重組胎兒彎桿菌n端表面膜蛋白及其編碼基因和應用的製作方法
2024-01-20 15:30:15 2
專利名稱：：重組胎兒彎桿菌n端表面膜蛋白及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白及其編碼基因，本發明還涉及該重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白在牛胎兒彎桿菌病血清學檢測中的應用，屬於動物疾病檢驗檢疫領域。
背景技術：
：胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)屬於彎桿菌屬的成員，包括胎兒彎桿菌胎兒亞種(C.fetussubsp.fetus)和胎兒彎桿菌性病亞種(C.fetussubsp.venerealis)。自McFadyean等(1913)從流產綿羊的陰道分泌物中分離到弧菌樣^t生物以來，國內外學者己對胎兒彎桿菌進行大量研究，發現胎兒彎桿菌呈世界性分布，是危害人或動物健康的重要病原微生物之一。胎兒彎桿菌叉稱胎兒弧菌，是一種革蘭氏陰性，一端或兩端鞭毛，不形成芽孢或莢膜，"S，，狀或螺旋狀的小彎桿菌，但在老齡培養物中可呈球形或螺旋狀長絲(由多個S形菌體形成的鏈)。胎兒彎桿菌胎兒亞種可引起牛羊的流產和不育，性病亞種專嗜牛的生殖道，破壞牛的胎盤，導致不孕；公牛感染後，症狀不明顯，但可以汙染精液，通過配種或人工授精等造成胎兒彎桿菌性病亞種的傳播。胎兒彎桿菌通過汙染的水源、食物、精液、流產的胎兒和糞便等進行傳播，非易感動物和鳥類可作為其感染的第二宿主。帶菌公牛、感染母牛和康復母牛是主要的傳染源。人，尤其患有免疫缺陷症的人，感染胎兒彎桿菌後能引起腦膜炎、菌血症、關節炎和腹瀉等疾病。因此，胎兒彎桿菌嚴重威脅著人類的健康並給畜牧業造成重大經濟損失。胎兒彎桿菌病的診斷方法有細菌學方法、分子生物學方法和免疫學方法等。目前，國內對於胎兒彎桿菌病的診斷方法主要依賴於生化實驗，例如氧化酶實驗(使用瓊脂平板表面經24h培養的生長物〔也可取用於抗生素試驗的平板〕，將氧化酶試劑滴於棉拭子上，並用棉拭子去接觸表面生長物，在接觸點出現深藍色斑點者為陽性。)，硫化氫產生試驗(將肉湯培養物接種於加有0.02%鹽酸半胱氨酸的基礎培養基,將一根浸有飽和乙酸鉛的濾紙條懸於試管的上部〔不讓濾紙條接觸培養基〕，旋緊試管帽，置空氣中於37'C培養。每日檢查,觀察濾紙條是否變黑,紙條變黑表明有硫化氫產生,為陽性反應。對未出現陽性反應者需培養5d,方可做出最後判斷)以及1%甘氨酸生長試驗等。病原分離是檢測傳染性疾病的常規方法，但是由於胎兒彎桿菌的生長需要嚴格的氣體環境和生化條件，且對採集的病料有特殊要求，這給胎兒彎桿菌的分離帶來很大困難。秦貞奎等(1987)建議用無菌的3.5%的02,10%的0)2，86.5。/。的N2來分離和培養胎兒彎桿菌。但一般的實驗室不具這種條件，且不易操作。另夕卜，胎兒彎桿菌在合適的培養基上也生長緩慢，既便得到了可疑菌落，用生化試驗來鑑定胎兒彎桿菌難度較大，因為其新陳代謝速度慢，適用的生化實驗少，且有些生物中間型更不易區別。由於胎兒彎桿菌分離難度大，花費時間長，且有一定的主觀性，不利於處理大量樣品。因此，研究檢測胎兒彎桿菌病的新方法，對於了解其在我國的分布和流行情況具有重要意義。隨著分子生物學的不斷發展，國外主要採用PCR方法，DNA指紋印跡，脈衝場凝膠電泳對胎兒彎桿菌進行分離鑑定。例如Oyofo等利用flaA基因保守區設計引物，用來檢測空腸彎桿菌和大腸彎桿菌。實驗結果表明:只有空腸彎桿菌和大腸彎桿菌的樣品出現450bp擴增產物，而胎兒彎桿菌、螺旋體等微生物無特異性擴增產物。該聚合酶鏈式反應能糹企測到0.0062pg純化的空腸彎桿菌或大腸彎桿菌的基因組DNA。這說明聚合酶鏈式反應在檢測空腸彎桿菌或大腸彎桿菌時具有特異性和敏感性。Vargas等(2003)利用PCR技術對胎兒彎桿菌亞型的分型進行了研究，在其研究過程中運用脈衝場凝膠電泳技術，並應用樹狀圖對其進行了分析。Re皿ie等用生化實驗和藥敏實驗研究分離自感染人的血液和糞便胎兒彎桿菌的差異，並通過脈衝電場凝膠電泳得到胎兒彎桿菌基因組DNA酶切後的基因圖譜來證實，這說明利用胎兒彎桿菌基因圖譜來發現和檢測其突變抹具有一定的意義。sloMasakiFujita等用內切酶Sa/I和SmaI分別酶切21林胎兒彎桿菌的基因組DNA,利用脈沖電場凝膠電泳獲得它們的指紋圖譜，然後分析各菌抹間的系統進化關係，為研究胎兒彎桿菌的流行病學提供了方便。也有利用PCR方法通過擴增16sRNA的方法來檢測胎兒彎桿菌的研究。分子生物學方法雖然特異性和敏感性較高，但只適於實驗室操作而不適於臨床推廣應用。血清學方法尤其是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法在細菌疾病的檢測中是經濟，方便和省時省力的首選方法。Newsam等(1967)建立了利用特異性IgA進行的陰道粘液凝集實驗，但這一方法只適用於群體檢查，不能用於個體確診。並且該法僅能檢測出50%的感染動物。由於IgA抗體在感染後30-70天才開始出現，且抗體水平低，持續一段時間後，部分動物會出現抗體消失。SaeedAkhtar利用ELISA方法對來自加利福尼亞的630份牛血清進行檢測，應用其數據來評定胎兒彎桿菌、睡眠嗜血菌和牛病毒性腹瀉病毒等的血清學陽性率及陰性率。Brooks等利用自己研究的四個單克隆抗體與胎兒彎桿菌脂多糖核心抗原表位結合，以蛋白酶K消化和石,友酸水洗塗下來的脂多糖作為抗原，應用ELISA方法對四個單克隆抗體進行;險測。他們得出這些單克隆抗體對於胎兒彎桿菌具有;^艮高的特異性，可作為鑑定胎兒彎桿菌的潛在性免疫診斷試劑。胎兒彎桿菌野型菌抹表面覆蓋有一層高分子量的表面蛋白，這層蛋白對胎兒彎桿菌的毒力起重要作用，其分子量約為97-149KDa,該表面蛋白在引起牛羊的流產等疾病中起了至關重要作用。在混合培養中，單一菌抹可以表達三種蛋白，但以其中一種佔主導地位，其原因尚不十分清楚。有的自發突變抹缺失高分子量的表面蛋白後，對正常血清變得敏感。ShujiFujimoto等用冷凍蝕刻分析技術研究發現98KDa的表面蛋白呈六角形排列，中心距為24nm;127KDa和149KDa的表面蛋白呈四角形排列，中心距為8nm。事實表明高分子量的表面蛋白的保守，特別是氨基(N)端具有保守性，可能和它抵抗補體成分C3b與菌體相結合、排洩、自我組裝和形成晶體結構等功能有關。由於表面蛋白抵抗補體成分C3b與菌體相結合，因此它具有抗血清、抗呑噬的作用。高分子量的表面蛋白由sap基因族編碼，由I型分泌系統分泌和運輸。sap基因族中sapA2基因，編碼全長1109個胺基酸的表層蛋白，sapA2基因閱讀框前的70個鹼基及與其相連的閱讀框中的550個鹼基是保守的，並以完整的基因形式存在於基因組中。用sapA基因5'保守端作為探針對脈衝電場凝膠電泳後的凝膠進行Southern雜交，結果表明sap基因族緊密群聚於基因組中。由於胎兒彎桿菌8個緊密群聚的sap基因族的重組,其表達的高分子量的表面蛋白的抗原性不斷發生變化，以逃避宿主的免疫殺傷作用。sap同位基因的重組伴隨著一個6.2kb的sapA基因的含啟動子序列的基因組件的倒置，或和一個甚至多個sap基因的側翼序列一起倒置。這和sap基因側翼序列的一致及其5，端含有相同識別序列有關。能促進同源鹼基配對和單鏈DNA交換的RecA蛋白在sap基因族的重組中起到不可缺少的作用。Murali等研究發現，sapA基因啟動子的缺失能導致高分子量表面蛋白的缺失。研究胎兒彎桿菌野型林擁有的高分子量的表面蛋白，對於進一步了解其致病機理，製造基因疫苗，控制胎兒彎桿菌的傳播具有重要作用。Grogono-Thomas等人將胎兒彎桿菌97KDa的表面蛋白SapA純化，皮下途徑免疫該表面蛋白，發現表面蛋白是非常強的抗原，可以從奶，血清，膽汁及尿液中檢測到抗體。研究人員從經胎兒彎桿菌表面蛋白(97KD)免疫過的2隻兔體內找到位於表面蛋白N末端保守區第184個胺基酸多肽結合的IgG抗體，其中被鑑定的2個假定的抗原表位位於胺基酸81到110和141到160之間。胎兒彎桿菌J05577抹表面蛋白全基因sapA由3974個鹼基組成，其開放閱讀框架為2820個鹼基，所表達的蛋白約為97KDa，與上述所說保守區域的免疫保護效果較好的蛋白位置相符，這就更說明表面蛋白是一種較好的血清學檢測抗原。另夕卜，Wang等學者研究發現胎兒彎桿菌表面蛋白具有多個抗原表位和較強的致病作用。在感染動物體內表達的佔主導地位的表面蛋白的大小和類晶體結構不斷發生變化，從而導致其相應抗體的不斷變化。目前，國內還沒有關於牛胎兒彎桿菌表面蛋白的研究報導，更沒有應用ELISA方法檢測牛胎兒彎桿菌病的研究，故本發明應用胎兒彎桿菌表面蛋白作為抗原建立間接ELISA診斷方法，以達到對胎兒彎桿菌病的快速特異的診斷。但由於胎兒彎桿菌表面蛋白基因片段較長，全基因表達困難和產量過低，不符合作為診斷抗原的要求。
發明內容本發明目的之一是提供一種可作為胎兒彎桿菌病診斷抗原的重組蛋白；本發明目的之二是提供編碼上述重組蛋白的基因。本發明目的之三是提供一種製備上述重組蛋白的方法。本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的可作為胎兒彎桿菌病診斷抗原的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白，其為SEQIDN0:2所示的胺基酸序列。編碼上述重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的基因，其鹼基序列為SEQIDNO:l所示。一種製備上述重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的方法，包括(1)、從胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)菌林中提取基因組DNA;(2)、以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的鹼基序列為引物，以步驟(1)所製備的基因組DNA為模板進行PCR擴增；(3)、將步驟(2)所擴增得到的基因片段連接於表達載體中，得到重組表達載體；(4)將重組表達載體在大腸桿菌中進行誘導表達；收集、純化所表達的蛋白，即得。上述方法中，其中，步驟(3)中所述的表達載體優選為pET22b、pET30a、pGEX-6p-l或pET32a(+)載體，更優選為pET32a(+);所述的重組表達載體優選是pET32-sapA-N;步驟(4)中所述的純化蛋白的方法優選為金屬鰲合層析的方法。本發明對位於胎兒彎桿菌表面蛋白N端1398bp的基因進行了表達，所表達的可溶性蛋白(rSapA-N)經過金屬鰲合層析的方法純化，得到約66KD大小的蛋白，經過ELISA檢測和Westernblot分析，發現該蛋白具有很好的免疫活性；將本發明表達的蛋白質作為抗原，可用間接ELISA試驗方法檢測胎兒彎桿菌病，檢測結果說明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用於胎兒彎桿菌病的血清學診斷。圖1sapA-N基因的PCR擴增結果；1sapA-NPCR產物；2,MarkerDL2000。圖2pET-sapA-N重組質粒的酶切鑑定；1pET-sap-N質粒的酶切；2DL15000DNAMarkcr。圖3重組質粒的蛋白表達；1,2pET-sap-N細菌裂解上清,3，4sap-N細菌裂解沉澱；5,6pET32a載體對照；蛋白質分子量marker。圖4重組rSap-N蛋白的Westernblotting結果；1:蛋白質Marker;2:表達蛋白rSap-N。具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。實施例1編碼胎兒彎桿菌N端(sapA-N)表面蛋白DNA的製備sapA-N基因(1398bp)的PCR擴增胎兒彎桿菌553抹(吉林出入境檢驗檢疫局)基因組lul,引物sapA-N-U和sapA-N-L各0.5ul(sapA-N曙U5'GAATTCGCAAGTGAGGGTGATGGT3'(SEQIDNO:3);sapA-N-L5'AAGTCGACAACCTTAGCAGCAGCTC3，(SEQIDNO:4))引物濃lOpMol,10xTaqDNA聚合酶Buffer2.5ul、2mMdNTP1.5ul、TaqDNA聚合酶0.5ul，以水補足，反應體系為25ul，然後進行PCR擴增。PCR反應的條件為95。C變性10分鐘，94。C變性1.5分鐘，55。C退火1.5分鐘，72。C延伸1.5分鐘，30個循環，72。C延伸10分鐘。在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，100V電壓20分鐘後觀察結果。然後用膠回收試劑盒進行sapA-N基因的回收。結果，PCR擴增出1389bp的DNA片段(圖1)，與實際大小相符。實施例2編碼胎兒彎桿菌N端(sapA-N)表面蛋白基因的分子克隆、表達和純化.sapA-N基因的分子克隆先將上述Taq酶擴增的sapA-N基因連接pMD18T-Vector,轉化DH5a感受態細月包，獲得重組質粒pMD18T-sapA-N。經酶切和PCR鑑定的重組質粒，用￡coiI和Sa/I切下並膠回收sapA-N基因，將它們分別連入經酶切處理的pET32a(+)的相應位點，轉化DH5a感受態細胞，酶切和PCR鑑定後獲得重組質粒pET32-sapA-N。結果經過酶切鑑定(如圖2所示)，表明已經成功構建含有目的基因的重組表達載體，經過IPTG誘導進行了表達(如圖3所示)，表達的重組蛋白(rSapA-N)與實際設計的大小相符。將IPTG誘導後的菌液經過離心、洗塗後進行超聲波裂解，高速離心後收集上清液，應用親和層析柱進行純化，測定純化後的蛋白濃度為2.964mg/ml。純化後的rSapA-N置於-7(TC保存。純化後的rSapA-N的Westernblotting結果見圖4。試驗例1本發明抗原蛋白的診斷效果試驗一、試驗材料1、供試樣品用本發明實施例2所純化的蛋白質作為包被抗原。2、陽性對照、陰性對照由本實驗室保存。空白對照為100|il底物溶液加50nl終止液。3、試劑明膠、吐溫20、TMB(鄰苯二胺)。二、試^瞼方法將本發明實施例2所表達的蛋白純化後，所純化的蛋白可以作為ELISA的診斷抗原，用於臨床樣品的檢測，能夠達到預期的診斷效果。ELISA檢測程序1、將純化後的抗原用pH9.5的碳酸鹽緩衝液稀釋後進行包被ELISA板(Nunco公司)，50pl/孔，室溫過夜；2、次日厄掉液體，力。1%明膠(Sigma)進行封閉，150^1/孔37。C溼盒lh;3、取出後甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，300^1/孔每次3min;4、加用PBST稀釋後的待檢血清，50pl/孔37。C溼盒lh,同時設立陽性對照、陰性對照和空白對照；5、取出後甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌3次，300^1/孔每次3min;6、加用辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗牛的二抗(Sigma公司)，50^1/孔，37X:溼盒lh;7、取出後甩掉液體，用pH7.6的PBST洗滌4次，300^1/孔每次3min;8、加底物TMB5(Hil/孔，避光室溫放置10min顯色；9、力。50nl/孔2MH2S04終止反應，450nm測定OD值。10、結果判定OD>0.45為陽性，OD<0.45為陰性。試驗結果見表1表lELISA檢測結果tableseeoriginaldocumentpage9說明供試樣品的數值結果大於等於0.45為陽性結果表明採用本發明表達的蛋白質作為抗原，可用間接ELISA試驗方法檢測胎兒彎桿菌病，檢測結果說明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用於胎兒彎桿菌病的血清學i貪斷。序列表<110〉中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白及其編碼基因和應用PKL0878<160〉4Patentlnversion3.511389<212〉DNA<213〉Campylobacterfetus1atgttaaacattcaatgctttatatcactattatggg城ggc幼gtgag60ggtgatggtaataagtat"tggttagattatatagtttaggagtttcaagt120ttagct3atattatgcttgatagtccaggggcggctaaattctttggtgattctctttta180gc3ggtaBtg犯犯agattttgttactaagatatatagtatagcttt鄉taatactagt240gatgttgatggcattaattattggactaaggcaataactggcggtggagaatttactgat300agt犯gggtaatgttattagtgttgctagtttaBgcaagggtgatttaataggtgctatg360attaactctatggUaatggcggtagtgctgagtctaaggcta/tat"ttgeiggctaaggca420gctgctagtgattactttgccgatgctactttggt犯gggatattagtggattaga/tgag480ggtactacttctaagttaattagcgagattaatagtgcteigtgatcttgataaggttaag540agtgagattgatgctttgaagagtgagctacct犯tccgggtagtacttatgatcttaca600gagggtaatgataatttaaagggtactgatttagacgatacttttaatgggactacatat660gtaggtaatggtactaataagagtactcttagtgcatttgataagartagatggtcggtg720cUggg鄉gatacgttgaatgcgatatttactgcaataacacgcgctgcgctactaact780gatcaagctgcactaaaaggcgtacaaacgtagaaaatatcaatataatt840tcagatctagaaacaagtggcgatttcgttttcaacggtt■gtacttggcgctttgctaccgacgcatctaaaagcgtaaatgtagaaaca960ac3gg肌cgataactgctttcaccgcagccgg幼caggc3犯gtcgatgttgtcgccggt1020aaaatctctgcccttacggccgattcgcgaacaagcgtaaatttaactgctacaaacgac1080actatcacattaaccagtgcaaacgctgctactagtgtgaatttaaaacagCggC6LggCC1140aaagacgctacaataacatccgcaa/tgcagcaa幼atataacaatagacgcaacaggatt1200gcaactataacttcagctacggctgtagagaatttgacagttaaacatgc1260gcgctaaatggtggcatggataaacttgcaacagttactcttgac幼tgctgctttaact1320gctgcaatagatataaaatctgcaagcacact幼atttaataaattcaagtgtt犯cgga1380ccaaaacat13892463<212〉PRTCampylobacterfetus2MetLeuAsnLysThrAspValSerMetLeuTyrlieThrlieMetGly1015MetAlaSerGluGlyAspGlyAsnLysTyrTrpLeuAspTyrAlaAsn202530AsnAsnSerI>euGlyValSerSerLeuAlaAsnlieMetLeuAspSer354045ProGlyAlaAlaLysPhePheGlyAspSerLeuLeuAlaGlyAsnGlu505560LysAspPheValThrLyslieTyrSerlieAlaLeuGlyAsnThrSer65707580AspValAspGlylieAsnTyrTrpThrLysAlalieThrGlyGlyGly859095GluPheThrA印SerLysGlyAsnVallieSerValAlaSerLeuSer100105110LysGlyAspLeulieGlyAlaMetlieAsnSerMetValAsnGlyGly115120125SerAlaGluSerLysAlaliePheGluAlaLysAlaAlaAlaSerAsp130135140TyrPheAlaAspAlaThrLeuValArgAsplieSerGlyLeuAspGlu145150155160GlyThrThrSerLysLeulieSerGlulieAsnSerAlaSerAspLeu165170175AspLysValLysSerGlulieAspAlaLeuLysSerGluLeuProAsn180185190ProGlySerThrTyrAspLeuThrGluGlyAsnAspAsnLeuLysGly195加O205ThrAspLeuAspAspThrPheAsnGlyThrThrTyrValGlyAsnGly210215220ThrAsnLysSerThrLeuSerAlaPheAspLysThrArgTrpSerVal225230235240LeuGlyArgAspThrLeuAsnAlaliePheThrAlalieThrArgAla245250255AlaLeuLeuThrAspGinAlaGluLeulielieThrLysArgArgThr260265270AsnValGluAsnlieAsnlielieSerAspLeuGluThrSerGlyAsp275280285PheValPheAsnGlyTyrGluLysValGlyPheAsnValLeuGlyAsp290295300lieValSerPheAlaThrAspAlaSerLysSerValAsnValGluThr305310315320ThrGlyThrlieThrAlaPheThrAlaAlaGlyThrGlyLysValAsp325330335ValValAlaGlyLyslieSerAlaLeuThrAlaAspSerArgThrSer340345350ValAsnLeuThrAlaThrAsnAspThrlieThrUuThrSerAlaAsn355360365AlaAlaThrSerValAsnLeuLysGinArgGinAlaLysAspAlaThr370375380lieThrSerWaMetGinGinLysTyrAsnAsnArgArgAsnArglie385390395400Ala丁hrlieThrSerAlaThrAlaValGluAsnLeuThrValLysHis405楊415AlaThrAsnValAlaLeuAsnGlyGlyMetAspLysLeuAlaThrVal420425430ThrLeuAspAsnAlaAlaLeuThrAlaAlalieAsplieLysSerAla435440445SerThrLeuAsnLeulieAsnSerSerValAsnGiyProLysHis450455460<210〉324腿artificalsequence〈400>3g犯ttcgc犯gtgagggtgatggt244<211〉25DNAartificalsequence4aagtcgacaaccttagcagcagctc2權利要求1.重組胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)N端表面膜蛋白，其特徵在於其胺基酸序列為SEQIDNO2所示。2、編碼權利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的DNA,其特徵在於其鹼基序列為SEQIDNO:1所示。3、含有權利要求2所述DNA的表達載體。4、含有權利要求3所述表達載體的細胞系。5、一種製備權利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白的方法，包括(1)、從胎兒彎桿菌(Campylobacterfetus)菌抹中提取基因組DNA;(2)、以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的鹼基序列為引物，以步驟(1)所製備的基因組DNA為模板進行PCR擴增；(3)、將步驟(2)所擴增得到的基因片段連接於表達載體中，得到重組表達載體；(4)、將重組表達載體在大腸桿菌中進行誘導表達；收集、純化所表達的蛋白，即得。6、按照權利要求5的方法中，其特徵在於步驟(3)中所述的表達載體選自pET22b、pET30a、pGEX-6p陽l或pET32a(+)載體。7、按照權利要求6的方法中，其特徵在於步驟(3)中所述的表達載體是pET32a(+)載體；所述的重組表達載體是pET32-sapA-N。8、按照權利要求5的方法中，其特徵在於步驟(4)中所述的純化蛋白的方法為金屬鰲合層析的方法。9、權利要求1所述的重組胎兒彎桿菌N端表面膜蛋白在製備檢測牛胎兒彎桿菌病血清學試劑中的用途。'10、權利要求2所述的DNA在製備檢測牛胎兒彎桿菌病血清學試劑中的用途。全文摘要本發明公開了胎兒彎桿菌N端表面膜重組蛋白及其編碼基因，本發明還公開了該重組蛋白的製備方法及其在牛胎兒彎桿菌病血清學診斷中的應用。本發明對位於胎兒彎桿菌表面蛋白N端1398bp的基因進行了表達，所表達的可溶性蛋白(rSapA-N)經過金屬鰲合層析的方法純化，得到約66KD大小的蛋白，經過ELISA檢測和Westernblot分析，發現該蛋白具有很好的免疫活性；將本發明表達的蛋白質作為抗原，可用間接ELISA試驗方法檢測胎兒彎桿菌病，檢測結果說明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用於胎兒彎桿菌病的血清學診斷。文檔編號C07K1/16GK101302250SQ20081011159公開日2008年11月12日申請日期2008年6月10日優先權日2008年6月10日發明者劉思國,劉慧芳,薇司,王春來,趙海玲申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所