基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的dna生物傳感器及其製備和應用的製作方法

2024-01-19 13:44:15 1

基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的dna生物傳感器及其製備和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器和製備方法，以及所述傳感器用於乳腺癌基因檢測的方法。採用模板法在ITO電極上製備三維有序金摻雜納米二氧化鈦薄膜電極（3DOMGTD/ITO），然後將5』端標記有二茂鐵的DNA探針（5』-Fc-ssDNA）滴於電極上製得修飾電極，即所述的DNA生物傳感器。所述修飾電極置於乳腺癌基因片段的溶液中雜交後，採用示差脈衝伏安方法檢測雜交信號的變化，實現對乳腺癌基因的電化學檢測。本發明利用DNA探針和乳腺癌基因之間的特異性識別作用製備標記型DNA生物傳感器，具有較好的穩定性、重現性和電極再生性，可應用於DNA雜交及腫瘤電化學檢測領域。
【專利說明】基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器及其製備和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種DNA生物傳感器及其製備和應用，尤其涉及一種基於三維有序納米二氧化鈦電極的標記型DNA生物傳感器及其製備，以及該生物傳感器用於乳腺癌腫瘤基因檢測上的應用，屬於DNA生物傳感器【技術領域】和生物電化學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響著婦女身心健康甚至危及生命。研究發現，DNA分子中鹼基序列的變異與腫瘤及其人類的許多遺傳疾病有關，因此研究用特定DNA探針進行乳腺癌基因的識別，發展對乳腺癌基因的快速、簡便、可靠的檢測方法，對乳腺癌的前期診斷及治療提供依據具有十分重要的意義(參見T.0hmichi, Y.Kawamoto,P.ffu, D.Miyoshi, H.Karimata, N.Sugimot, Biochemistry, 2005, 44, 7125.)。
[0003]在乳腺癌的檢測方法中，乳房X射線技術雖然是最有效的方法，然而對於40歲以下的婦女因其乳腺細胞密度高而使得檢測靈敏度比較低；磁共振成像檢測乳腺癌靈敏度很好，但費用昂貴且需較長時間。電化學生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、所需儀器簡單、能在複雜體系中進行在線連續監測、易於實現微型化等優點，已經被廣泛地應用在臨床醫學檢驗和藥物篩選等領域，為人類疾病的防治、診斷和治療開闢了新的途徑(參見 Tiwari A, Gong S.Talanta, 2009, 77 (3): 1217.)。
[0004]電化學DNA生物傳感器用於測定DNA的過程一般包括四個步驟，如圖1所示:(I)DNA探針固定:選擇合適的固定方法將DNA探針固定到電極的表面；(2)雜交過程:將固定有DNA探針的電極置於待測溶液中，合適的條件下，識別溶液中的目標序列形成雙鏈DNA ；
(3)雜交指示:將雜交反應信號轉化為可以測定的電化學信號；(4)電化學信號的檢測:可以將電流、電壓或電導作為檢測信號。
[0005]近年來納米材料以其吸附能力強、生物兼容性好、催化效率高等優良性質，在生物標記、放大信號和DNA的固定化技術中得到了廣泛的應用。納米粒子具備良好的生物相容性，能為生物活性分子提供一個類似生物分子本體環境的微環境，可以有效地保持生物分子的活性；納米粒子具有表面效應，使其具有較高的表面吸附能力，是固定生物活性分子的合適媒介。因此，利用納米粒子作為固定生物分子的載體來構建生物傳感器的活性界面，可以製備出性能良好的生物傳感器。
[0006]在電化學生物傳感器的製備中，生物活性分子在電極表面的固定直接關係到生物傳感器的穩定性、重現性、靈敏度等性能，是製備過程中的關鍵步驟。三維有序結構金摻雜納米TiO2既具有納米TiO2呈現出的特有的光、電、催化等性能，又具備納米金良好的導電性能；此外，三維有序結構可以使固定的生物分子達到定向排列、取向規則的目的，從而能夠有效提高生物分子在電極表面的固定效率及電化學活性。
[0007]目前，固定在電化學生物傳感器上的DNA探針分為標記型和非標記型兩種。與傳統的非標記型DNA探針相比，標記型探針不僅可以有效減少非特異性吸附及背景幹擾，還可以提高識別和檢測特定序列DNA的靈敏度和選擇性。目前已發展的標記型DNA電化學生物傳感器大多通過標記電活性分子(參見(a) Xiao Y, Qu X G, Kevin ff.Plaxc0., AlanJ.Heeger.J.Am.Chem.Soc, 2007, 129 (39): 11896 ; (b) Yang K, Zhang C Y.Anal.Chem, 2010, 82 (22): 9500.)、納米粒子(參見 Zhang Y L, Wang Y, Wang H B, et al.Anal,chem., 2009, 81: 1982.)、催化酶(參見 Zhang J, Song S P, Zhang L Y, et al.J.Am.Chem.Soc., 2006, 128:8575.)等方式來提高分析檢測的靈敏度。常用的電活性標記物二茂鐵(Fe)標記的DNA探針具有較好的穩定性及氧化還原可逆性，因而是應用最廣泛的DNA電化學生物傳感器標記分子(參見(a) F.R.R.Teles, L.P.Fonseca.Talanta, 2008, 77:606 ； (b) Sassolas A, Leca-Bouvier B D, Blum L.Chem.Rev., 2008, 108(I):109 ； (c)Korr1-Youssoufi H, Makrouf B.Anal Chim Acta, 2002, 469:85.)。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是將二茂鐵標記的DNA探針(5』-Fc-ssDNA)固定在三維有序多孔結構的納米二氧化鈦電極(3D0M GTD/1T0)表面，構建一種新的標記型DNA生物傳感器，實現對乳腺癌基因片段(Breast-cancer BRCAl gene, ssl)的電化學檢測。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的:
一種基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器，其特徵在於，所述的生物傳感器包括三維有序多孔結構的金摻雜納米TiO2修飾的ITO電極，其表面固定DNA探針，所述的DNA探針為5』端標記有二茂鐵的DNA探針5』 -Fc-GAA CAA AAG GAA GAAAATC-(SH)-3，。
[0010]所述的DNA生物傳感器採用以下方法製備，包括以下步驟:
1)製備三維有序多孔結構的金摻雜納米TiO2修飾的ITO電極，標記為3D0MGTD/1TO修飾電極；
2)將5』端二茂鐵標記的DNA探針，標記為5』-Fc-ssDNA溶液滴於3D0M GTD/1TO修飾電極表面，在4 °C下晾乾，製得所述的DNA生物傳感器，標記為5』 -Fc-ssDNA /3D0M GTD/ITO修飾電極。
[0011]所述的5』 -Fc-ssDNA 溶液優選為 1.0 X l(T5mol/L 的 5』 -Fc-ssDNA 溶液。
[0012]所述的3D0M GTD/1TO修飾電極採用以下方法製備:
O製備金摻雜納米TiO2溶膠；
2)將處理好的ITO在1%PS小球(優選290nm)乙醇溶液放置，隨著乙醇溶液的揮發，PS小球通過自組裝到ITO電極表面，形成六方緊密堆積結構，然後將其放置烘箱中於95°C恆溫固化，即得到PS小球模板；
3)將PS小球模板傾斜，移取金摻雜納米TiO2溶膠沿PS小球模板斜面滴下，直到浸潤整片模板，室溫晾5-10min ;再次滴加所述的金摻雜納米TiO2溶膠，重複上述過程3次，晾乾備用;
4)馬弗爐中高溫煅燒去除模板中的PS小球模板，以2V/min的速度升溫至500°C，並恆溫2h，然後以2V Mn的速度降至室溫，留在ITO上的多孔有序結構即為三維有序結構的金摻雜納米TiO2修飾電極(3D0M GTD/1 ΤΟ) ο
[0013]本發明還涉及所述的DNA生物傳感器的應用，即一種基於所述的DNA生物傳感器檢測乳腺癌基因的方法，包括下列步驟:
1)DNA探針在修飾電極上的固定
取 40 μ L 1.0Xl0-5mol/L 5』-Fc-ssDNA 溶液滴於 3DOM GTD/ITO 修飾電極表面，在 4°C下晾乾，製得5』 -Fc-ssDNA /3DOM GTD/ITO修飾電極；
2)雜交反應
將步驟1)所述的修飾電極置於包含乳腺癌基因片段ssl的0.lmol/L磷酸鹽緩衝液中進行雜交，所述的基因片段ssl DNA序列為5』-GAT TTT CTT CCT TTT GTTC-3』，取出電極，用二次蒸餾水清洗，去除非特異性吸附的基因片段ssl，在4 °C下晾乾；
由於ssl與修飾電極上的DNA探針5』-Fc-ssDNA能完全配對，形成穩定的雙螺旋鏈，雜交後DNA探針峰電流比雜交前明顯減小，而其它基因片段與DNA探針存在鹼基錯配，不能形成穩定的雙螺旋鏈，因此本發明中的DNA生物傳感器對ssl具有特異性，通過5』-FC-ssDNA與ssl雜交前後電化學信號的變化可以實現對乳腺癌腫瘤基因的電化學檢測。
[0014]3)電化學檢測
採用三電極系統以示差脈衝伏安(DPV)方法檢測DNA雜交信號的變化，分別以製備的5』-Fc-ssDNA /3D0M GTD/ITO修飾電極和雜交後的該電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為對電極，在電解液為0.lmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中進行示差脈衝伏安(DPV)掃描，根據峰電流的變化值測定乳腺癌基因片段ssl的濃度。
[0015]具體地，步驟3)中測定乳腺癌基因片段ssl的濃度的方法包括以下步驟:
a、ssl標準溶液配製:配製一組含不同已知濃度ssl的磷酸鹽緩衝溶液；
b、建立工作曲線:將製備的DNA探針的修飾電極分別浸入不同濃度ssl磷酸鹽緩衝溶液中進行雜交反應，反應完成後將電極取出，用二次蒸餾水衝洗，除去未雜交的ssl，在4°C下晾乾;將DNA探針電極及雜交後的該電極在磷酸鹽緩衝溶液中進行DPV掃描，記錄峰電流的變化；峰電流值I與標準溶液中ssl的濃度c成反比，繪製i-c標準曲線，或採用線性回歸法得到i-C線性回歸方程；
C、乳腺癌基因樣品的檢測:將待測樣品配製成溶液，在磷酸鹽緩衝溶液中按照與步驟b相同的方法進行雜交反應和示差脈衝伏安掃描，記錄響應電流；若雜交後的電極上響應電流無明顯變化，表明待測樣品中不含乳腺癌基因片段ssl ;若響應電流減小，則表明樣品中含乳腺癌基因片段，根據i-C標準曲線，得到樣品中ssl的濃度。
[0016]所述的方法中，雜交反應的溫度為35~60°C，優選37 °C。
[0017]所述的方法中，雜交反應時間為≥lh。
[0018]所述的方法中，雜交反應所用的磷酸鹽緩衝溶液的pH在5~8範圍內，優選6~7;最優選pH 7.0 PBS溶液作為雜交反應的緩衝液。
[0019]與現有技術比較，本發明具有以下有益效果:
電化學DNA生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、所需儀器簡單、能在複雜體系中進行在線連續監測、易於實現微型化等優點。在生物傳感器的製備中，生物活性分子在電極表面的固定直接關係到生物傳感器的穩定性、重現性、靈敏度等性能，是製備過程中的關鍵步驟。目前採用Au摻雜納米TiO2修飾電極的方法改善了生物大分子在電極表面的固載量，但仍然存在固載穩定性不理想及生物分子在電極表面的固載取向難以控制等問題。[0020]本發明採用三維有序金摻雜納米TiO2修飾電極(3D0M GTD/IT0)，三維有序多孔結構具有相互貫通的剛性孔道結構以及超高的比表面積，可以很好地改善生物分子在電極表面的固載效果，生物分子固載量大，固載條件簡單，採用簡單的物理吸附即可，而且電極材料有很好的生物相容性和導電性。修飾電極具有規整有序的三維結構，使固定的生物分子達到定向排列、取向規則的目的，從而能夠更好地保持生物分子的活性。
[0021]用SEM方法對製備的3D0M GTD/1TO電極表面的形貌進行表徵，3D0M GTD/1TO電極表面的三維結構層次清晰、整齊有序、孔徑均一。將二茂鐵標記的DNA探針(5』 -Fc-ssDNA)固定在電極表面製備的電化學DNA生物傳感器，可以成功地檢測乳腺癌腫瘤基因，DNA探針在電極表面的峰電流與乳腺癌腫瘤基因的濃度呈現線性關係，所述的傳感器快速、高效、靈敏度高，並且所述的方法具有較低的檢出限，檢測限為5.2X10_7 mol/L。
[0022]下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述。本發明的保護範圍並不以【具體實施方式】為限，而是由權利要求加以限定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為DNA電化學生物傳感器製備及電化學檢測過程。
[0024]圖2為在ITO電極表面製備的三維有序金摻雜納米TiO2多孔結構掃描電鏡圖。
[0025]圖3為不同電極在Fe (CN) 63_/4_溶液中的交流阻抗圖。分別為3D0M GTD/IT0電極(曲線a)，DNA探針修飾電極(曲線b)、DNA探針與對照組DNA片段雜交修飾電極(曲線c)及DNA探針與乳腺癌基因片段雜交修飾電極(曲線d)。
[0026]圖4為在3D0M GTD/1 TO電極上，DNA探針在不同濃度的乳腺癌基因片段溶液中的示差脈衝伏安曲線，其中乳腺癌基因濃度a-g分別是:I X 10_5，8 X 10_6，6 X 10_6，4X 10_6，2 X 10_6,1 X 10_6,8 X 10_7 mol/L。
[0027]圖5為DNA探針在電極表面的峰電流與乳腺癌基因濃度的線性關係。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
將30mL無水乙醇置於IOOmL錐形瓶中，邊攪拌邊加入0.3mL三乙醇胺，然後再慢慢加Λ 0.7mL鈦酸四丁酯，繼續攪拌至溶液呈現均一透明的淡黃色，然後加入IOmL HAuCl4、水和乙醇的混合溶液(0.5g/L的HAuCl4 0.5mL,三次水3mL，無水乙醇6.5mL)，攪拌6h，溶液在反應中依次呈現淡黃色，微黃色，微紅色，粉紅色，直至最後呈酒紅色，即為金摻雜納米TiO2溶膠。透射電鏡實驗結果表明，納米粒子分布均勻，平均粒徑小於25nm。
[0029]所用ITO電極(50 mmX 10 mmX 1.2 mm)首先在鹼液中浸泡30min，然後依次在異丙醇、乙醇、蒸餾水中超聲半小時，之後用二次水淋洗玻片3次，自然晾乾。將處理好的ITO懸放在裝有IOmL 1%PS小球(290nm)乙醇溶液的稱量瓶(35_X 70mm)中，30°C下放置3天左右。隨著乙醇溶液的揮發，PS小球通過自組裝到ITO電極表面，形成六方緊密堆積結構。然後將其放置烘箱中於95°C恆溫2小時進行固化，即得到PS小球模板。由PS小球模板的掃描電鏡圖看到，PS小球在ITO電極表面排列整齊，表面均一平整。將PS小球模板微微傾斜，用移液器移取金摻雜納米TiO2溶膠ΙΟμ?，沿PS小球模板斜面緩緩滴下，直到浸潤整片模板，室溫晾5-10min ;再次滴加，重複上述過程3次，晾乾備用。採用馬弗爐高溫煅燒法去除模板中的PS小球模板，以2°C /min的速度升溫至500°C，並恆溫2h，然後以2°C /min的速度降至室溫，留在ITO上的多孔有序結構即為三維有序結構的金摻雜納米TiO2修飾電極(3D0M GTD/1T0),由掃描電鏡圖(圖2)可見製備的三維結構規整有序、孔徑均一。
[0030]實施例2
將實施例1製得的3D0M GTD/1TO電極用二次水衝洗乾淨，室溫晾乾。將40μ?1.0X l(T5mol/L 5』 -Fc-ssDNA 滴在 3D0M GTD/IT0 電極表面，在 4 °C 下晾乾，製得5』 -Fc-ssDNA/3D0M GTD/1TO 修飾電極，4。C 保存。
[0031]5』-Fc-ssDNA/3D0M GTD/1TO 修飾電極的 UV-Vis 吸收光譜在 260 nm 處有一個 DNA特徵吸收峰，表明DNA探針已固定在3D0M GTD/1TO電極表面。5』-Fc_ssDNA/3D0M GTD/1TO修飾電極上DNA的峰位與自由狀態的DNA峰位幾乎一致，表明固定在3D0M GTD/1TO電極上的DNA探針仍保持其生物活性。
[0032]DNA探針分子在3D0M GTD/1TO電極表面可產生明顯的電化學信號，5』 -Fc-ssDNA/3D0M GTD/1TO修飾電極的循環伏安曲線在0.460V和0.307V出現一對明顯的氧化還原峰，這對峰是由DNA探針分子的Fe在電極表面發生氧化還原反應產生的。由於氧化還原峰的電位差小於200 mV,可根據公式^s= mnF/RT計算出Fe在電極上的電子轉移速率常數I為4.87S'氧化還原峰電流隨著掃速的增加峰電流值增大，氧化還原峰電流與掃速成線性關係，表明該 反應速度受電極的表面電化學過程控制。
[0033]實施例3
本實施例利用DNA探針(5』 -Fc-ssDNA)和乳腺癌基因片段(ssl)兩條互補的DNA單鏈間的特異性相互作用的原理，通過雜交前後DNA探針峰電流的明顯變化來檢測ssl，實現對乳腺癌腫瘤基因的電化學檢測。
[0034]將5』-Fc-ssDNA/3D0M GTD/1TO修飾電極置於2mL ssl的溶液中，於37 °C下雜交I h。取出電極，用二次蒸餾水充分清洗，以去除非特異性吸附的ssl，在4 1:下晾乾。另選擇一個隨機的基因片段ss2作為對照組進行實驗，ss2 DNA序列為:5』 -GGT CAG GTG GGGGGT ACG CCA GG-3，。
[0035]電化學檢測採用三電極系統，以製備的5』 -Fc-ssDNA /3D0M GTD/1TO修飾電極和雜交後的該電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為對電極。進行循環伏安(CV)和示差脈衝伏安(DPV)測量時，電解液為0.lmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)。實驗前通入高純N2 15min除氧，實驗在N2保護下進行。所有實驗溫度均為25 °C。
[0036]當溶液中存在ssl時，DNA探針與ssl在3D0M GTD/1TO電極上的示差脈衝伏安實驗結果表明，與ssl雜交反應後DNA探針的電流明顯減小。由於ssl與DNA探針能完全配對，形成穩定的雙螺旋鏈，使DNA探針電流明顯減小；而對照組DNA片段(ss2)與DNA探針存在鹼基錯配，則不能形成穩定的雙螺旋鏈，使DNA探針電流不發生明顯變化。由於DNA分子不導電，當電極表面固定有DNA探針後，使Fe (CN) 63_/4_和電極表面的電子轉移受到阻礙，電極表面的阻抗值變大。當DNA探針與ssl雜交在電極表面形成雙鏈結構後，較為剛性的雙鏈結構使DNA探針5』 -末端的電活性基團Fe與電極表面距離變大，則電極表面的阻抗值進一步增大。交流阻抗實驗測定不同電極表面的電阻變化，如圖3所示，進一步證明DNA探針與乳腺癌基因片段ssl雜交後，使電極表面電子傳遞受阻，因而DNA探針的電流明顯減小。[0037]實施例4
方法同實施例3，區別在於改變雜交反應的溫度。
[0038]在DNA探針與乳腺癌基因雜交過程中，雜交溫度的改變影響著雜交反應的程度，雜交溫度過低時，溶液中的DNA探針擴散緩慢，將會影響互補鏈鹼基之間的配對；溫度過高時，會導致DNA變性。在本實驗中當溫度低於35 1:時，幾乎觀察不到雜交反應的發生。溫度在35?60°C的範圍內時，能檢測到明顯的DNA探針電化學信號變化。本發明推薦選擇雜交溫度為37 °C。
[0039]實施例5
方法同實施例3,區別在於改變雜交反應的時間。
[0040]在DNA探針與乳腺癌基因雜交過程中，雜交反應的程度是時間的函數。隨著雜交時間的增加，雜交反應的程度也增加，DNA探針產生的峰電流減小。本實施例表明，雜交反應I h後DNA探針峰電流趨於穩定，表明雜交反應趨於平衡，因此本發明推薦選擇DNA探針與乳腺癌基因雜交反應的時間為I h。
[0041]實施例6
方法同實施例3，區別在於改變雜交反應所用的磷酸鹽緩衝溶液的pH。
[0042]溶液的pH也會影響雜交反應中DNA探針電化學信號，當pH>7.0時，DNA探針的氧化還原峰隨著pH的增加而減小，當pH>8.0時，氧化還原峰幾乎消失。結合人體的生理環境，本發明推薦選擇PH 7.0 PBS溶液作為雜交反應的緩衝液。
[0043]實施例7
以NDA探針修飾電極5』-Fc-ssDNA /3D0M GTD/ITO為工作電極，採用本發明的方法檢測乳腺癌基因，當溶液中含有乳腺癌基因片段ssl時，通過示差脈衝伏安掃描記錄Fe峰電流的變化，可以實現對乳腺癌基因的電化學檢測。
[0044]a、ssl標準溶液配製:向5.6nmol ssl中分別加入56 μ L的滅菌水，即得濃度為1.0X10_4mol/L的ssl儲備液。實驗中所需不同濃度溶液再按比例稀釋，配製含不同濃度ssl的磷酸鹽緩衝溶液(雜交液，pH 7.0)，溶液置於4° C冰箱保存；
b、建立工作曲線:將製備的DNA探針的修飾電極分別浸入不同濃度ssl磷酸鹽緩衝溶液中進行雜交反應lh，反應完成後將電極取出，用二次蒸餾水衝洗3次，除去未雜交的ssl，在4 1:下晾乾。將DNA探針電極及雜交後的該電極在pH 7.0磷酸鹽緩衝溶液中進行DPV掃描，記錄Fe峰電流的變化，如圖4所示。Fe的峰電流值I與標準溶液中ssl的濃度c成反比，繪製J-c標準曲線，採用線性回歸法得到J-c線性回歸方程；
當不同濃度的乳腺癌基因ssl分別與電極表面的DNA探針雜交時，Fe的峰電流值J與溶液中ssl的濃度c成反比，示差脈衝實驗結果表明:隨著ssl濃度的增加(圖4，g-a)，Fe峰電流值逐漸減小。當ssl濃度在8.0X 10_7 mol/L?1.0X 10_5mol/L的範圍內，Fe的峰電流值與ssl的濃度呈現線性關係。
[0045]J-c標準曲線，如圖5所示。線性方程為:y(yA)= 0.5005 X IO5 χ (μ mol/L)-0.9577，線性相關係數為 0.9908，檢測限為 5.2X10_7mol/L (S/N=3)。
[0046]實施例8
將DNA探針修飾電極在100mV/s的掃描速度下連續循環掃描40圈，氧化還原峰電位幾乎不變，峰電流略有降低。在4個分別製備的3D0M GTD/1TO電極上修飾相同量的DNA探針，分別進行循環掃描，得到的氧化還原峰電位一致，峰電流的相對標準偏差小於5%，表明所製備的修飾電極具有較好的重現性。
【權利要求】
1.一種基於三維有序金摻雜納米二氧化鈦電極的DNA生物傳感器，其特徵在於，所述的生物傳感器包括三維有序多孔結構的金摻雜納米TiO2修飾的ITO電極，其表面固定DNA探針，所述的DNA探針為5』端標記有二茂鐵的DNA探針5』 -Fc-GAA CAA AAG GAA GAAAATC-(SH)-3』，標記為 5，-Fc-ssDNA ο
2.—種權利要求1所述的DNA生物傳感器的製備方法，包括以下步驟: 1)製備三維有序多孔結構的金摻雜納米TiO2修飾的ITO電極，標記為3D0MGTD/1TO修飾電極； 2)將DNA探針溶液滴於3D0MGTD/1TO修飾電極表面，所述的DNA探針為5』端二茂鐵標記的 DNA 探針 5』 -Fc-GAA CAA AAG GAA GAA AATC-(SH)-3』，標記為 5』 -Fc-ssDNA ;在 4°C下晾乾，製得所述的DNA生物傳感器，標記為5』 -Fc-ssDNA /3D0M GTD/IT0修飾電極。
3.根據權利要求2所述的DNA生物傳感器的製備方法，其特徵在於，所述的3D0MGTD/ITO修飾電極採用以下方法製備: 1)製備金摻雜納米TiO2溶膠； 2)將處理好的ITO在1%PS小球乙醇溶液放置，隨著乙醇溶液的揮發，PS小球通過自組裝到ITO電極表面，形成六方緊密堆積結構，然後將其放置烘箱中於95°C恆溫固化，即得到PS小球模板； 3)將PS小球模板傾斜，移取金摻雜納米TiO2溶膠沿PS小球模板斜面滴下，直到浸潤整片模板，室溫晾5-10min ;再次滴加所述的金摻雜納米TiO2溶膠，重複上述過程3次，晾乾備用; 4)馬弗爐中高溫煅燒去除模板中的PS小球模板，以2V/min的速度升溫至500°C，並恆溫2h，然後以2V /min的速度降至室溫，製得所述的3D0M GTD/1TO修飾電極。
4.一種基於權利要求1所述的DNA生物傳感器檢測乳腺癌基因的方法，包括下列步驟: 1)DNA探針在修飾電極上的固定 取 40 μ L 1.0Xl(T5mol/L 5』-Fc-ssDNA 溶液滴於 3D0M GTD/IT0 修飾電極表面，在 4°C下晾乾，製得5』 -Fc-ssDNA /3D0M GTD/IT0修飾電極； 2)雜交反應 將步驟I)所述的修飾電極置於包含乳腺癌基因片段ssl的0.lmol/L磷酸鹽緩衝液中進行雜交，所述的基因片段ssl DNA序列為5』-GAT TTT CTT CCT TTT GTTC-3』，取出電極，用二次蒸餾水清洗，去除非特異性吸附的基因片段ssl，在4 °C下晾乾； 3)電化學檢測 採用三電極系統以示差脈衝伏安方法檢測DNA雜交信號的變化，分別以製備的5』 -Fc-ssDNA /3D0M GTD/IT0修飾電極和雜交後的該電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為對電極，在電解液為0.lmol/L磷酸鹽緩衝液中進行示差脈衝伏安掃描，根據峰電流的變化值測定乳腺癌基因片段ssl的濃度。
5.根據權利要求4所述的檢測乳腺癌基因的方法，其特徵在於，步驟3)中測定乳腺癌基因片段ssl的濃度的方法包括以下步驟: a、ssl標準溶液配製:配製一組含不同已知濃度ssl的磷酸鹽緩衝溶液； b、建立工作曲線:將製備的DNA探針的修飾電極分別浸入不同濃度ssl磷酸鹽緩衝溶液中進行雜交反應，反應完成後將電極取出，用二次蒸餾水衝洗，除去未雜交的ssl，在4°C下晾乾^fDNA探針電極及雜交後的該電極在磷酸鹽緩衝溶液中進行DPV掃描，記錄峰電流的變化；峰電流值I與標準溶液中ssl的濃度c成反比，繪製1-c標準曲線，或採用線性回歸法得到/-C線性回歸方程； C、乳腺癌基因樣品的檢測:將待測樣品配製成溶液，在磷酸鹽緩衝溶液中按照與步驟b相同的方法進行雜交反應和示差脈衝伏安掃描，記錄響應電流；若雜交後的電極上響應電流無明顯變化，表明待測樣品中不含乳腺癌基因片段ssl ;若響應電流減小，則表明樣品中含乳腺癌基因片段，根據/-C標準曲線，得到樣品中ssl的濃度。
6.根據權利要求4或5所述的檢測乳腺癌基因的方法，其特徵在於，步驟2)中，雜交反應的溫度為35~60°C。
7.根據權利要求4或5所述的檢測乳腺癌基因的方法，其特徵在於，步驟2)中，雜交反應時間為≥lh。
8.根據權利要求4或5所述的檢測乳腺癌基因的方法，其特徵在於，步驟2)中，雜交反應所用的磷酸鹽緩衝溶液的PH在5~8範圍內。
【文檔編號】G01N27/26GK103743802SQ201410009934
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】常穎萃, 杜江燕 申請人:南京師範大學