改進的均勻時間分辨能量轉移測定的製作方法

2023-12-06 13:30:31 1

專利名稱：改進的均勻時間分辨能量轉移測定的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於改進的、均勻的時間分辨能量轉移的生物親和力測定，其中靈敏度通過提高信號/背景比得到了提高。該改進的方法可用於檢測單一分析物，或者同時檢測兩種或更多種分析物(多分析物檢測)。本發明還涉及可用於實施所述改進方法的設備。
背景技術：
本文中用於闡述本發明背景的出版物和其它材料，以及具體用來提供有關該實踐的附加細節的案例，被引入作為參考。
在兩個分子的能量(供體(D)發射與受體(A)吸收)互相重疊而且互相間距合適距離的條件下，這兩個分子之間發生Frster型不輻射的偶極-偶極能量轉移(Frster(1948)Ann.Physik.，6，55)。能量轉移要求分子振動有正確取向。能量轉移效率E由等式E＝1/(1+r6/R06)表示，其中r是指供體和受體之間的距離，且R0是供體-受體對和它們之間的介質的距離參數特徵。對於採用常規供體-受體對的FRET試驗而言，可用的距離尺度是-10-100。
螢光共振能量轉移(FRET)，也稱作發光共振能量轉移(LRET)，已經廣泛用於基礎研究和生物分析技術中，作為均勻測定的平臺以及作為測量生物分子中距離的光譜學標尺。Ullman首先描述了基於抗體識別反應將Frster型不輻射的能量轉移應用到均勻生物分析測定中(Ullman，Scharzberg和Rubenstein(1967)J.Biol.Chem.，2514172)，且自此人們研製了大量的合適供體-受體探針對並應用於免疫測定(有關綜述請參見I Hemmil，Applications of Fluorescence inImmunoassays，Wiley，NY，1991，第8.3.4章)。
由於能夠完全區分由有機化合物和光散射引起的na-壽命的背景螢光，所以時間分辨(TR)螢光分析法(在微秒-毫秒範圍時域內的時間分辨)是非常好的用於均勻測定的測量方案。其中用於TR-FRET測量的合適供體包括鑭系元素螯合物(穴狀化合物)和一些其它金屬配體絡合物，它們的螢光壽命可以是微秒-毫秒時間區，所以允許能量轉移在微秒-毫秒時間區內發生。這使得能夠進行FRET信號的時間分辨檢測。尤其是鑭系元素和它們的螢光絡合物在用作TR-FRET測量的供體中已經佔據了重要位置。從1978年開始，Stryer、Thomas和Meares(例如，參見Thomas等，(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.，755746)已經採用螢光鑭系元素螯合物作為能量供體，且從此以後，人們已經描述了大量的基於均勻TR-FRET的測定方法，並取得了專利，所述方法具有局限和不足(Mathis(1995)Clin.Chem.，41，1391Selvin等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91，10024)。
在生物測定中，測定靈敏度一直都是很重要的參數。對基於FRET的測定進行測量的極其有效方式是監控受體螢光而不是供體螢光。這是因為在理想情況下，受體信號僅僅對能量轉移具有特異性(受體由於能量轉移被激發)而且螢光信號由僅僅一種螢光群體(fluorescentpopulation)形成，這使得更容易進行靈敏性的檢測。受體螢光監控也有助於避免和FRET探針不完全標記相關的問題。相反，供體螢光基本上總是包含至少兩種不同的螢光群體參與能量轉移的供體和游離供體。兩種群體在相同波長處發射，這意味著在供體螢光通道中總是相對於高的背景(游離供體)來測量供體螢光信號中的變化。
在FRET測定中的受體信號監控本身具有局限性，所述局限性基於探針對的能量轉移方案以及在大多數情況下受體吸收和供體發射相互重疊的事實(有關非重疊性能量轉移，請參見美國專利No.5998146)。所以，在基於光吸收的激發方法中，受體分子直接被供體激發光激發到和外部光源強度成比例的程度。同樣由於所述光譜重疊，在某種程度上受激供體總是發射背景螢光到受體發射通道中。源自這些來源到受體發射通道的螢光信號對於能量轉移而言是非特異性的，且限制了基於受體發射的FRET測定的靈敏度。
人們已經描述了克服這些局限性的方法並得到了專利。Morrison首先描述了採用瞬時區分(長壽命供體，短壽命受體和時間分辯)來避免直接受激受體分子的影響(Morrison(1988)Anal.Biochem.，174，101；美國專利No.4822733)。他採用的是有機供體-受體對；芘供體(τ＝400ns)和藻紅素受體(τ＝4ns)。採用發射帶窄的供體可以減弱供體背景螢光在受體發射通道中的影響，這樣使得能夠對受體螢光進行更有效地濾光。例如，Selvin等已經描述了在TR-FRET測量中採用銪螯合物和鋱螯合物作為供體顯著提高了S/B比(Selvin等，(1994)J.Am.Chem.Soc.，116，6029-6030；Selvin等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91，10024-10028)。Mathis等採用總量子產額低的鑭系元素穴狀化合物作為TR-FRET測定中的供體，以減弱由游離供體導致的背景(美國專利No.5512493)。然而，仍然存在著對更靈敏FRET-測定的需求。
人們也已經描述了基於均勻FRET的多分析物檢測方法，其中由相同測定介質可以同時檢測多於一種分析物。TagMan方法(Lee等(1993)Nucl.Acids.Res.，Vol 21，16，3761-3766)採用雙標記寡核苷酸探針，其中螢光報導染料和猝滅劑兩者附著在相同寡核苷酸中，而且探針的Tag-DNA聚合酶切割導致測定中信號發生變化.在TagMan雙測定中，供體具有不同的發射波長，且供體信號通過光譜方法進行分辨。分子信標(Molecular Beacon)方法(Tyagi S.和KramerF.R.(1996)Nat.Biotech.，14，303-308，美國專利No.5925517)也採用了雙標記寡核苷酸探針，其中螢光報導染料和猝滅劑兩者附著到相同寡核苷酸中。信號變化基於探針的自身雜交。當探針沒有結合到靶上時，由於探針的自身雜交供體螢光猝滅，這導致報導染料和猝滅劑互相靠近。當結合到靶上時，自身雜交得以避免，且可以獲得供體螢光。在雙分子信標測定中，供體具有不同的發射波長，且不同的供體信號通過光譜方法進行分辨。Hemmil等已經描述了基於均勻TR-FRET的多分析物檢測，其中對不同分析物採用了獨立的供體-受體對(WO 98/15830)。他們沒有詳細描述該方法，但是要求保護的供體是鑭系元素螯合物(Eu、Tb、Sm)，且要求保護的受體是壽命短的螢光團。人們可以假定Hemmil描述的方法中信號分離是基於光譜可分辨的供體發射和/或光譜可分辨的受體發射的。
有關光信號分離方法的問題是通常合適受體螢光團的發射光譜是寬的。難以完全避免染料信號之間所謂的串擾，這意味著一種染料在第二染料波長處的發射也佔其總發射的一定百分比。在高靈敏度測定中，這種串擾降低了測定的檢測極限，並可能導致假陽性結果，尤其是在所檢測化合物之一和其它化合物相比嚴重過量的情況下。光譜串擾可以隨後進行數學校正，但是它使數據處理更加困難。上述方法沒有一種適於對所有分析物採用一個且相同的供體同時進行多分析物檢測。Hemmil描述的方法(WO98/15830)使得在多標記測定中採用一種供體和不同的受體，但是由於能量轉移的光譜依賴性，所以針對該相同供體的合適受體必須具有相當相似的光學性質。這樣導致難以在光學上避免不同受體信號的串擾。
常規的均勻TR-FRET生物親和力測定通常基於使用壽命長的鑭系元素螯合物作為供體分子以及採用有機發色團(納秒壽命)作為受體分子。這些鑭系元素螯合物的壽命通常為～100-2500μs，具體取決於螯合物結構。長的供體壽命(和游離受體的壽命相比較)使得基於能量轉移的受體信號能夠在微秒時間區內發生，且這使得能夠對基於FRET的受體信號進行時間分辨檢測。在微秒時間區內進行時間分辨檢測(在激發脈衝後將信號和一定的延遲時間結合起來)有效去除了來自樣品基質的納秒壽命背景信號的影響，因此提高了測定的信號/噪聲比(S/B比)。鑭系元素供體的其它優點在於鑭系元素的發射光譜由窄峰組成，這樣使得在受體發射測量通道中能夠對供體背景進行光譜減弱(採用濾光)。當適當選擇了測量波長時，這使得在基於受體發射的TR-FRET測定中能夠另外提高S/B比。
通過改變能量轉移速率來調整基於能量轉移的受體螢光壽命的能力，在TR-FRET測量和應用中並沒有充分利用。在採用ms壽命供體時將能量轉移信號壽命縮短到數個微秒的能力也沒有被用來提高TR-FRET測定靈敏度。例如，受體壽命調整已經得到了應用，其中已經開發了所謂的壽命和顏色都實現定製的發色團(Chen和Selvin(2000)J.Am.Chem.Soc.，122，657-660)。在這個應用中，ms壽命供體和ns壽命受體被結合到剛性模板中，且形成的具有一定能量轉移效率的能量轉移絡合物被認為是新型單一發色團，它可以進一步附著到目標分子上。但是，受體壽命調整並沒有直接用來對TR-FRET測量進行最優化處理。在一些公開的論文中，當採用毫秒壽命供體和ns壽命受體時，在受體測量通道中已經獲得了壽命非常短的螢光信號(微秒時標)，但是所述信號的短暫並沒有被特別用來提高測定靈敏度。在一些具體情況下，基於短壽命信號是直接由受激受體分子或者由檢測器人為現象形成的這個假設，在TR數據分析中拋棄了短壽命受體群體(例如，參見美國專利No.5656433，Selvin等(1994)J.Am.Chem.Soc.，116，6029-6030，Selvin等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA，91，10024-10028)。然而，由於作為時間函數的非常強的信號衰減，所以直接受激的ns壽命受體並不能在微秒時標大量發射。除了檢測器人為現象以外，高效能量轉移方法還可以產生非常強的信號，該信號的壽命為幾個微秒。採用尖端TR儀器，這種類型的現象可用來提高TR-FRET測定的靈敏度。
人們迫切需要用於單分析物檢測、但特別是用於多分析物測定的靈敏度提高的TR-FRET測定。本發明的目標是克服上述局限性。
發明概述本發明的目標是提供改進的、基於均勻時間分辨能量轉移的生物親和力測定，其中所述靈敏度通過提高信號/背景比得以提高。通過提高從供體到受體的能量轉移效率以及通過在短暫延遲後在窄時間窗口(time window)中檢測受體發射，實現了本目標。另一目標是基於所述改進的、基於均勻時間分辨能量轉移的生物親和力測定，提供同時檢測兩種或更多種分析物的方法。另一目標是提供能夠測量在短暫延遲後受體發射的改進設備。
因此，根據一個方面，本發明涉及均勻時間分辨發光能量轉移生物親和力測定，其包括用能量供體標記的第一基團和用能量受體標記的第二基團，其中供體是受激態壽命長的發光標記而受體是受激壽命短的發光標記，並且測量了從供體標記到受體標記的能量轉移變化。根據本發明，對基於能量轉移的受體發射的檢測在時間窗口中進行，所述時間窗口在1微秒或以上但小於50微秒的延遲後打開，所述延遲從供體激發開始計算，而且其中所述時間窗口的寬度為1微秒或以上但是小於100微秒。所述基於能量轉移的受體發射的衰減被基本調整到在所述時間窗口內。
根據另一方面，本發明涉及可用於進行上述均勻時間分辨發光能量轉移測定的設備，其中所述設備包括用於供體激發的光源、用於檢測基於能量轉移的受體發射的檢測器、激發濾光片、分色鏡、樣品、發射濾光片、光學透鏡、計數器和數據分析儀。根據本發明，從激發光脈衝計算，由該設備導致的背景在小於1微秒內熄滅。
根據第三方面，本發明涉及均勻的時間分辨發光能量轉移生物親和力測定，其包括用能量供體標記的第一基團和用能量受體標記的第二基團，其中所述供體是受激態壽命長的發光標記而所述受體是受激壽命短的發光標記，並且測量了從所述供體標記到所述受體標記的能量轉移變化。根據本發明，-至少兩種分析物被同時檢測，而且每種分析物通過特異性供體-受體對檢測，其中針對每一分析物的供體和/或受體可以相同或不同，和-針對不同分析物(i)的受體發射衰減時間(τi)不同，和-測量了受體發射信號的整個衰減曲線，和-用壽命等式I(t)=iiexp(-ti)]]>擬合測得的衰減曲線，其中I(t)是在時刻t的混合物強度，αi和τi是所述測量曲線中的第I種螢光群體的幅度和相應壽命，和-利用擬合的等式中的不同幅度αi對不同分析物進行定量。
附圖簡述

圖1示出了根據本發明的測定的原理，其中繪製了信號強度對時間的關係曲線。顯示了傳統TR窗口和根據本發明的窄窗口的比較。曲線解釋用菱形表示的曲線是根據本發明的調整到窄窗口內的受體發射；用矩形表示的曲線示出了傳統市售TR-FRET測定的受體發射例子，且用三角形表示的曲線是來自未結合供體的背景。
圖2A和2B描述了將本方法用於同時檢測兩種分析物，並證實消除了受體信號的光學串擾。使來自第一分析物的受體的能量轉移發射適適應於短暫延遲後打開的窄窗口(菱形)。來自第二分析物的受體的能量轉移發射的壽命(三角形)經調整後略微長於第一分析物的壽命，且在另一TR窗口中檢測，所述TR窗口在第一分析物的短壽命受體信號已經衰減後的時刻打開(圖2A)。圖2B示出了兩種受體信號的相對強度對波長的關係曲線。第一分析物發射出對第二分析物光學通道的串擾，但是所述串擾通過採用合適的TR窗口定位得以避免。另一方面，第二分析物發射出對第一分析物TR窗口的串擾(分析物-2在和分析物-1TR窗口相同的時標進行發射)，但是第二分析物的發射可以在光學上和第一分析物的發射相分離。
圖3A示出了對壽命不同(3.5μs和25μs)但在相同波長發射的兩種螢光群體的衰減曲線的模擬(矩形)。為了比較，直線是相同螢光群體在單獨測量時的相應衰減曲線。兩種螢光群體都為該總衰減曲線貢獻了自己的指數項。
圖3B舉例說明了採用本方法作為DNA測定來同時檢測兩種不同的DNA序列(突變的和非突變的)。對於兩種分析物而言，供體-受體距離不同，因而受體發射壽命不同。
圖4示出了實施根據本發明的方法的儀器裝置。
圖5示出了對於DNA測定中供體和受體之間的各種距離而言，基於能量轉移的受體發射的S/B比與時間的關係曲線。
圖6示出了對於Δ-F508稀釋物系列而言，信號與靶濃度的關係曲線。
圖7示出了對於Δ-F508和-2221ct分析物的稀釋物系列而言，單檢測和雙檢測時的信號與濃度的關係曲線。
發明詳述本發明涉及用於改善基於均勻TR-FRET的測定的檢測靈敏度的方法和設備。它進一步涉及實施均勻TR-FRET多標記測定的方法，其中從相同介質可以同時以改善的靈敏度檢測多於一種分析物。所述方法可應用於TR-FRET測定，其中供體和受體通過特異性結合到分析物上形成能量轉移絡合物，且隨後監控基於FRET的敏化的受體信號。
為了在TR測量(在本情形中是基於能量轉移的受體發射)中獲得強信號，需要在該信號明顯衰減之前，在激發脈衝後的最小化延遲後，測量基於能量轉移的發射。在TR測量中必需的(最小)延遲時間是背景螢光壽命的函數。在生物測定中正常的背景螢光(所謂的自身螢光)由有機材料產生，且通常壽命為～10ns或以下。1μs的延遲時間足以將壽命為10ns的背景衰減到原來的～1/2.7×1043，這表明在TR測量中理論上可以採用極其短的延遲。但是，由於當採用短延遲時間時市售TR儀器的性能受限，所以在常規TR-FRET測定中並沒有利用這一方面。即使儀器用戶界面允許選擇極其短的延遲時間進行測量，但通常可用的最短延遲時間是～10-100μs，最通常＞50μs。性能受限是因為採用短延遲時間，尤其是1-50μs時，儀器背景和其它和儀器相關的問題增加，這導致靈敏性TR檢測不可行，因此就不能檢測出在1-50μs時標內發生的快速事件。這是使常規TR-FRET化學最優化至信號壽命為～100-1000μs的部分原因，即使市場上的有些高級TR儀器可能適用於延遲時間極短的TR測量。
TR-FRET受體發射測量的另一方面是TR窗口寬度。由於能量轉移的光譜重疊原則，游離供體通常也以受體發射波長發射背景螢光。另外，由於在常規TR-FRET測定中使用的是長壽命供體，所以游離供體的背景信號不能通過瞬時方法進行區分。降低所得供體背景水平的合適方法是縮短TR窗口的寬度。但是，這個方面在常規TR-FRET測定中並沒有充分利用，這是由於為了能對來自測定的統計學上足量的總體信號進行積分，TR窗口必須相對較寬。
對於供體壽命長(微秒)和受體壽命短(納秒)的情況，基於FRET的受體信號的壽命是能量轉移效率的函數，E＝1-τAD/τD，(其中E是能量轉移效率，τAD是基於能量轉移的受體發射的壽命或衰減，且τD是供體發射的壽命)。這意味著常規測定中在不導致FRET信號對儀器而言太快的條件下，能量轉移效率不能太高(通常E≤％)。當FRET信號壽命為～100-1000微秒時，由於在延遲時間內能量轉移信號並沒有完全猝滅，所以在常規TR儀器測量中可以採用≥50μs的延遲時間。但是，由於受損的能量轉移效率，所以基於FRET的信號並不是儘可能的高，且為了獲得統計學上足量的總信號，需要相當長的信號積分時間(TR窗口寬度為～100-1000μs)或者數目顯著增加的激發脈衝。使用長TR窗口增加了測定中測量的游離供體背景量。另外，當能量轉移效率受損時，儘管積分時間長，但是由於能量轉移過程慢，所以無論如何都有相當大部分的受體信號在測量窗口外面發射。在常規TR-FRET測定中，所謂的TR窗口透射率(比率TR窗口內的積分信號/衰減曲線的積分信號)低。
長壽命供體(比如鑭系元素螯合物，壽命為～1-5000微秒，優選1000-5000微秒)和作為受體的短壽命螢光團使得FRET受體信號可以在微秒時間區內發生，這使得可以採用TR測量對納秒壽命背景信號和直接受激受體分子的信號進行瞬時區分。但是，受體發射通道中的供體背景螢光(由於光譜重疊)總是限制FRET測量中的靈敏度，且它不能通過瞬時方法區分。本發明的主要觀點是採用長壽命供體和高能量轉移效率，以及利用短延遲時間和窄測量窗口在縮短的(從約100-1000微秒到約1-最多100微秒)時標內進行TR-FRET測量。應該強調的是，本發明的新特徵涉及FRET染料對，其中供體壽命長(≥1μs，優選數百或數千微秒)，並採用高能量轉移速率獲得了可檢測的短壽命受體信號。如同本發明所述，採用短壽命供體(壽命小於幾個微秒)並進行基於壽命的測量，可能獲得相似或更短壽命的受體信號(例如，參見Kang等(2002)J.Fluorescence，12，1，97-103)。然而，所述發明並不涉及那種系統，而且那種系統並不提供和本發明方法相同種類的優點。在分析物特異性絡合物中的具有高能量轉移效率(E)(例如，E＞0.9)的供體-受體群體，由於能量轉移的概率增加，所以產生了提高的敏化受體信號。重要的是，基於FRET的受體信號的壽命取決於能量轉移效率，且當能量轉移效率高時，和未猝滅的供體相比，敏化受體信號的壽命顯著縮短(τ受體＝(1-E)τ供體)。這使得可以在TR-FRET測量中能夠利用時標縮短的好處。本發明的一個主要方面是通過適當提高能量轉移效率調整受體信號的衰減，以使其基本適應於縮短的TR窗口。在延遲短而且測量窗口窄的情況下，由於TR窗口的透射率更好(比率TR窗口內的積分信號/衰減曲線的積分信號)以及能量轉移概率增加，所以增強了測量到的能量轉移信號。同時，檢測到的由附近沒有受體的受激供體群體產生的長壽命供體背景螢光的量作為窗口長度縮短的函數而減弱。供體壽命越長，從一定群體的游離供體得到的(在短TR窗口中)背景越低，這是因為長螢光壽命減少了在某時間點光子發射的概率。圖1示出了根據本發明的測定的原理，其中繪製了信號強度對時間的關係曲線。示出了可用的常規TR窗口的例子和本發明的窄窗口。通過改善能量轉移以及在窄窗口中檢測受體發射，提高了檢測靈敏度。在該窄窗口中，所述提高的受體信號可以幾乎完全測量出來，同時檢測到的背景信號變弱。這樣和傳統的TR-FRET測定相比，提高了S/B比，在所述傳統的TR-FRET測定中受體發射壽命通常是100-1000微秒。
如圖1所示，基於能量轉移的受體發射的衰減已經被調整，從而基本適應於窄(即，縮短的)時間窗口。這個情形是通過根據等式τ受體＝(1-E)τ供體調整從供體到受體的能量轉移效率E來繼而適當調整受體壽命獲得的。能量轉移效率又可以根據Frster等式E＝1/(1+(r6/R06))以多種方式增加，其中r是指供體和受體之間的距離，且R0是供體-受體對和它們之間介質的距離參數特徵(R0是D-A重疊積分、供體量子產額、介質折射率以及供體和受體偶極之間的取向因子的函數)。因此，縮短供體和受體之間的距離r使能量轉移效率增加。備選地，或者另外，可以選擇供體-受體對，從而使距離參數R0增加，如上述Frster等式所定義的那樣。高的R0值也使能量轉移效率提高。其它提高能量轉移效率的方法也是公知的。例如，已經有人報導金屬表面的存在會影響能量轉移效率(Lakowicz等(2003)J.Fluorescence，Vol.13，No.1，69-77)。
優選，延遲為1-10微秒，更優選1-5微秒。時間窗口寬度優選為1-50微秒，更優選為1-25微秒。
供體優選為受激態壽命為至少100微秒的鑭系元素螯合物。WO98/15830及其中引用的參考文獻公開了特別合適的鑭系元素螯合物。
受體優選是量子產額儘可能接近一(1)、而且摩爾吸光係數高，優選超過100000的強發光分子。受體必須和供體有能量重疊，優選受體的吸收和供體的能量供給性發射重疊。受體的優選特徵是它在供體具有最小或者沒有任何發射的波長處有強烈發射。受體的壽命要使得直接受激受體的發射應該在激發脈衝後的1μs內完全衰減。在WO98/15830及其中引用的參考文獻中公開了合適受體的例子，但是在本領域還有其它許多其它公知的受體。
根據本發明的改進測定尤其適用於核酸測定，在此供體標記探針和受體標記探針可以經分析，從而在供體和受體之間形成極短的受控距離。但是，這個方法也可應用到其它生物親和力測定中，前提是可以確保供體和受體之間的能量轉移效率得到提高。
本發明在多分析物測定中的用途通過對每種分析物採用獨立的特異性供體-受體組合，和利用通過調整能量轉移效率來調整敏化受體發射壽命的能力，可以進行均勻的TR-FRET多分析物測定。本發明的新特徵是在不同受體存在著部分光學串擾的情況下，對多種分析物採用一種且相同的供體分子，以及基於信號壽命和濾光來分辨分析物特異性受體信號。本方法完全區分了受體標記的光學串擾，這在正常情況下在對多種分析物採用相同供體時是極其可能的。但是，如果可以通過光譜方法完全分辨不同的受體信號，那麼基於壽命的信號分離就不是必需的了。
例如，可以同時檢測兩種分析物，其中用供體-受體對D-A1檢測第一分析物，且用供體-受體對D-A2檢測第二分析物。對於兩種分析物，供體D可以不同，但也可以相同。第一受體A1的基於能量轉移的發射根據本發明採用短延遲和窄時間窗口檢測，而第二受體A2的基於能量轉移的發射在當A1能量轉移信號已經衰減時才打開的窗口中(其可以在針對A1信號的TR窗口關閉之前或之後)檢測。因此，可以同時採用信號壽命和濾光將不同的受體信號分開。在雙測定中，分析物-1受體信號的壽命可以通過使能量轉移效率非常高而調短(例如，壽命＜5微秒)，且檢測靈敏度也由本發明的窄時間窗口而得到提高。隨後，通過採用合適的分析物-2特異性供體-受體組合以及通過將能量轉移效率仍舊保持在高水平，將分析物-2受體信號的壽命調整成比分析物-1的壽命略長(例如，25-50微秒)。現在，如果針對分析物-1和分析物-2的受體存在著部分光學串擾，則可以通過TR測量窗口的合適定位以及濾光來分離分析物信號。圖2A和2B顯示本方法用於同時檢測兩種分析物，其中信號分離是基於螢光壽命和濾光的。分析物-1在分析物-2的發射通道發射(圖2B)，但是通過對分析物-2採用合適的TR測量窗口並在分析物-1的串擾已經衰減時測量分析物-2的發射，消除了這種串擾(圖2A)。分析物-2在分析物-1的TR測量窗口內發射(圖2A)，但所述串擾通過濾光得以消除(圖2B)。無需數學校正。螢光團的常見特徵是其發射光譜在發射最大值後有長的紅移尾巴。這種寬光譜使光學信號分離變得困難，即使螢光團的發射最大值互相相差數十納米也是如此(例如，參見圖2B)。當對許多不同受體採用相同供體時，在受體信號之間極其可能發生光學串擾。這是因為為了能夠參與和某些供體的能量轉移過程，不同的受體必須具有相當類似的性質。
在本發明的多分析物測定中，也可以基於螢光壽命分析來分離分析物信號。這通過測量受體信號的整個衰減曲線以及通過用壽命等式擬合該衰減數據而得以實現。發射壽命不同的多種受激群體的總螢光強度的時間依賴性可以用多-指數等式[1]表示---I(t)=iiexp(-ti)]]>其中，I(t)是在時刻t的混合物強度，αi和τi是第i種螢光群體在測得的曲線中的幅度和相應壽命。基本上，等式[1]意味著在被測混合物中的每一個具有不同壽命的螢光團都為混合物的衰減曲線貢獻了自己的指數項。混合物的試驗衰減數據可以根據等式[1]進行擬合，且在擬合的等式中，不同幅度αi和具有不同壽命的螢光群體的濃度成比例。採用本發明的多分析物測定，不同的分析物可以經調整以具有明顯可區分的受體發射壽命，而且可以為每種分析物預先確定壽命。該預定壽命在對分析物混合物的測量衰減數據進行擬合時進一步用作常數。這種其中擬合壽命可以預定的擬合程序，由於和擬合等式[1]中的所有參數相比，擬合參數數目下降，所以使螢光衰減曲線的擬合結果更精確。螢光壽命分析的其它優點在於不同分析物在相同波長處可以有自己的受體發射，而且基本上對所有分析物而言受體可以是相同的分子。分析物信號的不同壽命是在螢光壽命分析的情況中進行TR-FRET多分析物測定的必須要求。
如果受體具有不同的發射波長，則可以分開測量和擬合兩種分析物的衰減曲線。圖3A示出了衰減曲線的例子，其中兩種受激螢光群體以不同壽命發射。
壽命數據可以例如採用多通道定標器(scaler)設備測量，所述定標器設備具有一定數目的數據通道。所述通道可以具有一定的時間長度(例如，1微秒)。有關激發時刻和檢測器信號的信息被給予該設備。在激發時刻後，來自檢測器的信號在第一微秒之內被通道1收集。在第二微秒以內，信號由通道2收集，等等。可以繪製出所有通道收集的信號對時間的關係曲線，以得到測得信號的衰減曲線。通道的時間長度限定了衰減數據的解析度，而通道數以及通道的時間長度一起限定了測量的衰減數據的總時間長度。例如，當解析度為1μs並且有1000個通道時，衰減數據的測量是從0到1000微秒進行的。優選地，衰減信號的收集時間應該足夠長，從而使得信號完全熄滅。收集數據的終點取決於信號的壽命。優選在信號實際壽命的約5-10倍長的時間收集數據。將有關該信號的合適數據組送到處理器並用來進行曲線擬合。當數據含有誤差時，例如，由於設備噪聲，可以省略某些時間點，即某些通道。應該強調的是，還有許多和上述方法不同的其它方法適用於獲取螢光信號的衰減信息。
根據本發明的測定也可用於同時檢測大於兩種分析物的多分析物測定中。在這種情況下，前兩種分析物可以如上所述進行檢測(同樣通過對這兩種分析物採用不同的供體並採用上述方法)。第三和後續的分析物可以進一步採用相同供體、合適的受體和能量轉移速率來檢測，這樣使得能夠基於上述原理分離不同的受體信號。優選地，檢測後續分析物，從而使得接下來的分析物總是都有新供體可用。這樣更容易找到合適的、光譜可分辨的受體，且也便於對每一種其它分析物進行壽命調整。對每一種分析物而言，可以將能量轉移速率保持在非常高的水平，這提高了檢測靈敏度。
圖3B示出了雙TR-FRET DNA測定的模型系統。供體標記的DNA探針結合到兩種分析物上(單鏈DNA)，且兩種序列特異性探針對所述突變的或非突變的DNA序列進行識別。對兩種分析物而言，供體-受體距離略微不同，因而敏化的受體發射壽命略微不同。如本發明所述，通過同時採用濾光和壽命，可以沒有串擾地測量受體信號。
實施根據本發明的方法的設備圖4示出了用於實施根據本發明的均勻時間分辨發光能量轉移測定的儀器裝置。該設備包括用於供體激發的可調節光源1、激發濾光片2、用於折射激發光和發射光的透鏡3、6和8、分色鏡4、樣品架5、發射濾光片7、用於檢測基於能量轉移的受體發射的檢測器9和用於處理檢測器信號的計數器10。短脈衝光通過激發濾光片2、透鏡3和分色鏡4照射到樣品5上。樣品中的供體吸收光能並受激。附近具有受體的供體參與能量轉移，所述基於能量轉移的受體發射透過分色鏡4、透鏡6和8以及發射濾光片7透射到達檢測器9。對於測量信號適當選擇激發濾光片2、分色鏡4和發射濾光片7。計數器10進一步用來在所選TR窗口中測量每種受體的TR信號和/或測量發射的衰減曲線。重要的是該設備產生的背景要短於1微秒。因此，為了充分利用本發明方法的優點，需要特定的TR儀器。主要要求是計數窗口在激發脈衝後的合適時標(例如，在微秒等級)打開並具有高解析度，從而使得檢測的短壽命受體信號可以具有最低水平的儀器噪聲，所述噪聲由光源、光學系統和TR檢測器系統產生。這意味著該儀器至少配有脈衝寬度短的光源(從激發時刻開始，在1微秒後激發脈衝完全熄滅)和高質量的光學系統(非螢光的)以縮短儀器噪聲壽命。另外，應該保護檢測器系統免於遭受激發脈衝，從而克服(例如，採用遮光器、偏振器、選通器或一些其它方法)瞬時螢光脈衝(例如，直接激發光、光學系統的螢光、自身螢光和其它來源)在激發時刻衝擊檢測器，而不出現檢測器噪聲的增長。TR檢測器還應該能夠在窄計數窗口中測量高速光子流而不使其達到飽和。
可用於激發供體的光源的例子是雷射器，比如氮雷射器，和傳統上使用的氙燈相比，它在約10納秒後熄滅，而後者完全消失需要約10-40微秒，具體取決於燈類型。
下面通過非限制性實施例闡述本發明。
實施例實施例1在針對ΔF508突變DNA靶的均勻FRET測定中調整基於能量轉移的受體螢光壽命。
採用四種不同的供體-和受體-探針組合對ΔF508突變DNA進行了均勻測定(表1)。這些探針組合允許對相同測定進行四種不同的修改，其中所述基於能量轉移的受體信號的壽命通過採用不同的供體-受體距離(D-A距離6、8、10或12鹼基對(bp)單鏈DNA)來調整。
表1
ΔF508突變靶DNA和特異性探針序列採用標準亞磷醯胺化學(Expedite 8909DNA-合成儀，PerSeptive Biosystems)合成，並採用聚丙烯醯胺凝膠電泳進一步純化(有關凝膠電泳詳細內容請參見Sambrook和Russel，Molecular cloninga laboratory manual，3rdedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)。所述供體探針對於靶DNA的ΔF508突變而言具有特異性。供體，W8044-Eu螯合物(PerkinElmer Life and Analytical sciences，WallacOy，芬蘭)，採用改性的寡核苷酸嵌段附著到探針序列上(Hovinen等(2001)，Org.Letters，Vol.3，No.16，2473-2476)。受體探針對靠近ΔF508突變位點的序列具有特異性。能量受體，AlexaFluor647(Molecular Probes Inc.，德國)通過氨基改性的寡核苷酸嵌段附著到探針序列上，作為琥珀醯亞胺基酯(Hovinen等(2001)，Org.Letters，Vol.3，No.16，2473-2476)。在標記後，採用聚丙烯醯胺凝膠電泳對寡核苷酸進行純化。
在雜交測定中，將5nM ΔF508DNA-靶(或者空白樣品中0nMΔF508 DNA-鏈)在處於200μl反應緩衝液(15mM TRIS，2.5mMMgCl2、50mM KCl、0.1％ TRITON X-100)中的含有10nM供體探針和10nM受體探針的檢測混合物中溫育(2小時，室溫(RT))。所有四種測定組合(不同的D-A距離)在獨立的反應管中溫育。在溫育後，從每種測定中移取4份陽性重複樣品和12份空白樣品到微孔板(25μl/孔，1508-0010 PerkinElmer Life and Analyticalsciences，Wallac Oy，芬蘭)。在實驗室級的TR-螢光計上，採用氮雷射器(Oriel，美國，＜10ns脈衝，45Hz)、光電倍增管(Hamamatsu，日本)和解析度為0.1μs的Turbo MCS多通道定標器(EGG)，進行了時間分辨測量。通過665nm發射濾光片(Omega Optical)收集基於能量轉移的發射(AlexaFluor 647)；每孔積分1000個激發脈衝。採用Origin 6.0(Microcal Software，Inc.)擬合壽命數據，並採用Microsoft Excel(Microsoft Corporation)由MCS數據計算選通信號。
結果和討論表2示出了擬合的受體螢光壽命和理論計算的受體螢光壽命。得到的基於能量轉移的受體螢光壽命取決於D-A距離，所述距離是根據Frster能量轉移理論的預期結果。但是，在本試驗中，距離依賴性並不單純遵循Frster等式。W8044-Eu-AlexaFluor 647供體-受體對的R0距離經確定是59.8，且假定一個鹼基對將DNA鏈的長度平均提高3.4，則可以利用等式[2]和[3]計算理論受體信號壽命。
E＝1/(1+r6/R06)[2]E＝1-τAD/τD[3]其中，r表示供體和受體之間的距離，R0是臨界能量轉移距離，τAD是基於能量轉移的受體信號的壽命，且τD是未猝滅供體的壽命(對於本試驗的W8044-Eu而言，為1270μs)。由於忽略了連接臂(在氨基改性嵌段中)和能量轉移對取向可能導致的作用，所以理論計算值含有一定的誤差。DNA鏈的螺旋幾何形狀對實際D-A距離也有作用。在理論計算時並沒有考慮這些作用，所以應該將該理論結果僅僅當作具有一定誤差的理論信號行為的簡化例子來考慮。
試驗結果清楚表明通過調整D-A距離可以定製基於能量轉移的受體螢光的壽命，而且能夠獲得高於90％的極高能量轉移效率(在本具體情況下，每種測定模型中E＞99％)。受體信號壽命的所得值以及理論值之間的差異很可能是由於供體和受體之間的單鏈DNA鏈的柔性所引起的，所述柔性導致難以估計測定模型中的真實D-A距離變化。
表2.基於能量轉移的受體螢光的所得壽命和理論計算壽命。E採用等式[3]和所得的受體壽命(τD＝1270μs)計算。
圖5示出了信號背景比對TR延遲時間的關係曲線，該圖證實了短時標TR測量的理論依據。在激發脈衝後極短時間的延遲(在這種情況是1-2μs)就足以區分測定的ns-壽命背景(ns-背景＝直接受激受體、有機樣品材料，光散射等)，且S/B-曲線在激發脈衝後很快達到其最大值。在圖5中，不同測定之間的性能差異部分是由於TR窗口的選擇。對測定而言，最優的TR延遲時間和TR窗口長度(針對最優S/B比)取決於分析物信號的壽命，但是在這種情況下，TR窗口長度並沒有對不同測定模型分別進行最優化。對每一測定都採用了7.5μs的窗口長度，且圖5的目的是證實縮短的時標對TR-FRET測量而言是否合適。測量參數和測定可以進一步最優化。
實施例2通過使用不同的光譜重疊因子調整基於能量轉移的受體螢光的壽命在基於DNA雙鏈的FRET模型系統中，證實了通過改變光譜重疊因子改變能量轉移效率和基於所述能量轉移的受體螢光的壽命的能力，其如表3所示。在模型系統中，W8044-Eu供體標記的DNA鏈和受體標記的DNA鏈雜交。合成了受體鏈的5個不同版本，它們含有相同的DNA序列但含有不同的螢光受體染料。在雜交後，D-A距離在每個樣品中都相同，但是由於受體染料的不同吸收性質，對每個樣品而言與供體的光譜重疊因子不同以及由此R0不同。
DNA序列採用標準亞磷醯胺化學(Expedite 8909 DNA-合成儀，PerSeptive Biosystems)合成，並採用聚丙烯醯胺凝膠電泳進一步純化(有關凝膠電泳詳細內容請參見Sambrook和Russel，Molecular cloninga laboratory manual，3rdedition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，2001)。供體，W8044-Eu螯合物(PerkinElmer Life and Analytical sciences，Wallac Oy，芬蘭)，採用改性的寡核苷酸嵌段附著到DNA序列上(Hovinen等(2001)，Org.Letters，Vol.3，No.16，2473-2476)。能量受體來自Alexa染料系列AlexaFluor647、660、680、700和750(Molecular ProbesInc.，德國)。受體染料通過氨基改性的寡核苷酸嵌段附著到DNA序列上，作為琥珀醯亞胺基酯(Hovinen等(2001)，Org.Letters，Vol.3，No.16，2473-2476)。在標記後，採用聚丙烯醯胺凝膠電泳對寡核苷酸進行純化。
針對每種測量製備三個不同樣品。能量轉移樣品10nM Eu-鏈和50nM受體-鏈；非能量轉移樣品10nM Eu-鏈和50nM受體-鏈；Eu-對照10nM Eu-鏈。基於從能量轉移樣品獲得的壽命(τAD)以及從非能量轉移樣品獲得的壽命(τD)，計算了能量轉移效率。測量Eu-對照以確認互補鏈與Eu鏈的雜交不顯著影響供體壽命。
所有樣品都在500μl反應緩衝液(15mM TRIS，2.5mM MgCl2、50mM KCl、0.1％TRITON X-100)中溫育(2小時，室溫)。在溫育後，移取每種樣品的4份陽性重複樣品到微孔板(20μl/孔，1508-0010 PerkinElmer Life and Analytical sciences，Wallac Oy，芬蘭)。在實施例1所述的實驗室級TR-螢光計上進行時間分辨測量。通過665nm發射濾光片(Alexa Fluor 647)、730nm發射濾光片(AlexaFluor 660、680、700)或者780nm發射濾光片(Alexa Fluor 750)以1μs的MCS-解析度收集基於能量轉移的發射。所有發射濾光片均來自Omega Optical公司。每孔積分1000個激發脈衝，並採用Origin 6.0(Microcal Software，Inc.)對壽命數據進行擬合。
表4示出了光譜重疊對基於能量轉移的螢光的壽命的作用。可以發現，即使物理D-A距離保持相同，通過改變受體染料的光譜性質(吸收)，也可以調整受體壽命。
表3
表4
實施例3對ΔF508突變DNA靶的最優化檢測靈敏度基於實施例1的結果，在ΔF508突變DNA測定中，選擇D-A距離8bp作為縮短時標TR測量的最合適距離。另外，交換供體和受體探針，從而使得Alexa 647標記的探針(受體探針)現在對ΔF508突變位點具有特異性，而W8044-Eu標記的探針(供體探針)結合鄰近該受體探針的8個鹼基對。探針序列如表5所示。
表5
探針採用實施例1所述方法合成和標記。同樣，現在對雜交條件(NaCl-濃度、溫度和探針多餘量)和TR測量窗口(延遲和窗口長度)進行最優化，以獲得針對均勻TR-FRETΔF508突變DNA測定的最佳靈敏度。
在雜交緩衝液(15mM TRIS、100nM NaCl、2.5mM MgCl2、50mMKCl、0.1％TRITON X-100)中，製備ΔF508突變靶的稀釋物系列(3nM、1nM、0.3nM、...、0.001nM)。該稀釋物系列的每個樣品都在處於雜交緩衝液中的、含有10nM Alexa 647探針和10nM W8044-Eu探針的150μl檢測混合物中溫育(2.5小時，室溫)。這些雜交條件已經預先在各自的測量中進行了最優化。在溫育後，從每種測定中移取4份陽性重複樣品和12份空白樣品到微孔板(25μl/孔，1508-0010 PerkinElmer Life and Analytical sciences，Wallac Oy，芬蘭)。在實施例1所述的實驗室級的TR-螢光計上進行時間分辨測量。通過665nm發射濾光片(Omega Optical)收集基於能量轉移的發射(AlexaFluor 647)。積分1000個激發脈衝，解析度為0.1μs MCS-解析度，並採用2μs的TR延遲和10μs的TR窗口長度由MCS數據計算了TR測量結果。
該稀釋物系列的測量曲線如圖6所示。測定的檢測極限是7pM的ΔF508突變靶(檢測極限＝avg(空白)+3*stdev(空白))，且該測定一直到最高3nM靶濃度時保持線性範圍。為了比較，相同靶在不均勻DELFIA測定中的檢測極限是2pM。可以得出結論本發明的改進均勻FRET方法的性能和DELFIA性能非常相似。
實施例4均勻TR-FRET雙測定理論的證據在本試驗中，通過對相同測定介質的ΔF508突變DNA和-2221ct突變DNA靶進行同時檢測，證實了基於TR-FRET的雙測定的原理。TR-FRET雙測定的序列方案如表6所示。ΔF508靶和ΔF508特異性供體-和受體探針與實施例3中所用的相同。採用實施例1所述的方法合成並標記了-2221ct靶特異性W8044-Eu供體探針和AlexaFluor 700受體-探針。-2221ct靶在雜交之前，首先從純化的基因組DNA樣品中擴增(不對稱PCR)，然後用MinElute PCR純化試劑盒(50)(Qiagen)進一步純化。兩種Alexa染料的光譜和其發射之間的光學串擾如圖2B所示(AlexaFluor 647(菱形)、AlexaFluor 700(三角形))。
表6
在試驗中，ΔF508和-2221ct稀釋物系列首先在單測定中測量，然後將該單測定結果和雙測定結果比較。靶DNA的稀釋物系列在雜交緩衝液(15mM TRIS、100mM NaCl、2.5mM MgCl2、50mM KCl、0.1％TRITON X-100)中製備。在單測定中，將稀釋物系列的每個樣品在含有10nM靶特異性受體探針和10nM靶特異性供體探針的200μl檢測混合物中溫育(3小時，室溫)。在雙測定中，將ΔF508和-2221ct樣品同時在含有針對兩種分析物的10nM特異性供體和受體的200μl檢測混合物中溫育(3小時，室溫)。在雙反應管中的相應稀釋物如表7所示。在每個試驗中，在將-2221ct樣品加到檢測混合物中之前，對所述-2221ct靶稀釋物進行了變性(4分鐘+94℃，2分鐘+4℃)。使用合成的靶ΔF508時沒有進行預處理。在溫育後，從每種測定中移取4份陽性重複樣品和8份空白樣品到微孔板(25μl/孔，1508-0010 PerkinElmer Life and Analytical sciences，WallacOy，芬蘭)。在實施例1所述的實驗室級的TR-螢光計上進行時間分辨測量。對每個樣品採用0.1μs的MCS解析度積分了1000個激發脈衝。通過665nm發射濾光片(Omega Optical)測量ΔF508分析物信號，並採用2μs的TR延遲和10μs的TR窗口長度分析數據。通過730nm發射濾光片(Omega Optical)測量-2221ct分析物信號，並採用25μs的TR延遲和30μs的TR窗口長度分析數據。
表7.雙測定中相同孔內的相應靶濃度
測量的測定曲線和雙測定與單測定的比較如圖7所示。對於ΔF508和-2221ct分析物兩者而言，雙測定結果和單測定結果相同，這顯然可以作為TR-FRET雙測定方法的理論的證據。採用本發明所述方法消除了受體的部分光學串擾。對於兩種分析物而言，在最低濃度處雙曲線和單曲線之間的很小差異可以通過測定結構進行解釋。在單測定情況下，只有一種類型的供體探針存在於檢測混合物中，而且在本試驗中單測定中的總Eu探針濃度是10nM。但是，本試驗的雙測定要求對兩種分析物採用單獨的供體探針，而且雙測定中的總Eu探針濃度是20nM。由於光譜重疊，部分Eu發射總是通過受體發射濾光片收集，且Eu濃度差異導致測量的Eu背景在雙測定中加倍。在實際測定計數值極低的檢測板限附近，可以發現這種信號增加。
應該理解，本發明的方法可以以各種實施方案的形式結合，在此僅僅公開了其一部分。對本領域技術人員而言，顯然存在著其它實施方案而且這些實施方案沒有偏離本發明的精神。因此，所述實施方案是示例性的，不應理解成是對本發明的限制。
權利要求
1.均勻時間分辨發光能量轉移生物親和力測定，其包括用能量供體標記的第一基團和用能量受體標記的第二基團，其中供體是受激態壽命長的發光標記而受體是受激壽命短的發光標記，並且測量了從供體標記到受體標記的能量轉移變化，其特徵在於-所述基於能量轉移的受體發射的檢測在時間窗口中進行，所述時間窗口在1微秒或以上但小於50微秒的延遲後打開，所述延遲從供體激發計算，而且其中所述時間窗口的寬度為1微秒或以上但是小於100微秒，和-所述基於能量轉移的受體發射的衰減被基本調整到在所述時間窗口內。
2.權利要求1的測定，其特徵在於所述延遲是1-10微秒，且所述寬度為1-50微秒。
3.權利要求1或2的測定，其特徵在於所述供體是受激態壽命為至少100微秒的鑭系元素螯合物。
4.權利要求1-3任一的測定，其特徵在於所述基於能量轉移的發射的衰減通過提高從所述供體到受體的能量轉移效率而被調整到所述窗口內。
5.權利要求4的測定，其特徵在於如Frster等式所定義的供體和受體之間的距離r縮短。
6.權利要求4或5的測定，其特徵在於所述供體-受體對經選擇從而使得如Frster等式所定義的距離參數R0增加。
7.上述權利要求任一的測定，其特徵在於同時檢測至少兩種分析物，其中每種分析物由特異性的供體-受體對檢測。
8.權利要求7的測定，其特徵在於同時檢測至少兩種分析物，其中供體-受體對D-A1用於檢測第一分析物，供體-受體對D-A2用於檢測第二分析物，其中所述供體D對於所述供體-受體對而言相同或不同，而且所述第一受體A1的基於能量轉移的發射在權利要求1或2限定的窗口中檢測，所述第二受體A2的基於能量轉移的發射在和第一受體A1在其中檢測的窗口相同或不同的窗口中檢測。
9.權利要求8的測定，其特徵在於同時檢測多於兩種分析物，其中所述最先兩種分析物根據權利要求8進行檢測，而第三和後續分析物通過其中所述供體和用於檢測所述最先兩種分析物的供體相同或不同的供體-受體對進行檢測。
10.用於進行權利要求1-9任一的均勻時間分辨發光能量轉移測定的設備，其中所述設備包括用於供體激發的光源、用於檢測基於能量轉移的受體發射的檢測器、激發濾光片、分色鏡、樣品架、發射濾光片、光學透鏡、計數器和數據分析儀，其特徵在於，從激發光脈衝計算，由所述設備導致的背景在小於1微秒內熄滅。
11.權利要求12的設備，其特徵在於所述用於供體激發的光源能夠給出短於1微秒的光脈衝，所述檢測器被保護免受所述激發脈衝以及由所述激發脈衝導致的來自所述樣品的瞬時螢光脈衝，而且所述光學系統在從所述供體激發開始的1微秒後基本不產生背景。
全文摘要
本發明涉及用於改進基於均勻TR－FRET的生物親和力測定中的檢測靈敏度的方法。所述靈敏度改善是由於採用壽命長的供體以及高的能量轉移效率，和由於在時間窗口中對基於能量轉移的受體發射進行了檢測，所述時間窗口從供體激發開始計算在1微秒或以上但是小於50微秒的延遲後打開，而且所述時間窗口的寬度為1微秒或以上但是小於100微秒。本發明還涉及本改進的方法在多分析物測定中的用途。而且，本發明涉及適用於實施所述改進方法的設備。
文檔編號G01N33/53GK1886661SQ200480035437
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月20日 優先權日2003年10月1日
發明者V·萊塔拉 申請人:沃拉克有限公司