檢測婦科癌症的方法
2024-01-20 18:33:15 1
專利名稱：檢測婦科癌症的方法
技術領域：
本發明背景婦科癌症如卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌及腹膜癌為美國和歐洲婦女中最常見的引起癌症死亡的原因。據估計1996年在美國僅卵巢癌就導致14800人死亡。這種悲慘結果至少部分由於不能在腫瘤發展的早期檢測卵巢癌。當卵巢癌在早期被診斷出時，其治癒率近90％。相反，對進展期疾病的婦女5年隨訪顯示不超過15％的較差的存活率。因此，早期診斷是最有效的改善卵巢癌預後的方法之一。
陰道超聲方法(transvaginal sonography)是目前用於檢測卵巢癌的已有技術中最靈敏的方法。然而，陰道超聲法是非特異性的，即它可以檢測良性瘤也可以檢測惡性腫瘤。因此，用陰道超聲法檢測卵巢腫瘤必須再經第二種能夠區分良性瘤與惡性瘤的診斷方法的檢測。此外，陰道超聲法是很昂貴的，因而不適於作為大量病人的普查。
一般，通過外科的方法例如由外科法取自病人的腫塊的活組織檢驗或腫塊的抽吸及細胞學檢驗來區分良性卵巢腫瘤與惡性卵巢腫瘤。然而，這些技術是高侵入性的、昂貴的，並且在用抽吸術時可導致癌變細胞釋放進入腹腔。
高分子量粘蛋白樣糖蛋白-抗原決定簇CA 125是現行篩查卵巢癌所選擇的血清生物標記。然而CA 125檢測受到兩個主要的限制。首先它不很敏感。例如，升高的血清CA 125水平，即高於臨界值(cut offpoint)35U/ml的水平存在於少於50％的卵巢癌Ⅰ期患者中(Taylor,K.J.W.及Schwartz,P.E.,「Screening for Early Ovarian Cancer,」Radiology,192:1-10,1994)。此外，CA 125檢測不是非常特異的。例如，約25％患有良性婦科疾病的患者也有CA 125血清水平的升高。另外，肝病如肝硬變儘管沒有腹水，血清CA 125水平仍升至高於35U/ml(Taylor,K.J.W.及Schwartz,P.E.,「Screening for Early Ovarian Cancer,」Radiology,192:1-10,1994)。
因而，期望有一種新的、簡便的、非侵入性的或邊緣侵入性的檢測婦科癌症，特別是卵巢癌症的方法，該方法應是對卵巢癌的早期階段足夠敏感的，並且對鑑別良性與惡性婦科癌症有足夠特異性的方法。
本發明概述本發明提供新的、簡便的、邊緣侵入性的用於檢測患者婦科癌症的存在的方法。該方法包括檢驗患者血漿樣品中溶血磷脂酸的存在。
優選的方法包括提供得自患者的血樣，由該血樣得到基本上不含血小板的血漿樣品，由該血漿樣品製備脂質提取物及在所述脂質提取物中檢測溶血磷脂酸的存在。因為本法在卵巢癌早期階段患者中對檢測卵巢癌是足夠靈敏的，對區分良性婦科與惡性婦科癌症有足夠特異性的且是邊緣侵入性的，因此該方法對篩查卵巢癌的患者特別有用。
本方法也用於檢測患者中子宮內膜癌、腹膜癌、及宮頸癌的存在。因而本方法對篩查多種婦科癌症是有用的。
也提供由生物體液(biological fluid)提取溶血磷脂酸的新方法。所述包括酸化生物體液並用有機溶劑由該酸化的樣品中提取溶血磷脂酸的方法可用於在生物體液中提取多於80％的溶血磷脂酸。本發明的詳細說明本發明提供新的、簡便的用於檢測患者婦科癌症特別是卵巢癌存在的方法。該方法包括檢測得自患者的血漿樣品中溶血磷脂酸的存在。優選該血漿樣品基本不含血小板。如此處所述，當在得自患者的原血樣中含有少於95％的血小板時，血漿樣品基本不含血小板。在優選的實施例中，所述方法包括提供得自患者的全血樣，由該全血樣得到基本上不含血小板的血漿樣品，由該血漿樣品提取脂質及檢測在所述脂質提取物中溶血磷脂酸的存在。
優選所述血漿樣品於存在所述全血樣中血小板最小釋放溶血磷脂酸的條件下得到。此種條件包括，例如，將患者的全血樣收集在含抗凝劑的試管中。合適的抗凝劑包括，例如，肝素和螯合劑。優選所述全血樣在螯合劑，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或枸櫞酸鈉的存在下收集，更優選EDTA，因為螯合劑既可減少所述樣品中磷酯酶的活性又可防止所述全血樣的血凝。
所述血漿一般由離心全血樣以沉澱全血樣中的血細胞並收集在全血樣中佔血漿主要部分的上清液得到。
優選所述血漿由下述方法得自所述血樣，所述方法包括，第一次離心步驟以提供血細胞和血小板的沉澱及第一次的上清液，及第二次離心步驟，其中第一次上清液經離心提供第二次血小板沉澱及血漿上清液。優選第一次離心步驟的速度在400-1000xg之間，更優選在約500-650xg之間，最優選在約550-約600xg之間。然後將所述上清液移出試管並以6500-10000xg之間，更優選在約7000-8500xg之間的速度第二次離心。該兩步離心方法減少了由血小板釋放溶血磷脂酸，並因此使得樣品中溶血磷脂酸的測定更精確。
然後優選通過由所述血漿樣品中回收至少80％溶血磷脂酸的脂質提取方法，提取在血漿樣品中的幾乎全部脂質，特別是磷脂。更優選該脂質提取方法回收血漿樣品中至少85％的LPA。優選的脂質提取方法的例子包括下述步驟酸化所述血漿樣品；與有機溶劑混合該酸化的血漿樣品得到水相和有機相，其中所述磷脂優先分布於有機相；及回收有機相得到一個在血漿樣品中含有多於80％的溶血磷脂酸的脂質提取物。優選用鹽酸酸化所述血漿樣品。優選在酸化的血漿樣品中最終酸的濃度為約0.2N-約2.0N，更優選約1.3N-約2.0N。
由酸化的血漿樣品中提取溶血磷脂酸的合適有機溶劑包括例如丁醇、異丙醇及包含極性有機溶劑如甲醇，和非極性有機溶劑如氯仿的混合有機溶劑。優選所述有機溶劑為甲醇和氯仿的比率是2∶1的混合物。
接著，在此也稱作「LPA」的所述溶血磷脂酸經使用常規技術例如，經薄層層析法分離由有機相的其它磷脂中分出。初步研究中的標準物包括溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯絲氨酸、溶血磷脂醯乙醇胺、及溶血磷脂酸、棕櫚醯-LPA、油醯-LPA和硬脂醯-LPA經單向平面TLC分離，該研究顯示LPA的Rf值對於棕櫚醯LPA和硬脂醯-LPA為0.14，對於油醯-LPA為0.13。初步研究也顯示每一類LPA位移的速率低於溶血磷脂醯膽鹼的並且以不同於溶血磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯絲氨酸、溶血磷脂醯乙醇胺的速率遷移。在磷脂標準物經雙向平面TLC的初步研究也顯示經此種方法即經單向平面TLC製備的LPA不含任何其它磷脂。
然後在LPA組分中的溶血磷脂酸用常規技術定量。所用的定量技術取決於受試者所提供的血樣的量。例如，如果所述血樣的量是2ml或更少，優選使用能夠檢測皮摩爾量的LPA的定量技術。合適的檢測皮摩爾量LPA的技術包括，例如，水解分離的LPA組分並接著通過氣相層析法定量水解物中的每一脂肪酸的量。如果所述血樣的量是20ml或更多，能夠檢測毫微摩爾量LPA的技術例如，LPA組分的全磷測定的方法是合適的。
此處介紹的方法可用於檢測婦科癌症如子宮頸癌、子宮內膜癌、腹膜癌及卵巢癌，即卵巢上皮癌。卵巢上皮癌包括漿液瘤、粘液瘤、子宮內膜瘤、透明細胞瘤、未分化癌、混合上皮瘤及未分類(unclassified)上皮瘤。
此處介紹的方法對於評估患者卵巢腫塊的惡性程度以及在患者腫瘤發展的早期(外科)階段，即外科Ⅰ期和Ⅱ期，及發展的後期階段，即外科Ⅲ期和Ⅳ期，檢測卵巢癌特別有用。外科分期表示疾病的嚴重程度，Ⅰ期為最輕程度，Ⅳ期為最嚴重程度。按照由InternationalFederation of Gynecology and Obsterics建立的標準，卵巢癌僅限於卵巢，在Ⅰ期卵巢癌中可以有或沒有腹水。在Ⅱ期有癌腫的骨盆擴散並可能擴散到子宮和輸卵管。Ⅲ期卵巢癌的特徵是腹腔轉移。Ⅳ期有腹腔外癌腫遠處轉移。
在此介紹的方法是簡單的、邊緣侵入性的及僅需要得自患者的血樣。因而這樣的方法對於篩查以前沒有被診斷患有癌症特別是具患婦科癌症尤其是卵巢癌危險性的患者也是有用的。此類患者包括有家族病史的高危婦女、不排卵周期的絕經前婦女及絕經後婦女。
本發明由下述實施例進一步說明。然而此類實施例並不解釋為任何意義上對本發明宗旨或範圍的限制。
實施例血漿樣品得自84位女性患者提供的血樣。用含有7.2mg EDTA的5ml真空接受管(vacutainer tube)由每一位患者收集大約2ml的全血樣。由全血樣得到血漿樣品全血樣以580xg離心5分鐘得到血細胞和血小板沉澱及上清液。所得上清液轉移至矽化微離心管，並以8000xg離心5分鐘得到第二次的沉澱及血漿上清液。所得血漿上清液或者立即進行試驗或者在-70℃儲存。由血漿樣品提取LPA脂質的提取，特別是由血漿樣品中提取LPA在0-4℃進行。每1ml血漿樣品通過加入0.2ml 12N的HCl酸化得到具有最終HCl濃度約為2.0N的血漿樣品。混合後，將4ml含有2∶1比例的甲醇/氯仿的混合有機溶劑加至該酸化的血漿中，並將該混合物渦旋混合1分鐘，在冰上孵育10分鐘。將1ml氯仿和1.25ml H2O加至該混合物中。充分混合後，該混合物於4℃、在1000xg離心10分鐘。下層有機層轉移至新的玻璃管中，並於40℃、在氮氣下乾燥得到磷脂提取物。
此提取方法的總回收率及重現性通過向三個平行的缺乏內源性油醯-LPA的血漿樣品中加入10nmol合成油醯-LPA來檢測。該樣品由本方法提取，並且每一樣品的油醯-LPA的量是定量的。此分析顯示由本提取方法的LPA的平均回收率為92.7％，相對標準誤差為±5.6％。脂質提取物中LPA的分離將每一份脂質提取物溶於50μl甲醇/氯仿為2∶1的混合物中，並將其置於得自EM Science,Darmstadt,Germany的預先鋪有矽膠60的TLC板(20×20cm，層厚250mm)上的單泳道(single lane)上。將50μl含有得自Avanti Polar-Lipids,Inc.的10-50μlg油醯-LPA的2∶1甲醇/氯仿的等份試樣置於該板的一外側的泳道上並將50μl含有得自Sigma ChemicalCompany的10-50μg溶血磷脂醯膽鹼的氯仿的等份試樣置於相對的對外側的泳道上。所述油醯-LPA和溶血磷脂醯膽鹼用作確定板上的LPA組分的位移參照。該脂質用氯仿-甲醇-氫氧化銨混合物(65∶35∶5.5)於室溫展開約3小時。然後外側含有油醯-LPA和溶血磷脂醯膽鹼標準物的泳道用0.1％的8-苯胺基-1-萘-磺酸噴塗並在紫外燈下顯色。
將在載有得自血漿樣品的脂質提取物的所述泳道上的每一份分離的LPA組分從板上刮下並分別置於得自Kimble,Vineland,NewJersey的15ml一次性玻璃離心管內。該LPA組分包括在板上的位移在相當於標準油醯-LPA的Rf的距離及延伸至小於標準溶血磷脂醯膽鹼的Rf的距離的所有脂質。測定每一份樣品分離的LPA的量將2ml 1M的醇制KOH加至含有分離的LPA組分的每一試管內。然後該試管於60℃孵育1小時，以水解試管中存在的LPA。冷卻後，將5μl含有二十二烷酸甲酯在氯仿中(1.5mg/ml)的內標溶液、1ml 6N的HCl、5ml H2O及5ml乙醚加至水解物中。將該混合物渦旋30秒，並於1000xg離心10分鐘。然後，將上層液轉移至新的玻璃管中，並在40℃於氮氣下乾燥。將含有得自LPA的脂肪酸的殘留物溶於0.6ml石油醚中，並且該溶解的脂肪酸經將1mlBCl3-甲醇試劑加入每一試管中並於100℃孵育10分鐘進行甲基轉移化。BCl3-甲醇得自Supelco Inc.,Bellefonte,PA.。所述脂肪酸甲酯用1ml石油醚提取。該混合物渦旋10秒鐘，並於1000xg離心5分鐘。上層轉移至3.7ml螺旋口(screw-topped)Supelco樣品管瓶中並在40℃於氮氣下乾燥。然後殘留物溶於25μl氯仿中，並用5-15μl氯仿進行氣相色譜分析。由LPA水解釋放的脂肪酸的GC分析使用配有熔融矽膠柱(25m×0.2mm)(在得自Supelco Inc.的100/120 Chromosorb WAW上塗有3％SP-2310,2％SP-2300)的Hewlett-Packard Model 5710A氣相色譜儀檢測每一樣品中的各個脂肪酸的量。氣相色譜條件如下色譜爐起始溫度是185℃；2分鐘後，溫度以2℃/分的速度升至230℃；並持續4分鐘；進樣器溫度為200℃；檢測器溫度為300℃；氮載氣的流動速率是30ml/分鐘，50 PSI；空氣流速為240ml/分鐘，24PSI；氫氣流速為30ml/分鐘，15PSI。使用離子焰檢測器檢測脂肪酸甲酯。使用得自Nu Check Prep.Inc.Elysian,MN.的兩種脂肪酸甲酯標準混合物製得標準曲線。所述兩種標準混合物包括棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、花生四烯酸甲酯及二十二烷酸(behanate)甲酯的不同組合。保留時間為對棕櫚酸甲酯是3.8分鐘，對硬脂酸甲酯是6.7分鐘，對油酸甲酯是7.3分鐘，對亞油酸甲酯是8.3分鐘，對花生四烯酸甲酯是14.0分鐘及對二十二烷酸甲酯(內標)是15.3分鐘。
在每一樣品中的各個脂肪酸的濃度經計算並相加得到每一血漿樣品中的總LPA濃度。每一樣品中的各類LPA及總LPA的濃度(μM)見表Ⅰ。
每一女性患者也經過一種或多種常規診斷方法以確定其是否健康或患有活動性疾病。該診斷方法包括，(合適時)臨床檢查、臨床化學及任何檢查到的腫塊的外科評價。在這些常規診斷方法的基礎上，患者被診斷為健康或為表Ⅰ中所列疾病之一的活動形式。
表Ⅰ實施例患者血漿中LPA濃度(μM
表Ⅰ，續
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表Ⅰ，續
LPA(P)棕櫚醯-LPALPA(S)硬脂醯-LPALPA(O)油醯-LPALPA(L)亞油醯-LPALPA(A)花生四烯醯(arachidyl)-LPALPA(D)二十二烷六烯醯(docosahexanyl)-LPAB.D.低於檢測N.A.不可得到診斷為患有婦科癌症的患者血漿中每一類LPA的平均濃度±SE及診斷為未患有婦科癌症的患者血漿中每一類LPA的平均濃度±SE見表Ⅱ。患有婦科癌症的患者血漿中LPA的平均濃度±SE及未患有婦科癌症的患者血漿中總LPA的平均濃度±SE見表Ⅲ。統計學效能(statistical power)計算通過由W.J.Conover在Practical Nonparametric中介紹的Wilcoxon Rank Sum統計學檢驗來完成。此處LPA水平在檢出水平以下時用0.1μm來計算。
表Ⅱ實施例患者血漿中單獨LPA種類的平均濃度
LPA(P)棕櫚醯-LPALPA(S)硬脂醯-LPALPA(O)油醯-LPALPA(L)亞油醯-LPALPA(A)花生四烯醯-LPALPA(D)二十二烷六烯醯-LPAB.D.低於檢測N.A.不可得到表Ⅲ患者血漿中總LPA的平均濃度(μM)
LPA(P)棕櫚醯-LPALPA(S)硬脂醯-LPALPA(O)油醯-LPALPA(L)亞油醯-LPALPA(A)花生四烯醯-LPALPA(D)二十二烷六烯醯-LPAB.D.低於檢測N.A.不可得到如表Ⅰ中所見，在每一位患有Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期卵巢癌的患者中發現其LPA總水平可檢測。這樣每一位診斷為具有早期卵巢癌或晚期卵巢癌的患者其血漿中LPA的水平是可檢測的。在患有卵巢癌的患者中沒有發現假陰性。對於Ⅰ期及Ⅱ期卵巢癌的患者LPA的總濃度範圍為4.67-32.32μM。對於Ⅲ期及Ⅳ期卵巢癌的患者LPA的總濃度範圍為2.53-56.17μM。此外，發現全部卵巢癌患者的硬脂醯LPA的水平可檢測，並且在19位卵巢癌患者中發現18位患者的LPA種類中的棕櫚醯-LPA和油醯-LPA的水平可檢測。
相反，在23位確定為健康的受試者中的19位，在其血漿中的LPA水平不可檢測。而剩下的4位健康受試者的血漿中僅有低濃度的LPA，範圍在0.42-4.93μM。尚不知道這些值是表示假陽性還是這些個體有用其他通常用於診斷患者的常規方法所不能檢測到的婦科癌症。另外，在診斷為患有卵巢癌的患者血漿中的總LPA及每一種LPA的平均濃度明顯高於健康者血漿中的總LPA及每一種LPA的平均濃度。這些結果確證本方法是高度靈敏的，並因此可用於鑑別這些患有卵巢癌的婦科腫瘤的患者，包括仍處於發展的早期階段的卵巢癌患者。本結果也顯示檢測患者血漿中棕櫚醯-LPA或硬脂醯-LPA或油醯-LPA或它們的組合的存在的方法也適用於檢測卵巢癌。
LPA也可在診斷為患有子宮頸癌及子宮內膜癌的每一位患者的血漿中檢出，及在9位診斷為患有腹膜癌患者中的8位的血漿中檢出。血漿中LPA水平沒有檢測出的一名患者的腹膜癌已經完全被去除(debulked)。這個結果顯示LPA在癌症已經完全由外科手術除去的患者血漿中是不存在的。這樣，本發明方法適用於監測經外科手術除去癌症的婦科癌症患者的復發。患有子宮頸癌及子宮內膜癌的患者的血漿中LPA的濃度範圍為2.00-63.23μM。
相反，在17位診斷為非婦科癌症的癌症，即乳腺癌、白血病及子宮肉瘤患者中的15位患者中不存在可檢測的LPA水平。此外，在任何患有良性婦科疾病子宮纖維瘤的患者中不存在可檢測的LPA水平。由於由4位患有源於結締組織的婦科肉瘤及患有良性子宮纖維瘤患者中的三位的血漿中不存在可檢測的血漿總LPA水平，因而據信各個婦科器官的惡性上皮細胞可能是患有卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌及腹膜癌的患者血漿中LPA的來源。
由於其靈敏性、簡單性及其低費用，本發明適用於篩查婦科癌症的患者。因為用於本發明的血樣和用於CA125試驗的血樣可同時由患者採集，在患者由本發明方法進行婦科癌症篩查的同時也可進行CA125試驗。另外，本發明方法也可單獨用於檢測婦科癌症。
因為LPA在良性婦科疾病的患者血漿中是不存在的，本發明方法對於患有婦科腫塊的患者區分良性婦科疾病與惡性婦科疾病是有用的。應用此種方法區分惡性與良性卵巢腫塊可減少患者進行的現今通用的診斷卵巢腫瘤惡性變的更貴的技術如陰道超聲法、或更具侵入性的技術，如腫瘤活組織檢驗或腫瘤抽吸術的需求量。
儘管本發明一直著眼於介紹許多優選的實施例，它們對於進行本發明的發明者而言構成現今已知最好的方式，應該理解對於在本領域具有常規技術的人員可以在不背離經權利要求限定的本發明的範圍的基礎上進行各種變化和修改是顯然易見的，該權利要求補充於此。
權利要求
1．包括下述步驟的檢測患者婦科癌症存在的方法，所述步驟如下(a)提供得自患者的血樣；(b)製備得自所述血樣的血漿樣品；及(c)檢測在所述血漿樣品中存在的溶血磷脂酸。
2．權利要求1的方法，其中所述婦科癌症選自卵巢癌、腹膜癌、子宮內膜癌、子宮頸癌及其組合。
3．權利要求1的方法，其中所述血漿樣品由所述血樣經包括下述步驟的方法製得，所述步驟如下(a)以介於400×g和1000×g之間的速度第一次離心所述血樣得到第一血細胞和血小板的沉澱及第一次的上清液；及(b)以介於6500和10000×g之間的速度第二次離心步驟(a)的第一次的上清液得到第二次沉澱和第二次的上清液；(c)收集由步驟(b)得到的所述第二次的上清液得到所述血漿樣品。
4．權利要求1的方法，其中在所述血漿樣品中存在的溶血磷脂酸經包括下述步驟的方法檢測(a)製備得自所述血漿樣品的脂質提取物；(b)檢測在所述脂質提取物中存在的溶血磷脂酸。
5．權利要求4的方法，其中在所述脂質提取物中存在的溶血磷脂酸經包括下述步驟的方法檢測(a)分離所述脂質提取物成磷脂組分；及(b)檢測在所述磷脂組分中存在的溶血磷脂酸。
6．權利要求4的方法，其中在所述脂質提取物中存在的溶血磷脂酸經包括下述步驟的方法檢測(a)分離所述脂質提取物成磷脂組分；及(b)檢測在所述磷脂組分中存在的棕櫚醯-LPA，或硬脂醯-LPA，或油醯-LPA或其組合。
7．權利要求1的方法，其中所述婦科癌症為卵巢癌。
8．權利要求3的方法，其中所述婦科癌症為卵巢癌。
9．權利要求4的方法，其中所述婦科癌症為卵巢癌。
10．權利要求5的方法，其中所述婦科癌症為卵巢癌。
11．包括下述步驟的由生物體液樣品提取LPA的方法(a)用足夠量的酸酸化所述生物體液樣品生成酸化的所述樣品，其中在所述樣品中酸最終的濃度為約0.2-2.0N；(b)用有機溶劑混合所述酸化樣品得到水相和有機相；(c)由所述有機相分離所述水相得到在所述生物體液樣品中含有大於80％的LPA的有機相提取物。
12．權利要求11的方法，其中所述生物體液樣品為基本上無血小板的血漿樣品。
13．權利要求11的方法，其中所述酸化樣品中酸的最終的濃度為約1.3-約2.0N。
14．包括下述步驟的檢測患者婦科癌症的方法(a)提供得自患者的基本上不含血小板的血漿樣品；(b)製備得自所述血漿樣品的脂質提取物；及(c)檢測在所述脂質提取物中存在的溶血磷脂酸。
15．權利要求14的方法，其中所述婦科癌症為卵巢癌。
全文摘要
本發明提供新的檢測患者存在的婦科癌症的方法。本方法包括檢測患者血漿樣品中存在的溶血磷脂酸,該方法適用於檢測卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌及腹膜癌。在一個優選的實施方案,該方法包括:由患者提供一份血樣、在使血樣中的血小板最少釋放溶血磷脂酸進入血漿的條件下由血樣獲得血漿樣品、從血漿提取脂質及檢測脂質提取物中的溶血磷脂酸的存在。也提供一個由生物體液提取溶血磷脂酸的新方法。該方法包括酸化生物體液並且由酸化的樣品和用有機溶劑從酸化樣品中提取溶血磷脂酸,該方法可以用於從生物體液中提取大於89%的溶血磷脂酸。
文檔編號G01N33/92GK1226316SQ97196733
公開日1999年8月18日 申請日期1997年5月30日 優先權日1996年5月30日
發明者徐燕, G·卡塞 申請人:克裡夫蘭診所基金會