一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法

2024-01-19 12:34:15 2

專利名稱：：一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法。
背景技術：
：棉花黃萎病(CottonVerticilli咖Wilt)是一種侵害棉株維管束的真菌性病害，具有分布廣、危害重、寄主範圍寬、傳播途徑多、存活時間久的特點。由於生產上一直沒有找到理想的防治和控制方法，其被稱為棉花的"癌症"。我國的黃萎病自1935年由美國引進品種傳入，先後在陝西涇陽、山西運城、山東高密和河南安陽等地發生；1993年棉花黃萎病在我國大範圍爆發，北方棉區重病棉田棉花病株率達50%，當年全國發病面積為26.67萬公頃，損失皮棉逾l億公斤；2002、2003年棉花黃萎病在黃河流域和新疆棉區再次爆發。化學防治黃萎病的方法成本較高，汙染環境，且防治效果不理想；而常規育種也難以培育出相對病指低於20的抗性品種。隨著分子植物病理學和基因工程技術的迅猛發展，運用轉基因技術提高植物的抗病性已成為棉花抗病育種的重要手段。
發明內容本發明的目的在於提供一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法。本發明提供的培育抗黃萎病的轉基因植物的方法，是將含有細胞凋亡抑制基因的重組表達載體導入目的植物中，得到抗黃萎病的轉基因植物；所述轉基因植物對黃萎病的抗性高於目的植物；所述細胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5'端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5，端第7-906位所示；所述重組表達載體的出發質粒是pCAMBIA1301。所述重組表達載體的構建方法如下將通過EcoRI和PstI雙酶切載體pBI121-p35得到的含有p35基因的片段插入載體pl301-iap的多克隆位點中，得到所述重組表達載體(命名為p1301—iap-p35);所述載體pBI121-p35是將p35基因插入載體pBI121的BamHI和SacI酶切位點之間得到的重組質粒。所述p1301-iap是將iap基因是插入載體pCAMBIA1301的BglII和Eco91I酶切位點之間，得到的重組質粒。上述目的植物可以是任何可感染黃萎病的植物，具體可為棉花、辣椒、茄子或黃瓜。上述棉花是中棉所39。上述的方法在培育植物新品種中的應用也屬於本發明的保護範圍之內。上述植物新品種具體可以是抗黃萎病的棉花新品種，上述棉花是中棉所39。實驗證實將本發明的重組載體導入棉花中，得到15株轉基因棉花株系，經潮黴素篩選後得到12個陽性株系，對這12個陽性株系的丁3代依次進行了潮黴素篩選、PCR、RT-PCR、Westernblot以及病圃篩選，篩選到抗病指數均在3-10之間的高抗黃萎病棉花株系。圖1為載體pl301-iap-p35的構建流程圖，a是載體pl301-i即的構建，b是載體pBI121-p35的構建，c是pl30卜iap-p35的構建。圖2為T3代轉基因棉花病圃抗病性檢測，(a)為未轉化的棉花單株，(b)為轉基因棉花單株。圖3為T3代轉基因棉花的RT-PCR檢測，(a)為p35基因RT-PCR擴增產物電泳圖，(b)為iap基因RT-PCR擴增產物電泳圖，1為未轉化的棉花RT-PCR產物(陰性對照)，2-4為轉基因棉花RT-PCR產物，5為質粒P1301-iap-p35的PCR產物(陽性對照)，6為1kbDNAladder,由下到上分別為250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp。圖4為Westernblot檢測T3代轉基因棉花葉片中的p35蛋白和iap蛋白，(a)為T3代轉基因棉花葉片中的p35蛋白，(b)為T3代轉基因棉花葉片中的i即蛋白，卜3為轉基因棉花，4為未轉化棉花(陰性對照)，6為蛋白分子量標準(a)由下到上分別為16.5kDa，25kDa，32.5kDa，47.5kDa，62kDa，(b)由下到上分別為16.5kDa，25kDa，32.5kDa。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例l、培育抗黃萎病轉基因棉花及其抗病檢測一、抗黃萎病轉基因棉花的獲得1、細胞凋亡抑制基因的克隆1)iap基因的克隆由Invitrogen公司合成序列表中序列1的自5'端第1-820位所示的核苷酸，其中第1-6是BglII酶切位點，第7-813是i即基因的序列，第814-820是Eco91I的酶切位點。將序列1所示的片段插入pGEM-T載體(購自Promage公司)，得到載體pGEM-iap，經過測序驗證，合成得到的片段iap具有序列表中序列1的自5'端第7-813位所示的核苷酸。2)p35基因的克隆由Invitrogen公司合成序列表中序列2的自5'端第1-912位所示的核苷酸，其中第1-6是BamHI酶切位點，第7-906是p35基因的序列，第907-912是SacI的酶切位點。將序列2所示的片段插入pGEM-T載體(購自Promage公司)，得到載體pGEM-p35，經過測序驗證，合成得到的片段p35具有序列表中序列2的自5'端第7-906位所示的核苷酸。2、重組載體的構建構建過程如圖l所示。1)載體pl301-iap的構建將步驟l的l)得到的載體pGEM-iap經過Bgl1I和Eco91I雙酶切，回收小片段，然後將該片段與經同樣酶切過的載體pCAMBIA1301(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriclture,www.cambia.org)連接，《導至U載^本pl301-iap(圖la)。2)載體pBI121-p35的構建將步驟1的2)得到的載體pGEM-p35經過BamHI和SacI雙酶切，回收小片段，然後將該片段與經同樣酶切過的載體PBI121(ArabidopsisBiologicalResourceCenter,www.arabidopsis.org/a_brc/)連接，得至職體pBI121-p35(圖lb)。3)載體pl301-iap-p35的構建將上述步驟2的2)得到的載體pBI121-p35經EcoRI和PstI雙酶切，回收含有p35基因及其上下遊的CaMV35S啟動子和終止子的片段，然後將該片段與經同樣酶切過的載體pl301-iap連接，得到載體pl301-iap-p35(圖lc)。3、抗黃萎病轉基因棉花的獲得1)轉化農桿菌農桿菌感受態細胞的製備挑取農桿菌EHA105(抗生素抑制農桿菌的效果及對條斑紫菜生長發育的影響，王萍等水產科學，200928(7)，公眾可從中國農業大學獲得)單菌落接種於100mlYEB液體培養基中，220rpm28。C振蕩培養至0De。(P0.5;轉入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入10ml預冷的0.15M的CaCh溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min;4°C，5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預冷的含10%甘油的O.15M的CaCl2溶液，輕輕懸浮；農桿菌懸浮液分裝於無菌印pendorf管中，每管200ul於液氮中速凍lmin，凍存於-70°C。表達載體轉化農桿菌EHA105取lPg的表達載體pl301-iap-p35加入到200WEHA105感受態細胞中，混勻；液氮中速凍lmin，37。C水浴5min，加入1mlYEB液體培養基，28°C150rpm振蕩培養4h;10000rpm離心30sec，棄上清，加入0.1ralYEB液體培養基，重新懸浮細胞；塗布於含50ug/mlKan和50ug/ml利福平的YEB固體平板上，28°C培養約48h。長出單菌落用PCR鑑定，鑑定用的引物是以p35基因的5'引物5，atgtgtgtaatttttccggtag3，、3，弓l物5，ttatttaattgtgtttaata3，禾口iap基因的5，弓l物5，atgagctcccgagcaatt3，、3，弓l物5，ttacacttggtacatgcgcac3'分別擴增，結果顯示載體p1301-iap-p35已經成功轉入農桿菌中。2)轉化棉花a、外植體的獲得將受體材料中棉所39(購自中國農業科學院棉花研究所科技貿易公司)的去殼種子利用。0.P/。升汞消毒5min，無菌水衝洗3-5次，接種於MS培養基上，光照培養5—7d;用刀片將其下胚軸切成長0.5cm左右的切段，以此5-7d的棉花無菌苗下胚軸切段作為外植體進行農桿菌感染轉化。b、農桿菌介導轉化與培養挑取上述經過驗證過的含有p1301-iap-p35表達載體的農桿菌單菌落接種於YEB(50lig/mlKan和50ug/ml利福平)液體培養基中，28。C振蕩培養至OD,值為0.5—0.7，5000rpm離心5min，用MSB液體培養基重新懸浮，與5-7d的棉花無菌苗下胚軸切段共培養10min，用無菌濾紙吸乾外植體表面菌液，轉入表面鋪有一層濾紙的共培養培養基(MSB+0.1mg/L2,4-D+0.lmg/LKT+0.lmg/LIAA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite,pH5.8)中，2rC黑暗條件下共培養48h，接著轉移到抗性愈傷誘導培養基(MSB+0.1mg/L2，4-D+0.lmg/LKT+0.1mg/LIAA+500mg/L頭孢黴素+50mg/L潮黴素+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite，pH5.8)培養3周，將誘導的抗性愈傷轉入分化培養基(MSB+0.02mg/LKT+0.005mg/LIAA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite,PH5.8)中誘導分化成胚狀體，將胚狀體轉入成苗培養基(MSB+0.1mg/LIBA+30g/L葡萄糖+2g/LGelrite，pH5.8)形成再生植株，用劈接法將獲得的15棵轉基因再生植株嫁接到砧木苗上，移至溫室培養，並進行潮黴素抗性檢測，得到12株轉基因植株，該12株轉基因棉花自交授粉後獲得T。代種子，長成L代棉花，經過3年的自交繁殖分別獲得T,代種子、L代棉花、L代種子.L代棉花、L代種子。3)轉基因棉花的檢測a.潮黴素檢測在12個T3代轉基因棉花株系的單株幼苗長出2-3片真葉時，對其進行了潮黴素葉片塗抹初篩實驗。取濃度為50mg/L的潮黴素塗抹轉化單株，塗抹7-10d後觀察塗抹部位的顏色，淘汰葉片塗抹點變黃的單株，然後進行第二輪篩選，如此連續塗抹3次，選出塗抹葉片依然為綠色的單株為陽性株系。b.DNA水平檢測PCR檢測以步驟a得到的各陽性株系的基因組DNA為模板，質粒pl301-iap-p35為陽性對照，未轉化棉花的基因組DNA為陰性對照，分別以p35基因表達框的5，弓l物5，cccacagatggttagagagg3，、3，弓l物-5,gtagtagtcgttgcgttcgt3，禾口iap基因的5，弓l物5，atgagctcccgagcaatt3，、3，弓l物5，acgcctcagtcatcaccc3，擴增，反應體系ddH2037u110XPCRBuffer5u1dNTP(25mM)4n15，引物(5pmol/u1)lu13，引物(5pmol/u1)lu1rT叫酶(5U/u1)lu1模板(l"g/ul)1"總體積50ulPCR反應程序為第一輪95。C變性5min;第二輪95n變性50sec，各基因特定退火溫度(iap:60。C，p35:58。C)50sec，72。C延伸lmin30s，35個循環；第三輪72'C延伸10min。反應結束後，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。選出能同時擴增出特異的1300bp和568bp的p35和i即基因片段的PCR陽性植株。c.RNA水平檢測RT-PCR檢測為了檢測步驟b中的PCR陽性植株中p35和iap基因是否得到轉錄，進一步進行PT-PCR檢測。用CTAB法提取步驟b中的PCR陽性植株的總RNA，以完整性好、無汙染的RNA為模板，用M-MLV酶(購自TaKaRa生物工程公司)反轉錄RNA為cDNA，反轉錄反應體系賺(1.0ixg/u1)4.On1OligdT2.0u1總體積6.0til將上述混合物混勻後，短暫離心將之收集於管底，72"C溫育10min，再立即置於冰上5min，再加入以下成分5XM-MLVBuffer2.0u1dNTP2.0li1RTaseM-MLV(200U/u1)0.75u1HPR(40,)0.25u1總體積ll.Oixl將上述混合物混勻，短暫離心將之收集於管底，在3(TC反應10min，42。C溫8育60rain，70。C反應10rain，取出置於冰上，離心後儲存於一2(TC。以0.5yl反轉錄產物為模板進行PCR擴增，PCR反應體系及反應條件與步驟b相同。選出經RT-PCR能同時擴增出特異的1300bp和568bp的p35和iap基因片段(如圖3所示)的植株，為RT-PCR陽性植株。d.蛋白水平檢測Westernblot:為了檢測步驟c中得到的RT-PCR陽性植株中p35和iap基因是否得到表達，進一步進行westernblot檢測。提取轉基因植株的總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，應用電轉裝置將蛋白轉移至醋酸纖維膜上進行免疫印跡雜交，p35蛋白的第一抗體購自IMGENEX公司(產品目錄號是IMG-5740)，Iap蛋白第一抗體購自GeneTex公司(產品目錄號是GTX23930)，第二抗體均為鹼性磷酸酶標記的山羊抗兔lgG(購自北京博奧森生物技術有限公司，產品目錄號是bsap-0295G)，雜交膜洗滌3次後，用NBT/BCIP顯色。能夠顯色有特異的35kDa和30kDa的條帶(如圖4所示)的轉化株為westernblot陽性植株。結果如表l所示，每一株系均可獲得陽性植株。至此，成功獲得T3代陽性植株。二、抗病功能檢測將經上述步驟d驗證過的T3代陽性植株在當年進行病情調查，調査方法如下T3代陽性植株和對照(未轉化的棉花植株中棉所39)種於中國農業科學院棉花研究所植保室黃萎病病圃，該病圃具中等致病力，可保證感病對照發病株率達80%,病指50以上。分別於蕾期、花期和鈴期逐株進行3次病情調査，調查按照全國統一的分級標準，單株劃分病情級別，黃萎病發病程度分為0、1、2、3、4等5級。用發病程度值的大小作為衡量抗病程度的指標，篩選出抗病的單株。棉花黃萎病發病強度分級標準0級健株；1級病株葉片有25%以下表現病狀，葉片主脈間產生淡黃色或黃色不規則病斑；2級病株葉片有25%_50%表現病狀，病斑顏色大部分變成黃色或黃褐色，葉片邊緣略有巻枯；3級病株葉片有50%-75%表現病狀，病斑顏色大部分成黃褐色，葉片邊緣巻枯，有少數葉片凋落；4級全株葉片發病，多為褐色掌狀枯斑，以致植株死亡。根據調査結果計算病情指數病情指數=[(2:各級病級X相應病級發病株數)/調査總株數X最高病級值(4)]xioo以一個株係為一個樣本，對每個株系中的T3代陽性植株進行病圃調查，每個株系得到一個病情指數，對照調査了30個單株。照片如圖2所示，未轉化的棉花單株(對照)上黃萎病症狀明顯，轉基因的陽性植株葉片正常。3次調査得到的病情指數的平均值如表1所示，獲得的T3代株轉基因棉花株系的病情指數均在3-10之間。表1.T3代株轉基因棉花株系tableseeoriginaldocumentpage10序列表<110〉中國農業大學—種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法CGGNARL925282〈210〉1〈211〉820DNA〈230〉〈400〉1agatctatgagctcccgagcaattggcgcgccgcaagaaggcgcagacatgsaa^aca^60gccgcgcgtctcggcacgtacaccaattggcccgtccagtttttggagccgagccgcatg120gccgccagcgggttctactacttgggccgcggcgacgaggtgcgctgcgcgttttgca_ag180cg肪ttgggt朋ggggcgscgacccggaaacggaccac肌gcggtgggcg240ccgcagtgtccgtttgtgcgcaacaacgcgcacgacacgccacacgaccgcgccccgccg300gcgcggtcggcggccgcgcacccgcagtatgccacggeiagccgcgcgtttgcgcaccttt360gcggagtggccccgcgggttga獄agcggcccgaagagttggccgaggccggattcttt420tacactggccagggcgacaagacgcggtgcttttgctgcgacggcggtctg朋ggattgg■gaacccgacgacgcgccgtggcagcaacacgcccgctggtacgaccgctgcgagtacgtg540ctgctcgtcaagggccgcgaCtttgtgC3gcgggtgatgactgaggcgtgtgtggttcgc600ga_cgcgg3C3acgaaccgcacattgagcggccggccgttgaagcggaggtggcggatgac660CggCtgtgC33ga_tttgcctcggcgccgaaaagaccgtgtgctttgtgccctgcgggcac720gtggtggcgtgcggcaagtgcgctgcgggcgtgeiccacgtgccccgtttgccgcggtcag780ttagaceiaeigcggtgcgcatgtaccaagtgtaeiggtgacc820<210〉2912〈212〉靈〈213〉人工序列<220〉〈400〉2ggatccatgtgtgtaatttttCCggt3g333tCg8Cgtgtcccagacgattattcgagat60tgtcaggtggacaaacaaaccagagagttggtgtacattaa_caa_gattatg3ELcacgc肌120ttg3C3a^cccgttctcatgatgtttaacatttcgggtcctatacgaagcgttaicgcgc180aageiEicaacaatttgcgcgacagaataaaatcaaaagtcgatgaacaatttgatcaacta240g朋CgCg3ttacagcgatcaaatggatggattccacgatagcatcaagta300gaaceictattcggt犯gttgccaaaatggcagcgtgttgaaa_agca_agtttgct犯a^tt360tta_a_a_g8gtcatgattataccgataaaaagtctattgaagcttacgagaaatactgtttg420ccc犯attggtcgacgaacgcaacgactactacgtggcggtatgcgtgttgaagccggga480tttgagaeicggcagcaaccaagtgctatctttcgagtacaacccga_ttggtaacaaagtt540attgtgccgtttgctcacgaaattaacgacacgggactttacgagtacgacgtcgtagct600tacgtggacagtgtgcagtttgatggcgaacaatttgaagagtttgtgcag3gtttaata660ttgccgtcgtcgttcaaaaattcggaaaaggttttatattacaacgaagc720a肌agcatgatctacaaggctttagagtttactacagaatcgagctggggc肌atccgaa780aagtataattggsieiaattttttgtaacggttttatttatgataaaaaatcaa^Lgtgttg840t3tgtt犯3ttgcacaatgt肪ctagtgcactcaacei犯aatgtaatatt900aaataeigagctc91權利要求1、一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法，是將含有細胞凋亡抑制基因的重組表達載體導入目的植物中，得到抗黃萎病的轉基因植物；所述轉基因植物對黃萎病的抗性高於目的植物；所述細胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5』端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5』端第7-906位所示；所述重組表達載體的出發質粒是pCAMBIA1301。2、如權利要求l所述的方法，其特徵在於所述重組表達載體的構建方法如下將通過EcoRI和PstI雙酶切載體pBI121-p35得到的含有p35基因的片段插入載體pl301-iap的多克隆位點中，得到所述重組表達載體；所述載體pBI121-p35是將p35基因插入載體pBI121的BaraHI和SacI酶切位點之間得到的重組質粒；所述p1301-iap是將iap基因是插入載體pCAMBIA1301的BglII和Eco91I酶切位點之間，得到的重組質粒。3、如權利要求1或2任一所述的方法，其特徵在於所述目的植物為棉花。4、如權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於所述棉花是中棉所39。5、權利要求l-4任一所述的方法在培育植物新品種中的應用。6、如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述植物新品種是抗黃萎病的棉花新品種，所述棉花是中棉所39。全文摘要本發明公開了一種培育抗黃萎病的轉基因植物的方法。本發明提供的方法是將細胞凋亡抑制基因通過表達載體導入目的植物中，得到抗黃萎病的轉基因植物；所述轉基因植物對黃萎病的抗性高於目的植物；所述細胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表中序列1的自5』端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5』端第7-906位所示；所述表達載體是pCAMBIA1301。本發明得到的T3代植株依次進行潮黴素篩選、PCR、RT-PCR、Westernblot以及病圃篩選，篩選到抗病指數均在3-10之間的高抗黃萎病棉花株系。文檔編號C12N15/82GK101659964SQ20091009243公開日2010年3月3日申請日期2009年9月8日優先權日2009年9月8日發明者濤王,娟田,董江麗申請人:中國農業大學