食用菌和植物雙鏈rna病毒檢測試劑盒及其應用的製作方法
2024-02-26 22:20:15
專利名稱：食用菌和植物雙鏈rna病毒檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒，屬於病毒學、分子生物學領域。
背景技術：
1979年Morris和Dodds成功的將雙鏈RNA(double-stranded RNA，簡稱dsRNA)技術用於植物和真菌病毒的研究中，雙鏈RNA技術的基本方法是將去垢劑、抗氧化劑及螯合劑的緩衝液及有機溶劑加人充分破碎的植物組織中，使其變性去除蛋白質，並使雙鏈RNA在適當乙醇濃度下與纖維素粉結合，再洗脫去除DNA及單鏈RNA，從而獲得純化雙鏈RNA，純化的雙鏈RNA可通過電泳分析及其它手段鑑定其性質。大多數植物病毒在組織中複製時會產生雙鏈RNA，而正常的植物中往往不產生，且雙鏈RNA對酶具有一定的抗性，因而較易操作。不同病毒組中的病毒由於它們的基因組結構差異較大，因而在植物組織中產生的雙鏈RNA具有特異性，而同一組內病毒產生的雙鏈RNA具有一定的相似形，因此通過對植物組織中雙鏈RNA的分析，可用於植物病毒的檢測和診斷等研究中。近年來，雙鏈RNA技術已日趨完善，由於從植物組織中提取雙鏈RNA方法簡單，不需要特殊設備，研究周期短，因而已被廣泛應用於植物病毒研究中。食用菌中大部分病毒的基因組也屬於雙鏈RNA，因此，此方法也可運用於食用菌，如平菇，雙孢蘑菇等。由於VLPs(virus-likeparticles，病毒樣顆粒)不是總是存在的，有些雙鏈RNA是裸露的，雙鏈RNA技術更能快速、靈敏地檢測出雙鏈RNA病毒的存在。在國外，已經使用此方法成功地檢測到平菇中的雙鏈RNA基因組，即糙皮側耳(平菇)病毒I，它的基因組有兩個片段，雙鏈RNA-1和dsRNA-2，長度分別為2296和2223bp。推測的胺基酸序列與兩分體病毒科(Partitiviridae)相似，其中雙鏈RNA-1編碼RdRp，雙鏈RNA-2編碼衣殼蛋白。大約90％的植物病毒基因組為單鏈RNA，當病毒侵染植物後利用寄主成分進行複製時，首先產生與基因組RNA互補的鏈，配對成雙鏈模板，再以互補鏈為模板轉錄出子代基因組RNA，互補鏈的長度與基因組RNA相同。這種雙鏈RNA(double-stranded RNA，簡稱雙鏈RNA)結構稱為複製型分子(RF)，可在植物組織中積累起來。有些病毒基因組為雙鏈RNA，因而複製後會產生大量的子代雙鏈RNA基因組，而正常的植物中往往不產生。故此，雙鏈RNA技術有很大的應用空間。該方法的另外一個優點是，可以利用瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測的雙鏈RNA做進一步的理論分析。我們可以利用RT-PCR反轉錄RNA進行測序，分析其基因的結構、功能以及其進化樹；鑑定其所屬的科、屬、種；歸類其相似性，探詢其規律。同時，有助於我們從分子水平上了解雙鏈RNA複製、進化的機制，為更好的脫毒做好準備。現在的食用菌和植物病毒的有電鏡法、電泳法、血清學方法、酶聯免疫吸附分析法、酶學法等方法，然而，電鏡法的應用需要提取病毒顆粒，操作繁瑣，且有些病毒是裸露的dsRNA，所以該方法雖然可靠，但不是一種簡便的方法；血清學法，手續較多，在病毒濃度較低時，製備的抗血清效價不高，檢測效果不理想，特異性不強，不適於ELISA或免疫電鏡檢測。酶聯免疫吸附分析法雖然適用於無症狀而有病毒的蘑菇、香菇、平菇等食用菌栽培菌株的檢測，但需要抗體的製備，並連接在特定的酶上進行信號的放大，是以病毒顆粒和dsRNA的提取為基礎的；酶法的檢測是提取總的核苷酸，包括DNA、dsRNA、ssRNA，然用酶去除DNA和ssRNA，此方法在純化dsRNA時，容易損失，且在RNase A酶切ssRNA和dsRNA時不容易控制，會出現樣品被汙染的情況。
發明內容
本發明的目的在於提供一種簡便地檢測食用菌和植物雙鏈RNA病毒的試劑盒，並能應用於相關的病毒分子生物學研究方面。
為了達到上述目的，本發明的技術方案在於採用了一種食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒，它包含有以下藥物(1)提取緩衝液，由去垢劑、抗氧化劑及螯合劑組成的提取緩衝液，具有高鹽、高pH值的物質，所述的提取緩衝液成分包括(a)GPS 0.2M甘氨酸、0.1M磷酸氫二鈉、0.6M氯化鈉，pH＝9.5；(b)STE 0.1M氯化鈉、0.05M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.001M乙二胺四乙酸(EDTA)pH＝8；(c)10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)；(d)β-巰基乙醇；(2)提取雙鏈RNA的藥物(a) 飽和酚/氯仿/異戊醇體系，其中氯仿/異戊醇的體積比為25/1(b) 乙酸鈉3M(3)純化的藥物(a) 纖維素(b) 含15％的1×STE緩衝液(c)玻璃纖維；
(4)雙鏈RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測藥物(a)TAE 2M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1M乙酸、0.1M乙二胺四乙酸 (EDTA)(b)2×SSC 0.3M氯化鈉、0.03M檸檬酸鈉(c)RNA酶A 100ug/ml(d)DNA酶I(RNase free)(e)分子marker(λ噬菌體DNA HindIII)(f)6×loading buffer(6×上樣緩衝溶液)。
同時，本發明的技術方案還在於採用了一種食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，包括常規樣品的收集，雙鏈RNA基因組提取、純化，其中具體包括以下步驟(1)樣品的收集用巴氏漏鬥將培養好的菌絲收集，收集時用無菌超純水洗滌3次，用濾紙吸去過多的水分，存放在4℃冰箱中，用時取出；或者採集植物組織、食用菌的子實體，裝在密封袋中，存放在4℃冰箱中，用時取出；(2)所用的樣品，懷疑存在病毒，或者有病變的症狀；(3)提取緩衝液的配製所用的水為超純水，STE配製為50×STE貯存液，用時稀釋為不同倍數的STE工作液。菌絲提取時用GPS緩衝液，植物組織和子實體提取時用STE緩衝溶液；(4)提取雙鏈RNA藥物乙酸鈉溶液配製用水為超純水；(5)TAE配製為50×的貯存液；(6)RNA酶A配製為100mg/ml的貯存液；(7)DNA酶I(RNase free)反應體系10×DNase buffer，DNase酶I；
(8)雙鏈RNA的提取(a)收集樣品(b)加入提取緩衝溶液，每克樣品加入1ml的GPS或者STE，0.1ml的10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1ml的β-巰基乙醇(c)每克樣品中再加1ml的飽和酚，0.5ml的氯仿/異戊醇(25/1)，在研砵中研磨成勻漿，在冰上放置30min，偶爾輕輕的搖動形成乳濁液(d)離心(e)取上層淡黃色的水相，調整乙醇的濃度為15％(9)雙鏈RNA的純化(a)稱取1.5g CF-11纖維素粉末，加入上e步驟中的溶液中，混合均勻(c)用專用的轉移纖維素塑料的藥匙轉入一次性注射器中，注射器底部有玻璃纖維(d)用150ml含15％的1×STE緩衝液進行洗脫，棄洗脫液(e)再用10ml的1×STE緩衝液洗脫，收集洗脫液(f)加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的2M的乙酸鈉(pH6.0)溶液，-20℃條件下過夜沉澱雙鏈RNA(g)離心雙鏈RNA，重懸浮於100ul雙蒸水中(10)雙鏈RNA的檢測(a)酶切反應體系(a.1)DNA酶I(RNase free)反應體系(20ul)樣品10ul10×DNase buffer2ul
DNase酶I 1ul超純水7ul(a.2)RNA酶A反應體系(20ul)樣品 10ulRNA酶A1ul2×SSC或者0.1×SSC9ul(b)用適量的苯酚(1～5ul)是酶失活而終止反應(c)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
根據樣品的不同，菌絲體用GPS，子實體和植物組織用STE，可選用的範圍1～5×STE。
離心條件為在高速冷凍離心機8000r/min(4℃)，離心20min。
調整乙醇的濃度可為15～17％。
洗脫過程中測量洗脫液中的核苷酸的吸光值，波長為262nm，直至吸光值為零，3克的菌絲體大約為150ml。
離心dsRNA的條件為12000 r/min，20min，4℃。
RNA酶A在2×SSC反應溶液中，只降解ssRNA，而在0.1×SSC反應溶液中可以降解ssRNA(單鏈)和雙鏈RNA，從而驗證是否是雙鏈RNA。
電泳檢測可用0.8--1.5％的瓊脂糖凝膠或者6％的聚丙烯醯胺。
用適量的苯酚(1～5ul)使酶失活而終止反應後可直接上樣於瓊脂糖凝膠或者聚丙烯醯胺凝膠電泳。
由於雙鏈RNA對酶具有一定的抗性，因而較易操作。採用本發明的試劑盒不但能檢測出病毒顆粒中的雙鏈RNA，也可檢測出裸露的雙鏈RNA；本發明中可以利用瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測的雙鏈RNA做進一步的理論分析。採用本發明的試劑盒不需要特殊設備，研究周期短，簡便、快速、靈敏，能在較少的樣品中檢測到病毒，不容易出現假陽性。本發明可以廣泛的應用於食用菌和植物雙鏈RNA病毒的檢測，為脫毒菌種和脫毒苗的生產、製備，以及為防止病毒危害提供了有利手段。
本發明的dsRNA技術是很具有優勢的，簡便、快速、高效，方法簡單，不需要特殊設備，研究周期短，以下的是此技術最大的優點(1)dsRNA對酶具有一定的抗性，因而較易操作。
(2)不但能檢測出病毒顆粒中的dsRNA，也可檢測出裸露的dsRNA。
(3)可以利用瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測的dsRNA做進一步的理論分析。
圖1為本發明的應用實施例1的電泳圖；圖2為本發明的應用實施例1的另一電泳圖；圖3為本發明的應用實施例2的電泳圖。
具體實施例方式
製備食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒實施例試劑盒中常規試劑除外，其它藥物敘述如下本施例中的試劑盒是以3克菌絲為標準的，可用20次(1)提取緩衝液(a)60ml的GPS(b)300ml的20×STE
(c)6ml的10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)(d)6ml的β-巰基乙醇(2)提取雙鏈RNA的藥物(a)60ml飽和酚(b)3ml的氯仿/異戊醇(25/1)(3)純化的藥物及儀器(a)30克的纖維素(b)30克的玻璃纖維(c)20個一次性注射器(d)20個專用的轉移纖維素塑料的藥匙(e)3個洗脫時專用固定一次性注射器的支架(4)雙鏈RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測藥物(a)200ml的50×TAE(b)200ul的2×SSC(c)40ul的RNA酶A(d)20次的DNA酶I(RNase free)(e)1.5ml的分子marker(λ噬菌體DNA HindIII)(f)1.5ml的6×loading buffer將上述藥物總裝於試劑盒。
應用實施例1(1)菌絲的收集接種，上搖瓶培養7～9天，然後用紗布(四層)或布氏漏鬥過濾，用無菌雙蒸水洗滌3次，把獲得的菌絲放在--20℃條件下凍存；
(2)菌絲得研磨取3.0g菌絲，加入提取緩衝液在研砵中充分研磨；提取緩衝液，GPS 1mL/g菌絲，等體積的飽和酚(1ml/g)，1/2體積的氯仿/異五醇(25/1，0.5ml/g)，1/10體積濃度為10％的SDS(0.1ml/g)，1/10體積的β-巰基乙醇(0.1ml/g)，研磨成勻漿後，在冰上放置30min，偶爾輕輕的搖動形成乳濁液；(3)離心研磨混合液用高速冷凍離心機在8000r/min(4℃)，離心20min，保留上層淡黃色的水相，加入無水乙醇使其最終的濃度為15％；(4)過柱稱取1.5g CF-11纖維素粉末，加入以上混和液中，混勻後倒入10ml注射器內(下墊有剪碎的玻璃纖維)；用150ml含15％的1×STE緩衝液進行洗脫，棄去洗脫液，再用10ml的1×STE緩衝液洗脫，收集洗脫液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的2M的乙酸鈉(pH＝6.0)溶液，-20℃條件下過夜沉澱得雙鏈RNA；(5)離心12000r/min，20min，4℃，收集沉澱(室溫下乾燥)，然後重懸浮於100ul雙蒸水中；(6)電泳採用1％的瓊脂糖凝膠電泳(恆壓60V)，至溴酚藍前沿接近膠板下邊緣為止，然後用溴化乙錠溶液染色10-30min，拍照，觀察雙鏈RNA的帶型。如圖2所示，提取的平菇的dsRNA病毒，第一個泳道是以λ噬菌體DNAHindIII做的分子marker；第二、三個泳道是平菇dsRNA。圖1中，第一泳道以λ噬菌體DNA HindIII做的分子marker；第二泳道為DNase I酶切平菇dsRNA；第三泳道是RNaseA在0.3M NaCl下酶切平菇dsRNA；第四泳道是RNaseA在15mM NaCl下酶切平菇dsRNA；第五個泳道是DNase I酶切marker。
應用實施例2(1)植物組織的採集採集懷疑與病毒有關的病變症狀植物組織；(2)植物組織研磨取10克的植物組織放入研砵中，加入液氮，快速地充分研磨成粉末，加入提取緩衝液，GPS，1mL/g植物組織。等體積的飽和酚(1ml/g)，1/2體積的氯仿/異五醇(25/1，0.5ml/g)，1/10體積濃度為10％的SDS(0.1ml/g)，1/10體積的β-巰基乙醇(0.1ml/g)，在冰上放置30min，偶爾輕輕的搖動形成乳濁液；(3)離心研磨的混合液用高速冷凍離心機在8000r/min(4℃)，離心20min，保留上層淡黃色的水相，加入無水乙醇使其最終的濃度為15--17％；(4)過柱稱取1.5g CF-11纖維素粉末，加入以上混和液中，混勻後倒入10ml注射器內(下墊有玻璃纖維)；用150ml含15-17％的1×STE緩衝液進行洗脫，棄去洗脫液，再用10ml的1×STE緩衝液洗脫，收集洗脫液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的2M的乙酸鈉(pH6.0)溶液，-20℃下過夜沉澱dsRNA；(5)離心12000r/min，20min，4℃，收集沉澱(室溫下乾燥)，然後重懸浮於100ul雙蒸水中；(6)電泳採用1％的瓊脂糖凝膠電泳(恆壓60V)，至溴酚藍前沿接近膠板下邊緣為止。然後用溴化乙錠溶液染色10～30min，拍照，觀察dsRNA的帶型。
圖3為平菇子實體中提取的dsRNA，第一泳道為第一個泳道是以λ噬菌體DNA HindIII做的分子marker；第二、三泳道為平菇子實體中的dsRNA。由於平菇的子實體與植物組織相似，所以此方法完全可以應用於植物dsRNA病毒的檢測。
最後所應說明的是以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
權利要求
1.食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒，其特徵在於，它包含有以下藥物(1)提取緩衝液由去垢劑、抗氧化劑及螯合劑組成的提取緩衝液，具有高鹽、高pH值的物質，所述的提取緩衝液成分包括(a)GPS 0.2M甘氨酸、0.1M磷酸氫二鈉、0.6M氯化鈉，pH＝9.5；(b)STE 0.1M氯化鈉、0.05M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.001M乙二胺四乙酸(EDTA)pH＝8；(c)10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)；(d)β-巰基乙醇；(2)提取雙鏈RNA的藥物(a)飽和酚/氯仿/異戊醇體系，其中氯仿/異戊醇的體積比為25/1(b)乙酸鈉3M(3)純化的藥物(a)纖維素(b)含15％的1×STE緩衝液(c)玻璃纖維；(4)雙鏈RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測藥物(a)TAE 2M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1M乙酸、0.1M乙二胺四乙酸(EDTA)(b)2×SSC 0.3M氯化鈉、0.03M檸檬酸鈉(c)RNA酶A 100ug/ml(d)DNA酶I(RNase free)(e)分子marker(λ噬菌體DNA HindIII)(f)6×loading buffer(6×上樣緩衝溶液)。
2.一種如權利要求權所述的食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，包括常規樣品的收集，雙鏈RNA基因組提取、純化，其特徵在於(1)樣品的收集用巴氏漏鬥將培養好的菌絲收集，收集時用無菌超純水洗滌3次，用濾紙吸去過多的水分，存放在4℃冰箱中，用時取出；或者採集植物組織、食用菌的子實體，裝在密封袋中，存放在4℃冰箱中，用時取出；(2)所用的樣品，懷疑存在病毒，或者有病變的症狀；(3)提取緩衝液的配製所用的水為超純水，STE配製為50×STE貯存液，用時稀釋為不同倍數的STE工作液。菌絲提取時用GPS緩衝液，植物組織和子實體提取時用STE緩衝溶液；(4)提取雙鏈RNA藥物乙酸鈉溶液配製用水為超純水；(5)TAE配製為50×的貯存液；(6)RNA酶A配製為100mg/ml的貯存液；(7)DNA酶I(RNase free)反應體系10×DNase buffer，DNase酶I；(8)雙鏈RNA的提取(a)收集樣品(b)加入提取緩衝溶液，每克樣品加入1ml的GPS或者STE，0.1ml的10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1ml的β-巰基乙醇(c)每克樣品中再加1ml的飽和酚，0.5ml的氯仿/異戊醇(25/1)，在研砵中研磨成勻漿，在冰上放置30min，偶爾輕輕的搖動形成乳濁液(d)離心(e)取上層淡黃色的水相，調整乙醇的濃度為15％(9)雙鏈RNA的純化(a)稱取1.5g CF-11纖維素粉末，加入上e步驟中的溶液中，混合均勻(c)用專用的轉移纖維素塑料的藥匙轉入一次性注射器中，注射器底部有玻璃纖維(d)用150ml含15％的1×STE緩衝液進行洗脫，棄洗脫液(e)再用10ml的1×STE緩衝液洗脫，收集洗脫液(f)加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的2M的乙酸鈉(pH6.0)溶液，-20℃條件下過夜沉澱雙鏈RNA(g)離心雙鏈RNA，重懸浮於100ul雙蒸水中(10)雙鏈RNA的檢測(a)酶切反應體系(a.1)DNA酶I(RNase free)反應體系(20ul)樣品10ul10×DNase buffer2ulDNase酶I1ul超純水 7ul(a.2)RNA酶A反應體系(20ul)樣品10ulRNA酶A 1ul2×SSC或者0.1×SSC 9ul(b)用適量的苯酚(1～5ul)是酶失活而終止反應(c)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於根據樣品的不同，菌絲體用GPS，子實體和植物組織用STE，可選用的範圍1～5×STE。
4.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於離心條件為在高速冷凍離心機8000r/min(4℃)，離心20min。
5.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於調整乙醇的濃度可為15～17％。
6.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於洗脫過程中測量洗脫液中的核苷酸的吸光值，波長為262nm，直至吸光值為零，3克的菌絲體大約為150ml。
7.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於離心dsRNA的條件為12000r/min，20min，4℃。
8.權利要求7所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於RNA酶A在2×SSC反應溶液中，只降解ssRNA，而在0.1×SSC反應溶液中可以降解ssRNA(單鏈)和雙鏈RNA，從而驗證是否是雙鏈RNA。
9.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於電泳檢測可用0.8-1.5％的瓊脂糖凝膠或者6％的聚丙烯醯胺。
10.根據權利要求2所述食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒的應用，其特徵在於用適量的苯酚(1～5ul)使酶失活而終止反應後可直接上樣於瓊脂糖凝膠或者聚丙烯醯胺凝膠電泳。
全文摘要
本發明涉及一種食用菌和植物雙鏈RNA病毒檢測試劑盒及其應用，它包含有以下藥物(1)提取緩衝液；(2)提取雙鏈RNA的藥物；(3)純化的藥物；(4)雙鏈RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測藥物。由於雙鏈RNA對酶具有一定的抗性，因而較易操作。採用本發明的試劑盒不但能檢測出病毒顆粒中的雙鏈RNA，也可檢測出裸露的雙鏈RNA；本發明中可以利用瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測的雙鏈RNA做進一步的理論分析。採用本發明的試劑盒不需要特殊設備，研究周期短，簡便、快速、靈敏，能在較少的樣品中檢測到病毒，不容易出現假陽性。本發明可以廣泛的應用於食用菌和植物雙鏈RNA病毒的檢測，為脫毒菌種和脫毒苗的生產、製備，以及為防止病毒危害提供了有利手段。
文檔編號G01N27/447GK101086011SQ20061001792
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者邱立友, 李彥鵬, 戚元成, 高玉千, 王淑敏, 梁振普, 申進文, 陳鋼, 劉全軍 申請人:河南農業大學