用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量pcr方法、引物、探針及試劑盒的製作方法

2024-02-26 22:47:15 3

專利名稱：用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量pcr方法、引物、探針及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及一種用於檢測結核分枝桿菌的螢光定量PCR方法。本發明還涉及用於該方法的引物和探針，以及包含該引物和探針的試劑盒。
背景技術：
結核病是全球面臨的主要公共健康問題之一，是引起成年人死亡的主要傳染源，尤其是近年來，由於大規模人口流動及細菌本身耐藥性的產生，結核病的發病率有回升的趨勢。結核分枝桿菌(MTB)是結核病的病原體，目前對MTB的診斷主要採用實驗室診斷與臨床體徵相結合的方法。實驗室診斷主要包括塗片染色法、細菌培養法、抗原抗體檢測、PCR等方法。其中，病人組織或體液標本的細菌培養是目前檢測結核分枝桿菌的金標準，但其缺點是檢測周期較長(需要8周)，難以實現致病菌的快速檢測，因此在臨床上很容易貽誤病情，不利於早期治療。抗原抗體檢測通常採用ELISA(酶聯免疫吸附試驗)法，該方法具有操作簡單、價格低廉的優點，但在檢測特異性和靈敏度方面還有待提高。隨著分子生物學的發展，PCR技術已成為目前常見的實驗手段，特別是實時螢光定量PCR，因具有技術成熟、靈敏度高、操作簡單和特異性好的優點，已被逐步應用到臨床上。同時，利用基因晶片在細菌耐藥性方面的應用，近幾年出現了不少將螢光定量PCR技術和基因晶片相結合的檢測MTB及其耐藥基因的方法，例如，名稱為「一種從痰中提取細菌核酸的方法、試劑盒及其應用」的中國發明專利(申請號200810105172. X)，利用了基因晶片技術，通過比較不同菌株中16S rRNA基因的差異，設計引物和探針對MTB進行檢測，但由於16S基因較短(1500bp)，因此該方法的檢測特異性較低；另一名稱為「一種結核分枝桿菌複合群的螢光定量RT-PCR檢測方法」的中國發明專利申請(申請號201010522800. 1)，在引物和探針設計時，也採取了比較不同菌株中16S rRNA基因的方法，因此，也存在上述的問題，此外，該方法採用人的基因組DNA最為陰性對照進行檢測，其檢測結果的特異性有待改進。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種能夠特異性檢測結核分枝桿菌的引物對。為解決上述技術問題，本發明的用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的引物對，包括上遊引物和下遊引物，其中，上遊引物具有如SEQ ID No:I所示的序列或其互補鏈，下遊引物具有如SEQ ID No :2所示的序列或其互補鏈；所述上遊引物還可以向5』端方向延伸10個鹼基，所述下遊引物還可以向3』端方向延伸10個鹼基。本發明要解決的技術問題之二是提供一種能夠特異性檢測結核分枝桿菌的探針。為解決上述技術問題，本發明的用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的探針，具有如SEQ ID No :3所示的序列或其互補鏈，且所述探針的5』端連接有一個螢光報告基團，3』端連接有一個螢光淬滅基團。所述探針還可以向3』端方向延伸10個鹼基。本發明要解決的技術問題之三是提供一種利用上述引物對和探針進行實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的方法，它不僅簡便、快速，而且特異性高。為解決上述技術問題，本發明的用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量PCR方法，包括以下步驟I)採集患者痰液樣本，並進行處理；2)提取樣本中的DNA ；3)以結核分枝桿菌標準菌株中提取的DNA為陽性對照，滅菌水為陰性對照，利用前述引物對和探針，對樣本DNA進行實時螢光定量PCR反應，測定樣本和標準品的Ct值；4)利用步驟3)的測定結果，判斷樣本中是否含有結核分枝桿菌，並計算樣本中結核分枝桿菌的拷貝數。步驟I)採集的樣本，在2 8°C下保存不應超過24小時，在_20°C下保存不超過3個月，在-80°C下可以長期保存，樣本應低溫運輸。步驟I)中，可以按照如下步驟進行樣本的處理取2 3mL樣本，加入I 4倍體積的4%氫氧化鈉，混勻，室溫液化O. 5 3小時，至樣本變為透明溶液；取已液化的痰液樣本I I. 5mL,放入滅菌的I. 5mL滅菌PE管中，10, 000 15，OOOrpm離心5 10分鐘，棄上清；沉澱加入ImL生理鹽水重懸，10, 000 15，OOOrpm離心5 10分鐘,棄上清；沉澱用於進行DNA的提取。步驟2)中，樣本DNA的提取，可以利用商業化的DNA提取試劑盒，例如Qiagen公司或TaKaRa公司的DNA提取試劑盒，按照試劑盒的說明書進行操作；也可以按照以下方法進行操作向經步驟I)處理後得到的沉澱中，加入50 100 μ L滅菌水，放在100°C水浴中煮沸10 15min，所得溶液即為樣本DNA的溶液，取上清2 4 μ L，可直接用於螢光定量PCR反應。步驟3)中，PCR反應採用20 μ L的反應體系，每份反應液中含2 X PCR Master Mix10 μ L, 10 μ mol/L 的上、下遊引物各 O. 2 O. 6 μ L，10 μ mol/L 探針 O. 6 I. O μ L，ROXReferenceDye (50 X) O. 4 μ L,結核分枝桿菌DNA模板I 3 μ L,用滅菌水補充至總體積為20. O μ L，反應溶液在冰上配製。PCR反應條件為95°C，30秒；然後進行40個循環95°C，5秒，60°C，31 秒。本發明要解決的技術問題之四是提供一種用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的試劑盒。為解決上述技術問題，本發明的用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的試劑盒，除包含有常規實時螢光定量PCR試劑(包括Taq酶、dNTP試劑、PCR緩衝液、滅菌水等)、陽性對照(結核分枝桿菌標準菌株的DNA，濃度分別為ΙΟ6、105、104copies/mL)、陰性對照外，還包含有上述弓I物對和探針。本發明的用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量PCR方法，以及用於該方法的引物和探針或試劑盒，不僅對結核分枝桿菌具有較好的檢測特異性，而且簡便、快速，可以在2 3小時內完成臨床痰液樣本的檢測診斷，從而有助於疾病的預防和及時診斷，在臨床上具有良好的應用前景。


圖I是結核分枝桿菌檢測靈敏度測試圖，圖中橫坐標是PCR反應的循環數，縱坐標是採集的螢光信號值；圖2是採用瓊脂糖凝膠電泳驗證本發明試劑盒的可靠性；圖3A是使用本發明的試劑盒進行志賀菌檢測的結果；圖3B是使用本發明的試劑盒進行軍團菌檢測的結果；圖3C是使用本發明的試劑盒進行其他菌檢測的結果；圖4是利用本發明的試劑盒進行臨床痰液樣本檢測的結果。
具體實施方式
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下面結合附圖和實施例，對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(NewYork ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。I.樣本的採集和處理，及樣本DNA的提取按照臨床樣本採集要求，採集患者的痰液樣本，採集的樣本保存在_20°C。將樣本在冰上融化，取樣本2mL，向樣本中加入4mL的4 %的NaOH溶液，混勻，室溫處理O. 5小時。然後，取樣本I. 5mL,在13，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入ImL的I XPBS重懸，在13，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，保留沉澱。加入50 μ L滅菌水，在100°C水浴中煮沸10分鐘，所得溶液即為含樣本DNA的溶液，取I μ L該溶液用於實時螢光定量PCR反應。2.檢測靈敏度測試通過對GenBank上結核分枝桿菌和其他物種序列的比對,選取結核分枝桿菌特異序列，設計出一組用於PCR檢測結核分枝桿菌核苷酸片段的引物和探針，其序列如下上遊引物5』 -GGCTGTCGTTTTGCTCTG-3 』下遊引物5，-CTGATGTTGGTGTTGTAGGC-3』檢測探針5』-CGACACCCGAACAACAGAGC-3』上述檢測探針的5』端連接有一個螢光報告基團FAM(6-羧基螢光素)，3』端連接有一個螢光淬滅基團TAMRA (6-羧基四甲基丹諾明)。PCR反應採用20 μ L的反應體系，每份反應液中含有2XPCR Master Mix10 μ L,上、下遊引物(10 μ mol/L)各 O. 4 μ L，探針(10 μ mol/L) O. 8 μ L，ROX ReferenceDye (50 X) 0. 4 μ L，滅菌水6. 0 μ L,結核分枝桿菌DNA樣品(濃度分別為:(a) 2 X 10°ng/ μ L，(b) 2 X 10 1Iig/ μ L, (c) 2 X 10 2ng/ μ L, (d) 2 X 10 3ng/ μ L, (e) 2 X 10 4ng/ μ L, (f) 2 X 10 5ng/μ L，(g) 2 X10_6ng/U L, (h) 2 X l(T7ng/μ L，(i) 2 X l(T8ng/μ L) 2 μ L。反應溶液在冰上配製，配製完成後使用ABI 7300real-Time PCR System進行PCR反應。反應條件95°C，30秒；然後進行40個循環，每個循環為95°C，5秒，60°C，31秒。反應結束後，對擴增曲線進行分析，得到以循環數為橫坐標，吸光值為縱坐標的定量曲線，如圖I所示。從圖中可以看出，當DNA模板濃度分別為2 X 10°ng/μ LJXlO-1Iig/μ L，2Χ 10_2ng/ μ L，2X 10_3ng/ μ L，2X 10_4ng/ μ L時，均出現明顯的擴增曲線，但當模板濃度低於2X10_4ng/yL時，未出現明顯的擴增曲線。即使用本發明的螢光定量PCR方法及試齊U盒對結核分枝桿菌的檢測可以達到2X10_4ng/yL(基因組DNA)的檢測靈敏度，相當於40拷貝數(copies)的結核分枝桿菌。為了驗證本發明試劑盒檢測結果的可靠性，對實時螢光定量PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，其中的泳道I 9為上述不同拷貝數的結核分枝桿菌DNA模板,泳道10為陰性對照(滅菌水)，M為IOObp標記物(Marker)。檢測結果與目的片段大小一致。3.本發明試劑盒的特異性檢驗分別用結核分枝桿菌DNA提取物、志賀菌DNA提取物、大腸桿菌DNA提取物、肺炎克雷伯菌DNA提取物、李斯特菌DNA提取物、腸炎沙門菌DNA提取物、金黃色葡萄球菌DNA提取物、軍團菌DNA提取物為模板，採用本發明的試劑盒，按照上述檢測靈敏度測試中所述 的反應體系和條件，進行實時螢光定量PCR檢測。檢測結果如圖3A 3C所示，從圖中可以看出，只有以結核分枝桿菌DNA為模板的樣品有明顯的擴增曲線，其他的樣本均無明顯的擴增曲線。4.臨床痰液樣本的檢測按照臨床樣本採集要求，採集患者痰液樣本,採集的樣本保存在2 8°C (不超過4小時)。取樣本2mL，向樣本中加入4mL的4% NaOH溶液，混勻，室溫處理I. O小時。然後取樣本1.5mL，在13，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入I. 5mL的IXPBS重懸，在13，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，保留沉澱。加入50 μ L滅菌水，放在100°C水浴中煮沸10分鐘，所得溶液即為樣本DNA的溶液，可直接用於進行螢光定量PCR反應。取上清2 μ L，以結核分枝桿菌標準菌株(源自ATCC27294，美國標準菌種保藏中心)提取的DNA為陽性對照，無菌蒸餾水為陰性對照，利用本發明的試劑盒，並按照上述檢測靈敏度測試中所述的反應體系和條件進行實時螢光定量PCR反應。反應結束後，分析PCR檢測結果，得到每個樣本的Ct _值、陽性標準品的Ct 值以及陰性對照的Ct水值(Ct為域值循環數，且Ct標準 35)，若Ct樣本值 35，或者無擴增信號，則為陰性結果，表明樣本中無結核分枝桿菌。根據圖4所示的反應曲線可以看出，陽性標準品和臨床採集的樣本均呈現出明顯的擴增曲線，表明該臨床痰液樣本中含有結核分枝桿菌。進一步根據公式copies =標準品拷貝數*2_Λα,式中ACt = Ct
可以計算得到樣本中所含結核分枝桿菌的拷貝數。
權利要求
1.一種用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的引物對，其特徵在於，該引物對包括上遊引物和下遊引物，所述上遊引物具有如SEQ ID No: I所示的序列或其互補鏈，或這兩個序列向5』端方向延伸10個鹼基範圍內得到的序列或其互補鏈；所述下遊引物具有如SEQIDNo 2所示的序列或其互補鏈，或這兩個序列向3』端方向延伸10個鹼基範圍內得到的序列或其互補鏈。
2.一種用於實時螢光定量PCR檢測結核分枝桿菌的探針，其特徵在於，該探針具有如SEQ ID No :3所示的序列或其互補鏈，或這兩個序列向3』端方向延伸10個鹼基範圍內得到的序列或其互補鏈；且該探針的5』端連接有一個螢光報告基團，3』端連接有一個螢光淬滅基團。
3.一種用於實時突光定量PCR檢測結核分枝桿菌的試劑盒,其特徵在於，包含有權利要求I所述的引物對和權利要求2所述的探針。
4.一種用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量PCR方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)採集患者痰液樣本，並進行處理； 2)提取樣本中的DNA； 3)以結核分枝桿菌標準菌株提取的DNA為陽性對照，以滅菌水為陰性對照，利用權利要求I所述的引物對和權利要求2所述的探針，對樣本DNA進行實時螢光定量PCR反應，測定樣本和標準品的Ct值； 4)根據步驟3)的測定結果，判斷樣本中是否含有結核分枝桿菌，並計算樣本所含結核分枝桿菌的拷貝數。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟I)中，樣本的處理，包括以下步驟 取2 3mL樣本，加入I 4倍體積的4%氫氧化鈉，混勻，室溫液化O. 5 3小時，至樣本變為透明溶液；取已液化的痰液樣本I I. 5mL,放入I. 5mL滅菌PE管中，10, 000 15, OOOrpm離心5 10分鐘,棄上清；沉澱加入ImL生理鹽水重懸，10, 000 15，OOOrpm離心5 10分鐘，棄上清；沉澱用於進行DNA的提取。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟2)中，樣本DNA的提取，按照以下任意一種方法進行 (1)向步驟I)處理得到的樣本沉澱中加入50 100μ L滅菌水，放在100°C水浴中煮沸10 15分鐘，得到樣本DNA的溶液，取上清2 4 μ L直接用於進行螢光定量PCR反應； (2)採用商業化的細菌DNA提取試劑盒，在步驟I)處理得到的樣本沉澱中加入50μ L的裂解液重懸，按照試劑盒說明書的操作步驟提取樣本DNA。
7.根據權利要求4-6任何一項所述的方法，其特徵在於，步驟3)中，實時螢光定量PCR反應採用20 μ L的反應體系，反應液中包含2XPCR Master Mix 10 μ L，10 μ mol/L的上、下遊引物各 O. 2 0.6 μ L，10 μ mol/L 探針 O. 6 I. O μ L，50 X ROX Reference Dye 0. 4μ L,結核分枝桿菌DNA模板I 3 μ L，用滅菌水補充至總體積20. OyL,反應溶液在冰上配製。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟3)中，PCR反應條件為95°C，30秒；然後進行40個循環95°C，5秒，60°C，31秒。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測結核分枝桿菌的實時螢光定量PCR方法，包括步驟1)採集患者痰液樣本並進行處理；2)提取樣本的DNA；3)以標準菌株的DNA為陽性對照，滅菌水為陰性對照，進行樣本DNA的實時螢光定量PCR反應；4)根據反應得到的Ct值判斷樣本的檢測結果，並計算樣本中結核分枝桿菌的拷貝數。本發明還公開了上述檢測方法所用的引物和探針以及包含該引物和探針的試劑盒。該檢測方法簡便、快速且特異性高，可以實現臨床痰液樣本中結核分枝桿菌的快速定量檢測，從而有助於疾病的預防和及時治療。
文檔編號C12Q1/06GK102952850SQ20111024076
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月22日 優先權日2011年8月22日
發明者張春秀, 朱建民, 陳金絲, 周穎, 周佳菁, 李先茜, 肖華勝 申請人:上海生物晶片有限公司, 上海伯豪生物技術有限公司, 上海市徐匯區中心醫院