一種肥胖症或脂肪肝治療藥物的製作方法

2024-01-20 18:59:15

專利名稱：：一種肥胖症或脂肪肝治療藥物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種肥胖症或脂肪肝治療藥物。
背景技術：
：淫羊藿常見於亞洲和地中海地區，是一種辛辣性觀賞草本植物。中國人稱之為淫羊藿，大致的意思為"放肆的山羊草"。淫羊藿是一個屬，包括多種相關植物，其中一些已作為藥用，包括箭葉淫羊藿、小檗科淫羊藿、大花淫羊藿和朝鮮淫羊藿。箭葉淫羊藿是一種重要的傳統中草藥，在中國、日本和韓國被廣泛用作滋補藥和抗風溼藥，並被證明能有效治療骨質疏鬆、心血管疾病和腫瘤。淫羊藿苷(ICA)(分子量為676)，一種黃酮醇糖苷，是箭葉淫羊藿的主要成分。近來有文獻報導，分離於淫羊藿的淫羊藿苷是一個神經介素U2受體(NeuromedinU2Receptor,NMU2R)的強力激動劑，能選擇性激活NMU2R。淫羊藿苷給予食物誘導的肥胖(DIO)小鼠可以抑制進食，並降低體重。NMU2R激動劑調節進食行為和能量平衡的分子機制和信號途徑尚不清楚。激動劑的一個可能效應是通過促腎上腺皮質釋放激素(CRH)信號途徑。已經表明，經腦室內給予CRH也能抑制大鼠進食。在(CRH)敲除的小鼠，神經介素U(NeuromedinU，NmU)對抑制攝食、增加耗氧量、調節體重的作用完全消失。在下丘腦室旁核(ParaventricularNucleus,PVN)區發現含有CRH的神經元。另外，NmU能刺激下丘腦釋放CRH。這些資料強烈提示，激活NMU2R可能增加CRH釋放，調節進食行為以及能量內平衡。進一步的研究，如NMU2R敲除小鼠或NMU-2R/CRH雙基因敲除小鼠的表型分析，可能有助於完全理解該受體的分子基礎和生理學功能。近來文獻報導，動物脂肪酸合成酶(FattyAcidSynthase,FAS)是肥胖和腫瘤的一個潛在治療靶標。鑑定新的FAS抑制劑一直引起人們很大的興趣。現已發現，黃酮類以可逆和不可逆方式抑制FAS。並且證實，一種綠茶生物活性黃酮類化合物表沒食子兒(EGCG)，通過減少能量吸收，增加脂肪氧化，可以使DIO小鼠變瘦。而且還發現，FAS抑制劑(淺藍菌素和一個合成化合物C75)經全身和腦室內處理小鼠，可抑制進食，顯著減輕體重。C75抑制下丘腦前期信號神經肽Y的表達，以來普汀(抗肥胖藥)依賴性方式發揮作用，似乎由丙二醯輔酶A介導。因此，FAS可能是飲食調節方面的一個重要鏈環，是一個潛在的治療靶標。有文獻報導(LiuJandLouYJ，JPharmBiomedAnal.2004Oct29;36(2):365-370;LiuJetal.，Pha謹zie，2005,60(2)，120—125)，淫羊藿苷已被生物轉化，至少被轉化成3種代謝產物淫羊藿次甙II(分子量為514)，淫羊藿素(分子量為368)以及去甲淫羊藿素(分子量為354)。但對淫羊藿素通過抑制FAS，從而抑制小鼠進食及減肥的研究未見報導。
發明內容本發明提供一種以淫羊藿素作為有效成分的肥胖症或脂肪肝治療藥物。肥胖症或脂肪肝治療藥物中也可含有治療有效量的淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。本發明人通過試驗證明淫羊藿素是一個非常有效的FAS拮抗物，給DIO小鼠口服淫羊藿素可強烈抑制進食，顯著減輕體重。小鼠試驗顯示，淫羊藿素給藥可降低肝臟的脂肪變性，並具有減輕脂肪變性肝臟缺血/再灌注損傷的程度。淫羊藿素具有被開發成一種肥胖症或脂肪肝治療藥物的巨大潛力。淫羊藿素的製備參考文獻報導(葉海湧等，浙江大學學報(醫學版)，2005，34(2):131-136)簡述如下將箭葉淫羊藿磨成粉末，用溶劑萃取，萃取物通過矽膠柱層析，用溶劑洗脫，可製得淫羊藿素前體淫羊藿苷。再按照下列示意的反應路線，將淫羊藿苷通過水解反應製得淫羊藿素。淫羊藿苷淫羊藿素淫羊藿素的藥理試驗l.體外試驗a)淫羊藿素具有抑制細胞脂肪酸生成的活性為了證實淫羊藿素抑制脂肪酸生成的活性，用不同濃度的淫羊藿素處理前列腺癌細胞LnCAP5小時，定量測定2-14C標記的醋酸鹽在細胞脂質中的摻入量。如圖1所示，0.5pM淫羊藿素抑制脂肪生成大於50%。更高濃度淫羊藿素以劑量依賴性方式減少脂肪酸生成。處理24小時後則進一步降低。b)淫羊藿素通過抑制FAS活性以降低細胞中脂肪酸生成為了證實淫羊藿素是一個FAS抑制劑，用不同濃度的淫羊藿素預處理LnCAP細胞蛋白質提取物，然後定量測定2-14C標記的丙二酸單醯輔酶A在脂肪酸中的掾入量。如圖2所示，0.5淫羊藿素在體外降低FAS酶活性，酶活性小於50%。Westernblot分析表明，淫羊藿素不影響FAS蛋白水平。因此證實抑制脂肪酸生成是抑制FAS酶活性的直接結果，而不是通過降低FAS表達實現的。2.淫羊藿素能使DIO小鼠強烈抑制進食和顯著減輕體重本試驗應用DIO模型評價淫羊藿素對來普汀(抗肥胖藥)抵抗的肥胖模型的作用。通過餵養C57BL6/J小鼠高脂肪飲食誘導肥胖症，高脂肪飲食中60%總熱量來自於脂肪。對照小鼠餵食低脂肪飲食，其中10%總熱量來源於脂肪。7周後，餵養高脂肪飲食的小鼠體重增加76±7%，而對照小鼠體重僅增加34±4%。如圖3所示，給予劑量為50mg/kg或100mg/kg淫羊藿素，第一天可使DIO小鼠攝食減少25%或50%。淫羊藿素處理小鼠的攝食抑制表現為劑量依賴性效應。但是，在整個試驗過程中淫羊藿素處理小鼠的這種攝食抑制並未呈現時間依賴性。儘管如此，在整個試驗過程中經淫羊藿素處理的DIO小鼠的體重不斷減輕(見圖4)。淫羊藿素處理動物的這種體重減輕具有劑量依賴性和時間依賴性。分析DIO小鼠身體組成的目的是確定淫羊藿素反覆給藥引起的體重減輕是否主要源於脂肪減少。如表1所示，在14天治療期間內，用100mg/kg和50mg/kg淫羊藿素分別處理的DIO小鼠，其身體脂肪重量失重差別明顯(-6.1g和-3.7g)。這些身體脂肪含量的差別正是淫羊藿素處理的DIO小鼠與對照小鼠之間體重差別的主要原因。3.淫羊藿素具有減輕脂肪變性肝臟缺血/再灌注損傷的程度通過組織學分析進一步證實淫羊藿素在保護脂肪變性肝臟免於缺血/再灌注損傷方面的作用。採用評定壞死的標準分析蘇木素和伊紅染色樣本(圖5)，每張切片觀察5個高倍視野，評分範圍從0(無凋亡)到4(融合病灶)。結果顯示，治療組動物的肝壞死指數為0.80(n=10)，較對照組的2.57(n=10)有顯著下降，給藥後肝壞死指數平均下降68.9%。為進一步鑑定淫羊藿素保護脂肪變性肝臟減輕缺血/再灌注損傷的能力，對口服淫羊藿素治療組小鼠接受缺血/再灌注損傷，然後測定血清丙氨酸氨基轉移酶水平，以確定淫羊藿素是否減輕了肝細胞損傷。血清丙氨酸氨基轉移酶水平見圖6，口服淫羊藿素小鼠治療組的血清丙氨酸氨基轉移酶水平明顯降低，為92.3IU/ml(n=10),而口服賦形劑對照組為1170IU/ml(n=10)。結果證實，與對照組相比，口服淫羊藿素的治療組可顯著保護肝臟，減輕缺血/再灌注的損傷。與痩鼠相比，脂肪變性肝臟的小鼠對伴有腸充血的全肝缺血/再灌注更敏感。實驗評估再灌注後24小時動物生存的情況治療組的生存率為100%，而對照組為65%,顯示生存率有顯著增加。4.淫羊藿素能降低肝臟的脂肪變性淫羊藿素能使脂肪變性的肝臟降低缺血/再灌注損傷，為了闡明其作用機制，確定淫羊藿素是否減少ob/ob鼠的肝臟的脂肪變性，使用油紅O染色的定量分級評分。試驗結果顯示，缺血/再灌注前，未操作的對照組鼠樣本的脂肪變性百分比為50%，而淫羊藿素給藥的治療組鼠樣本的脂肪變性百分比明顯下降(18.5%)(圖7)(n=6)。此外，淫羊藿素給藥的肝臟從大泡性脂肪變改變為小泡性脂肪變。考慮到脂肪中可能有某些特別的成分對較高等級的脂肪變移植器官的衰竭的重要性，使用氣相色譜氫焰離子化檢測法測定肝臟的脂肪酸成分，軟脂酸和亞油酸含量如圖8和圖9(以標準曲線下面積顯示)所示。這兩種脂肪酸大量存在於脂肪變性的肝臟，他們的含量在淫羊藿素給藥後均明顯下降，缺血/再灌注前對照組的脂肪酸成分軟脂酸和亞油酸的標準曲線下面積各為6856和1823，而治療組各為2116.6和689。試驗證實淫羊藿素能降低肝臟中存在的脂肪酸量，即顯著降低肝臟的脂肪變性。此外還進行了下列試驗淫羊藿素在小鼠體內的藥代動力學試驗口飼給藥的淫羊藿素在4個小鼠體內的藥代動力學參數見表2,這些實驗數據說明淫羊藿素能在體內保持一定的藥物濃度，有利於治療肥胖症或脂肪肝的效果。給藥後淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗受試小鼠處死後進行病理分析，結果顯示，以單次劑量1000mg/kg和多次劑量200mg/kg(Q2DX15)給予淫羊藿素，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。由以上藥理試驗的效果證明，來源於天然物質中草藥箭葉淫羊藿的淫羊藿素具有抑制脂肪酸生成的活性；淫羊藿素是一個有效的FAS抑制劑，能通過抑制FAS活性以降低細胞中脂肪酸生成；淫羊藿素能使DIO小鼠強烈抑制進食和顯著減輕體重，且體重減輕具有劑量依賴性和時間依賴性；淫羊藿素具有減輕脂肪變性肝臟缺血/再灌注損傷的程度，應用ob/ob小鼠模型測定了淫羊藿素對缺血/再灌注損傷標記物血清丙氨酸氨基轉移酶，試驗結果圖6顯示治療組的血清丙氨酸氨基轉移酶水平較對照組明顯降低；淫羊藿素能降低肝臟中存在的脂肪酸量，即能顯著降低肝臟的脂肪變性。此外，淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗結果也顯示未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。因此淫羊藿素是一種有效的具有很大開發前景的肥胖症/或脂肪肝治療新藥，治療藥物中也可含有有效量的淫羊藿素及通常已知常規的可藥用載體和/或賦形劑。例如Captisol，作物油，羧甲基纖維素鈉。口服的有效劑量推薦為每天750-1000mg/體表面積M2，持續兩周為一療程。具體病例可由醫師根據病情調整。表1淫羊藿素處理對DIO小鼠身體組成的影響tableseeoriginaldocumentpage9注括號內為標準誤差平均值。表2淫羊藿素在小鼠體內的藥代動力學參數tableseeoriginaldocumentpage9圖1是LiiCAP細胞經淫羊藿素處理後的脂肪生成-淫羊藿素濃度曲線圖。圖2是LnCAP細胞經淫羊藿素處理後的脂肪酸合成酶-淫羊藿素濃度曲線圖。圖3是淫羊藿素抑制DIO小鼠攝食示圖。圖4是淫羊藿素治療導致DIO小鼠體重減輕示圖。圖5是對照組和治療組的壞死指數示圖。圖6是對照組和治療組的血清丙氨酸氨基轉移酶水平示圖。圖7是對照組和治療組的脂肪變性百分比示圖。圖8是對照組和治療組的肝臟中脂肪酸(軟脂酸)的含量示圖。圖9是對照組和治療組的肝臟中脂肪酸(亞油酸)的含量示圖。具體實施方式實施例1淫羊藿素的製備(參見葉海湧等，浙江大學學報(醫學版)，2005，34(2):131-136)取在中國南部山區採集獲得的箭葉淫羊藿2kg磨成粉末，然後用95%乙醇(10L)萃取。獲得250g濃縮原料，然後用2.5L氯仿、乙酸乙酯和n-丁醇進一步萃取。將8g乙酸乙酯萃取物和10gn-丁醇萃取物裝入矽膠層析柱，用CHC13-MeOH-HC00H(15:1:0.5)和CHCl3_Me0H(8:2)分別洗脫。通過這一過程，可製得300mg淫羊藿素和去甲淫羊藿素前體淫羊藿苷。然後按照以下簡要描述的方法將前體水解，即可製得淫羊藿素。溶液A:將80mg前體超聲溶解於18ml甲醇溶液中；溶液B:500U(0.433g)纖維素酶溶於180ml(0.1mol/L)，pH5.0乙酸緩衝液中。一邊攪拌一邊將溶液A緩慢加入溶液B中，然後將所得混合物在37°C的振蕩水浴中孵育過夜，以充分水解連接在前體上的葡萄糖和鼠李糖。第二天用三份等體積(約200ml)的乙酸乙酯萃取，並將有機物層在旋轉蒸發儀上真空乾燥得淫羊藿素(150mg)。實施例2用(2-14C)醋酸鹽摻入法測定淫羊藿素對細胞脂肪酸生成的抑制活性用不同濃度的淫羊藿素處理LnCAP細胞5小時或24小時後，2-"C標記的醋酸鹽(57mCi/mmol;2)iCi/dish;AmershamBiosciences)加入LnCAP細胞培養基中。孵育4小時後，收集細胞和培養基，重懸離心收集的細胞於O.SmlPBS。應用BlighDyer法(SwinnenJ.V.etal.，Endocrinology1996;137:44684474)抽提脂類，通過閃爍計數法定量測定細胞脂類的(2-14C)醋酸鹽摻入量。獲得的結果被標準化為樣品蛋白質含量。淫羊藿素處理LnCAP細胞後脂肪生成-淫羊藿素濃度曲線圖見圖l。實施例3淫羊藿素對LnCAP細胞提取物脂肪酸合成酶活性抑制的試驗利用LnCAP細胞蛋白抽提物測定FAS酶活性(BrusselmansK.etal.,JBiolChem.2005Feb18;280(7):5636-5645)。通過離心收集LnCAP細胞，重懸於低滲緩衝液中(lmMEDTA，20mMTris-HCl,pH7.5)，然後應用BCA法(Pierce)測定樣品蛋白質含量。等量的蛋白(50pg)與不同濃度的淫羊藿素(0.03-30pm)置於2.5ml磷酸鹽緩衝液(100mM,pH7.0)，在37。C預孵育30分鐘。之後加入20nl反應液[2.5mMNADPH，1.25mM乙醯-輔酶A，1.25mM丙二醯-輔酶A,0.02mM[2-"C]丙二醯-輔酶A(60mCi/mmol;PerkinElmerLifeSciences)],37。C再孵育15分鐘，加入3ml冰冷的lM鹽酸/甲醇混合液(6:4,V/V)終止反應，並用石油醚抽提脂肪酸，通過閃爍計數分析摻入2-"C的丙二醯輔酶A。結果如圖2所示。實施例4用淫羊藿素治療DIO小鼠抑制進食和減輕體重的試驗用高脂肪飲食(D12492)或低脂肪飲食(D12450B)(ResearchDiets,NewBrunswick,NJ)餵養C57BL6/J小鼠7周，製備DIO小鼠。高脂肪飲食中60%熱量是脂肪，以豬油為主，而低脂肪飲食只有10%熱量來源於脂肪。每周2次稱重。7周後，餵養低脂肪飲食的小鼠體重增加34±4%，而餵養高脂肪飲食的小鼠體重增加>70%，被定義為DIO小鼠。適應7天後，小鼠被隨機分成3個組第一組為對照組，每天腹腔內注射賦形劑1%羧甲基化纖維素鈉，共10天。第二組和第三組為治療組，用淫羊藿素(以1%羧甲基化纖維素鈉配製)治療，每天口服，分別為50mg/kg和100mg/kg，共10天。每天數次監視攝食情況，共5天。每天測定體重1次，共2周。抑制迸食和減輕體重結果見圖3和圖4。身體組成分析(見表1):處死動物，動物屍體貯存在-80'C。分析時取出，除去胃腸道，剩餘屍體在6(TC乾燥。溼重與乾重的差即為屍體水重。應用索克斯雷特萃取器和石油醚萃取脂質測定乾屍的脂肪量(ChenRZetal.,EurJPharmacol.2004Jul8;495(1):63-66)。萃取後乾重即為無脂肪餘重。去除內臟的屍重減去脂肪重即為無脂肪重。實施例5用淫羊藿素治療ob/ob小鼠(肥胖小鼠，n型糖尿病動物模型)脂肪變性肝臟缺血/再灌注損傷的試驗動物餵養6-8周成年雄性ob/ob小鼠(25-28g)購自Jackson實驗室(BarHarbor，ME)。每籠4隻，在溫度、光線均可控的房間內飼養，明暗周期為12小時，自由飲食。淫羊藿素給藥淫羊藿素用1%羧甲基纖維素鈉粉劑配製。治療組按100mg/kg口月艮5天。對照組用1%羧甲基纖維素鈉口服5天。缺血/再灌注按照文獻(ChavinKDetal.，JBiolChem，1999;274:5692-5700;ChavinKDetal.，AmJTransplant,2004;4:1440-1447)進行肝臟缺血/再灌注。簡述如下，戊巴比妥麻醉小鼠(50mg/kg)，小切口打開腹腔，暴露肝臟。以無創傷血管夾鉗閉肝門造成缺血。局部缺血15分鐘後解除血管夾，關閉腹腔，縫合切口。將小鼠轉至溫控的籠子中恢復，自由飲食。組織學染色試驗蘇木素和伊紅染色如文獻所述(PreeceA.，AManualforHistologicTechnicians.3rded.Boston,Mass:CarolinaPress;1985)，壞死的分級依照一個改良的評分標準(0-4)(NeilDAetal.,Transplantation,2001;71:1566-1572)。每張切片分析與中央靜脈有關的5個高倍視野。圖5是對照組和治療組的肝壞死指數示圖。血清丙氨酸氨基轉移酶測定在麻醉狀態下開胸，從右心房收集全血，室溫放置15分鐘待凝固，室溫3500g離心5分鐘，收集血清。然後測定血清丙氨酸氨基轉移酶活性，以RJ/ml表示。測定結果見圖6。紅油O染色試驗紅油O染色如文獻所述(LunaLG,editor,ManualofHistologicStainingMethodsoftheArmedForcesInstituteofPathology.3rded.NewYork,NY:McGraw-HillBlakistonDivision;1968)。使用紅油O染色的定量分級評分，圖7是對照組和治療組的脂肪變性百分比示圖。實施例6脂肪變性肝臟中的脂肪酸含量測定肝臟的脂肪酸含量測定使用氣相色譜氫焰離子化檢測法(GC/FID)(參見FioriniRNetal.,Hepatology，2003;38:562A)簡述如下將肝臟樣本製成勻漿，氯仿-甲醇(2:1)混合物提取脂質。勻漿經有機分離濾器分離，去除水分和肝臟勻漿。加入BF3-10n/。甲醇進行催化反應，將脂肪分解成自身成分脂肪酸甲酯。然後將試管置於蒸氣浴45分鐘，促使反應完成。樣本經氮蒸氣乾燥後，蓋封，冷凍(-8(TC)備用。分析前將其重新溶解於甲醇(500pl)，使用Agilent7683自動進樣器進樣，進樣口選擇脈衝不分流模式，Agilent6890氣相色譜儀，DB-5(內徑30mmx0.25mm，薄層厚度0.25)毛細管柱。柱溫保持在70°C2分鐘，而後溫度以每分鐘15'C的梯度增至300°C，保持12分鐘。氫焰離子化檢測法檢測。色譜峰通過對比FAME標準鑑定，肝臟的脂肪酸成分軟脂酸和亞油酸含量數據顯示為曲線下面積，以總蛋白校正。圖8和圖9分別是對照組和治療組肝臟中脂肪酸軟脂酸和亞油酸的標準曲線下面積示圖。權利要求1.一種肥胖症或脂肪肝治療藥物，其特徵在於該藥物是以淫羊藿素作為有效成份。2.如權利要求1所述的肥胖症或脂肪肝治療藥物，其特徵在於該藥物中含有治療肥胖症或脂肪肝的有效量的淫羊藿素及可藥用載體和/或賦形劑。全文摘要一種以淫羊藿素作為有效成分的肥胖症或脂肪肝治療藥物。藥理試驗效果證明淫羊藿素是一個有效的脂肪酸合成酶抑制劑；淫羊藿素能對DIO小鼠強烈抑制進食和減輕體重；淫羊藿素能降低肝臟的脂肪變性；淫羊藿素具有減輕脂肪變性肝臟缺血/再灌注損傷的程度。且淫羊藿素對小鼠的急性毒性試驗顯示無毒性。因此淫羊藿素是一種具有很大開發前景的肥胖症或脂肪肝的治療新藥。文檔編號A61P3/04GK101284000SQ200710039289公開日2008年10月15日申請日期2007年4月10日優先權日2007年4月10日發明者南張,殷正豐,邱日輝申請人:殷正豐;張南;邱日輝