C1orf59肽及包含它的疫苗的製作方法

2023-11-07 00:26:22

C1orf59肽及包含它的疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明涉及C1ORF59肽及包含它的疫苗。本發明提供了分離的具有胺基酸序列SEQ?ID?NO:43的肽或其免疫學活性片段，其結合HLA抗原且具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力。本發明進一步提供了對上述肽或片段包括1、2、或幾處胺基酸插入、替換或添加，但仍具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽。進一步提供了編碼任何這些上述肽的核酸以及包括任何上述肽或核酸的藥物製劑和藥物組合物。本發明的肽、核酸、藥物製劑和藥物組合物可用於治療癌症或腫瘤。
【專利說明】C10RF59肽及包含它的疫苗
[0001] 本申請是中國發明申請（發明名稱：C10RF59肽及包含它的疫苗；申請號： 200980157412. 3;申請日：20091217)的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本申請要求2008年12月24日提交的日本專利申請2008-327358和2009年1月 20日提交的美國臨時申請No. 61/145,912的權益，通過述及將其全部內容收入本文。
[0003] 本發明涉及生物科學領域，更具體的說是癌症治療領域。具體而言，本發明涉及新 的肽（它們作為癌症疫苗極其有效）和用於治療和預防腫瘤的藥物。

【背景技術】
[0004] 已經證明，⑶8陽性細胞毒性T淋巴細胞（CTL)可識別主要組織相容性複合物 (MHC)I類分子上的腫瘤相關抗原（TAA)所衍生的表位肽，然後殺死腫瘤細胞。從TAA的 第一個例子--黑素瘤抗原（MAGE)家族被發現起，人們主要通過免疫學手段（NPLl:B 〇〇n T, Int J Cancer1993May8, 54(2) :177-80 ；NPL2:Boon T&van der Bruggen P, J Exp Medl996Marl, 183 (3) :725-9)已經發現了許多其它TAA。這些TAA中的一些目前正在作為 免疫治療靶標接受臨床開發。
[0005] 能夠誘導強力且特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑑定 保證了針對各種類型癌症的肽疫苗接種策略的臨床應用的進一步開 發（NPL3:Harris CC，J Natl Cancer Instl9960ctl6,88(20):1442-55 ; NPL4: Butterfield LH et al. , Cancer Res1999Ju11，59 (1 3) :3 1 34-42 ; NPL5:Vissers JL et al. , Cancer Resl999Novl, 59 (21) :5554-9 ； NPL6: van der Burg SH et a 1. , J Immuno1 1996May1, 156 (9) :3308-14 ； NPL7:Tanaka F et al., Cancer Resl9970ctl5, 57 (20) :4465-8 ；NPL8:Fujie T et al.,Int J Caneer1999Jan 18, 80 (2) :169-72 ； NPL9:Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999May5,81 (3) :459-66 ；NPL10:Oiso M et al.,Int J Cancerl999May5, 81 (3) : 387-94)。迄今為止，已經有數項使用這些腫瘤相關抗原衍生的肽 進行試驗的臨床報告（NPLll:Belli F et al.，J Clin 0ncol20020ctl5, 20 (20) :4169-80 ; NPL12:Coulie PG et a1., Immunol Rev20020ct, 188: 33-42 ；NPL13:Rosenberg SA et al. , Nat Med2004S印，10 (9) : 909-15)。
[0006] 哺乳動物基因收集項目（MGC)已經通過cDNA文庫篩選鑑定了染色體1可讀 框 59(Clorf59)(NPL14:MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A.2002Dec24; 99 (26) : 16899-903)。然而，尚未證實Clorf59是否可作為靶物用於針對腫瘤患者的癌症免 疫療法。
[0007] 引用表
[0008] 專利文獻
[0009] [NPLl]Boon T, Int J Cancer1993May8, 54(2):177-80
[0010] [NPL2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Medl996Marl, 183(3):725-9
[0011] [NPL3]Harris CC，J Natl Cancer Instl9960ctl6, 88 (20):1442-55
[0012] [NPL4]Butterfield LH et al.，Cancer Resl999Jull，59(13) :3134-42
[0013] [NPL5]Vissers JL et al., Cancer Resl999Novl, 59 (21):5554-9
[0014] [NPL6]van der Burg SH et al. , J Immunol1996Mayl, 156(9):3308-14
[0015] [NPL7]Tanaka F et al. , Cancer Resl9970ctl5, 57(20):4465-8
[0016] [NPL8]Fujie T et al. , Int J Cancerl999Janl8, 80(2):169-72
[0017] [NPL9]Kikuchi M et al. , Int J Cancerl999May5, 81(3):459-66
[0018] [NPL10]0iso M et al. , Int J Cancerl999May5, 81 (3):387-94
[0019] [NPLll]Belli F et al. , J Clin 0ncol20020ctl5, 20(20):4169-80
[0020] [NPL12]Coulie PG et al. , Immunol Rev20020ct, 188:33-42
[0021] [NPL13] Rosenberg SA et al·，Nat Med2004S印，10(9) :909-15
[0022] [NPL14]MGC Program Team, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002Dec24 ； 99(26):16899-903


【發明內容】

[0023] 本發明部分地基於合適的免疫治療靶標的發現。由於TAA-般被免疫系統察 覺為"自身"並因此往往沒有免疫原性，合適的靶標的發現是極為重要的。如上所述， Clorf59(SEQ ID N0:43,其由 GenBank 登錄號 NM_144584(SEQ ID N0:42)編碼）已經被鑑 定為在癌症諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、骨肉 瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和小細胞肺癌（SCLC)的組織中上調。因此，Clorf59是免疫 療法的候選靶標。
[0024] 本發明至少部分基於Clorf59的擁有誘導對Clorf59特異性的細胞毒性T淋 巴細胞（CTL)的能力的特定表位肽的鑑定。如下文詳細討論的，使用自Clorf59衍生的 HLA-A*0201或A*2402結合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細胞（PBMC)。然後 建立了具有針對經每一種候選肽衝激的HLA-A02或A24陽性靶細胞的特異性細胞毒性的 CTL系。這些結果證明，這些肽是能誘導針對表達Clorf59的細胞的強力且特異性的免疫應 答的HLA-A02或A24限制表位肽。這些結果指明，Clorf59具有強免疫原性，而且它的表位 是腫瘤免疫療法的有效靶標。
[0025] 因此，本發明的一個目的是提供自Clorf59(SEQ ID N0:43)衍生的分離的肽或其 免疫學活性片段，其能結合HLA抗原。本發明肽預期具有CTL誘導能力。它們可用於離體 誘導CTL或可施用於受試者以誘導針對癌症諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食 道癌、NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC的免疫應答。優選地，所述肽是九肽 或十肽，且典型地，由選自 SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、17、20、26、32、34、40 和 41 的氨基 酸序列組成，顯示強的CTL誘導能力。
[0026] 本發明涵蓋經過修飾的肽，其具有 SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、17、20、26、32、 34、40和41的胺基酸序列，其中替換或添加了 1個、2個或更多個胺基酸，只要所述經修飾 肽保留原始的CTL誘導能力。
[0027] 另外，本發明提供了分離的編碼任何本發明肽的多核苷酸。這些多核苷酸可用於 誘導具有CTL誘導能力的抗原表達細胞（APC)或可施用於受試者以誘導針對癌症以及本發 明肽的免疫應答。
[0028] 當被施用於受試者時，本發明的肽被呈遞於APC的表面上，然後誘導出靶向相應 肽的CTL。因此，本發明的一個方面是提供包括任何本發明肽或多核苷酸的作用劑，其用於 誘導CTL。另外，包括任何所述肽或多核苷酸的作用劑可用於治療和/或預防癌症，諸如 膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和 SCLC，和/或防範它們的手術後復發。因此，本發明的另一個目的是提供用於治療和/或預 防癌症，和/或用於防範它們的手術後復發的藥劑，其包括任何本發明肽或多核苷酸。作為 本發明肽或多核苷酸的替換或除本發明的肽或多核苷酸之外，本發明的作用劑或藥劑可包 括呈遞任何本發明肽的APC或外來體作為活性組分。
[0029] 本發明的肽或多核苷酸可用於誘導在其表面上呈遞HLA抗原與本發明肽的複合 物的APC，例如通過使源自受試者的APC接觸本發明肽或將編碼本發明肽的多核苷酸導入 APC。此類APC具有針對靶肽的高CTL誘導能力且可用於癌症免疫療法。因此，本發明的另 一個目的是提供用於誘導具有CTL誘導能力的APC以及通過所述方法可獲得的APC的方 法。
[0030] 本發明的另一個目的是提供用於誘導CTL的方法，其包括共培養⑶8-陽性T細胞 與在其表面上呈遞本發明肽的APC或外來體的步驟或導入包括編碼能夠結合本發明肽的T 細胞受體（TCR)亞單位的多核苷酸的基因的步驟。可通過本發明方法獲得的CTL也可用於 治療和/或預防Clorf59過表達的癌症，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、 NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC。因此，本發明的另一個目的是提供可通過 本發明方法獲得的CTL。
[0031] 此外，本發明的另一個目的是提供用於誘導針對癌症的免疫應答的方法，該方法 包括施用含有Clorf59或其免疫學活性片段、編碼Clorf59或其片段的多核苷酸、或呈遞 Clorf59或其片段的外來體或APC的作用劑或組合物的步驟。
[0032] 本發明還可應用於任何涉及Clorf59過表達的疾病，包括癌症，諸如膀胱癌、乳腺 癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC。
[0033] 應當理解前面的
【發明內容】
和下面的詳細描述均為示例性的實施方案，並不對本發 明或本發明的其他可替換實施方案構成限制。
[0034] 附圖簡述
[0035] 本領域技術人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發明及其優選實施方案的 詳細說明後將清楚地得知本發明的各個方面的應用：
[0036] 圖1包括一系列照片，（a)至（j)，顯示對用Clorf59衍生的肽誘導的CTL進行的 IFN-YELISP0T 測定的結果。用 Clorf59-A02-9-261(SEQ ID N0:1)刺激的 6 號孔（a)、用 Clorf59-A02-9-152(SEQ ID N0:3)刺激的 2 號和 7 號孔（b)、用 Clorf59-A02-9-121 (SEQ ID N04)刺激的 4 號和 6 號孔（c)、用 Clorf59-A02-9-122(SEQ ID N07)刺激的 3 號孔 (d)、用 Clorf59-A02-10-240(SEQ ID N0:9)刺激的 5 號孔（e)、用 Clorf59-A02-10-90(SEQ ID N0:13)刺激的 4 號孔（f)、用 Clorf59-A02-10-188(SEQ ID N0:15)刺激的 7 號 孔（g)、用 Clorf59-A02-10-122(SEQ ID N0:17)刺激的 4 號和 8 號孔（h)、和用 Clorf59-A02-10-196(SEQ ID N0:20)刺激的2號孔（i)中的CTL分別顯示與對照相比強的 IFN-γ生成。擴增用矩形框標示的孔中的細胞以建立CTL系。相反，作為陰性數據的一種 典型情況，對用Clorf59-A02-10-261(SEQ ID N0:8)刺激的CTL沒有檢測到特異性IFN-γ 生成（j)。在圖中，〃+〃指示針對經適宜肽衝激的靶細胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對未 經任何肽衝激的靶細胞的IFN-γ生成。
[0037] 圖2包括一系列線圖，（a)至（e)，描繪用IFN-YELISA測定法得到的 用 Clorf59-A02-9-152(SEQ ID N0:3)(a)、Clorf59-A02-9-121(SEQ ID N0:4)(b)、 Clorf59-A02-10-188(SEQ ID N0:15)(c)、Clorf59-A02-10-122(SEQ ID N0:17)(d)、和 Clorf59-A02-10-196(SEQ ID N0:20) (e)刺激的CTL系的IFN-y生成。通過用所有肽刺激 而建立的CTL系均顯示與對照相比強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經適宜肽衝激 的靶細胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對未經任何肽衝激的靶細胞的IFN-γ生成。
[0038] 圖 3 描繪從經 Clorf59-A02-9-121 (SEQ ID N0:4) (a)、Clorf59-A02-10-188(SEQ ID N0:15) (b)和 Clorf59-A02-10-196(SEQ ID N0:20) (c)刺激的 CTL系通過有限稀釋建立 的CTL克隆的IFN-γ生成。這裡描繪的結果證明通過用每一種所述肽刺激而建立的CTL 克隆與對照相比顯示出強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對用適宜肽衝激過的靶細胞 的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對未用任何肽衝激過的靶細胞的IFN-γ生成。
[0039] 圖4包括一系列線圖，（&)-((：)，描繪針對外源表達(：1〇"59和!11^4*0201的靶細 胞的特異性CTL活性。製備用HLA-A*0201或用全長Clorf59基因轉染的C0S7細胞作為對 照。用 Clorf59-A02-9-152(SEQ ID N0:3)(a)、Clorf59-A02-9-121(SEQ ID N0:4)(b)和 Clorf59-A02-10-188(SEQ ID N0:15)(c)建立的 CTL 系顯示針對用 Clorf59 和 HLA-A*0201 二者轉染的C0S7細胞的特異性CTL活性（黑色菱形）。相反，沒有檢測到顯著的針對表達 HLA-A*0201 (三角形）或Clorf59 (圓形）的靶細胞的特異性CTL活性。
[0040] 圖5描繪的照片顯示對用Clorf59衍生的肽誘導的CTL進行的IFN-YELISP0T 測定的結果。用Clorf59-A24-9-221(SEQ ID N0:26)刺激的5號孔（a)、用 Clorf59-A24-9-66(SEQ ID N0:32)刺激的 3 號孔（b)、用 Clorf59-A24-9-200(SEQ ID N0:34)刺激的 4 號孔（c)、用 Clorf59-A24-10-124(SEQ ID N0:40)刺激的 5 號孔（d)和用 Clorf59-A24-10-363(SEQ ID N0:41)刺激的7號孔（e)中的CTL分別顯示與對照相比強的 IFN-γ生成。這些圖片的孔上的方框表示擴增來自相應孔的細胞以建立CTL系。在圖中， 〃+〃指示該孔中的細胞經適宜肽衝激，而〃_〃指示該細胞未經該肽衝激。
[0041] 圖6描繪的線圖顯示用ELISA測定法得到的用Clorf59-A24-9-221(SEQ ID N0:26)(a)、Clorf59-A24-9-66(SEQ ID N0:32)(b)、Clorf59-A24-9-200(SEQ ID N0:34) (c)、Clorf59-A24-10-124(SEQ ID N0:40)(d)和 Clorf59-A24-10-363(SEQ ID N0:41)(e) 刺激的CTL系的IFN-y生成。其證明通過用所有肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照相 比強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示該細胞經適宜肽衝激，而〃-〃指示該細胞未經任何 肽衝激。
[0042] 圖 7 顯示從經 Clorf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a 和 b)、 Clorf59-A24-9-66(SEQ ID N0:32)(c)、Clorf59-A24-9-200(SEQ ID N0:34)(d)、 Clorf59-A24-10-124(SEQ ID N0:40) (e)和 Clorf59-A24-10-363(SEQ ID N0:41) (f)刺激 的CTL系通過有限稀釋建立的CTL克隆的IFN- γ生成。其證明通過用這些肽建立的CTL 克隆與對照相比顯示出強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示該細胞用SEQ ID N0:26(a和 b)、SEQ ID N0:32(c)、SEQ ID N0:34(d)、SEQ ID N0:40(e)和 SEQ ID N0:41(f)衝激過，而 〃_"指示該細胞未用任何肽衝激過。
[0043] 圖8描繪線圖，顯示針對表達Clorf59和HLA-A*2402的靶細胞的特異性CTL 活性。製備只用HLA-A*2402或只用全長Clorf59基因轉染的C0S7細胞作為對照。用 Clorf59-A24-9-221(SEQ ID N0:26)建立的 CTL 克隆顯示針對用 Clorf59 和 HLA-A*2402 二 者轉染的C0S7細胞的特異性CTL活性（黑色菱形）。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表 達HLA-A*2402 (三角形）或Clorf59 (圓形）的靶細胞的特異性CTL活性。
[0044] 實施方案的描述
[0045] 現在描述優選的方法、裝置、和材料，不過在實施或檢驗本發明的實施方案時可使 用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發明材料和 方法之前，要理解本發明不限於特定大小、性狀、尺度、材料、方法、方案等，因為它們可因循 例行實驗和優化而變化。還要理解，所述描述中使用的術語只是出於描述特定樣式或實施 方案的目的，而非意圖限制本發明的範圍，本發明的範圍只會由所附權利要求來限制。
[0046] 通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或專利申請的公開文本 完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發明沒有資格憑藉發明在先而早於此 類公開文本。
[0047] 如果有衝突，以本說明書（包括定義）為準。此外，材料、方法和實例僅為舉例說 明而不構成限制。
[0048] I.定義
[0049] 如本文中使用的，詞語"一個/種"、"該"、和"所述"意味著"至少一個/種"，除非 另有明確說明。
[0050] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該 術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是經過修飾的殘基或非天然存在型殘基（諸如相 應的天然存在型胺基酸的人工化學模擬物）的胺基酸聚合物，以及天然存在型胺基酸聚合 物。
[0051] 如本文中使用的，術語"胺基酸"指天然存在型和合成型胺基酸，以及與天然存在 型胺基酸相似地發揮功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。胺基酸可以是L-胺基酸或 D-胺基酸任一。天然存在型胺基酸指由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及在細胞中在翻譯後被 修飾的胺基酸（例如羥脯氨酸、Y -羧基穀氨酸、和〇-磷酸絲氨酸）。短語"胺基酸類似物" 指與天然存在型胺基酸具有相同的基礎化學結構（α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結合） 但具有經過修飾的R基團或經過修飾的主鏈的化合物（例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸 亞碸、甲硫氨酸甲基鋶）。短語"胺基酸模擬物"指與具有與一般胺基酸不同的結構但發揮 與一般胺基酸相似的功能的化學化合物。
[0052] 胺基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委 員會推薦的單字母符號來指稱。
[0053] 術語"基因"、"多核苷酸"、"核苷酸"和"核酸"在本文中可互換使用，而且除非另 有明確說明與胺基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。
[0054] 除非另有定義，術語"癌症"指過表達Clorf59基因的癌症，它的實例包括但不限 於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、骨肉瘤、卵巢癌、胰 腺癌、前列腺癌和小細胞肺癌（SCLC)。
[0055] 除非另有定義，術語"細胞毒性T淋巴細胞"、"細胞毒性T細胞"和"CTL"在本文 中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞（例如腫瘤細胞、病毒感染 的細胞）並誘導此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。
[0056] 除非另有定義，術語"HLA-A02"指包含諸如HLA-A0201或HLA-A0206等亞型的 HLA-A2 類型。
[0057] 除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技 術人員的普遍理解相同的含義。
[0058] II.狀
[0059] 為了證明衍生自Clorf59的肽發揮被CTL所識別的抗原的功能，對衍生自 Clorf 59 (SEQ ID N0:43)的肽進行了分析以確定它們是否為HLA-A02或A24限制性 的抗原表位，HLA-A2(A*0201)是經常遇到的HLA等位基因 （Date Y et al.，Tissue Antigens47:93-101, 1996 ；Kondo A et al.,J Immunol155:4307-12, 1995 ；Kubo RT et al.，J Immunoll52:3913-24，1994)。基於它們對HLA-A02的結合親和力，鑑定了衍生自 Clorf59的HLA-A02結合肽的候選者。下述肽是候選肽：
[0060] Clorf59-A02-9-261(SEQ ID N0:1),
[0061] Clorf59-A02-9-333 (SEQ ID NO :2),
[0062] Clorf59-A02-9-152(SEQ ID NO:3),
[0063] Clorf59-A02-9-121(SEQ ID N0:4),
[0064] Clorf59-A02-9-271(SEQ ID N0:5),
[0065] Clorf59-A02-9-63(SEQ ID NO:6),
[0066] Clorf59-A02-9-122(SEQ ID NO:7),
[0067] Clorf59-A02-10-240(SEQ ID NO:9),
[0068] Clorf59-A02-10-260(SEQ ID NO:10),
[0069] Clorf59-A02-10-270(SEQ ID NO:11),
[0070] Clorf59-A02-10-346(SEQ ID NO:12),
[0071] Clorf59-A02-10-90(SEQ ID NO:13),
[0072] Clorf59-A02-10-334(SEQ ID NO:14),
[0073] Clorf59-A02-10-188(SEQ ID NO:15),
[0074] Clorf59-A02-10-121(SEQ ID NO:16),
[0075] Clorf59-A02-10-122(SEQ ID NO:17),
[0076] Clorf59-A02-10-30(SEQ ID NO:18),
[0077] Clorf59-A02-10-183(SEQ ID NO:19),
[0078] Clorf59-A02-10-196(SEQ ID NO:20),
[0079] Clorf59-A02-10-10(SEQ ID NO:21),
[0080] Clorf59-A02-10-66(SEQ ID NO:22),
[0081] Clorf59-A02-10-326(SEQ ID N0:23)，和
[0082] Clorf59-A02-10-252(SEQ ID N0:24)。
[0083] 用加載了這些肽的樹突細胞（DC)體外刺激T細胞後，使用下述每個肽，成功地建 立了 CTL :
[0084] Clorf59-A02-9-261(SEQ ID N0:1),
[0085] Clorf59-A02-9-152(SEQ ID NO:3),
[0086] Clorf59-A02-9-121(SEQ ID N0:4),
[0087] Clorf59-A02-9-122(SEQ ID NO:7),
[0088] Clorf59-A02-10-240(SEQ ID NO:9),
[0089] Clorf59-A02-10-90(SEQ ID NO:13),
[0090] Clorf59-A02-10-188(SEQ ID NO:15),
[0091] Clorf59-A02-10-122(SEQIDN0:17)jP
[0092] Clorf59-A02-10-196(SEQ ID N0:20)。
[0093] 基於它們對HLA-A24的結合親和力，鑑定了衍生自Clorf59的HLA-A24結合肽的 候選者。下述肽是候選肽：
[0094] Clorf59-A24-9-385-25(SEQ ID NO:25),
[0095] Clorf59-A24-9-221-26(SEQ ID NO:26),
[0096] Clorf59-A24-9-338-27(SEQ ID NO:27),
[0097] Clorf59-A24-9-339-28(SEQ ID NO:28),
[0098] Clorf59-A24-9-182-29(SEQ ID NO:29),
[0099] Clorf59-A24-9-35-30(SEQ ID NO:30),
[0100] Clorf59-A24-9-253-31(SEQ ID NO:31),
[0101] Clorf59-A24-9-66-32(SEQ ID NO:32),
[0102] Clorf59-A24-9-145-33(SEQ ID NO:33),
[0103] Clorf59-A24-9-200-34(SEQ ID NO:34),
[0104] Clorf59-A24-9-257-35(SEQ ID NO:35),
[0105] Clorf59-A24-9-144-36(SEQ ID NO:36),
[0106] Clorf59-A24-9-151-37(SEQ ID NO:37),
[0107] Clorf59-A24-9-338-38(SEQ ID NO:38),
[0108] Clorf59-A24-9-97-39(SEQ ID NO:39),
[0109] Clorf59-A24-9-124-40(SEQ ID N0:40)，和
[0110] Clorf59-A24-9-363-41(SEQ ID N0:41)。
[0111] 用加載了這些肽的樹突細胞（DC)體外刺激T細胞後，使用每個下述肽，成功地建 立了 CTL :
[0112] Clorf59-A24-9-221-26(SEQ ID NO:26),
[0113] Clorf59-A24-9-66-32(SEQ ID NO:32),
[0114] Clorf59-A24-9-200-34(SEQ ID NO:34),
[0115] Clorf59-A24-9-124-40(SEQ ID N0:40)，和
[0116] Clorf59-A24-9-363-41(SEQ ID N0:41)。
[0117] 這些建立的CTL針對經相應肽衝激的靶細胞顯示強且特異性的CTL活性。本文中 的這些結果證明Clorf59是被CTL識別的抗原，且這些肽是Clorf59的受HLA-A02或A24 限制的表位肽。
[0118] 由於Clorf59基因在諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、NSCLC、骨 肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC的癌細胞中過表達且在大多數正常器官中不表達， 它是良好的免疫治療靶標。因此，本發明提供對應於Clorf59的被CTL識別的表位的九肽 (由九個胺基酸殘基組成的肽）和十肽（由十個胺基酸殘基組成的肽）。本發明的九肽和 十肽的優選例子包括那些由選自SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、17、20、26、32、34、40和41 的胺基酸序列組成的肽。
[0119] -般而言，目前可以通過網際網路訪問的軟體程序，如Parker KC et al.，J Immunoll994Janl, 152(1) :163-75等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與 HLA抗原之間的結合親和力。與HLA抗原的結合親和力可以按照例如Parker KC et al.，J Immunoll994Janl, 152(1):163-75 和 Kuzushima K et al.，Blood2001, 98(6):1872-81 中 描述的那樣進行測定。用於測定結合親和力的方法在例如Journal of Immunological Methods,1995，185:181-190. ;Protein Science, 2000, 9:1838-1846 中有描述。因此，可使 用此類軟體程序來選擇與HLA抗原具有高結合親和力的自Clorf59衍生的免疫學活性片 段。因此，本發明涵蓋由使用這些已知程序鑑定的可與HLA抗原結合的Clorf59衍生的任 何免疫學活性片段組成的肽。本發明的肽可以是由全長Clorf59組成的肽。
[0120] 本發明的這些肽的側翼可以具有額外的胺基酸殘基，只要所得的肽保持其CTL誘 導能力即可。本發明肽的側翼的胺基酸序列可以由任何種類的胺基酸構成，只要它們不損 害原來的肽的CTL誘導能力。因此，本發明涵蓋包括自Clorf59衍生的肽且具有對HLA抗 原的結合親和力的肽。這樣的肽典型地少於約40個胺基酸，經常少於約20個胺基酸，通常 少於約15個胺基酸。
[0121] 一般而言，肽中一個、兩個、或更多個胺基酸的修飾不會影響肽的功能，而且在 有些情況下甚至會增強原始蛋白質的期望功能。事實上，已知有經過修飾的肽（即由與 原始參照序列相比其中修飾（即替換、刪除、添加或插入）一個、兩個或數個胺基酸殘 基的胺基酸序列構成的肽）保留原始肽的生物學活性（Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA1984, 81:5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Resl982, 10:6487-500 ； Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA1982, 79:6409-13)。因此，在一個 實施方案中，本發明的肽可既具有CTL誘導能力，又具有選自SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、 17、20、26、32、34、40和41的胺基酸序列中添加、插入和/或替換一個、兩個或甚至更多個氨 基酸而得到的胺基酸序列。
[0122] 本領域技術人員認可，改變胺基酸序列中的單個胺基酸或少數百分比氨基 酸的個別添加或替換往往會導致原始胺基酸序列的特性得以保留。因此，它們經常 稱作"保守替換"或"保守修飾"，其中對蛋白質的改變導致具有與原始蛋白質類似的 功能的修飾蛋白質。提供功能上相似的胺基酸的保守替換表是本領域公知的。期望 保留的胺基酸側鏈特徵的例子包括例如疏水性胺基酸（A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、親水性 胺基酸（R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能團或特徵的側鏈：脂肪族 側鏈（G，A，V，L，I，P);含羥基側鏈（S，T，Y);含硫原子側鏈（C，M);含羧酸和醯胺側鏈 (D，N，E，Q);含鹼側鏈（R，K，H);和含芳香族側鏈（H，F，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本 領域公認互為保守替換的胺基酸：
[0123] 1)丙氨酸（A)，甘氨酸（G);
[0124] 2)天冬氨酸（D)，穀氨酸（E);
[0125] 3)天冬醯胺（N)，穀氨醯胺（Q);
[0126] 4)精氨酸（R)，賴氨酸（K);
[0127] 5)異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)，甲硫氨酸（M)，繳氨酸（V);
[0128] 6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W);
[0129] 7)絲氨酸⑶，蘇氨酸（T);和
[0130] 8)半胱氨酸（C)，甲硫氨酸（M)(參見例如 Creighton, Proteinsl984)。
[0131] 此類保守修飾肽也被視為本發明的肽。然而，本發明的肽不限於此，可包括非保守 修飾，只要該修飾的肽保留原始肽的CTL誘導能力。另外，經過修飾的肽不應排除Clorf59 的多態變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導CTL的肽。
[0132] 為了保持所需的CTL誘導能力，可以修飾（插入、刪除、添加和/或替換）少數（例 如，1個、2個或數個）或小百分比的胺基酸。這裡，術語"數個"意指5個或更少的胺基酸， 如4個、3個或更少。要被修飾的胺基酸的百分比優選為20%以下，更優選15%以下，甚至 更優選10%以下或1-5%。
[0133] 此外，可對本發明的肽插入、替換或添加胺基酸殘基或者可刪除胺基酸殘基 以實現更高的結合親和力。當在免疫療法的語境中使用時，本發明的肽應呈遞在細 胞或外來體的表面上，優選作為與HLA抗原的複合物。除了天然被展示的肽之外，由 於已經知道通過結合HLA抗原而被展示的肽的序列規律（J Immunoll994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178 ;J Immunol 1994, 155:4307)，可將基於此類規律的修飾引入 本發明的免疫原性肽。例如，可能希望進行替換，將自N端起的第二個胺基酸替換為苯丙 氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替換，和/或將位於C端的胺基酸替換為苯丙氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸，以提高HLA-A24結合。因此，具有選自SEQ ID N0:26、 32、34、40和41的胺基酸序列，其中所述SEQ ID NO的胺基酸序列中自N端起第二個氨 基酸被替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸和肽，和/或其中所述SEQ ID N0的 胺基酸序列中位於C端的胺基酸被替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸的肽涵蓋在本發明之內。另一方面，擁有高HLA-A02結合親和力的肽中自N端起的 第二個胺基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸，且位於C端的胺基酸被替換為纈氨酸或亮氨 酸。因此，具有SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、17和20的胺基酸序列，其中自N端起第 二個胺基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中位於C端的胺基酸被替換為纈氨酸 或亮氨酸的肽涵蓋在本發明之內。不僅可以在肽的末端胺基酸處引入替換，而且可以在 潛在的T細胞受體（TCR)識別位置處引入替換。數項研究證明了具有胺基酸替換的肽 可等同於或好於原來，例如 CAP1、p53(264_272)、Her-2/neu(369_ 377)或 gplOO(2CI9_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002)Febl ； 168 (3):1338-47. , S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52:199-206 及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004)53, 307-314)〇
[0134] 本發明還考慮向所述肽的N和/或C端添加一個、兩個或數個胺基酸。此類具有 高HLA抗原結合親和力且保留CTL誘導能力的修飾肽也包含在本發明之內。
[0135] 然而，當肽序列與具有不同功能的內源或外源蛋白質的胺基酸序列的一部分相同 時，可能誘導副作用，諸如自身免疫性病症和/或針對特定物質的變應性症狀。因此，優選 的是，首先利用可得的資料庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質的胺基酸 序列匹配的情況。當根據同源性搜索清楚了即使與目標肽相比差1個或2個胺基酸的肽亦 不存在時，可以修飾目標肽以提高其與HLA抗原的結合親和力，和/或提高其CTL誘導能 力，而沒有任何發生此類副作用的危險。
[0136] 雖然預期如上所述的對HLA抗原具有高結合親和力的肽是高度有效的，但還是對 根據高結合親和力的存在為指標選出的候選肽檢查了 CTL誘導能力的存在。這裡，短語 "CTL誘導能力"指肽被呈遞到抗原呈遞細胞（APC)上時誘導CTL的能力。另外，"CTL誘導 能力"包括肽誘導CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN- γ生成的能 力。
[0137] CTL誘導能力的確認如下來實現，誘導攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細胞、 巨噬細胞、和樹突細胞（DC))，或者更具體地說，衍生自人外周血單核白細胞的DC，並且在 用肽誘導後，與CD8陽性細胞混合，然後測量由CTL針對靶細胞生成和釋放的IFN-γ。作為 反應系統，可使用已經製成的表達人HLA抗原的轉基因動物（例如BenMohamed L，Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol2000Aug, 61(8):764-79, Related Articles,Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRltransgenic mice:dependence on HLA class II restricted T(H)reSp〇nSe中描述的那些）。例如，可以用 51Cr等放射性標記靶細胞，並且可以自靶細胞 釋放的放射性計算細胞毒性活性。或者，CTL誘導能力可以如下評估：測量在攜帶固定化肽 的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- γ，並使用抗IFN- γ單克隆抗體顯現培養基上的抑 制區。
[0138] 作為如上所述檢查肽的CTL誘導能力的結果，發現選自由SEQ ID N0:l、3、4、7、9、 13、15、17、20、26、32、34、40和41所示的胺基酸序列組成的肽的九肽或十肽顯示特別高的 CTL誘導能力以及對HLA抗原的高親和力。因此，例舉這些肽為本發明優選的實施方案。
[0139] 另外，同源性分析的結果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產物衍生的肽沒 有顯著的同源性。這降低了用於免疫療法時未知的或不想要的免疫應答的可能性。因此， 也是根據這個方面，這些肽可用於在癌症患者中引發針對Clorf59的免疫力。因此，本發明 的肽，優選由選自SEQIDN0 :1、3、4、7、9、13、15、17、20、26、32、34、40和41的胺基酸序列組 成的肽。
[0140] 除上文討論的對本發明肽的修飾之外，可將所述肽進一步連接至其它物質，只要 它們保留原始肽的CTL誘導能力。例示性的物質包括：肽、脂質、糖和糖鏈、乙醯基、天然的 和合成的聚合物等。本發明肽可含有修飾，諸如糖基化、側鏈氧化、和/或磷酸化，只要該修 飾不破壞原始肽的生物學活性。這些種類的修飾可賦予額外的功能（例如靶向功能和投遞 功能）和/或使肽穩定。
[0141] 例如，為了提高多肽的體內穩定性，本領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模擬物或 非天然胺基酸；此構思也可適用於本發明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學介質（諸如人血漿和血清）來測試穩定性（參見例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokinl986, 11:291-302) 〇
[0142] 本文中，本發明的肽也可以記為"Clorf59肽"或"Clorf59多肽"。
[0143] III.Clorf59 肽的製備
[0144] 本發明的肽可使用公知技術來製備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術或 化學合成來製備。本發明的肽可個別地合成，或合成為由兩個或更多個肽構成的較長多肽。 然後可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質及 其片段或任何其它化學物質。
[0145] 可以根據選定的胺基酸序列，藉助化學合成來獲得本發明的肽。可適用於合成的 常規肽合成法的例子包括但不限於：
[0146] (i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
[0147] (ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
[0148] (iii) Peptide Synthesis (日文），Maruzen Co.，1975 ;
[0149] (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),Maruzen Co.,1985 ；
[0150] (v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；
[0151] (vi)W099/67288 ;和
[0152] (vii)Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, ^Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
[0153] 或者，可應用任何已知的遺傳工程肽生產方法來獲得本發明的肽（例如 Morrison J, J Bacteriologyl977,132:349-51 ；Clark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，製備包含處於可表達形式（例 如處於相當於啟動子序列的調節序列下遊）的編碼目標肽的多核苷酸的合適載體，並轉移 入合適宿主細胞。然後培養宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以適用體外翻譯系統在體外 生產肽。
[0154] IV.多核苷酸
[0155] 本發明還提供編碼任何上述本發明肽的多核苷酸。這些包括由天然存在型 Clorf59基因 （GenBank Accession No. NM_144584(SEQ ID N0:42))衍生的多核苷酸以及具 有它們的經過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語"經過保守修飾的核苷酸 序列"指編碼相同或本質上相同的胺基酸序列的序列。由於遺傳密碼的簡併性，對於任何給 定蛋白質都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子 編碼胺基酸丙氨酸。因此，在任何由密碼子規定為丙氨酸的位置處，該密碼子均可改變成任 何相應的密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異"，是保守修飾變異 的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領域 普通技術人員會認識到，可以修飾核酸中的每一個密碼子（AUG和TGG除外，AUG在正常情 況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子）以產生功能 上相同的分子。因而，每一種公開的序列均隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。
[0156] 本發明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構成。DNA由鹼基諸如A、T、C、和 G合適地構成，而T在RNA中被U替換。
[0157] 本發明的多核苷酸可編碼多個本發明肽，其中它們之間有或無居間胺基酸序列存 在。例如，居間胺基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點（例如酶識別序 列）。另外，多核苷酸除編碼本發明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多 核苷酸可以是包括表達肽所需要的調節序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標誌基因等 等的表達載體（質粒）。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規重組技術操作多核苷酸來 製備，例如通過使用聚合酶和內切核酸酶。
[0158] 重組和化學合成技術都可用來生成本發明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉 染入感受態細胞後能表達的適宜載體來生成多核苷酸。或者，可藉助PCR技術或通過在 合適宿主中的表達來擴增多核苷酸（參見例如Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)。或者，可使用固相 技術來合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP，Tetrahedronl992, 48:2223-311 ;Matthes et al.，EMB0 J1984, 3:801-5 中記載的。
[0159] V.夕卜來體（exosomes)
[0160] 本發明進一步提供了稱作外來體的細胞內囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞 本發明肽與HLA抗原之間形成的複合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報 平11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來製備，並可以用從治療和/或預防所針對 的患者獲得的APC製備。本發明的外來體可以作為疫苗以與本發明的肽相似的方式進行接 種。
[0161] 複合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型匹 配。例如，在日本人群中，HLA-A02 (特別是A*0201和還有A*0206)和A24 (特別是A*2402) 是普遍的且因此會適合於治療日本人患者。使用在日本人和白種人中高表達的A02或A24 型有利於獲得有效的結果。典型的，在臨床上，預先考察需要治療的患者的HLA抗原類型， 這樣就能夠合適地選擇對特定抗原具有高水平的結合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的 CTL誘導能力的肽。此外，為了獲得具有高結合親和力和CTL誘導能力二者的肽，可以在天 然存在的Clorf59部分肽的胺基酸序列的基礎上進行1個、2個或幾個胺基酸的取代、插入 和/或添加。
[0162] 當本發明的外來體使用A02型HLA抗原時，具有SEQ ID N0:l、3、4、7、9、13、15、17 和20任一的序列的肽是有用的。或者，當本發明的外來體使用A24型HLA抗原時，具有SEQ ID N0:26、32、34、40和41任一的序列的肽是有用的。
[0163] VI.抗原旱遞細朐（APC)
[0164] 本發明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發明肽之間形成的複合物的分離 的APC。APC可衍生自要進行治療和/或預防的患者，而且可作為疫苗單獨或與其它藥物 (包括本發明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。
[0165] APC不限於特定種類的細胞，包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化 的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質性質的抗原，從而被淋巴細胞識別。由 於DC是APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC，DC可以用作本發明的APC。
[0166] 例如，可通過自外周血單核細胞誘導DC，然後在體外、離體或在體內用本發明的肽 接觸（刺激）它們來獲得本發明的APC。當對受試者施用本發明的肽時，在受試者的身體中 誘導出呈遞本發明肽的APC。因此，本發明的APC可通過將本發明的肽施用於受試者後自受 試者收集APC來獲得。或者，本發明的APC可通過使自受試者收集的APC接觸本發明的肽 來獲得。
[0167] 本發明的APC可單獨地或與其它藥物（包括本發明的肽、外來體或CTL)組合地施 用於受試者以在受試者中誘導針對癌症的免疫應答。例如，離體施用可包括下述步驟：
[0168] a :自第一受試者收集APC ;
[0169] b :使肽接觸步驟a的APC ;並
[0170] c :對第二受試者施用步驟b的APC。
[0171] 第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。通過步驟b獲 得的APC可作為疫苗來施用，用於治療和/或預防癌症，包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸 直腸癌、食道癌、NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC。
[0172] 本發明還提供一種製備誘導APC的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括 將本發明的肽與藥學可接受的載體混合或配製的步驟。
[0173] 依照本發明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導能力。在術語"高水平的CTL 誘導能力"中，高水平是相對於未與肽接觸或與不能誘導CTL的肽接觸的APC的該水平而言 的。這樣的具有高水平CTL誘導能力的APC可通過上文所述方法以及下述方法來製備，該方 法包括在體外將編碼本發明肽的多核苷酸轉移至APC的步驟。所導入的基因可以是DNA或 RNA的形式。用於進行導入的方法的例子包括但不具體限於本領域中常規實施的各種方法， 諸如脂質體轉染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Resl996, 56:5672-7 ; J Immunoll998, 161:5607-13 ;J Exp Medl996, 184:465-72;國際公開文本No. 2000-509281 的已
【公開日】文翻譯中所述來實施。通過將基因轉移入APC，基因在細胞中經歷轉錄、翻譯、等 等，然後得到的蛋白質被MHC I類或II類加工，並經由呈遞途徑呈遞肽。
[0174] VII.細朐毒件T淋巴細朐（CTL)
[0175] 被誘導的針對任何本發明肽的CTL可在體內加強靶向癌細胞的免疫應答，並且因 此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發明還提供由任何本發明肽特異性誘導 或活化的、分離的CTL。
[0176] 此類CTL可通過下述步驟來獲得：（1)對受試者施用本發明的肽並從該受試者收 集CTL ; (2)在體外用本發明的肽接觸（刺激）受試者衍生的APC和CD8陽性細胞、或外周血 單個核白細胞，然後分離CTL ; (3)在體外使CD8-陽性細胞或外周血單個核白細胞接觸在其 表面上呈遞HLA抗原與本發明肽之間形成的複合物的APC或外來體，然後分離CTL ;或（4) 將包括編碼結合本發明的肽的T細胞受體（TCR)亞單位的多核苷酸的基因導入CTL。上述 APC和外來體可通過上文記載的方法來製備，而且（4)之方法詳述於下文"VIII. T細胞受體 (TCR)" 部分。
[0177] 可以從要進行治療和/或預防的患者獲取本發明的CTL，而且可以將它們單獨施 用，或者與其它藥物（包括本發明的肽或外來體）組合施用以實現調節效果的目的。所得 到的CTL特異性針對呈遞本發明的肽例如與用於誘導的肽相同的肽的靶細胞起作用。靶細 胞可以是內源表達Clorf59的細胞，諸如癌細胞，或被Clorf59基因轉染的細胞；而且因本 發明的肽的刺激而在細胞表面上呈遞該肽的細胞也可充當活化CTL攻擊的靶標。
[0178] VIII. T 細朐誇體（TCR)
[0179] 本發明還提供包含編碼能夠形成T細胞受體（TCR)的亞單位的多肽的核酸的多 核苷酸，及使用該組合物的方法。所述TCR亞單位具有形成賦予T細胞針對表達Clorf59 的腫瘤細胞的特異性的TCR的能力。通過使用本領域已知的方法，可鑑定出編碼用本發 明的肽誘導的CTL攜帶的TCR亞基的α和β鏈的核酸序列（W02007/032255及Morgan et al.，J Immunol, 171，3288(2003))。例如，優選使用PCR方法來分析編碼TCR亞單 位的核酸序列。用於分析的PCR引物可以是但不限於例如作為5'側引物的5'-R引物 (5'-gtctaccaggcattcgcttcat_3'）（SEQ ID N0:44)和作為 3' 側引物的對 TCRa 鏈 C 區特 異性的 3-TRa-C 引物（5'-tcagctggaccacagccgcagcgt_3'）（SEQ ID N0:45)、對 TCRP 鏈 C1 區特異性的 3-TRb-Cl 引物（5'-tcagaaatcctttctcttgac_3'）（SEQ ID N0:46)或對 TCRi3 鏈C2 區特異性的 3_TRbeta_C2 引物（5'-ctagcctctggaatcctttctctt_3，）（SEQ ID N0:47)。 衍生的TCR能以高親合力結合展示Clorf59肽的靶細胞，且任選在體內和在體外介導有效 率的對呈遞Clorf59肽的靶細胞的殺傷。
[0180] 可以將編碼TCR亞基的核酸摻入合適的載體，例如逆轉錄病毒載體。這些載體是 本領域公知的。可使用本領域公知的方法將核酸或含有它們的載體轉移入T細胞，例如來 自患者的T細胞。有利的是，本發明提供一種即配即用型（off-the-shelf)組合物，其容許 快速修飾患者自己的T細胞（或其他哺乳動物的T細胞）以快速且容易地生成具有卓越的 癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。
[0181] 從用本發明的肽誘導的CTL分離的核酸編碼的TCR能夠特異性識別本發明肽與 HLA分子之間形成的複合物，當T細胞的表面上攜帶該TCR，可給予該T細胞針對靶細胞的 特異性活性。此類特異性識別可通過任何已知方法來確認，而且優選的方法包括例如使用 HLA分子和本發明肽進行的四聚物分析（例如Altman et al. Science. 274, 94-96(1996); McMichael et al.J Exp Med. 187, 1367-1371(1998))和ELISPOT測定法。通過實施ELISPOT 測定法，能確認在細胞表面上表達TCR的T細胞通過TCR來識別細胞，並細胞內傳遞信號， 然後自T細胞釋放細胞因子，諸如INF-γ。T細胞針對靶細胞的細胞毒活性可使用本領域 公知的方法來檢查。一種優選的方法包括例如鉻釋放測定法，其使用表達Clorf59的HLA 陽性細胞作為靶細胞。
[0182] 此外，本發明提供通過用編碼在HLA-A02的背景下結合如SEQ ID N0:l、3、4、7、9、 13、15、17 和 20 的 Clorf59 肽及在 HLA-A24 的背景下結合 SEQ ID N0:26、32、34、40 和 41 的Clorf59肽的TCR亞單位多肽的核酸轉導而製備的CTL。經過轉導的CTL在體內能夠歸 巢（homing)到癌細胞，並且可以利用公知的體外培養方法擴增（例如Kawakami et al.，J Immunol.，142, 3452-3461 (1989))。可以利用本發明的CTL來形成免疫原性組合物，所述組 合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療或預防癌症（W02006/031221)。
[0183] IX.藥劑或藥物糹目合物
[0184] 預防和防範包括降低來自疾病的死亡率或發病率負擔的任何活動。預防和防範可 發生於"一級、二級和三級預防水平"。一級預防和防範避免疾病的發生，而二級和三級預防 和防範水平涵蓋旨在預防和防範疾病進展和症狀出現以及降低已建立的疾病的負面影響 的活動，這通過恢復功能和減輕疾病相關併發症來實現。或者，預防和防範包括廣泛的預防 療法，它們旨在減輕特定病症的嚴重性，例如降低腫瘤的增殖和轉移、降低血管發生。
[0185] 治療和/或預防癌症或腫瘤，和/或預防其手術後復發包括任何下述步驟，諸如手 術清除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌症減退和遏制癌症發生、腫瘤 消退、及降低或抑制轉移。癌症的有效治療和/或預防降低患癌個體的死亡率並改善其預 後，降低血液中腫瘤標誌物的水平，及減輕伴隨癌症的可檢測症狀。例如，構成有效治療和 /或預防的症狀減輕或改善包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩定。
[0186] 由於Clorf59表達在癌症（包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、 NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC)中與正常組織相比特異性升高，本發明 的肽或編碼此類肽的多核苷酸可用於治療和/或預防癌症或腫瘤，和/或預防它們的手術 後復發。因此，本發明提供用於治療和/或預防癌症或腫瘤，和/或預防它們的手術後復 發的藥劑或藥物組合物，其包括一種或多種本發明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性組 分。或者，可以在任何上述外來體或細胞諸如APC的表面上表達本發明的肽，以用作藥劑或 藥物組合物。另外，上述靶向任何本發明的肽的CTL也可用作本發明藥劑或藥物組合物的 活性組分。
[0187] 在另一個實施方案中，本發明還提供選自下組的活性組分在製備用於治療癌症或 腫瘤的藥物組合物或藥劑中的用途：
[0188] (a)本發明的肽，
[0189] (b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0190] (c)在其表面上呈遞本發明肽的外來體或APC，和
[0191] (d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0192] 或者，本發明進一步提供用於治療癌症或腫瘤的選自下組的活性組分：
[0193] (a)本發明的肽，
[0194] (b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0195] (c)在其表面上呈遞本發明肽的外來體或APC，和
[0196] (d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0197] 或者，本發明進一步提供一種製備用於治療癌症或腫瘤的藥物組合物或藥劑的方 法或工藝，其中該方法或工藝包括配製藥學或生理學可接受載體與作為活性組分的選自下 組的活性組分的步驟：
[0198] (a)本發明的肽，
[0199] (b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0200] (c)在其表面上呈遞本發明肽的外來體或APC，和
[0201] ⑷本發明的細胞毒性T細胞。
[0202] 在另一個實施方案中，本發明還提供一種製備用於治療癌症或腫瘤的藥物組合物 或藥劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學或生理學可接受載體的 步驟，其中所述活性組分選自下組：
[0203] (a)本發明的肽，
[0204] (b)處於可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0205] (c)在其表面上呈遞本發明肽的外來體或APC，和
[0206] (d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0207] 或者，本發明的藥物組合物或藥劑可用於防範癌症或腫瘤和/或預防其手術後復 發。
[0208] 本發明的藥劑或藥物組合物可用作疫苗。在本發明的語境中，短語"疫苗"（也稱 作"免疫原性組合物"）指具有在接種入動物後誘導抗腫瘤免疫力的功能的物質。
[0209] 本發明的藥劑或藥物組合物可用於在受試者或患者（包括人和任何其它哺乳動 物，包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩， 特別是商業上重要的動物或馴養的動物）中治療和/或預防癌症或腫瘤，和/或預防其手 術後復發。
[0210] 依照本發明，已經發現具有 SEQ ID 冊：1、3、4、7、9、13、15、17、20、26、32、34、40和 41任一的胺基酸序列的肽是HLA-A02或A24限制性表位肽或能誘導針對表達強且特異性的 免疫應答的候選者。因此，包括任何這些具有SEQ ID勵:1、3、4、7、9、13、15、17和20的氨 基酸序列的肽的本發明藥劑或藥物組合物特別適合於對其HLA抗原為HLA-A02的受試者施 用，而包括任何這些具有SEQ ID勵:26、32、34、40和41的胺基酸序列的肽的本發明藥劑或 藥物組合物特別適合於對其HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。對含有編碼任何這些肽的 多核苷酸（即本發明的多核苷酸）的藥物製劑和藥物組合物也是如此。
[0211] 要用本發明的藥劑或藥物組合物治療的癌症或腫瘤不受限制，包括其中涉及 Clorf59的所有種類的癌症或腫瘤，包括例如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、 NSCLC、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC。
[0212] 除上述活性組分之外，本發明的藥劑或藥物組合物還可含有其它具有誘導針對癌 性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞 等等。在本文中，其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽以癌症特異性抗原（例如 已鑑定的TAA)為例，但是不限於此。
[0213] 如果需要，本發明的藥劑或藥物組合物可任選包括其它治療性物質作為活性組 分，只要該物質不抑制活性組分例如任何本發明肽的抗腫瘤效果。例如，配製劑可包括抗炎 齊IJ、鎮痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質之外，本發明的藥物 還可以與一種或多種其它藥理學作用劑順序或同時施用。藥物和藥理學作用劑的量取決於 例如所使用的藥理學作用劑的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。
[0214] 應當理解，除在本文中具體提及的組分之外，參考所討論的配製劑的類型，本發明 的藥劑或藥物組合物本領域常規的其它作用劑或組合物。
[0215] 在本發明的一個實施方案中，本發明的藥劑或藥物組合物可包括在制品和試劑盒 中，該製品和試劑盒含有可用於治療要治療的疾病（例如癌症）的病理狀況的材料。製品 可包括容納任何本發明藥劑或藥物組合物的容器及標籤。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試 管。容器可以用多種材料製成，諸如玻璃或塑料。容器上的標籤應指明該藥劑用於治療或 預防一種或多種疾病狀況。標籤還可指明關於施用的指導等等。
[0216] 除上文描述的容器之外，包括本發明藥劑或藥物組合物的試劑盒還可任選進一步 包括第二容器，其中裝有藥學可接受稀釋劑。它可進一步包括從商業和用戶立場看期望的 其它材料，包括其它緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。
[0217] 如果期望的話，藥劑或藥物組合物可存在於藥包或分配器裝置中，該藥包或分配 器裝置可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如 泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
[0218] (1)含有肽作為活性組分的藥劑或藥物組合物
[0219] 本發明的肽可以作為藥劑或藥物組合物直接施用，或者如果必要，可以通過常規 配製方法來配製。在後一種情況中，除本發明的肽之外，還可以視情況包括通常用於藥物的 載體、賦形劑等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、培 養液、等等。另外，藥劑或藥物組合物視需要可含有穩定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等 等。本發明的藥劑或藥物組合物可用於抗癌目的。
[0220] 本發明的肽可製備成由兩種或更多種本發明肽構成的組合以在體內誘導CTL。肽 組合可採取雞尾酒的形式，或者可使用標準技術彼此綴合。例如，可以將各個肽化學連接或 表達成為單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發明的 肽，肽被HLA抗原以高密度呈遞在APC上，然後誘導出與所呈遞的肽與HLA抗原之間形成的 複合物特異性起反應的CTL。或者，可以給受試者施用在其細胞表面上展示任何本發明的肽 的APC (其可通過用本發明的肽刺激源自受試者的APC (例如DC)而獲得），結果在受試者體 內誘導出CTL，並且可提高針對癌細胞的攻擊性。
[0221] 包括本發明的肽作為活性組分、用於治療和/或預防癌症的藥劑或藥物組合物還 可包括已知可有效誘導細胞免疫的佐劑。或者，所述藥劑或藥物組合物可以與其它活性組 分一起施用或通過配製成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學活性的蛋白質一起（或順 序）施用時增強針對該蛋白質的免疫應答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻中記載的 那些（Clin Microbiol Revl994, 7:277-89)。合適佐劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、 霍亂毒素、沙門氏菌毒素、諸如此類，但不限於此。
[0222] 另外，可方便地使用脂質體配製劑、其中肽結合於幾微米直徑的珠子的顆粒配製 齊U、和其中脂質結合於肽的配製劑。
[0223] 在本發明的另一個實施方案中，本發明的肽也可以藥學可接受鹽的形式施用。鹽 的優選例子包括與鹼金屬成的鹽、與金屬成的鹽、與有機鹼成的鹽、與有機酸成的鹽和與無 機酸成的鹽。
[0224] 在一些實施方案中，本發明的藥劑或藥物組合物可進一步包括引發（prime)CTL 的成分。已經確認脂質是能夠在體內引發針對病毒抗原的CTL的作用劑。例如，可將棕 櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然後連接至本發明的肽。然後脂化肽可 以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質體，或在佐劑中乳化來施用。作為脂質引發CTL 應答的另一個例子，大腸桿菌（E.coli)脂蛋白，諸如三棕櫚醯基-S-甘油基半胱氨醯絲 氨醯-絲氨酸（P3CSS)，當與適宜的肽共價連接時，可用來引發CTL(參見例如Deres et al. , Naturel989, 342:561-4) 〇
[0225] 施用的方法可以是口服、皮內、皮下、靜脈內注射等等，及系統施用或局部施用至 靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發明肽的劑量 可以依據要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調整，通常是O.OOlmg 至lOOOmg，例如0· OOlmg至lOOOmg，例如0· lmg至10mg，而且可以每少數天施用一次至每少 數月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。
[0226] (2)含有多核苷酸作為活性組分的藥劑或藥物組合物
[0227] 本發明的藥劑或藥物組合物也可含有處於可表達形式的編碼本文中公開的肽 的核酸。在本文中，短語"處於可表達形式的"意味著多核苷酸在導入細胞時會在體內 表達成誘導抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的 核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調節元件。多核苷酸可具有為實現穩定插入靶細 胞的基因組所需的配置（關於同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR，Celll987,51:503-12)。參見例如 Wolff et al.，Sciencel990,247:1465-8;美國 專利 No. 5, 580, 859 ;5, 589, 466 ;5, 804, 566 ;5, 739, 118 ;5, 736, 524 ;5, 679, 647 ;及 W098/04720。基於DNA的投遞技術的例子包括"裸DNA"、易化（布比卡因、聚合物、肽介導 的）投遞、陽離子脂質複合物、和顆粒介導的（"基因槍"）或壓力介導的投遞（參見例如美 國專利 No. 5, 922, 687)。
[0228] 本發明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。 在導入宿主後，重組牛痘病毒表達免疫原性肽，並由此引起免疫應答。可用於免疫接種方案 的牛痘載體和方法記載於例如美國專利No. 4, 722, 848。另一種載體是卡介苗（BCG，Bacille Calmette Guerin)。BCG 載體記載於 Stover et al.，Naturel991, 351:456-60。有很多 種可用於治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載 體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此 類。參見例如 Shata et al.，Mol Med Today2000,6:66-71;Shedlock et al.，J Leukoc Biol2000,68:793-806 ;Hipp et al·，In Vivo2000, 14:571-85。
[0229] 將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，其中受試者直接暴露於攜帶多核苷酸的 載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉化細胞，然後將細胞移植入受 試者。這兩種辦法分別稱作體內和離體基因療法。
[0230] 關於基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993,12:488-505 ；ffu and ffu, Biotherapy1991, 3:87-95 ；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicoll993, 33:573-96 ；Mulligan,Sciencel993, 260:926-32 ； Morgan&Anderson, Ann Rev Biochem1993 , 62 : 1 9 1 - 2 1 7 ；Trends in Biotechnologyl993, 11 (5):155-215。 在 eds.Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, NY, 1993 ；及 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 中描述的重組 DNA

【技術領域】 的公知方法也可用於本發明。
[0231] 施用的方法可以是口服、皮內、皮下、靜脈內注射等等，而且可使用系統施用或局 部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。合適的 載體或經編碼本發明肽的多核苷酸轉化的細胞中的多核苷酸的劑量可以依據要治療的疾 病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當地加以調整，通常是〇. ooimg至lOOOrng，例如 0. OOlmg至lOOOmg，例如0. lmg至10mg，而且可以每數天施用一次至每數月施用一次。本領 域技術人員能恰當選擇合適的劑量。
[0232] X. #用狀、外來體、APC和CTL的方法
[0233] 本發明的肽和多核苷酸可用於誘導APC和CTL。本發明的外來體和APC也可用於 誘導CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不 抑制它們的CTL誘導能力。因此，任何前文所述的本發明藥劑或藥物組合物均可用於誘導 CTL，而且除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用於誘導APC，如下文討論解釋的。
[0234] (1)誘導抗原呈遞細胞（APC)的方法
[0235] 本發明提供了使用本發明的肽或多核苷酸來誘導具有高CTL誘導能力的APC的方 法。
[0236] 本發明的方法包括在體外、離體或在體內使APC接觸本發明肽的步驟。例如，離體 使APC接觸肽的方法可包括下述步驟：
[0237] a :自受試者收集APC ;並
[0238] b :使步驟a的APC接觸肽。
[0239] APC不限於特定種類的細胞且包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞和活化 的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質性質的抗原，從而被淋巴細胞所識別。 由於DC在APC中具有最強的CTL誘導能力，可優選使用DC。任何本發明肽均可以單獨或與 其它本發明肽組合用作步驟b的肽。
[0240] 或者，可以將本發明的肽施用於受試者以在體內使肽接觸APC。因此，能在受試者 的身體中誘導具有高CTL誘導能力的APC。因此，本發明還涵蓋將本發明的肽施用於受試者 以在體內誘導APC的方法。也有可能將編碼本發明肽的多核苷酸以可表達形式施用於受試 者，使得本發明的肽在體內表達並與APC接觸，因此在受試者的身體中誘導具有高CTL誘導 能力的APC。因此，本發明還涵蓋將本發明的多核苷酸施用於受試者以在體內誘導APC的 方法。上文"IX.藥劑（2)含有多核苷酸作為活性組分的藥劑"部分定義了短語"可表達形 式"。
[0241] 另外，本發明包括將本發明的多核苷酸導入APC以誘導具有CTL誘導能力的APC。 例如，所述方法可包括下述步驟：
[0242] a :自受試者收集APC ;並
[0243] b :導入編碼本發明肽的多核苷酸。
[0244] 步驟b可以如上文"VI.抗原呈遞細胞"部分所述來實施。
[0245] (2)誘導CTL的方法
[0246] 另外，本發明提供了使用本發明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導CTL的方 法。
[0247] 本發明還提供了使用編碼能形成T細胞受體（TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘 導CTL的方法，所述TCR亞單位識別本發明的肽與HLA抗原之間形成的複合物。優選地，所 述誘導CTL的方法包括選自下組的至少一個步驟：
[0248] a)使CD8-陽性T細胞與抗原呈遞細胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細胞和外 來體在其表面上呈遞HLA抗原與本發明的肽之間形成的複合物；和
[0249] b)向⑶8-陽性細胞中導入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述TCR 亞單位可識別本發明的肽與HLA抗原之間形成的複合物。
[0250] 當本發明的肽、多核苷酸、APC、或外來體被施用給受試者後，受試者的身體中誘導 出CTL，而且靶向癌細胞的免疫應答的強度增強。因此，本發明還涵蓋一種方法，其包括將本 發明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用於受試者以誘導CTL的步驟。
[0251] 或者，CTL也可通過它們的離體使用來誘導。在此類情況下，在誘導CTL後，將活 化的CTL返還給受試者。例如，本發明誘導CTL的方法可包括下述步驟：
[0252] a)自受試者收集APC;
[0253] b)使步驟a)的APC接觸肽；並
[0254] c)共培養步驟b)的APC與⑶8-陽性細胞。
[0255] 上文步驟c中要與⑶8-陽性細胞共培養的APC也可通過將包括本發明多核苷酸 的基因轉移入APC來製備，如上文"VI.抗原呈遞細胞"部分中詳述的；但是不限於此，而且 任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發明肽的APC均可用於本發明的方法。
[0256] 代替此類APC，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原與本發明肽之間形成的複合物 的外來體。也就是，本發明還涵蓋一種方法，其中將在其表面上呈遞HLA抗原與本發明肽之 間形成的複合物的外來體與CD8-陽性細胞共培養。此類外來體可通過上文"V.外來體"部 分中記載的方法來製備。
[0257] 另外，可通過將包括編碼TCR亞單位的多核苷酸的基因導入⑶8-陽性細胞來誘導 CTL，所述TCR亞單位能結合本發明的肽。此類轉導可以如上文"VIII. T細胞受體（TCR)" 部分所述來實施。
[0258] 另外，本發明提供了一種製備用於誘導CTL的藥劑或藥物組合物的方法或工藝， 其中所述方法包括將本發明的肽與藥學可接受的載體混合或配製的步驟。
[0259] (3)誘導免疫應答的方法
[0260] 此外，本發明提供了用於誘導針對與Clorf59有關的疾病的免疫應答的方法。合 適的疾病包括癌症，其例子包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、NSCLC、骨肉 瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和SCLC。
[0261] 所述方法包括施用含有任何本發明肽或編碼它們的多核苷酸的作用劑或組合物 的步驟。本發明方法還涵蓋施用呈遞任何本發明肽的外來體或APC。詳情參見"IX.藥劑或 藥物組合物"部分，特別是描述本發明藥物製劑和藥物組合物作為疫苗使用的部分。另外， 可用於本發明誘導免疫應答的方法的外來體和APC詳細記載於上文"V.外來體"、"VI.抗 原呈遞細胞（APC)"、和"X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法"之（1)和（2)部分。
[0262] 本發明還提供了一種製備誘導免疫應答的藥劑或藥物組合物的方法或工藝，其中 該方法包括將本發明的肽與藥學可接受的載體混合或配製的步驟。
[0263] 或者，本發明的方法可包括施用疫苗或藥物組合物的步驟,所述疫苗或藥物組合 物含有：
[0264] (a)本發明的肽；
[0265] (b)處於可表達形式的編碼本文中公開的此類肽的核酸；
[0266] (c)在其表面上呈遞本發明肽的APC或外來體；和
[0267] (d)本發明的細胞毒性T細胞。
[0268] 在本發明中，可以用這些活性組分來治療過表達Clorf59的癌症。所述癌症包括 但不限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、骨肉瘤、卵 巢癌、胰腺癌、前列腺癌、和小細胞肺癌（SCLC)。因而，在施用包含活性組分的疫苗或藥物組 合物之前，優選確認要治療的癌細胞或組織中的Clorf59表達水平與同一器官的正常細胞 相比是否提高。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種用於治療（過）表達Clorf59 的癌症的方法，該方法可包括下述步驟：
[0269] i)測定Clorf59在自具有要治療的癌症的受試者獲得的癌細胞或組織中的表達 水平；
[0270] ii)將Clorf59表達水平與正常對照比較；並
[0271] iii)將至少一種選自上文所述（a)至⑷的成分施用於具有與正常對照相比過表 達Clorf59的癌症的受試者。
[0272] 或者，本發明還提供了一種包含至少一種選自上文所述（a)至（d)的成分的疫苗 或藥物組合物，其用於施用於具有過表達Clorf59的癌症的受試者。換言之，本發明進一步 提供了一種用於鑑定要用本發明的Clorf59多肽來治療的受試者的方法，該方法可包括測 定Clorf59在受試者衍生癌細胞或組織中的表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常 對照水平相比的升高指明該受試者具有可以用本發明的Clorf59多肽來治療的癌症。
[0273] 根據本發明，測定在自受試者獲得的癌細胞或組織中Clorf59的表達水平。表達 水平可在轉錄產物（核酸）水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，Clorf59的mRNA 可通過雜交方法（例如，Northern雜交）使用探針定量。可在晶片或陣列上實施所述檢測。 對檢測Clorf59的表達水平而言,優選使用陣列。本領域技術人員可利用Clorf59的序列 信息製備上述探針。舉例而言，Clorf59的cDNA可用作探針。如果需要，可以用合適的標 記物，例如染料、螢光物質或同位素，來標記所述探針，而所述基因的表達水平可以作為發 生了雜交的標籤的強度來檢測。
[0274] 進一步，Clorf59的轉錄產物可通過基於擴增的檢測技術（例如，RT-PCR)使用引 物定量。上述引物可基於所述基因可用的序列信息製備。
[0275] 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、溫和條件或低嚴格條件下與 Clorf59的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語"嚴格（雜交）條件"是指這樣的條件，在該 條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴於序列的， 在不同的環境下會不同。較長序列的與較短序列相比在更高的溫度下觀察到雜交。一般地， 嚴格條件的溫度應選擇比特定序列在限定的離子強度和pH下的熱熔點（Tm)低大約5°C。 Tm是（在限定的離子強度、pH和核酸濃度下）平衡狀態下有50%的與其靶序列互補的探 針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被佔 據。典型地，嚴格條件是這樣的：其中鹽濃度小於大約1.0M鈉離子，典型地大約0.01-1. 0M 鈉離子（或其它鹽），PH7. 0-8. 3,溫度對於較短的探針或引物（例如10-50個核苷酸）是 至少大約30°C，用於較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩定 齊U，例如甲醯胺，來實現。
[0276] 或者，可以檢測翻譯產物以測定Clorf59表達水平。例如，可以確定Clorf59蛋白 的量。測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋 白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾（例如嵌合抗體、 scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等）均可用於檢測，只要該片段或經修飾抗體保留對Clorf59蛋白 的結合能力即可。製備這些類型的用於檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，並且 在本發明中可以使用任何方法製備這些抗體和它們的等價物。
[0277] 作為另一種基於Clorf59的基因翻譯產物檢測其表達水平的方法，可利用針對 Clorf59蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察其染色的強度。意即，在此測量中，強染色 表明所述蛋白質的存在/水平增加，且同時表明Clorf59基因的高表達水平。
[0278] 如果Clorf59基因在癌細胞中的表達水平較之靶基因的對照水平增加了例如 10 %，25 %或50 %的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過 10倍或者更多，則可認為該水平是增加的。
[0279] 對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態（癌性或非癌性）已知的 受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌症的器官的非癌性區獲得的正常細胞 可用作正常對照。或者，對照水平可以藉助統計方法，根據通過分析先前測定的來自疾病狀 態已知的受試者的樣品的Clorf59基因表達水平獲得的結果加以確定。進一步，對照水平 可以是衍生自先前測試過的細胞的表達模式資料庫。
[0280] 而且，根據本發明的一個方面，可以將源自受試者的樣品中Clorf59基因的表達 水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優選地使用從來自與源自受試者的樣品 組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優選地，使用具有已知的疾病 狀態的群體中Clorf59基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲 得。例如，平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的範圍可以用作標準值。
[0281] 在本發明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作"正常對照水 平"。另一方面，如果對照水平是從癌性生物樣品確定的，則稱作"癌對照水平"。
[0282] 當Clorf59基因的表達水平相比正常對照水平有所提高或與癌性對照水平相似/ 等同，則優選用本發明的疫苗或藥物組合物來治療受試者。
[0283] 更具體地，本發明提供了（i)診斷受試者是否具有要治療的癌症，和/或（ii)為 癌症治療選擇受試者的方法，該方法包括下述步驟：
[0284] a)測定Clorf59在自懷疑具有要治療的癌症的受試者獲得的癌細胞或組織中的 表達水平；
[0285] b)將Clorf59表達水平與正常對照水平比較；
[0286] c)如果Clorf59表達水平與正常對照水平相比升高，則將受試者診斷為具有要治 療的癌症；和
[0287] d)如果在步驟c)中將受試者診斷為具有要治療的癌症的受試者，則選擇該受試 者進行癌症治療。
[0288] 或者，此類方法包括下述步驟：
[0289] a)測定Clorf59在自懷疑具有要治療的癌症的受試者獲得的癌細胞或組織中的 表達水平；
[0290] b)將Clorf59表達水平與癌性對照水平比較；
[0291] c)如果Clorf59表達水平與癌性對照水平相似或等同，則將受試者診斷為具有要 治療的癌症；並
[0292] d)如果在步驟c)中將受試者診斷為具有要治療的癌症，則選擇該受試者進行癌 症治療。
[0293] 本發明還提供了用於確定罹患可用本發明的Clorf59多肽來治療的癌症的受試 者的試劑盒，其也可用於評估和/或監測癌症免疫療法的功效。優選地，所述癌症包括但不 限於膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、非小細胞肺癌（NSCLC)、骨肉瘤、卵巢癌、 胰腺癌、前列腺癌、和小細胞肺癌（SCLC)。更具體地，所述試劑盒優選包含至少一種在源自 受試者的癌細胞中檢測Clorf59基因表達的試劑，所述試劑可選自下組：
[0294] (a)檢測Clorf59基因的mRNA的試劑；
[0295] (b)檢測Clorf59的蛋白質的試劑；
[0296] (c)檢測Clorf59的蛋白質的生物活性的試劑。
[0297] 適於檢測Clorf59基因 mRNA的試劑包括特異性結合或識別Clorf59mRNA的核 酸，例如具有與Clorf59mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對 Clorf59mRNA為特異性的引物與探針。可基於本領域眾所周知的方法製備這類寡核苷酸。 如果需要，檢測Clorf59mRNA的試劑可固定化在固體基質上。另外，在所述試劑盒中可包括 多於一種用於檢測Clorf59mRNA的試劑。
[0298] 另一方面，適於檢測Clorf59蛋白質的試劑包括針對Clorf59蛋白質的抗體。所 述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾（例如，嵌合抗 體、scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等等）均可用作檢測試劑，只要所述片段或經修飾抗體保留與 Clorf59蛋白的結合能力。為檢測蛋白製備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在 本發明中使用任何方法製備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產生信號的分 子通過直接連接或間接標記技術進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其祀結合的 方法在本領域是眾所周知的，且本發明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可 包括多於一種用於檢測Clorf59蛋白質的試劑。
[0299] 所述試劑盒可包含多於一種前述的試劑。例如，自沒有癌症或罹患癌症的受試者 獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發明的試劑盒可進一步包括其它從商業或用戶 角度而言期望的材料，包括緩衝劑、稀釋劑、濾紙、針頭、注射器和帶有使用說明書的裝箱單 (例如，書面、磁帶、CD-ROM等等）。這些試劑之類的可保留在帶標籤的容器中。合適的容 器包括瓶、管狀瓶（vials)和試管。所述容器可從多種材料製得，例如玻璃或塑料。
[0300] 在本發明的一個實施方案中，當所述試劑是針對Clorf59mRNA的探針時，所述試 劑可固定化於固體基質（例如多孔條）上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量 或檢測區域可包含多個位置，每個都包含核酸（探針）。測試條亦可包含陰性和/或陽性對 照的位置。此外，對照位置可位於與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不 同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較高而在接下來的位置上量較低。在加入測 試樣品之後，顯示可檢測信號的位置的數量提供了在樣品中存在的Clorf59mRNA量的定量 指徵。所述檢測位置可具有任何合適可檢測的形狀，並通常是橫跨測試條寬度的條狀或點 狀。
[0301] 本發明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或Clorf59標準樣品。本發明的 所述陽性對照樣品可通過收集Clorf59陽性樣品，隨後測定其Clorf59水平來製備。或 者，可將純化的Clorf59蛋白或多核苷酸添加至不表達Clorf59的細胞以形成陽性樣品 或Clorf59標準樣品。在本發明中，純化的Clorf59可為重組蛋白。所述陽性對照樣品中 Clorf59的水平是例如高於截止值的。
[0302] 因此，本發明涉及以下項：
[0303] 1. 一種結合HLA抗原且具有細胞毒性T淋巴細胞（CTL)誘導能力的分離的肽，其 中該肽由胺基酸序列SEQ ID N0:43或其免疫學活性片段組成。
[0304] 2.項1的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A02。
[0305] 3.項1或2的分離的肽，其包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID N0:l、3、4、7、9、 13、15、17 和 20。
[0306] 4.項1-3的分離的肽，其是九肽或十肽。
[0307] 5.項4的分離的肽，其由選自SEQIDN0:1、3、4、7、9、13、15、17和20的胺基酸序 列組成，其中插入、替換、刪除或添加了 1個、2個或幾個胺基酸。
[0308] 6.項5的肽，其具有下面的兩項特徵之一或二者：
[0309] (a)自N端起的第二個胺基酸選自亮氨酸和甲硫氨酸；和
[0310] (b)C端胺基酸選自纈氨酸和亮氨酸。
[0311] 7.項1的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24。
[0312] 8.項1或7的分離的肽，其包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID N0:26、32、34、40 和41。
[0313] 9.項7或8的分離的肽，其是九肽或十肽。
[0314] 10.項9的分離的肽，其由選自SEQ ID N0:26、32、34、40和41的胺基酸序列組成， 其中插入、替換、刪除或添加了 1個、2個或幾個胺基酸。
[0315] 11.項9的肽，其具有下面的兩項特徵之一或二者：
[0316] (a)自N端起的第二個胺基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和
[0317] (b)C端胺基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。12. -種分 離的多核苷酸，其編碼項1-11中任一項的肽。
[0318] 13. -種用於誘導CTL的作用劑，其中所述作用劑包含一種或多種項1-11中任一 項的肽或者一種或多種項12的多核苷酸。
[0319] 14. 一種用於治療和/或預防癌症和/或防止其手術後復發的藥劑，其中該藥劑包 含一種或多種項1-11中任一項的肽，或一種或多種項12的多核苷酸。
[0320] 15.項14的藥劑，其配製為用於對HLA抗原為HLA-A02或A24的受試者施用。
[0321] 16.項14或15的藥劑，其配製為用於治療癌症。
[0322] 17. -種用於誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞（APC)的方法，其中該方法包 括下面的兩個步驟之一：
[0323] (a)在體外、離體或在體內使APC接觸項1-11中任一項的肽；和
[0324] (b)將編碼項1-11中任一項的肽的多核苷酸導入APC。
[0325] 18. -種用於誘導CTL的方法，其通過包括至少一個下述步驟的任何方法來進行：
[0326] (a)將⑶8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與項1-11中任一項的肽的復 合物的APC共培養；
[0327] (b)將⑶8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與項1-11中任一項的肽的復 合物的外來體共培養；和
[0328] (c)將包含編碼結合項1-11中任一項的肽的T細胞受體（TCR)亞單位多肽的多核 苷酸的基因導入T細胞。
[0329] 19. 一種分離的APC，其在其表面上呈遞HLA抗原與項1-11中任一項的肽的複合 物。
[0330] 20.項19的APC，其是通過項17的方法誘導的。
[0331] 21. -種分離的CTL，其靶向項1-11中任一項的肽。
[0332] 22.項21的CTL，其是通過項18的方法誘導的。
[0333] 23. -種在受試者中誘導針對癌症的免疫應答的方法，包括對所述受試者施用包 含項1-11中任一項的肽、其免疫學活性片段、或編碼所述肽或片段的多核苷酸的藥劑。
[0334] 提供下面的實施例來例示本發明及幫助本領域普通技術人員來製備和使用本發 明。實施例並非意圖以任何方式限制本發明的範圍。 實施例
[0335] 實施例1
[0336] 材料和方法
[0337] 細朐系
[0338] T2 (HLA-A2)即人B淋巴母細胞樣細胞系和C0S7即非洲綠猴腎細胞系購自ATCC。
[0339] 自Clorf59衍牛的狀的候詵物詵擇
[0340] 使用結合預測軟體"BIMAS" (www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.，J Immunoll994, 152 (1):163-75及Kuzushima et al.，Blood2001，98 (6) :1872-81) 預測了 Clorf59衍生的結合HLA-A*0201分子的9聚物和10聚物肽。由 Biosynthesis (Lewisville, Texas)依照標準固相合成法合成了這些肽，並通過反相高效液 相層析（HPLC)進行了純化。分別通過分析性HPLC和質譜術分析測定了肽的純度（>90% ) 和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞碸（DMS0)中溶解，並保存於-80°C。
[0341] 體外CTL誘導
[0342] 使用單核細胞衍生的樹突細胞（DC)作為抗原呈遞細胞（APC)來誘導針對人白 細胞抗原（HLA)上呈遞的肽的細胞毒性T淋巴細胞（CTL)應答。如別處所述（Nakahara 5 6七&1.，0&1?^11^82003扣115,63(14):4112-8)在體外生成0(：。具體而言，將用 Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液自正常志願者（HLA_A*0201陽性）分離的外周血單個核細 胞（PBMC)通過塑料組織培養皿（Becton Dickinson)粘附來加以分離，以將它們作為單核 細胞級分富集。將富集了單核細胞的群體在含有2%熱滅活自體血清（AS)的AM-V培養基 (Invitrogen)中、於1000U/ml粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF) (R&D System)和 1000U/ml白介素（IL)-4(R&D System)存在下培養。培養7天後，將經細胞因子誘導的DC在 AIM-V培養基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽於37°C衝激 3小時。所生成的細胞表現出在它們的細胞表面上表達DC相關分子，諸如⑶80、⑶83、⑶86 和II類HLA(數據未顯示）。然後將這些經肽衝激的DC通過X-輻照（20Gy)來滅活，並以 1:20比例與自體⑶8+T細胞混合；自體⑶8+T細胞是用⑶8陽性分離試劑盒（Dynal)通過 正選擇獲得的。在48孔板（Corning)中設立這些培養物；每個孔在0. 5ml AM-V/2% AS培 養基中含有1. 5xl04個經肽衝激的DC、3xl05個CD8+T細胞和10ng/ml IL-7 (R&D System)。 3天後，給這些培養物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細 胞用經肽衝激的自體DC進一步刺激。每次的DC均通過與上文所述相同的方式來製備。 在第21天在第三輪肽刺激後測試針對經肽衝激的T2細胞的CTL(Tanaka H et al.，Br J Cancer2001Jan5, 84(1):94-9 ；Umano Y et al. , Br J Cancer2001Apr20, 84 (8):1052-7 ； Uchida N et al.,Clin Cancer Res2004Decl5, 10(24):8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5):411-9 ;Watanabe T et al·，Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。
[0343] CTL擴增稈序
[0344] 使用 與 Riddell 等人（Walter EA et a 1 . , N Engl J Medl9950ctl9,333(16):1038-44;Riddell SR et al.，Nat Medl996Feb，2(2):216-23)記 載的方法相似的方法在培養物中擴增CTL。在40ng/ml抗⑶3單克隆抗體（Pharmingen) 存在下，將總共5xl0 4個CTL與兩種經絲裂黴素 C滅活的人B-淋巴母細胞樣細胞系 一起懸浮在25ml AM-V/5%AS培養基中。啟動培養後一天，向培養物添加120IU/ ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養物補加新鮮的含有30IU/ml IL-2的 AM-V/5 % AS 培養基（Tanaka H et al.，Br J Cancer2001Jan5, 84 (1):94-9 ;Umano Y et al. , Br J Cancer2001Apr20, 84(8):1052-7 ；Uchida N et al.,Clin Cancer Res2004Decl5, 10(24):8577-86 ；Suda T et al., Cancer Sci2006May, 97(5) :411-9 ； Watanabe T et al·，Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。
[0345] CTL克降的律立
[0346] 在96孔圓底微量滴定板（Nalge Nunc International)中進行稀釋以獲得0. 3、 1、和3個CTL/孔。在總共150 μ 1/孔含有5% AS的AIM-V培養基中將CTL與lxlO4個細 胞/孔的兩種人B-淋巴母細胞樣細胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體、和125U/ml IL-2 -起溫 育。10天後向培養基添加50 μ 1/孔IL-2,以達到終濃度125U/ml IL-2。在第14天測試 CTL活性，並使用與上文所述相同的方法來擴增CTL克隆（Uchida N et al.，Clin Cancer Res2004Decl5, 10(24):8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5):411-9 ； Watanabe T et al·, Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。
[0347] 特異件CTL活件
[0348] 為了檢查特異性CTL活性，實施幹擾素（IFN) - γ酶聯免疫斑點（ELISPOT)測定和 IFN- γ酶聯免疫吸附測定（ELISA)。具體而言，製備經肽衝激的T2 (lxlO4/孔）作為刺激 細胞。使用48孔中培養的細胞作為應答細胞。依照製造商的規程實施IFN- γ ELISP0T測 定和IFN-γ ELISA測定。
[0349] 外源表汰靶某閔和/或HLA-A02的細朐的制各
[0350] 通過PCR來擴增編碼靶基因或HLA-A02的可讀框的cDNA。將PCR擴增產物克隆 入pCAGGS載體。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)依照製造商推薦的規程將質粒轉 染入C0S7, 一種無靶基因和HLA-A02的細胞系。自轉染起2天後，用Versene(Invitrogen) 收穫經過轉染的細胞，並用作CTL活性測定的靶細胞（5xl0 4個細胞/孔）。
[0351] 結果
[0352] 癌症中增強的Clorf59表汰
[0353] 使用cDNA微陣列自多種癌症獲得的全局基因表達譜（global gene expression profile)數據揭示了 Clorf59(GenBank 登錄號 NM_144584;SEQ ID No:42)表達升高。 Clorf59表達在33例膀胱癌中的31例、70例乳腺癌中的34例、12例宮頸癌中的11例、8 例結腸直腸癌中的8例、57例食道癌中的25例、10例NSCLC中的2例、16例骨肉瘤中的8 例、1例卵巢癌中的1例、6例胰腺癌中的3例、41例前列腺癌中的20例、13例SCLC中的7 例和34例軟組織腫瘤中的25例中與相應的正常組織相比確實升高（表1)。
[0354] 表1 :觀察到Clorf59在癌性組織中與正常相應組織相比上調的病例的比例
[0355]

【權利要求】
1. 下述（a)或（b)的分離的肽： (a) 由 SEQ ID NO: 1，4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 和 41 的胺基酸序列組成的分離 的肽； (b) 由 SEQ ID NO: 1，4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 和 41 的胺基酸序列組成，其中 替換1個或2個胺基酸的分離的肽，其中該肽結合HLA-A02或HLA-A24並具有CTL誘導能 力，其中所述替換選自（i)至（iv): (i) 自N端起的第二個胺基酸替換為甲硫氨酸或亮氨酸； (ii) C端胺基酸替換為纈氨酸或亮氨酸； (iii) 自N端起的第二個胺基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和 (iv) C端胺基酸替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
2. -種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1的肽。
3. -種用於誘導CTL的作用劑（agent)，其中所述作用劑包含一種或多種權利要求1 的肽或者一種或多種權利要求2的多核苷酸。
4. 一種用於治療和/或預防癌症和/或防止其手術後復發的藥劑（agent)，其中該藥 劑包含一種或多種權利要求1的肽，或一種或多種權利要求2的多核苷酸。
5. 權利要求4的藥劑，其配製為用於對HLA抗原為HLA-A02或HLA-A24的受試者施用。
6. 權利要求4或5的藥劑，其配製為用於治療癌症。
7. -種用於誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞（APC)的體外方法，其中該方法包 括下面的兩個步驟之一： (a) 在體外使APC接觸權利要求1的肽；和 (b) 將編碼權利要求1的肽的多核苷酸導入APC。
8. -種用於誘導CTL的體外方法，其通過包括至少一個下述步驟的任何方法來進行： (a) 將⑶8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA-A02或HLA-A24與權利要求1的肽的復 合物的APC共培養； (b) 將⑶8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA-A02或HLA-A24與權利要求1的肽的復 合物的外來體共培養；和 (c) 將包含編碼結合權利要求1的肽的T細胞受體（TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基 因導入T細胞。
9. 一種分離的APC，其在其表面上呈遞HLA-A02或HLA-A24與權利要求1的肽的複合 物。
10. 權利要求9的APC，其是通過權利要求7的方法誘導的。
11. 一種分離的CTL，其革巴向權利要求1的肽。
12. 權利要求11的CTL，其是通過權利要求8的方法誘導的。
13. 權利要求1的肽或編碼所述肽的多核苷酸在製備用於誘導針對癌症的免疫應答的 藥劑中的用途。
14. 權利要求1的肽在製備用於誘導抗原呈遞細胞的藥物組合物中的用途。
15. 權利要求1的肽在製備用於誘導CTL的藥物組合物中的用途。
【文檔編號】C12N15/85GK104193816SQ201410336021
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2009年12月17日 優先權日:2008年12月24日
【發明者】角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子, 渡邊朝久 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司