雜交瘤細胞株及其產生的抗Wnt5a單克隆抗體與應用的製作方法
2024-01-20 20:07:15 1
雜交瘤細胞株及其產生的抗Wnt5a單克隆抗體與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種雜交瘤細胞株及其產生的抗Wnt5a單克隆抗體與應用，具體而言，本發明通過分子克隆和單克隆抗體技術，篩選了一株可分泌特異識別wnt5a的單克隆抗體的雜交瘤細胞株Wnt5a。由雜交瘤細胞株Wnt5a所分泌的單克隆抗體可用於人體骨髓和血液中白血病變的臨床檢測。
【專利說明】雜交瘤細胞株及其產生的抗Wnt5a單克隆抗體與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫化學、腫瘤生物學和細胞生物學領域。具體而言，本發明涉及製備一種與人體細胞增殖、分化、黏附和遷移過程有關的分泌蛋白wnt5a，相結合的單克隆抗體的雜交瘤；由該雜交瘤產生的抗wnt5a單克隆抗體及其相應產品可應用於人白血病的診斷試劑或相關領域。
【背景技術】
[0002]白血病是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤，約佔腫瘤總發病率的3%左右。我國白血病患者約為3~4人/10萬人口，小兒的惡性腫瘤中以白血病的發病率最高，每年至少以3萬到4萬的速度增加。
[0003]目前，世界上治療白血病的主要方法是化療、骨髓移植和靶向治療等幾種。從醫學角度看，至今白血病的治療沒有一種完全有效的手段，尤其是容易復發。目前試驗室診斷白血病最完善的方法是WHO制定的MICM分型診斷法，即細胞形態學(Morphology)，免疫學(Immunology),細胞遺傳學(Cytogenetic)和分子生物學(Molecular biology)檢查方法，目前主要包括:外周血和骨髓顯微鏡下形態；單克隆抗體鑑別細胞表面分化標記；染色體檢查；基因診斷等。其中骨髓細胞形態學檢查仍為最經典最可靠的方法，但要準確分型診斷還需輔以其它方法，即ICM方法。在白血病療效和預後的判別方面也常以外周血和骨髓形態學檢查結果為標準，但該方法結果判斷存在主觀誤差，檢驗者判斷個體差異大，不便標準化；並且細胞形態學改變總落後於基因水平和蛋白質水平的改變，故不利於早期診斷；骨髓標本採集有創傷性在監控白血病療效和預後判斷時，需反覆抽取病人骨髓進行前後對照檢查，給病人造成很大痛苦，並且技術要求高，取材不便，每次抽取也存在部位差異，不能真實的反應病人的病情變化。尋找新的可作為診斷白血病的標誌物、對腫瘤的輔助診斷、鑑別診斷、療效觀察、病情監測以及預後的評價具有較高應用價值。
`[0004]Wnt5a是Wnt蛋白家族成員之一,是一種分泌性蛋白，在細胞增殖、分化、黏附和遷移中發揮作用。它不但與胚胎發育有關，它的異常表達與腫瘤發生有關，但在不同腫瘤中，Wnt5a表達失調不一致。如在人類胰腺癌、胃癌、肺癌、黑素瘤中過表達，在體外促進腫瘤細胞增殖和遷移，表現出癌基因的活性。而在甲狀腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌和血液腫瘤中，Wnt5a表達下調或缺失，表現出抑癌基因的活性。綜合已有的研究，導致fct5a抑癌和抗癌「兩面性」的原因至少有三方面:l、fct信號是多通路、多受體、多轉錄因子的開放式途徑，決定了其作用機制的複雜性。2、腫瘤存在高度異質性，Wnt5a在不同腫瘤或不同組織類型中發揮不同功能。3、Wnt5a介導的信號有細胞特異性，即Wnt5a與不同細胞表面表達的不同受體組合，轉導不同信號，發揮不同生理功能。fct5a在腫瘤發生中的作用和機理仍不清楚。目前有研究發現:fct5a主要激活非經典Wnt信號通路發揮作用，在發育的組織、骨髓基質細胞和造血細胞中有表達，可促進造血幹/祖細胞分化發育。
[0005]Wnt5a與白血病的研究報導不多，發明人曾以半定量RT-PCR檢測白血病和治療緩解病例中fct5a表達，其表達陽性率:急性髓細胞白血病AML和慢性髓細胞白血病CML為10%(5/50)，急性淋巴細胞白血病ALL和慢性淋巴細胞白血病CLL為7.7%( 1/13)，而經治療緩解的髓細胞白血病病例為62.50%，緩解的淋巴細胞白血病病例為71.4%，正常人為88.9%(24/27 )。顯示Wnt5a在髓細胞白血病和淋巴細胞白血病中均有表達缺失或下調，而在治療緩解病例中則表達恢復並接近正常人水平。
[0006] 綜上所述，Wnt5a可作為分子標誌物應用於診斷白血病的新腫瘤標誌物、評價治療效果的良好指標、篩選抗腫瘤藥物的良好靶標，也是基因治療的新靶點，對腫瘤防治具有重要的理論意義和潛在的應用價值。因此，一種高特異性和靈敏度的fct5a抗體是生產臨床診斷試劑所必需的。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於，提供一種能專一性針對Wnt5a的單克隆抗體雜交瘤細胞株及其製備方法。
[0008]本發明所述的雜交瘤細胞株，其保藏號為:CCTCC C2013112。
[0009]本發明還提供由上述的雜交瘤細胞株分泌產生的抗Wnt5a的單克隆抗體。
[0010]本發明所述的單克隆抗體可以用於製備檢測人外周血細胞系和骨髓中wnt5a的表達差異的製劑，用於製備檢測人外周血細胞系和骨髓中wnt5a的免疫印跡試劑，或用於製備檢測人體骨髓和血液中白血病變製劑，或用於製備檢測人白血病的診斷試劑。
[0011]本發明還提供上述的雜交瘤細胞株的製備方法，主要包含步驟:
[0012]I)以人臍帶血有核細胞的總RNA為模板，根據SEQ ID NO:1所示的Wnt5a序列設計引物序列，擴增獲得目的fct5a抗原序列；
[0013]2)將所述目的Wnt5a抗原序列酶切後與原核表達載體連接後誘導表達Wnt5a抗原蛋白；
[0014]3)根據表達的Wnt5a抗原蛋白合成多肽SEQ ID NO:4-9,並分別偶聯KLH ；
[0015]4)將偶聯後的多肽免疫小鼠；
[0016]5)吸取骨髓瘤細胞懸液和來源於偶聯後的多肽免疫小鼠的脾臟B淋巴細胞懸液進行細胞融合；
[0017]6)培養融合後的細胞，測雜交瘤效價，篩選陽性細胞株，獲得所述雜交瘤細胞株。
[0018]本發明人通過原核表達該蛋白，免疫Balb/c小鼠並經過融合、克隆篩選、製備腹水、親和層析技術純化腹水獲得了鼠源單克隆抗體。免疫印跡試驗檢測八組白血病病人骨髓細胞中及六種髓系白血病細胞系中Wnt5a的表達情況的試驗顯示:在所有的八組白血病病人骨髓細胞和白血病細胞系中，fct5a在正常組織中全部高表達，在腫瘤細胞中基本不表達。當以正常組織中fct5a的表達作為陽性對照時，6種特定腫瘤細胞系中均無Wnt5a的表達。
[0019]本發明的雜交瘤細胞株Wnt5a分泌產生的單克隆抗體，為小鼠IgG2a亞型單克隆抗體。該抗體不僅與重組的fct5a抗原具有極強的特異性和敏感性，而且與人體組織細胞和外周血中的Wnt5a有極強的特異性和敏感性。本發明中雜交瘤細胞株Wnt5a產生的單克隆抗體可應用於免疫印跡，免疫螢光和免疫組化等免疫學試驗技術中。而且，以本發明中的雜交瘤細胞株fct5a單克隆抗體為主體製作的白血病標誌物診斷試劑將對白血病的早期診斷和治療監測有較好的應用前景。本發明中雜交瘤細胞株fct5a分泌的單克隆抗體可應用於研究亞細胞定位，蛋白相互作用等信號通路的科學研究中。
[0020]為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合附圖，作詳細說明如下。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1表示純化後的wnt5a單克隆抗體純度。
[0022]圖2表示本發明單克隆抗體進行免疫印跡實驗檢測八對白血病組織中及六種白血病細胞系中Wnt5a的表達情況的實驗結果。實驗結果可見fct5a在所有的正常組織中高表達，在腫瘤組織中基本不表達，當以正常組織中白血病的表達作為陽性對照時，在6種白血病細胞系中均無Wnt5a的表達。
[0023]圖3A至圖3C表示採用本發明的單克隆抗體進行免疫組化實驗檢測白血病配對組織中的表達的實驗結果。具體可見Wnt5a在正常組織中高表達，但在白血病組織中低表達或不表達。其中圖3A是健康人和髓系白血病的對照，圖3B是20例髓系標本IHC實驗結果，圖3C是10例健康人組織標本IHC實驗結果。
【具體實施方式】
[0024]實施例1:Wnt5a抗原的製備
[0025]Wnt5a抗原是以人臍帶血有核細胞的總RNA為模板，根據Wnt5a序列(SEQID NO:1)設計引物序列，引物兩端連入EcoR I和Sal I酶切位點
[0026]上遊引物:(SEQID NO:2)`[0027]5』-CCGGAATTCATGAAGAAGTCCATTGGAATATTAAG-3』
[0028]下遊引物:(SEQID NO:3)
[0029]5』-ACGCGTCGACCTACTTGCACACAAACTGGTCC-3』
[0030]RT-PCR擴增出去除Wnt5a信號肽序列的基因(PCR參數:42°C 2小時，95°C 5min ；94°C 5min ；58.8°C 30s ；72°C 60s，共 35 個循環；72°C後延伸 5 分鐘)經 Sal I 和 EcoR I(Takara購買)雙酶切後與原核表達載體pET_42a(+)連接，轉化感受態細胞BL21 (DE3)，挑取單克隆提取質粒進行測序(英駿公司)，驗證序列無誤。選擇測序正確的陽性菌，經LB培養基在終濃度lmmol/L IPTG條件下，37°C 160rpm誘導表達4小時。收集菌體，經超聲破碎後4°C 4000rpm離心15min後,棄沉澱後再4°C 12000rpm離心20min,上清和沉澱分別進行SDS-PAGE電泳，結果顯示表達的產物為可溶性蛋白。
[0031]大量培養細菌後進行誘導表達，提取Wnt5a蛋白經N1-NTA親和層析柱進行純化，50mM咪唑洗脫Wnt5a蛋白，SDS-PAGE電泳，切取條帶進行MALD1-T0F/T0F鑑定，證實表達產物為Wnt5a。
[0032]實施例2 -M Wnt5a雜交瘤的製備
[0033]1.多肽合成與偶聯
[0034]合成多肽，共6條；通過軟體分析wnt5a蛋白序列，選取6段特異性表位，每段10-20個胺基酸左右(中科亞光合成)。
[0035]合成6條多肽:
[0036]Al (SEQ ID NO:4):LGMNNPVQMSEVYIIGAQPLC[0037]A2 (SEQ ID NO:5):HLYQDHMQYIGEGAKTGIKEC
[0038]A3 (SEQ ID NO:6):CSRAARPKDLPRDffLffGG [0039]A4 (SEQ ID NO:7):NSRFNSPTTQDLVYIDPSPDYC
[0040]A5 (SEQ ID NO:8):CSQLAGLSQGQKKL
[0041]A6 (SEQ ID NO:9):GRGYDQFKTVQTERC
[0042]每條多肽分別偶聯至血藍蛋白KLH，偶聯方式為SULF0-GMBS。
[0043]2.動物免疫
[0044]分別偶聯KLH後，把Al ；A2 ；A5混合免疫；混合免疫3隻小鼠；A3 ；A4 ；A6分別單獨免疫3隻小鼠；抗原濃度3mg/ml，免疫緩衝劑為8M尿素。選取12隻6周齡、體重約20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化選用雙注射器互推法。首次免疫時，將fct5a與等體積的弗氏完全佐劑乳化混合，每隻小鼠按60 μ g Wnt5a的量皮內多點加腹腔注射。第28和第42天分別進行第二次第三次免疫，佐劑改用不完全弗氏佐劑，注射體積和途徑不變，劑量改為30 yg.第3次免疫後間接ELISA法測定效價。融合前3天進行加強免疫，每隻小鼠腹腔注射不加佐劑的100 μ g Wnt5a，3天後進行細胞融合。
[0045]3.細胞融合
[0046]融合前將PEG1500置於37°C培養箱中預溫，吸取I X IO7個sp2/0骨髓瘤細胞懸液和I X IO8個來源於SPF級Balb/c小鼠脾臟B淋巴細胞懸液(細胞數1:10)至一個50ml離心管中，補加30mlMDM不完全培養基，充分混勻，1500rpm離心5min，棄上清，輕彈管底，使細胞團鬆散成糊狀，將離心管37°C水浴，用滴管吸取0.8ml預溫的50%PEG1500 (Roche)溶液，在離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細胞中，邊加邊轉動離心管，在I min左右加完，然後靜置90s，逐滴加入37°C預溫的不完全培養基IMDM8ml終止融合，2min之內加完，速度先慢後快，動作輕柔，將離心管在37°C培養箱中靜置5min，取出離心管，1000rpm離心5min，棄去上清，加入IOml HAT(SIGMA)培養基重懸細胞，輕輕吹打，混勻，將融合細胞接種至已鋪有滋養細胞的96孔細胞培養板，按100 μ I/孔，每塊培養板留6孔接種SP2/0細胞，作為HAT選擇的陰性對照，置37 °C，5%C02培養箱中培養。
[0047]4.挑克隆
[0048]融合後第5天即可在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，並補加HAT培養基100 μ 1，第10天可用間接ELISA法測雜交瘤效價，第14天換HT (SIGMA)培養基(含飼養細胞和1%ΗΤ液體)的96孔板中。放入5%C02細胞培養箱。
[0049]5.篩選
[0050]a.一篩:挑克隆後3天左右，觀察細胞量大約佔底面積2/3時，取100 μ L上清ELISA篩選。陽性克隆進行換液，添加200 μ L完全培養基(含1%ΗΤ液體)。
[0051]b.二篩:2天後重複步驟a進行二次篩選。陽性株轉入預先準備好培養基(含飼養細胞和1%HT液體)的24孔板。
[0052]c.三篩:5天後,用含標籤His的其它重組蛋白包板,取100 μ L上清ELISA篩選。符合要求的克隆轉入6孔板或細胞培養瓶擴大培養。
[0053]6.細胞凍存
[0054]對數生長期細胞佔滿底面積80%左右即可凍存。收集上清且去除死細胞等雜質，上清存於_20°C。直接將凍存細胞放4°C半小時，然後放-20°C兩小時，轉-80°C凍存過夜，次日放液氮罐。
[0055]7.雜交瘤細胞株保存:發明人將符合要求的克隆:雜交瘤細胞株Wnt5a，於2013年7月22日保藏於中國典型培養物保藏中心，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏號為CCTCC N0:C2013112。
[0056]實施例3:由保藏號為CCTCC C2013112的雜交瘤細胞系製備抗Wnt5a單克隆抗體
[0057]發明人將雜交瘤細胞株Wnt5a用於製備鼠抗Wnt5a單克隆抗體,具體操作步驟如下:
[0058]1.細胞復甦
[0059]從_80°C冰箱或液氮罐中迅速取出凍存管；迅速放入37°C水浴鍋中快速攪動，使凍存液在2分鐘內全部融化成液體。往15mL離心管中加入3mL血清培養基，將凍存液吸入離心管，1500轉/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用完全培養基懸起細胞，培養於6孔板(3mL)或瓶(5mL)中。
[0060]2.腹水製備
[0061]對數生長期細胞用無血清培養基洗滌並懸起；計數大約5X 105，ImL0懸浮的細胞腹腔注射SFP級，狀態良好的6周齡的成年BALB/c雌性小鼠，一般7_10天後便可收集腹水。第一次可收集3mL左右，每隔2、3天可重複取，最終可收集SmL/只。每次取出的腹水4000轉/分鐘，離心10分鐘；中間為腹水。小心吸出腹水收集於離心管中，4°C保存。
[0062]3.單克隆抗體的純化
[0063]用HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare, 17-5079-01)親和層析柱純化單克隆抗體。
[0064]將腹水在4°C條件下，10000轉/分鐘離心10分鐘，去除脂類物質。離心後吸取上清，並用偶聯緩衝液以1:3 (腹水:偶連液)稀釋，用0.45μπι膜過濾。濾液上樣到偶聯緩衝液平衡過的層析柱。用偶聯緩衝液洗過柱子後，用洗脫緩衝液洗脫抗體，收集於事先裝有中和液的收集管中。結果經SDS-PAGE顯示純度>90% (圖1)。
[0065]實施例4 =ELISA法鑑定單克隆抗體亞類
[0066]1.實驗操作
[0067]用IOOmM PBS (ρΗ7.4)稀釋包被羊抗鼠IgG (中杉金橋)稀釋至0.5 μ g/mL，每孔加100 μ L，40C，過夜。傾空液體，用含0.05%Tween的PBS (PBST)洗3次，每孔加入200 μ L封閉液，37°C孵育I小時。傾空液體，用PBST清洗3次。每孔加入0.1mL雜交瘤上清，37°C孵育I小時。傾空液體用PBST清洗3次。用封閉液1:1000稀釋HRP標記的羊抗鼠(κ，λ )抗體或 I:2000 稀釋 HRP 標記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗體 0.1mL 每孔，分別加入適當的孔中，37°C用孵育I小時。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50 μ L底物溶液，10-20分鐘內測405nm波長下的OD值。
[0068]2.實驗結果
[0069]實驗結果顯示，本發明單克隆抗體為IgG2a型鼠源單克隆抗體。
[0070]實施例5 =ELISA法測定單克隆抗體親和常數
[0071]1.實驗步驟:
[0072]包被免疫用重組Wnt5a，包被濃度為2μ g/mL，100 μ L/孔，4°C包被過夜，I XPBST洗3次。每孔加200 μ L封閉液(2%脫脂奶粉in PBS) 37 V封閉2小時，I X PBST洗3次。抗Wnt5a單克隆抗體，從1:200開始2倍梯度稀釋，最後I孔留空白對照，37°C孵育I小時，IXPBST洗3次。HRP標記的羊抗鼠二抗(中杉金橋1:2500稀釋)1:20000稀釋，每孔100 μ L，37。。孵育I小時，I XPBST洗3次。顯色液100 μ L/孔，顯色10分鐘，終止液(0.5Μ硫酸)50 μ L/孔終止反應。用酶標儀測定吸光值。
[0073]2.數據分析:找出≥1/2 「平臺OD值」對應的稀釋倍數Α。
[0074]
【權利要求】
1.一種雜交瘤細胞株，其保藏號為:CCTCC N0:C2013112o
2.一種抗Wnt5a的單克隆抗體，由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌產生。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測人外周血細胞系和骨髓中wnt5a的表達差異的製劑中的應用。
4.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測人外周血細胞系和骨髓中wnt5a的免疫印跡試劑中的應用。
5.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測人體骨髓和血液中白血病變製劑中的應用。
6.權利要求2所述的單克隆抗體在製備檢測人白血病的診斷試劑中的應用。
7.—種權利要求1所述的雜交瘤細胞株的製備方法，其特徵在於，包含步驟: 1)以人臍帶血有核細胞的總RNA為模板，根據SEQID NO:1所示的Wnt5a序列設計引物序列，擴增獲得目的fct5a抗原序列； 2)將所述目的Wnt5a抗原序列酶切後與原核表達載體連接後誘導表達Wnt5a抗原蛋白； 3)根據表達的Wnt5a抗原蛋白合成多肽SEQID NO:4_9，並分別偶聯KLH ; 4)將偶聯後的多肽免疫小鼠； 5)吸取骨髓瘤細胞懸液和 來源於偶聯後的多肽免疫小鼠的脾臟B淋巴細胞懸液進行細胞融合； 6)培養融合後的細胞，測雜交瘤效價，篩選陽性細胞株，獲得所述雜交瘤細胞株。
【文檔編號】G01N33/574GK103555668SQ201310516066
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】司維柯, 張曉麗, 趙宸, 牛長春, 楊忠, 吳韋銣, 潘靜 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院