化形成MNAzyme需要通過本文公開的方法將MNA複合體暴露於活化劑來活化催化活性。通常，本發明的試劑盒也會包含一種或多種其它的容器，其含有例如去垢劑和/或在實施本發明的方法中需要的其它試劑。在本發明中，區室化的試劑盒包括其中試劑包含在獨立容器中的任何試劑盒，並可以包括小玻璃容器、塑料容器或塑料條或紙條。這樣的容器可以使試劑從一個區室向另一區室進行高效的轉移，同時避免樣品與試劑的交叉汙染，並且每一容器中的試劑或溶液可以定量地從一個區室加入另一區室。這樣的試劑盒也可以包括會接受測試樣品的容器、含有在分析中使用的試劑的容器、含有去垢劑的容器和含有檢測試劑的容器。通常，本發明的試劑盒也會包括使用試劑盒組分實施適當方法的說明書。本發明的試劑盒和方法可以與自動分析儀器及系統結合使用，例如，包括但不限於實時PCR儀器。對於檢測、鑑別或定量不同靶標或事件的應用，本發明的單一試劑盒可以是適合的，或者可選地需要不同的試劑盒，例如含有對每一靶標具有特異性的試劑。本發明的方法和試劑盒應用於其中要求檢測、鑑定或定量任何實體或事件的任何情形。現在將參考如下具體的實施例更詳細地進一步描述本發明，這些實施例不應以任何方式解釋為對本發明範圍的限制。實施例實施例1:部件酶B包含兩種分子的MNAzyme例子本發明在MNAzyme基本設計的基礎上涉及許多變體。本實施例中，MNAzyme是在組裝易化子存在下/人部件酶A和含有兩種組分的部件酶B組裝的，所述兩種組分即一種是帶有截短的感應臂的部件酶組分，一種是作為穩定因子臂的組分。MNAzyme的組裝是由部件酶感應臂和組裝易化子序列通過Watson-Crick石成基識別進行的。以下實施例展現了截短的部件酶臂和穩定因子臂的用途。圖2(插圖(ii))和圖3顯示了本實施例中所用MNAzyme的檢測策略。所需寡核苷酸如下所述a)標準部件酶A;b)部件酶B，其包含第一組分，以及第二穩定因子臂組分，所述第一組分含有底物臂、部分催化核心和截短的感應臂，所述第二穩定因子臂組分與鄰接於所述部件酶截短感應臂的組裝易化子雜交。當部件酶中截短的感應臂與組裝易化子發生雜交時，穩定因子臂的設計促進MNAzyme的組裝；以及c)底物，例如糹艮告分子#:針底物。活性MNAzyme組裝還需要有組裝易化子的存在。1.1部件酶寡核苷酸和穩定因子臂在本實施例中，部件酶B的截短感應臂只有5個核苷酸長。部件酶A以及部件酶B的兩種組分的序列如下所示(5，-3，)。以下序列中，粗體顯示的鹼基與組裝易化子發生雜交，帶有下劃線的鹼基構成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體顯示的石威基與底物雜交。"-P"表示寡核苷酸的3'磷酸化。SEQIDNO:1部件酶A4Xd-P:ACTGGATGTCCATCTGTCTGACAACGAO^GGX^CCTT-PSEQJDNO:2部件酶B5Xd-P組分1:7Y7CCC4GG(X4GGCTAGCTTATAC-PSEQIDNO:3部件酶B穩定因子臂組分XdS-P:CTTCGTGAGGGTGAG-P1.2.報告分子底物本實施例所用的報告分子底物是5，末端標記有6-FAM部分、3，末端標記有BHQ1部分的SubBi-2,命名為SubBi-2-FB。以490nm(FAM激發波長)激發，於520nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2-FB的切割。以下列出了SubBi-2-FB的序列(5，到3，)，小寫字母鹼基代表RNA，大寫字母鹼基代表DNA。SEQIDNO:4SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA1.3.組裝易化子分子'78以下是用作組裝易化子的合成寡核苷酸序列(5，到3，)。該組裝易化子與部件酶B感應臂完全匹配。用無核酸酶水代替耙組裝易化子作為"無靶標"對照。SEQEDNO:5組裝易化子Xd-T:CCAGTTGGTGA1.4反應條件催化活性MNAzyme對報告分子底物的切割引起螢光信號的增加，通過測量這個增加檢測到組裝易化子，通過加入底物引發反應，全部反應的總體積是50/xL。反應在FLUOstarOPTIMA(BMGBiotech)上在55。C下進行。每2秒鐘讀一次各個反應的螢光度，總共5分鐘。所有反應含有200nMA4Xd-P、200nMB5Xd陽P、1xPCRJ爰沖齊寸II(AppliedBiosystem)以及25mMMgCl2。此夕卜，反應含有如表3所示寡核苷酸。表3.MNAzyme反應中的其他試劑tableseeoriginaldocumentpage791.5結果在有部件酶和組裝易化子的情況下，活性MNAzyme的組裝當組裝易化子和部件酶穩定因子臂組分均包含在反應中(反應(i):圖3),活性MNAzyme組裝，並對底物進4亍了切割，造成萸光隨時間提高。相反，沒有組裝易化子時，螢光信號沒有增加(反應(iii):圖3)。此外，表明穩定因子臂的存在對於活性MNAzyme的形成非常關鍵。含有包括組裝易化子在內的所有反應成分，但是缺少穩定因子臂組分的反應，螢光未隨時間提高(反應(ii):圖3)。因此，部件酶B的感應臂的5個鹼基不足以形成穩定的MNAzyme複合體，而穩定因子臂組分的存在顯示能夠彌補部件酶感應臂短的長度(截短的)，使得在嚴謹溫度條件下(本實施例的55。C)形成穩定的MNAzyme。本系統中使用了帶有截短的感應臂的部件酶，所以穩定因子臂組分是組裝活性MNAzyme的關4建寡核苷酸。另外，當含有部件酶A和部件酶B之兩種組分的反應中包含的是替代的組裝易化子，即其與部件酶感應臂有單個核苷酸錯配時，螢光信號不隨時間增加(數據沒有提供)。本實施例表明，在所述實驗條件下，只有存在完全匹配的組裝易化子時才能形成MNAzyme。本領域技術人員應理解可以通過提供完全匹配或帶有錯配的組裝易化子來調節活性MNAzyme和無活性MNA複合體之間的轉換。此外，本實施例展示了雙組分部件酶的用途，該部件酶包含含有截短的感應臂的第一分子和第二穩定因子臂分子。這類系統中對穩定因子臂分子的需求提供了另一個能調節MNAzyme的組裝的工具。含有多寡核苷酸組分的MNA系統提供了極大的靈活性，因為所述組分的序列可以根據熔解溫度、序列組成，以及與其他寡核苷酸組分有或缺乏互補性來具體決定。較短序列包括但不限於，帶有截短臂的部件酶組分、穩定因子臂，以及組裝組分，它們在本發明的這個方面特別有用。實施例2:利用溫度調節MNA複合體的組裝和解組裝，及其在構建用於溫度感應的DNA納米規模設備中的應用也可以通過溫度來控制MNAzyme的組裝和解組裝。溫度的升高或降低能提供用於將MNAzyme的催化活性"打開"和"關上"的機制。能利用MNAzyme對溫度的敏感性來建成溫度感應器和可變電阻器。如果溫度對於MNAzyme的組分寡核苷酸的組裝(雜交)，以及/或者催化活性來說過高或過低，就無法形成能夠對底物進行修飾(例如切割)的活性複合體。如果溫度能夠允許MNAzyme的組裝和/或活性，則底物將被修飾，並產生信號。通過變換鹼基組成和/或寡核普酸長度來改變組分寡核苷酸(例如，包括穩定因子臂組分和/或組裝易化子的部件酶)的熔解溫度的能力使得能夠建成這樣的系統，該系統可以對MNAzyme體系進行更細緻的調節。這就使得MNAzyme不僅能夠處於完全"開"或完全"關"的狀態，而是能夠產生適用於可變電阻器的活性漸變。它還使得能夠調製MNAzyme反應發生的溫度範圍。由MNAzyme活性所不適合的溫度升高或降低到與MNAzyme活性適合的溫度可以通過底物被MNAzyme修飾後產生的信號檢測到。讀取方式可以是例如螢光的或比色的。所述MNAzyme複合體可以通過對橋接寡核苷酸進行切割來對溫度變化做出反應，從而導致金納米顆粒的聚集。這使得能夠開發可以檢測溫度變化的簡單比色設備。本領域技術人員會理解本發明利用MNAzyme進行溫度感應的簡單設備可以應用在許多工業中，例如製藥業、食品業和農業。一個應用可以包括將MNAzyme溫度感應器與溫度每丈感性藥物或其他化合物包裝在一起。如果包裝未能保存在合適的溫度條件下(例如，冷藏)，MNAzyme可能形成並產生信號，從而認定所述化合物變質。類似的，可以藉助MNAzyme溫度感應器來監測某些需要維持在設定溫度範圍內的食品，例如冷凍食品，所述感應器能夠識別出儲存過程中在某個階段已融化的食品。這個利用溫度來控制MNAzyme的催化活性的例子展示了將MNAzyme催化活性打開和關閉的一般策略。因此，可以通過能夠影響到催化速率的許多因素來控制MNAzyme的組裝和解組裝。這類例子包括，但不限於組分部件酶或組裝易化子的存在與否、鹽濃度、pH、二價陽離子的類型和濃度、添加劑的存在與否，以及溫度。實施例3:促進和抑制活性MNAzyme或MNAi的組裝的機制MNAzyme由部件酶組成，後者在有一或多種組裝易化子組分的情況下，組裝形成活性酶(例如圖1、2、4(右側插圖)、圖5(i)和(ii)以及圖9(左側結構))。能夠與部件酶感應臂結合的組裝易化子可以是靶分析物，或者是加入反應混合物來推動MNAzyme的組裝的合成核酸分子。除了協助組裝活性MNAzyme的能力，當與"活性抑制劑"分子雜交時，部件酶還可以組裝成無催化活性的MNAi複合體(圖4(左側插圖)，圖5和圖9(MNAzyme結構右側的結構))。我們測試了多種替代的寡核苦酸序列，看它們調節活性MNAzyme複合體或MNAi的組裝的能力。本實施例中(圖4和5描述的)，MNAzyme的組裝是在有(i)單分子(組裝易化子Fl/2)或者(ii)兩種分子(組裝易化子組分Fl和組裝易化子組分F2)(其序列共同構成存在於易化子F1/2的序列)的情況下檢驗的。易化子F2與一種部件酶的整個感應臂結合，並且重疊結合第二種部件酶的感應臂的4個鹼基對。在另一個反應中，"活性抑制子"分子具有的序列包括易化子F2的序列加上另外的活性抑制子結構域，該分子被檢測了其推動反應向組裝MNAi複合體的方向進行的能力。3.1部件酶寡核苦酸以下序列中，粗體表示的鹼基與組裝易化子雜交，帶下劃線的鹼基構成組裝好的MNAzyme的催化核心，斜體顯示的鹼基與底物雜交。"-P"表示寡核苷酸的3'磷酸化。SEQIDN06:部件酶AR05A4/2畫P:CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGA(X4GGX^CC7T-PSEQIDN07:部件酶BR05B5/2畫P:rGCCC4GG(X4GGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTCCCACTTGC-P3.2報告分子底物本實施例所用報告分子底物是序列5，到3'如下所示的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5，末端標記有6-FAM部分，3'末端標記有BHQ1部分。以485nm(FAM激發波長)激發，於530nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2-FB的切割。小寫字母鹼基代表RNA，大寫字母鹼基代表DNA。SEQIDNO:4SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA3.3調節劑寡核苷酸本實施例中4企測了多個分子調節MNAzyme和/或MNAi的組裝的能力。構成組裝易化子F2的序列也包含在易化子F1/2和活性抑制劑的序列中，用粗體和下劃線表示。SEQIDNO8:組裝易化子Fl/2:GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGSEQIDNO:9組裝易化子Fl:GCAAGTGGGAAGGTGTAATCCGTCTSEQIDNO:10組裝易化子F2:CCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGSEQIDNO:11活性抑制劑分子AAGGTTTCCTCGTCCCTGGGCACCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG3.4反應《且分和對MNAzyme活性的監測對MNAzyme活性的實時監測在BMGLabTechFluoStar焚光儀上，共50/iL反應體積中進行。反應於55。C等溫監測4分鐘。通過向反應混合液中注入螢光底物SubBi-2_FB(101/iM溶液)來引發反應，所述反應混合液含有lxPCR緩沖劑II(AppliedBiosystems)、25mMMgCl2、200nM部件酶AR05A4/2-P、200nM部件酶BR05B5/2-P,以及或者是(i)400nM組裝易化子F1/2,或者(ii)400nM組裝易化子組分Fl和400nM組裝易化子組分F2,或者(iii)400nM活性抑制劑和400nM組裝易化子組分Fl，或者是(iv)不含有組裝易化子。3.5結果採用多種調節性或者結構性組分寡核苷酸的組合得到的結果示於圖5。在含有組裝易化子Fl/2(圖5(i))或者組裝易化子成分Fl和F2(圖5(ii))的反應中可以看到螢光信號快速增加，表明了高水平的MNAzyme切割活性。缺乏易化子時焚光沒有隨時間增加(圖5(iv))。這表明組裝易化子不需要總是完整的寡核苷酸，而是可以分成多個短的易化子組分，它們相互鄰接地排列在部件酶的感應臂上。在含有活性抑制劑和易化子Fl(圖5(ni))的反應中沒有觀察到螢光信號隨時間增加。因為活性抑制劑分子包括易化子F2的序列，所以鄰接著易化子F2的另外的非互補抑制序列是推動MNAi複合體組裝的元件。MNAi可以結合到底物上，但是不能催化性地修飾它。結果，所述底物未被切割，在有MNAi複合體的情況下，螢光沒有隨時間增力口(圖5(iii))。將含有組裝易化子組分F1和F2的反應(圖5(ii))與含有組裝易化子F1和活性抑制劑(引入了F2序列)的反應(圖5(iii))進行比較表明，活性抑制劑中存在的抑制結構域通過推動MNAi複合體的組裝，阻止形成活性MNAzyme，^v而^是供可以用來調節酶活性的工具。因此祐:i殳計成在有組裝易化子F1/2時可以形成的MNAzyme產生了螢光。本實施例表明組裝易化子F1/2可以被分成兩部分(組裝易化子組分F1和F2)，而保留指導催化活性MNAzyme組裝的能力。這兩種組裝易化子組分如果在部件酶感應臂上彼此相鄰結合，那麼它們合在一起可以穩定活性MNAzyme的形成並引起螢光。在相同條件下進行的後續實驗表明，在僅有組裝易化子序列組分F2的情況下，沒有觀察到螢光隨時間增加(數據未顯示)。因此，本實施例表明，部件酶組合成活性MNAzyme可能需要有多個組分組裝易化子的存在。當需要多組分組裝易化子時，一或多個這些組分的存在與否可以被用來控制活性MNAzyme的組裝，從而將它們打開和關閉。我們進一步發現，活性抑制劑分子能通過與部件酶雜交和破壞兩種組裝易化子組分在部件酶感應臂上結合處的二級結構來阻止MNAzyme組裝，所述二級結構是酶活性所必需的(見圖4和5的例子)。本領域技術人員會理解，可以設計與部件酶A或B,或者與部件酶感應或底物臂雜交的抑制分子。包括活性抑制劑、部件酶穩定因子臂組分以及組裝易化子或其組分在內的分子均可被用來調節活性MNAzyme和無活性狀態如MNAi的組裝。在活化(MNAzyme)和失活(比如MNAi)狀態之間轉換可以為生成分子開關提供一種機制，通過在活性和失活構象之間交替來調節所述分子開關。這類分子開關可以應用來控制核酸複製級聯(圖6,實施例4),或者自主治療、診斷以及計算分子規模設備的調節。貫穿在本文件中討論了可以應用來誘發特定寡核苷酸組分發生解離的多種實驗方案。實施例4:使用DNA的信號級聯(SCUD)產生用於靶分析物;險測的MNAzyme複製級聯的一個機制利用了SCUD級聯策略。該SCUD策略可以引入大量設計中的級聯，以舉例的方式，在例如圖6(引入了兩種MNA複合體)、圖IO(引入了三種MNA複合體)和圖11(級聯反應中引入了MNA複合體和DNAzyme)中有闡述。SCUD方法依賴於對由混合液中存在的組分寡核苷酸組裝成活性MNAzyme和MNAi的控制能力。圖6中描述了SCUD的一種形式。該SCUD例子描述了信號放大的一般方法。如圖6所示，被稱為SCUD(使用DNA的信號級聯)的該方法的一個策略含有以下組分(i)含有三種區域的雙標記RIF(報告分子-抑制劑-易化子)；a.活性抑制劑/報告分子(RI)結構域，其具有雙重功能，其一在引入RIF時是活性抑制劑；其二在RIF被切割時提供螢光信號，以及b.活化劑組裝易化子組分F2b，其構成MNAzyme2a的關鍵組分，c.位於RI和F2b結構域之間的底物結構域，其可被MNAzymela或MNAzyme2a切割，(ii)組裝易化子組分Fh(iii)僅在有組裝易化子Fl的情況下能夠形成活性MNAzymela結構的部件酶，以舉例的方式其可以是測試樣品中的耙標核酸；活性MNAzymela,其能將RIF切割成RI和F2b組分，從而產生螢光，消除MNAzyme活性抑制作用，同時產生新的活化劑組裝易化子組分F2b。(iv)僅在部件酶臂與組裝易化子組分F2a結合時才能夠形成活性MNAzyme2a複合體的部件酶，其中所述組分F2a鄰接著被釋放的活化組裝易化子組分F2b。隨之MNAzyme2a可以切割更多的RIF，牙奪放出更多的RI和F2b，從而產生MNAzyme2a自身複製和相伴的螢光信號放大的級聯。在沒有F1(例如其可以是靶標核酸)時，MNAzyme2a的部件酶會85形成帶有完整RIF的無活性複合體MNAi2i。在有靶標分析物的情況下，活性MNAzymela會形成，因此將RIF切割，釋i文出活化劑組裝易化子組分F2b，然後後者就自由結合，變成活性MNAzyme2a的組分。因為MNAzyme2a可以進一步切割更多的RIF，這就引發了複製/信號放大的級聯。每次MNAzyme2a切割RIF分子，就會產生形成新MNAzyme2a所需要的更多組分(活化劑F2b組裝易化子)。利用由MNAzyme2a催化活性產生的產物的組分，MNAzyme級4關導致組裝成與親本MNAzyme相同的MNAzyme2a複合體。因此，MNAzyme切割產物(F2b)能夠在自身催化的自身複製系統中，引導新(親本)MNAzyme分子的組裝。如果將SCUD策略與適體-MNAzyme系統聯繫起來，SCUD可以-故核酸靶標(DNA/RNA)或者其他靶標分析物(蛋白質、小分子等)所引發。因為所述反應僅在有靶標分析物的情況下被引發，這就提供了一種檢測和/或鑑定靶標分析物的技術。該方法建立在多組分核酸複合體失活和活化狀態之間的轉換的基礎上。與靶擴增技術(比如聚合酶鏈式反應或連接酶鏈式反應)不同，通過SCUD的MNAzyme複製和信號》文大不需要蛋白酶來協助其過程。此外，利用幾種寡核苷酸組分(比如穩定因子臂組分或組裝易化子組分)來控制和調節MNAzyme的催化活性的能力，使得MNAzyme的組裝受到微環境中的條件和組分的緊密調節實施例5:應用MNAzyme來檢測包括小分子(比如腺苷5'三磷酸)在內的非核酸分析物適體是由很大的隨機序列寡核苷酸庫，就其以高親和性和特異性結合靶標分析物的能力體外演化得到的單鏈DNA或RNA分子。根據其特異結合許多類型的分析物(包括蛋白質、碳水化合物、脂類、核普酸、完整細胞和病毒)的能力對適體進行了選擇。在本實施例中，將適體序列引入部件酶(適體-部件酶)的末端，其構象使得在有活化劑配體的情況下，僅形成活性適體-MNAzyme。實現這一目標有多種途徑，包括以下實施例中使用的策略，該策略在圖7中進4亍了闡述。苷酸，包括a)標準部件酶；b)適體-部件酶，它是一端引入了適體的部件酶；c)組裝易化子，其既能結合所述適體-部件酶，也結合使得活性MNAzyme組裝的所述部件酶；d)報告分子底物；以及e)組裝抑制劑寡核苷酸，其與適體-部件酶發生雜交的區域跨越至少適體序列的一部分和部件酶序列底物結合臂的一部分。在沒有活化劑配體的情況下(圖7，插圖(i))，組裝抑制劑寡核香酸結合到適體-部件酶上，從而阻止它與底物的結合。有活化劑配體的情況下(圖7，插圖(ii)),活化劑配體能夠與適體-部件酶的適體序列發生相互作用，從而阻止組裝抑制劑的結合，使得活性適體-MNAzyme得以組裝，然後與底物結合併對其進行切割。這樣，在有活化劑配體的情況下，僅能形成適體-MNAzyme並產生螢光信號。利用對小分子ATP進行的檢測論證了這一策略。本實施例中使用的長27個核苷酸的適體序列曾被報導是高度特異結合ATP和dATP的(Achenbach,2005,HuizengaandSzostak,1995)。5.1部件酶寡核苷酸、組裝易化子以及抑制性寡核苷酸在本實施例中，ATP適體序列被連接到部件酶的底物臂上，從而產生適體-部件酶分子(圖7)。適體-部件酶和標準部件酶的感應臂被設計成能夠結合合成組裝易化子，反應中包含該易化子以便當有靶標或調節分析物時，推動MNAzyme的組裝。適體-部件酶AtpA2/1和部件酶AtpB3/1的序列如下所示(5，到3，)。以下序列中粗體表示的鹼基與組裝易化子雜交，帶下劃線的鹼基形成了組裝成的MNAzyme的催化核心，斜體表示的鹼基與底物雜交。此外，部件酶AtpA2/1中常規字體表示的鹼基代表能夠結合ATP或dATP的DNA適體序列。SEQIDNO:12適體-部件酶A2AtpA2/l:AGTATTGCGGAGGAAGGTSEQIDNO:13部件酶B3AtpB3/1:C4rcrCTrcrCCGAGCGTCTGTACCGTGTAC組裝易化子的序列如下所示(5，到3，)SEQIDNO:14組裝易化子AtpC/l:GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT"組裝抑制劑"寡核苷酸的序列如下所示(5，到3，)SEQIDNO:15組裝抑制劑AtpR/l:CCAGGTACTCACTATT5.2報告分子底物通過對雙標記核酸4艮告分子底物的切割來監測適體-MNAzyme的活性。用於本實施例的報告分子底物是SubBi-l-FB，其序列5，到3，如下所示。小寫字母的鹼基表示RNA，大寫字母的鹼基表示DNA。帶有下劃線的石威基指示5'端的6-FAM部分和3'端的BHQ1部分的位置。以490nm(FAM激發波長)激發，於520nm(FAM發射波長)監測由於對SubBi-l-FB在FAM和BHQ1之間的核糖核香酸的切割所造成的螢光變化。SEQIDNO:16SubBi-l-FB:ACTCAC工ATaGGAAGAGAIG5.3靶標或調節分析物以及對照分子用於本實施例的活化劑配體是腺苷5'-三磷酸(ATP)和脫氧腺香5'-三磷酸(dATP)。鳥苷5'-三磷酸(GTP)和胞嘧啶5'-三磷酸(CTP)用作陰性對照分子。所有分子購自Bioline。無核酸酶水用作無分析物對照。5.4反應條件催化活性適體-MNAzyme對報告分子底物的切割導致焚光信號的增加，通過測量這個增加確定活化劑配體的存在。通過加入底物引發反應，所有反應的總體積均為50/iL。在注入底物前，所有反應於60°C溫育5分鐘(以減少二級結構)。反應於47。C在FLUOstarOPTIMA(BMGBiotech)上進行。每3秒鐘給各個反應讀取螢光讀數，共讀10分鐘。每個反應含有終濃度200nMAtpA2/1、200nMAtpB3/l、200nMAtpC/1、200nMAtpR/1、200nMSubBi-l-FB、25mMMgCl2、50mMTrisHC1pH7.5以及2mM的ATP或者dATP或者GTP或者CTP或88者沒有分析物(水對照)。5.5結果SubBi-l-FB報告分子底物的檢測和切割沒有ATP或dATP的情況下，可觀察到低水平的螢光，並且不會隨時間增加，這表明在沒有ATP時，組裝抑制劑阻止了活性適體-MNAzyme/底物複合體的組裝。而存在ATP或dATP時，螢光信號更高並隨時間增加。這說明抑制劑寡核苷酸被dATP和ATP所耳又代，並且形成了活性適體-MNAzyme。適體-MNAzyme的組裝是配體依賴性的。在有GTP或CTP日於，可以觀察到低水平螢光，且不隨時間增加。有GTP或CTP情況下觀察到的焚光與沒有ATP或dATP時(即無配體的水對照)觀察到的螢光類似。本實施例表明，可以將MNAzyme偶聯到適體上，通過對靶標分析物高度特異的方法來檢測分析物。本實施例進一步表明，可以用組裝抑制劑分子來控制適體-MNAzyme的組裝，ATP可以作為該系統中的活化劑配體或分子調節劑。本領域技術人員會認識到這一策略的設計是靈活的。可以將所述適體引入含有部分催化核心序列的兩種部件酶的任一端(5'或3')。這樣，組裝抑制劑可以結合到適體區域上，或者與底物臂(其結合底物)或感應臂(其結合組裝易化子)結合。在前一設計(圖7和本實施例)中，抑制劑阻斷了與底物的結合，在後面的設計中，抑制劑會阻止組裝易化子與適體-部件酶的結合，從而阻止了活性MNAzyme的組裝。現有文獻中含有能夠檢測許多類型分析物的大量適體的序列。所述待分析物包括蛋白質、碳水化合物、脂類、朊、核苷酸、完整細胞和病毒。可以將所有這些類型的待分析物的適體連接到部件酶上以便檢測非常多樣化的分子。與待分析物結合適體(或者適體-部件酶)以及MNAzyme對報告分子底物進行切割均適合的反應條件(緩沖液、溫度、二價陽離子濃度等)可以通過經^^測試來確定。通過去除或添加組裝抑制劑可以調整MNAzyme活性。改變寡核苷酸序列、熔解溫度和/或濃度可以實現更精細的調節。MNA中的組裝抑制劑的雜交受到許多因素的影響，這些因素包括，但不限於鹽濃度、陽離子濃度、溫度以及添加劑(例如，DMSO)的存在與否。這樣，影響雜交的實體就提供了控制MNA複合體的組裝和解組裝的工具。可以通過物理操縱，例如通過利用附著部分的物理特性將它作為分子"鉤"，以及/或者利用寡核苷酸的內在特性(例如負電荷或序列互補性)來去除組裝易化子、組裝抑制劑或其他MNA成分。實施例6:利用具有連接酶活性的DNAzyme和具有切割活性的MNAzyme的分子開關圖8概括了利用兩種DNA酶的催化活性的分子開關。第一個反應由MNAzyme介導，其能夠將含有寡核苷酸的RNA切割成2，,3，-環化磷酸酯和5，-羥基產物。第二個反應由DNAzyme連接酶介導，其能夠將2',3，-環化磷酸酯和5，-羥基產物連接起來。這類DNAzyme的例子是本領域已知的，包括例如"7Z81"和"7Z48"連接酶(Prioretal,2004)。在最簡單的形式中，寡核苷酸1/2可以;故MNAzyme切割成切割產物寡核苷酸1和寡核苷酸2，從而再次產生2，,3，-環化磷酸酯和5，-羥基產物，它們再參與隨後一輪的連接。然後DNAzyme連接酶可以利用切割產物作為連接的底物。DNAzyme可以將第一寡核苷酸產物(寡核苷酸l)連接到第二寡核苷酸產物(寡核苷酸2)上，產生與寡核苷酸1/2序列相同的連接產物。在複合形式中，MNAzyme可以將幾種寡核苷酸，例如四種寡核香酸切割成帶有2'，3，-環化磷酸酯和5，-羥基末端的產物。這些產物可以被一組16個DNAzyme連接酶連接成16個新的單一連接產物(即寡核苦酸l、2、3和4的每種組合)。如果能達到MNAzyme切割的最低序列要求，其他MNAzyme可以再將16個連接產物寡核苷酸中的一或多個，在寡核苷酸1、2、3和/或4之間的原有連接點之外的位點進4亍切割。例如，實施例1中的MNAzyme要求底物的切割位點上有。票呤嘧啶核糖核苦酸。一組MNAzyme可使用共同的組裝易化子，並且/或者MNAzyme可以將來自前面幾輪連接反應的連接產物作為自己的組裝易化子。這樣，寡核苷酸的連接所產生的新信息(輸入)數據可以被MNAzyme識別為"讀"。然後所述MNAzyme可以切割"寫"而產生新的輸出產物以及/或者信息。其中MNAzyme可以讀出輸入連接產物，然後將其切割成不是本來就存在於起始分子庫的產物寡核苷酸的系統可以被用來重寫或重編碼新的輸出序列。在某些實施方案中，DNAzyme進行的連接可以通過例如形成新的組裝易化子或其組分來"寫"輸入數據。MNAzyme可以利用部件酶感應臂通過查詢組裝易化子中編碼的信息來這些數據。然後MNAzyme可以"寫"數據，例如新序列(切割產物)，從而產生新的輸出數據，後者再被DNAzyme連接酶"讀"(通過確定MNAzyme切割產物是否適合作為DNAzyme連4妄酶的底物)。這樣，這一MNAzyme/DNAzyme連4妻酶級耳關可以形成自動才幾。這類設備能夠遵照設定的程序，將一個形式的信息轉換為另一形式。這種情況中，所述程序是由MNAzyme和DNAzyme連接酶的底物臂和/或感應臂編碼並指導的。Benensonetal(2001)利用DNA和蛋白質酶(限制性內切酶和連接酶)開發出能夠解決計算問題的自動機。級聯反應中，所述限制性內切酶將雙鏈DNA切割，蛋白連接酶將切割產物連接起來。所述蛋白酶作為"硬體"，而DNA編碼了"軟體"。通過選擇恰當的DNA軟體序列對輸入和自動機進行編程。自動機通過限制內切酶切割、雜交和連接循環的級聯進行，從而產生可檢測的輸出分子，其編碼了自動機的最終狀態，因此也就是計算結果(Benensonetal,2001)。可以類似於Benensonetal(2001)使用的級聯方式來使用MNAzyme/DNAzyme連接酶級聯，從而提供能夠解決計算問題的設備。與Benenson的設備不同的是，MNAzyme/DNAzyme連接酶級聯不需要蛋白酶來得到同樣的結果。Benenson的設備是由雙鏈DNA編程的，而MNAzyme/DNAzyme連接酶級聯可以由各種序列編碼，包括例如，最初輸入的寡核苷酸、MNAzyme的底物臂以及/或者感應臂和DNAzyme連4姿酶的底物。在另一個實施方案中，所述MNAzyme/DNAzyme連接酶級聯還可以作為構建分子文庫以及/或者提高該文庫的多樣性的方法，用於對寡核芬酸序列進行"重組"。在一個實施方案中，DNAzyme連接酶可被用於產生或破壞MNAzyme以及/或者無活性MNAi的組分。作為一個例子，DNA連接酶可以使"活性抑制劑"附著到"組裝易化子組分"上，導致MNAi的組裝("關"狀態)。可選地，DNAzyme連接酶可以使感應或底物臂附著到部件酶組分上，如圖ll(ii)和(iv)方面所示，通過促進組裝而產生MNAzyme的"開"轉換。在另一個實施方案中，DNAzyme連接酶可以附著帶有下述部分的標記序列所述部分使得利用例如一個生物素基團，寡核苷酸能夠被選擇性地捕獲；或者所述部分含有射頻磁場無線電，以便協助對雜交的電子遙控。這個方法使得能夠對組分分子進行選擇性去除，實現酶活性的活化或抑制。例如，MNAi複合體的活性抑制劑可以被選擇性地變性，使得轉變成活性MNAzyme狀態。在某些實施方案中，由DNAzyme進行的連接可以通過例如產生新的組裝易化子或其成分來"寫"輸入數據。MNAzyme可以利用部件酶感應臂查詢組裝易化子內編碼的信息來"讀"數據。然後MNAzyme可以"寫"數據，例如新序列(切割產物)，從而產生新的輸出數據。後者隨之可以被其他DNAzyme連接酶通過確定該MNAzyme切割產物是否適合作為底物來"讀"。實施例7:MNAzyme和MNAi分子開關的一個示例性結構形成活性MNAzyme所需要的組裝易化子可以包含兩種或多種組分寡核苷酸。活性抑制劑寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi結構的形成。本領域技術人員會認識到這類MNAzyme和MNAi有許多設計。活性MNAzyme結構的一些例子如圖9(插圖A到D,左側結構)所示。MNAi結構的例子也示於圖9(插圖A到D，活性MNAzyme右側的結構)。本實施例展示了圖9插圖B結構c(MNAzyme)和d(MNAi)的結構。本實'險使用的MNAzyme是由部件酶R05A4/2和5FAC2B5(6)/2(16)構成的，該MNAzyme的設計使之在被稱為組裝易化子1(FAC2)和組裝易化子2(d6p-l)這兩種寡核苷酸的指導下組裝好後，切割報告分子底物SubBi-2-FB。這個實驗還顯示了包含活性抑制劑的複合體的形成導致了MNAi複合體的產生。7.1部件酶寡核苷酸以下序列中，粗體顯示的鹼基與靶標核酸(或者組裝易化子)序列雜交，帶下劃線的石威基形成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體表示的石鹹基與底物雜交。SEQIDNO:17部件酶AR05A4/2:CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGJ(704^4CC7TSEQIDNO:18部件酶B5FAC2B5(6)/2(16):rGCCC4GG04GGCTAGCTCTGTCCGAGGCGTGAT7.2報告分子底物本實施例中的報告分子底物是序列5，到3'如下所示的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5'端標記有6-FAM部分，3'端標記有BHQ1部分。以485nm(FAM激發波長)激發，於530nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2-FB的切割。小寫字母鹼基代表RNA，大寫字母鹼基代表DNA。SEQIDNO:4SubBi隱2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA7.3易化子和活性抑制劑寡核苷酸所用組裝易化子的序列5，到3'如下所示。小寫字母鹼基代表RNA,大寫字母鹼基代表DNA。組裝易化子2和活性抑制劑共有的序列以粗體顯示。活性抑制劑SubBi-6-TRB的5'端標記了TexasRed部分，3'端標記了BHQ2部分。SEQIDNO:19組裝易化子2(F2)d6p-l:ATCACGCCTCgSEQIDNO:20組裝易化子1(Fl)FAC2:GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGSEQIDNO:21活性抑制劑SubBi-6-TRB:ATCACGCCTCguTCCTCCCAG7.4反應糹且分和對MNAzyme活'性的監測在SmartCycler(Cepheid)上，於25/^L總反應體積中對MNAzyme活性進行實時監測。於52。C對反應等溫監測30分鐘。通過向反應混93合液中注入螢光底物SubBi-2-FB(5]idlgM溶液)來引發反應。所述反應混合液含有lxPCRBufferII(AppliedBiosystems)、50mMMgCl2、部件酶R05A4/2和5FAC2B5(6)/2(16)各200nM、200nM易化子FAC2以及200nM的組裝易化子2(d6p-l)或者200nM活性抑制劑(SubBi-6-TRB)。7.5結果在本實施例中，組裝易化子由兩種寡核苷酸組分構成。圖9顯示了通過MNA形成的結構，即活性MNAzyme(插圖B結構c)和MNAi(插圖B結構d)的示意圖。該MNAzyme的組裝需要兩種組裝易化子(F1和F2)和兩種部件酶。可選地，活性抑制劑(I)可以與部件酶結合併形成MNAi結構。在這個實驗中，將部件酶和兩種組裝易化子Fl和F2孵育導致形成活性MNAzyme，它對報告分子底物進行的切割使得螢光隨時間增加了大約500個單位(從400到900單位)。相反，部件酶與一種組裝易化子(F1)以及一種活性抑制劑(I)孵育導致形成MNAi結構，該結構不能切割報告分子底物。結果隨時間僅觀察到螢光有低水平的背景增加，大概有20個單位的基線移動(從390到410單位)。因為含有共有序列，組裝易化子(F2)和活性抑制劑(I)結合到部件酶上的相同區域。但是，活性抑制劑上有，而組裝易化子F2上沒有的額外的抑制序列使得形成了MNAi結構。從活性抑制劑上除去這個額外的抑制序列會導致產生活化劑組裝易化子F2。這樣，添加或除去該抑制序列提供將活性MNAzyme轉換成MNAi或反之亦然的機制。實施例8:MNAzyme和MNAi分子開關形成活性MNAzyme所需要的組裝易化子可以包含兩種或多種組分寡核苷酸。活性抑制劑寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi結構的形成。本領域技術人員會認識到這類MNAzyme和MNAi複合體有許多設計。活性MNAzyme結構的例子如圖9(插圖A到D,左側結構)所示。MNAi結構的例子也示於圖9(插圖A到D，活性MNAzyme右側的結構)。本實^例展示了圖9所示插圖C結構e(MNAzyme)和f(MNAi)的結構。本實驗中產生的MNAzyme由兩種部件酶(FACA4/6(22)和5FAC2B5(2)/6(33))以及三種組裝易化子組分即易化子1(Fl)、易化子2(F2)和易化子3(F3)組裝而成。本實驗同樣顯示了包含活性抑制劑(SubBi-2-FB)和易化子1(F1)以及(F3)的複合體的形成可以產生MNAi複合體。8.1部件酶寡核苦酸以下序列中，粗體顯示的鹼基與耙標核酸(或者組裝易化子)序列雜交，帶下劃線的鹼基形成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體表示的鹼基與底物雜交。SEQIDNO:22部件酶AFACA4/6(22):CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGA04GGCGm471SEQIDNO:23部件酶B5FAC2B5(2)/6(33):C7UG(^GG^4GGCTAGCTCTGTCCGAGGAAACCTTCGTCGTCCAGACTGCG8.2報告分子底物本實施例所用報告分子底物是SubBi-6-TRB,其序列5，到3'如下所示。SubBi-6-TRB的5'端標記了TexasRed部分，3'端標記了BHQ2部分。以585nm(TexasRed激發波長)激發，在610nm(TexasRed發射波長)監測對SubBi-6-TRB的切割。小寫字母鹼基代表RNA,大寫字母鹼基代表DNA。SEQIDNO:21SubBi-6-TRB:ATCACGCCTCguTCCTCCCAG8.3易化子和活性抑制劑寡核苷酸所用組裝易化子的序列5，到3'如下所示。組裝易化子F2和活性抑制劑共有的序列以粗體顯示。小寫字母鹼基代表RNA,大寫字母鹼基代表DNA。活性抑制劑SubBi-2-FB的5'端標記了6-FAM部分，3，端標記了BHQ1部分。SEQIDNO:24組裝易化子FlSTAB:CGCAGTCTGGACGACGSEQIDNO:25組裝易化子F2d2p國l:AAGGTTTCCTCgSEQIDNO:4活性抑制劑SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCASEQIDNO:20組裝易化子F3FAC2:GACAGAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG8.4反應組分和對MNAzyme活性的監測在SmartCycler(Cepheid)上，於25/xL總反應體積中對MNAzyme活性進行實時監測。於52。C對反應等溫監測30分鐘。通過向反應混合液中注入螢光底物SubBi-6-FB(5]tdlgM溶液)來引發反應。反應混合液含有lxPCRBufferII(AppliedBiosystems)、50mMMgCl2、部件酶FACA4/6(22)和5FAC2B5(2)/6(33)各200nM、200nM易化子FlSTAB、200nM易化子F3FAC2，以及200nM的組裝易化子F2(d2p-l)或者200nM活性抑制劑(SubBi-2-FB)。8.5結果在本實施例中，組裝易化子由三種寡核苷酸組分構成。圖9顯示了通過MNA複合體形成的結構，即活性MNAzyme(插圖C結構e)和MNAi(插圖C結構f)的示意圖。該MNAzyme需要三種組裝易化子組分(F1、F2和F3)和兩種部件酶來組裝成具有催化活性的複合體。可選地，活性抑制劑(I)可以與部件酶結合併形成MNAi結構。在這個實^r中，將部件酶和三種組裝易化子組分F1、F2和F3孵育導致形成活性MNAzyme,它對報告分子底物進行的切割使得螢光隨時間增加了大約330個單位(從140到470單位)。相反，部件酶與兩種組裝易化子(F1和F3)以及一種活性抑制劑(I)的共孵育導致形成MNAi結構，該結構不能切割報告分子底物。結果隨時間觀察到螢光僅有低水平的背景增加，大概有40個單位的基線移動(從80到120單位)。因為含有共有序列，組裝易化子組分(F2)和活性抑制劑結合到部件酶上的相同區域。但是，活性抑制劑上有，而組裝易化子組分F2上沒有的額外的抑制序列使得形成了MNAi結構。從活性抑制劑上除添加或除去該抑制序列提供將活性MNAzyme轉換成MNAi或反之亦然的機制。實施例9:另一種MNAzyme和MNAi分子開關形成活性MNAzyme所需要的組裝易化子可以包含兩種或更多組分寡核苷酸。活性抑制劑寡核苷酸的存在或缺失可以促成MNAi結構的形成。本領域技術人員會認識到這類MNAzyme和MNAi複合體有許多設計。活性MNAzyme結構的例子如圖9(插圖A到D，左側結構)所示。MNAi結構的例子也示於圖9(插圖A到D,活性MNAzyme右側的結構)。本實施例展示了圖9所示插圖D結構g(MNAzyme)和h(MNAi)的結構。本實驗中的MNAzyme由這樣的部件酶構成，它們祐:設計成在有兩種組裝易化子組分Fl和F2的情況下進行組裝，並且能切割報告分子底物SubBi-2-FB。部件酶(4SYNTB6/2(8))之一的感應臂被截短到8個鹼基。另一種寡核香酸，穩定因子臂sA(B6/tag(13))與組裝易化子Fl雜交從而穩定了MNAzyme複合體，其中Fl與部件酶(4SYNTB6/2(8))的截短了的感應臂相鄰。所述組裝易化子有兩種組分F1和F2。9.1部件酶寡核苷酸以下序列中，粗體顯示的鹼基與靶標核酸(或者組裝易化子)序列雜交，帶下劃線的鹼基形成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體表示的鹼基與底物雜交。SEQIDNO:26部件酶A4SYNTA5/2(22):CAAACGAGTCCTGGCCTTCGAGTACAACGA04G04"CCTrSEQIDNO:27部件酶B4SYNTB6/2(8):rGCCC4GGG』GGCTAGCGAAACCTT9.2報告分子底物本實施例中的報告分子底物是具有如下所示的序列5，到3，的SubBi-2-FB。SubBi-2-FB的5，端標記有6-FAM部分，3，端標記有BHQ1部分。以485nm(FAM激發波長)激發，於530nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2-FB的切割。小寫字母鹼基代表RNA,大寫字母鹼基代表DNA。SEQIDNO:4SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA9.3易化子、活性抑制劑以及穩定因子臂寡核苷酸所用組裝易化子組分的序列5，到3'如下所示。小寫字母鹼基代表RNA,大寫字母鹼基代表DNA。組裝易化子l和活性抑制劑共有的序列以粗體顯示。SEQIDNO:28組裝易化子F2(R05/cA(18)):AAGGCCAGGACTCGTTTGSEQIDNO:29組裝易化子Fl(r2p-SYNT/cB(25):GGGAAGGTGTAATAAGGTTTCCTCgSEQTDNO:30活性抑制劑(2-SYNT/cB(25)):GGGAAGGTGTAATAAGGTTTCCTCguCCCTGGGCASEQIDNO:31穩定因子臂sA(B6/tag(13)):ATTACACCTTCCC9.4反應組分和對MNAzyme活性的監測在BMGLabTechFluoStar焚光儀上，於50/xl總反應體積中對MNAzyme活性進行實時監測。於40。C對反應等溫監測3分鐘。通過向反應混合液中注入焚光底物SubBi-2-FB(10/il的1/iM溶液)來引發反應。反應混合液含有lxPCRBufferII(AppliedBiosystems)、25mMMgCl2、部件酶4SYNTA5/2(22)和4SYNTB6/2(8)各200nM、200nM穩定因子臂B6/tag(13)、200nM易化子F2R05/cA(18)，以及200nM的組裝易化子Fl(。p-SYNT/cB(25))或者活性抑制劑(2-SYNT/cB(25))。9.5結果在本實施例中，組裝易化子由兩種寡核香酸組分構成。圖9顯示了通過MNA形成的結構，即活性MNAzyme(插圖D結構g)和MNAi(插圖D結構h)的示意圖。該MNAzyme需要兩種組裝易化子組分(Fl和F2)、兩種部件酶以及一種穩定因子臂來組裝成具有催化活性的複合體。可選地，活性抑制劑(I)可以與部件酶結合併形成MNAi結構。在這個實驗中，將兩種部件酶、兩種組裝易化子組分Fl和F2,以及一種穩定因子臂孵育導致形成活性MNAzyme,它對報告分子底物進行的切割使得螢光隨時間增加了大約28,000個單位(從12,000到40,000單位)。相反，部件酶與一種組裝易化子(F2)、一種穩定因子臂以及一種活性抑制劑(I)的共孵育導致形成MNAi結構，該結構不能切98割報告分子底物。隨時間觀察到螢光僅有低水平的背景增加，大概有1,500個單位的基線移動(從12,000到13,500單位)。因為含有共有序列，組裝易化子組分(F1)和活性抑制劑(I)結合到部件酶和穩定因子臂上的相同區域。但是，活性抑制劑上有，而組裝易化子組分F1上沒有的額外抑制序列使得形成了MNAi結構。從活性抑制劑上除去這個額外的抑制序列會導致產生活化劑組裝易化子Fl組分。這樣，添加或除去抑制序列提供將活性MNAzyme轉換成MNAi或反之亦然的機制。實施例10:SCUD級聯用於產生MNAzyme複製級聯的一個機制利用了SCUD級聯策略，其中所述MNAzyme複製級聯是設計用來進行靶標分析物;險測的。可以將SCUD策略引入到圖示的多種設計的級聯中，例如圖6，其中引入了兩種MNA複合體；圖10,其中引入了三種MNA複合體；以及圖11，其中級聯反應中引入了MNA複合體和DNAzyme兩者。SCUD方法依賴於調控從混合液中存在的組分寡核苷酸組裝成活性MNAzyme和MNAi的能力。圖10圖釋了SCUD級i[關的一個示例性方案。在該策略中，在有靶標(T)的情況下形成了起始MNAzyme(Mt)。這個起始MNAzyme切割底物(S1)從而產生形成級聯MNAzyme1(Mcl)所需要的活化劑組裝易化子組分之一(Slf)。然後MNAzymel切割底物(S2)而產生形成級聯MNAzyme2(Mc2)所必需的其他的活化劑組裝易化子組分。然後MNAzyme2切割底物(S1)由此引發級聯反應。以下實驗實施例展示了起始MNAzyme(Mt)在有靶標存在的情況下，將底物(S1)切割成兩種片段的能力。實施例進一步顯示了起始MNAzyme(Mt)可以將Sl底物切割成這樣的片段，其中之一(Slf)可以作為活化劑組裝易化子組分，與兩種其他易化子組分(F1和F2)—起形成能夠切割第二種底物(S2)的MNAzymeMcl。本實驗中，起始MNAzymeMt由部件酶R05A5/2-P和R05B6/2-P組成，它們是設計用來檢測人RPLPO基因(R05靶標)的片段，並切割Sl底物SubBi-2h-FB。SubBi-2h-FB的切割片段(Slf)與Fl和F2組裝易化子組分FAC5和FAC6—起結合到包含部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的Mcl級聯MNAzyme1的感應臂上。完全組裝好的活性級聯MNAzyme1被設計用於切割底物SubBi-6-TRB。10.1部件酶寡核苷酸以下序列中，粗體顯示的鹼基與靶標核酸(或組裝易化子)序列發生雜交，帶有下劃線的鹼基構成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體顯示的鹼基與底物雜交。"-P"表示寡核苷酸的3'磷酸化。SEQIDNO:51部件酶AR05A5/2-P:CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTTACAACGA04G04"CC7T陽PSEQIDNO:32部件酶BR05B6/2畫P::TGCCC4GG04GGCTAGCGTGGAGACGGATTACACCTTC-PSEQIDNO:33部件酶ACasA4(2h)/6:GTATCGTGTGTTCTTGCCCTCGTGCCCACAACGA04GGCSEQIDNO:34部件酶BCasB5(2h)/6:CrGGa4GG"GGCTAGCTAGGGACGCACTCCTACCTCTA10.2報告分子底物本實施例的報告分子底物Sl和S2是SubBi-2h-FB和SubBi-6-TRB，其序列5，到3'如下。SubBi-2h-FB在5'端末端標記了6-FAM部分，3，端內部標記了BHQl部分。SubBi-6-TRB在5'端末端標記了TexasRed部分，3'端末端標記了BHQ2部分。帶下劃線的鹼基表示螢光團的位置。以485nm(FAM激發波長)激發，於530nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2h-FB的切割。以585nm(TexasRed激發波長)激發，於610nm(TexasRed發射波長)監測對SubBi-6-TRB的切割。小寫字母表示的鹼基代表RNA，大寫字母表示的鹼基代表DNA。SEQIDNO:35SubBi-2h隱FB:△AGGTTTCCTCguCCCTGGGC^CACGAGGSEQIDNO:21SubBi-6-TRB:ATCACGCCTCguTCCTCCCAQ10.3易化子寡核苦酸本實施例中使用了兩種分子作為組裝易化子組分來和部件酶100CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的感應臂雜交。F1和F2組裝易化子FAC5和FAC6的序歹'J5，到3，如下所示。SEQIDNO:36組裝易化子FlFAC5:GCAAGAACACACGATACSEQIDNO:37組裝易化子F2FAC6:TAGAGGTAGGAGTGCG10.4把標序列本實施例的靶標序列是合成寡核苷酸R05靶標，其序列5，到3，如下所示。這個靶標序列與人RPLPO基因的一部分外顯子5序列相同。SEQIDNO:38R05耙標10.5反應組分以及對MNAzyme活性的監測在SmartCycler(Cepheid)上，於25/xL總反應體積中對MNAzyme活性進行實時監測。於50。C對反應等溫監測12分鐘。通過向反應混合液中注入焚光底物SubBi-2h-FB和SubBi-6-TRB(每種底物各5/d的2.5]HM溶液，終濃度均為0.5^M)來引發反應。反應混合液含有lxPCRBufferII(AppliedBiosystems)、25mMMgCl2、部件酶R05A5/2-P、R05B6/2-P、CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6各500nM、易化子組分FAC5和FAC6各500nM,以及100nM的R05把標或者無耙標(水)對照。10.6結果在有R05耙標序列的情況下，部件酶R05A5/2-P和R05B6/2-P形成了起始MNAzymeMt，它切割Sl底物SubBi-2h-FB,造成FAM螢光增加大約1250個單位(從1200到2450單位)。；波切割的Sl底物產生Slf易化子片段，然後後者與Fl和F2易化子組分FAC5和FAC6，以及部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6形成Mcl級聯MNAzyme1。該MNAzyme1然後切割第二S2底物SubBi-6-TRB，使得TexasRed螢光增加大約900個單位(從250到1150單位)。這樣，FAM和TexasRed螢光均發生增加表明該MNAzyme級聯反應中存在著靶標序列。沒有R05靶標的情況下，沒有觀察到FAM的螢光隨時間增加，TexasRed的螢光隨時間僅有低水平背景增加，基線遷移大約100個單位(從240到340單位)。不存在靶標時，部件酶R05A5/2-P和R05B6/2-P不能形成起始MNAzymeMt,因而Sl底物SubBi-2h-FB不被切割，FAM螢光不會增加。缺少切割的Sl底物，則沒有Slf易化子片段來指導Mcl級聯MNAzyme1的形成。然而未被切割的SI底物SubBi-2h-FB仍可結合到包含易化子FAC5和FAC6,以及部件酶CasA4(2h)/6和CasB5(2h)/6的複合體上，這就產生了不能切割S2底物SubBi-6-TRB的MNAi結構。結果TexasRed的螢光保持低水平。FAM和TexasRed的螢光均沒有顯著增加表明在這個MNAzyme級聯反應中沒有把標序列。實施例11:耙標檢測，其利用起始MNAzyme事件、隨後的SCUD反饋級聯放大以及DNAzyme連接酶介導的MNAzyme切割讀數用於本實施例的策略如圖11所示。該實施例論述了圖中該策略(i)到(iv)部分的方面。(i)靶標核酸(Fl)指導形成MNAzymela，所述MNAzymela切割割底物A並產生兩種切割產物，產物Aa和第二產物Ab,所述產物Aa是連接反應(ii部分)所需要的組分，所述第二產物Ab作為活化劑組裝易化子是(iii)部分所示的方面中所需要的。(ii)產物Aa的3，端有2',3，-環磷酸酯，因此適合作為具有連接酶活性的DNAzyme2a的底物。DNAzyme連接酶2a將(i)部分方面中產生的產物Aa連接到另一種寡核苷酸連接底物B上，從而產生了MNAzyme4a的新部件酶。(iii)產物Ab作為活化劑組裝易化子，指導部件酶組分形成活性MNAzyme3a。MNAzyme3a切割底物A產生兩種產物Aa和Ab。然後產物Ab可以作為活化劑組裝易化子，其指導產生更多的活性MNAzyme3a。這一MNAzyme3a系統產生SCUD自主催化自身複製反饋放大級聯。該SCUD級聯造成Ab的進一步積累，而Ab可以作為MNAzyme3a的活化劑組裝易化子，並在Aa的積累中起作用，所述Aa可以作為DNAzyme2a的底物。(iv)Aa和底物B連接所產生的連接產物形成了MNAzyme4a的新的連接好的部件酶。與易化子F4—起形成MNAzyme4a，並將底物C在螢光團和淬光劑染料對之間切割，使得螢光增強，指示存在著靶標102核酸F1。本實施例中，(i)、(ii)和(iii)方面在一個試管中於單一溫度同時發生。讀數才企測步驟(iv方面)是在向反應中加入其他試劑後進行的。本實施例中使用的DNAzyme連接酶以前曾被報導通過由2'，3，-環磷酸酯和5'-羥基基團形成2，-5，磷酸二酯鍵來連接RNA(Silvermanetal)。除了需要帶有2'，3，-環磷酸酯末端的5'底物，用於本實施例的DNAzyme連接酶還需要位於連接點上的特異序列基序是UA*G(A或G)(其中*代表連接位點)。11.1DNAzyme連接酶B作為DNAzyme連接酶的DNA寡核香酸序列如下所示。SEQIDNO39:DNAzyme連接酶7Z81-10/10:GAGTGC11.2部件酶寡核苷酸以下序列中，粗體顯示的鹼基與靶標核酸序列雜交，帶下劃線的鹼基形成組裝好的MNAzyme的催化核心的一部分，斜體表示的鹼基與底物雜交。以下是部件酶的序列，其形成MNAzyme1a的組分SEQIDNO:40部件酶AmiR20A2/l:TACCTGCACTACGGTCGA7UGT(L4SEQIDNO:41部件酶BmiR20B3/l:C47TrC7TCrCCGAGCTAAGCACTTTA以下序列對應部件酶，其與連接產物/部件酶結合形成MNAzyme4a的組分。SEQIDNO:42部件酶BSTB5/2(21):rGCCC4GG04GGCTAGCTCTGTCGTCGGAGTGGTCGTCG以下是部件酶的序列，其形成SCUDMNAzyme3a的組分SEQIDNO:43部件酶A4SYNTA2/li-10HP:GGATGGGCACTAACGTGCCCATCCCATCTCCGGTCGAAy4SEQIDNO:44部件酶B4SYNTB3/li-12HP:C47TTC7TCrCCGAGCTTCCCATCTCACGACGATAACGTCGTGAGATG11.3MNAzyme底物A(MNAzymela和3a的底物)以下序列中，小寫字母表示的鹼基代表RNA,大寫字母表示的鹼基代表DNA。SEQIDNO:45preSub5:CTGTAGCACTCACTAuaGGAAGAGATG11.4DNAzyme連接酶底物B以下序列中，小寫字母表示的鹼基代表RNA，大寫字母表示的鹼基代表DNA。3，DNAzyme連接酶底物被合成為具有以下序列和5，羥基團SEQIDNO:46preSub3:gGAACAACGAGAGGAAACCTT11.5MNAzyme底物C(MNAzyme4a的螢光才艮告分子底物)用於本實施例的報告分子底物是SubBi-2。本實施例中，SubBi-2的5'端標記了6-FAM部分，3'端標記了BHQl部分，被命名為SubBi-2-FB。以490nm(FAM激發波長)激發，於520nm(FAM發射波長)監測對SubBi-2-FB的切割。SubBi-2-FB的序歹'J5，到3'如下所示;小寫字母表示的鹼基代表RNA，大寫字母表示的鹼基代表DNA。SEQIDNO:4SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA11.6MNAzymela的耙標序列FlMNAzymela所識別的耙標序列是與人microRNAmiR-20RNA序列同源的合成DNA寡核苷酸。其具有以下序列SEQIDNO:47D-20耙標(MNAzymela靶標)TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA11.7MNAzyme4a的組裝易化子形成MNAzyme4a所需要的組裝易化子F4是具有以下序列的合成DNA寡核芬酸SEQIDNO:48MNAzyme4a的組裝易化子F4:11.8反應條件所有反應在一個SmartCyclerSmartCap試管(Cepheid)中如下所述進行。MNAzymela切割、DNAzyme2a連接和SCUDMNAzyme3a級聯放大(分別是(i)、(ii)和(iii)方面)在一個15/xl的起始反應體積中，在SmartCycler熱循環儀(Cepheid)上，於40°C經等溫溫育2小時。反應含有200nMpreSub5,100nMpreSub3、100nMDNAzyme連接酶7Z81-10/10、MNAzymela的部件酶(50nMmiR20A2/1和300nMmiR20B3/1)、MNAzyme3a的部件酶20nM(部件酶A4SYNTA2/li-10HP和部件酶B4SYNTB3/li-12HP)、150mMNaCl、2mMKCl、50mMTrisHC1(25。CpH9.0)和50mMMgCl2，以及100nMD-20耙標、或者100pMD-20靶標、或者100fMD-20靶標或者沒有靶標(只有dH20的對照)。對照反應缺少SCUDMNAzyme3a部件酶組分，因此只發生(i)、(ii)和(iv)方面。這些反應含有200nMpreSub5、100nMpreSub3、100nMDNAzyme連接酶7Z81-10/10、MNAzymela的部件酶(50nMmiR20A2/l和300nMmiR20B3/1)、150mMNaCl、2mMKCl、50mMTrisHC1(25。CpH9.0)和50mMMgCl2,以及100nMD-20耙標、或者100pMD-20把標、或者100fMD-20耙或者沒有耙標(只有dH20的對照)。將SCUD和對照反應進行溫育後，向SmartCapSystem試管中加入10jLtl等分檢測試劑得到25/xl總反應體積中終濃度如下300nM的部件酶STB5/2(21)、100nM的MNAzyme4a的組裝易化子F4、150mMNaCl、2mMKCl、50mMTrisHC1(25°CpH9.0)、50mMMgCl2、以及100nM的底物SubBi-2-FB。反應由55°C到80°C進行了90個熱循環(55。C80秒，80。C20秒)，並在SmartCycler(Cepheid)上監測螢光。隨時間監測SCUD和對照反應中，由於切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)導致的焚光增加。螢光的閾值設置為IOO個單位的焚光，測量每個反應達到閾值水平的螢光所需要的時間。11.9結果最初的等溫階段(對於對照反應，包括(i)和(ii)方面；對於包括SCUD放大級聯的反應，包括(i)、(ii)和(iii)方面)後，在熱循環階段((iv)方面)測量螢光值。在含有SCUD級聯組分和100nM靶標的反應中，螢光在一個循環內達到閾值，反應在10個循環時達到平臺期(表4)。在含有SCUD級聯組分和100pM靶標的反應中，螢光在第19個循環達到閾值，80個循環後仍未達到平臺期。在含有SCUD級聯組分和lOOfM靶標的反應中，螢光在第18個循環達到閾值，80個循環後仍未達到平臺期。相反，含有SCUD級聯組分，但沒有靶標的反應，在80個熱循環後未能達到閾值。這樣，達到閾值螢光表明這些反應中存在著靶標核酸。表4.達到閾值螢光的時間達到IOO單位的閾值所需要的時間(分鐘)(NS-閾值以上沒有信號)起始濃度SCUD對照100nM1個循環1個循環100pM19個循環59個循環100fM18個循環NS沒有靶標NSNS對照反應缺少SCUD級聯組分，但含有100nM的靶標，則在對照反應中，一個循環內達到閾值螢光，34個循環達到平臺(表4)。在含有100pM靶標的對照反應中，59個循環達到閾值焚光，80個循環後反應仍未達到平臺。在含有100fM靶標的對照反應中，80個循環後仍未達到閾值螢光。類似的，缺少靶標的對照反應在80個循環後未能達到閾值。這樣，達到螢光閾值表明這些反應存在著靶標核酸。以上觀察與含有(i)、(ii)、(iii)和(iv)方面所有組分的反應的酶擴增步驟是一致的(圖11)。首先，MNAzymela在有Fl特異靶標(D-20)的情況下，切割底物A產生兩種片段(Aa和Ab)((i)方面)。Aa片段是具有2'-3，環磷酸酯末端的5'片段(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQIDNO:49)。第二，Ab產物作為活化劑組裝易化子組分，指導活性MNAzyme3a的形成。MNAzyme3a將底物A切割產生兩種產物Aa和Ab。然後產物Aa作為易化子指導形成更多活性MNAzyme3a。這樣MNAzyme3a系統產生SCUD自主催化自身複製反饋放大級聯((iii)方面)。這個SCUD級聯還造成Aa的進一步積累，而Aa可以作為DNAzyme2a的底物。第三，5'片段Aa連接到反應混合液中存在的第二個連接酶底物B上，從而形成新的寡核苷酸(連接產物Aa/B),其序列為CTGTAGCACTCACTAuagGAACAACGAGAGGAAACCTT(SEQIDNO:50)(其中大寫字母表示DNA鹼基，小寫字母表示RNA鹼基)((ii)方面)。這個連接產物隨之作為MNAzyme4a的部件酶組分。最後，這個新產生的部件酶與第二個部件酶STB5/2(21))以及F4組裝易化子結合產生MNAzyme4a((iv)方面)。然後MNAzyme4a切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)使得螢光團與淬光劑染料對分離，導致螢光增加。在僅含有用於(i)、(ii)和(iv)方面的組分的對照反應中(圖11)，以上見察與下述事件一致。首先，MNAzymela在有Fl特異靶標(D-20)的情況下，將MNAzyme底物A切割成兩種片l殳(Aa和Ab)((i)方面)。Aa片段是具有2，-3，環磷酸酯末端的5，片段(CTGTAGCACTCACTAua)(SEQIDNO:49)。5，片段Aa連接到反應混合液中存在的第二連接酶底物B上，從而形成新的寡核苷酸(連接產物Aa/B)((ii)方面)。這個連接產物隨之作為MNAzyme4a的部件酶組分。最後，這個新產生的部件酶與第二個部件酶STB5/2(21))以及F4組裝易化子結合產生MNAzyme4a((iv)方面)。然後MNAzyme4a切割MNAzyme底物C(SubBi-2-FB)使得螢光團與淬滅劑染料對分離，導致螢光增加。缺乏靶標的反應表明，在含有或沒有SCUDMNAzyme組分的反應中，螢光信號的發生依賴於靶標核酸的存在。在含有SCUDMNAzyme組分，但缺少把標的反應中，不會形成易化子片段Ab,因此完整的底物A與MNAzyme3a的部件酶結合，形成MNAi複合體。圖9顯示SCUDMNA複合體所形成的結構，即活性MNAzyme3a(插圖A中的結構a)和MNAi(插圖A中的結構b)的示意圖。MNAzyme需要組裝易化子(圖9插圖A結構a中的Fl);或者活化劑組裝易化子(圖ll(iii)方面中的Ab)，它們可以由切割底物而產生。完整底物可以結合到MNAi結構上，作為如圖9插圖A結構b所示的活性抑制劑(I)。用於本實驗產生MNAzyme3a的部件酶有著這樣的感應臂，其在兩種部件酶的末端均有自身互補區域。組裝易化子結合在互補區域之間的區域上(圖9插圖A結構a和圖ll(iii)MNAzyme3a)。比較含有或缺少SCUDMNAzyme組分的反應的檢測極限，表明SCUD組分的存在造成信號的放大，從而可以檢測到少量的耙標。缺少SCUDMNAzyme3a部件酶組分的反應，其才企測限度是lx109分子(lOOpM的起始濃度)。相比之下，含有SCUD組分的反應能夠檢測lx106分子(100服的起始濃度)。此外，對於lxl(^分子，在含有SCUD組分的反應中，19個循環後能夠檢測到閾值以上的信號；與之相比，缺少MNAzyme3a的SCUD部件酶組分的反應需要59個循環。這樣，SCUD組分(MNAzyme3a的部件酶)耳關合起始MNAzyme(la)能夠產生活化劑組裝易化子組分Ab，從而使檢測時間和檢測極限均被降低。這個機制依賴於這樣的反饋，即每個SCUDMNAzyme3a產生更多MNAzyme3a所需的更多易化子，從而提供了信號放大的機制(圖ll(iii)方面)。這種SCUD信號放大方法允許信號放大藉助這樣的機制，所述^L制完全依賴於核酸酶類而非在其他核酸靶標擴增方法(比如PCR)中使用的蛋白質酶類的催化活性。此外，SCUD放大在試劑於40。C溫育時，等溫地發生在實驗的第一階段。總之，SCUD能夠在等溫狀態下，自主催化自身複製，導致信號放大。SCUD在不需要蛋白質酶類的方式中，使靈敏度和檢測速度提高。實施例12:利用MNA複合體的全加器MNA複合體，包括MNAzyme可以被利用於開發分子全加器。圖12展示了關於如何在MNAzyme的基礎上構建全加器的一個示例性i殳計方案。按照以下表5，全加器在三種通道(A、B、C)接收輸入，然後在輸入的基礎上在兩種通道(X,Y)產生輸出。108tableseeoriginaldocumentpage109為了清楚起見，缺失(或"關")信號用表中的空格表示。總之，在有正好一種或者全部三種輸入的情況下，輸出x是開，在有兩種或三種輸入的情況下，輸出y是開。雖然全加器通常是採用電信號作為輸入和輸出以電路邏輯工作的，該系統可以利用生物過程來執行，其中輸入以可檢測性事件表示，輸出以可才全測事件或可^r測效果來表示。正如可以從表中看出的，無效的情形(沒有輸入)之外，輸入有7種可能的組合。其中三種情形是恰好有一種輸入(以邏輯與非與非(nandnand)表示)，三種是有兩種輸入(以邏輯與(and)表示)，一種是存在全部三種輸入(以邏輯與與(andand)表示)。在圖12示意的一個系統中，這七種邏輯門被設計成在單個試管中使用，加入試管的任何輸入組合均藉此產生預期的結果(例如，螢光)。這些門都是在加入反應容器前各自構建的。圖12中，在把門匯集起來之前，黑色的寡核苷酸已經預先複合體化，包含實際的門。藍色和綠色的底物代表附著了不同萸光團的底物，包含兩種輸出信號，fac('易化子，)分子構成輸入。除了報告分子和感應臂均與相同的底物、fac或c寡核苷酸結合的情況，每個門的部件酶各自包含獨特的序列。在這些情形中，相同的部件酶可以用於構建兩種單獨的門，比如圖12所示與門2和3的b部件酶，與非與非門2和3的b部件酶，以及與非與非門i和與與門的b部件酶。fac1和fac2寡核苷酸作為組裝易化子，而fac3作為臂穩定劑，但是在這個方案中，所有fac寡核苷酸均用於同樣的目的，即對邏輯門進行活化/失活。'C，寡核苷酸(C1、C2、C3)與其相對應的FAC寡核普酸互補，並且已經與部件酶做了預先複合體化。當加入反應容器時，FAC通過分枝遷移過程脫下它們的互補C寡核苷酸，使含有互補C寡核苷酸的門失活。為了產生游離序列以便在此引發分枝遷移，將C寡核苷酸及其對應FAC寡核苷酸進行延伸就使這個過程可行了。就這個設計而言，加入任何一種並且只有一種FAC就會提供第一種螢光色彩(在本實施例中，如圖12所示的"藍色"螢光)，任何兩種FAC的組合會產生第二種螢光色彩(圖12的"綠色"螢光)，將所有三種FAC引入反應容器時，兩種螢光色彩都會產生(圖12的"藍色"和"綠色")。參考圖12提供了以下解釋。如果，例如沒有FAC分子的情況下，因為每個複合體具有活性所需要的組分不是都存在，所有複合體都將保持失活狀態。就沒有螢光。例如，如果輸入只有FAC1當FAC1與預複合的部件酶、C2和C3寡核苷酸以及底物結合時，FAC1活化圖12中的第一個與非與非門，產生藍色螢光。FAC1還脫去第二和第三與非與非門的Cl寡核普酸，它們任何情況都是失活的因為沒有FAC2和FAC3來形成活性的MNAzyme。,當只有FAC1時，與與和與門都沒有活性，因為它們的活化需要其他FAC分子。如果，例如FAC1和FAC2是輸入，就會發生以下情形*因為形成活性MNAzyme所需的兩種寡核苷酸都存在，圖12的第三與門就有活性，產生綠色螢光。*圖12的其他兩種與門因為還需要FAC3，所以不會被活化。,與與門沒有活性，因為所需的FAC分子中只存在兩種。FAC1和FAC2對於圖12中的第一和第二與非與非門複合體分別都是存在的。但是FAC1會脫去其在圖12中第二與非與非門的互補Cl寡核苷酸，所以沒有活性。FAC2會脫去其在圖12中第一與非與非門的互補C2寡核苷酸，所有沒有活性。第三種與非與非門沒有活性，因為它還需要FAC3(而且因為Cl和C2還會分別被FAC1和FAC2剝落掉)。*因此，所有門都沒有藍色螢光。只有相關的與門提供綠色螢光。如果，例如所有三種FAC寡核苷酸都在與門和與與門均被活化，分別產生綠色和藍色螢光。*因為"C"寡核苷酸會被其各自的FAC寡核苷酸剝落，與非與非門不會被活化。本領域技術人員會認識到，這樣的方案可以類似的方式應用於FAC寡核苷酸或寡核苷酸的任何其他組合。本領域技術人員明白，來自一個全加器的輸出可以作為另一個全加器的輸入。參考文獻專利和專利公開PCT國際發明者伊麗莎·莫卡尼,克里斯多福·羅蘭·裡德,唐納德·約翰·伯基特,崔姆·比奇·多恩,艾莉森·威爾彥·託德申請人:強生研究有限公司