一種山羊草屬殺配子染色體2c特異scar標記的製作方法

2024-01-20 17:43:15

專利名稱：一種山羊草屬殺配子染色體2c特異scar標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR標記，尤其涉及一種檢測小 麥遺傳背景下殺配子染色體2C的試劑盒及其應用。
背景技術：
小麥是世界上重要的糧食作物之一。在中國它是僅次於水稻的第二大農作物，小 麥生產對國民經濟發展有著十分重要的戰略意義。由於小麥栽培品種單一化，使其遺傳基 礎日益狹窄，抗源匱乏，極大地限制了其產量和品質的進一步改良。小麥的近緣物種中存在 著大量的遺傳變異，是小麥改良可以利用的有益基因資源，將這些有益基因導入小麥一直 是遺傳學家和育種學家經久不衰的研究課題。創製易位系是把外源有益基因導入小麥的一 種有效途徑。常用的創製易位系的方法有自發易位、輻射誘發、利用Ph基因、染色體錯分 裂與著絲點再融合、組織培養以及利用殺配子染色體等。國內外的研究都已證明，利用殺配 子染色體誘導產生易位的頻率要遠遠高於其它方法。山羊草屬植物中的一些殺配子染色體，當單體附加到不同基因型普通小麥中 時，具有完全或不完全的殺配子作用，在不完全殺配子作用下，可高頻誘導各種類型的染 色體結構變異，變異頻率可達10%以上，遠遠高於自發易位、輻射誘發、Ph基因等其他 方法的誘導效率。這些殺配子染色體是經長期自然選擇保留下來的，有的與小麥有部 分同源關係，在誘導染色體結構變異中有特殊的意義。殺配子染色體不僅可誘導普通 小麥染色體結構變異，而且對附加或代換到普通小麥中的外源染色體也具有同樣的功 能，這就為小麥的誘變育種開闢了一條新途徑。殺配子染色體起源於不同的基因組(C， S或M)，就同祖性來說，現已識別出三種類型的山羊草殺配子染色體同祖群2中的殺 配子染色體 Ae. Iongissima (2)、Ae. sharonensis、Ae. cylindrica、Ae. speltoides (1) 和Ae. speltoides (2)；同袓群3中的殺配子染色體Ae. triuncialis (1)和 Ae. triuncialis(2)；同袓群 4 中的殺配子染色體 Ae. Iongissima(I)、Ae. Iongissima (3)、 Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)0殺配子染色體效應的強度是多樣的，從致死到半致死，而且也受不同小麥的遺傳 背景的影響，其作用特點、方式也各不相同。染色體2S1，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在「中國春」小麥中引起不帶這些染色體的配子完全不育，因此無法傳遞給下一代。3C染色 體在「中國春」中發揮很強的殺配子效應，但在其它品種中卻產生溫和的、半致死效應，暗示 在這些栽培品種中仍存在阻遏基因。染色體T2B-2SSP "，2C，3(fAT*4Mg，在中國春中誘導半 致死效應的染色體斷裂，而且結構重排的染色體可以被保留和分離。染色體3C和3Csat都 起源於離果山羊草，但是它們的殺配子效應強度在「中國春」中卻不相同；其中3C的效應是 致死的，而3CSAT則是半致死的。殺配子染色體2C在普通小麥「中國春」等遺傳背景下可誘導半致死效應的染色體 斷裂，使後代產生易位、缺失等染色體結構畸變。利用殺配子染色體2C在構建大麥染色體 缺失圖譜，誘導小麥-偃麥草、小麥-冰草易位等方面取得了很好的成效。在殺配子染色體2C的利用過程中，雜種後代中2C染色體的鑑定是非常重要的環節。有很多學者利用分帶的 方法對後代進行鑑定，但該方法非常繁瑣，而且需要結合相關的細胞學技術。與之相比，利 用DNA分子標記進行鑑定則是十分方便快捷的途徑。隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術具有操作簡單、模板DNA用量少、擴增產物多態性 高、經濟快捷等優點，已經被廣泛應用於遺傳多樣性分析、品種鑑定、分子標記輔助育種、基 因定位及遺傳圖譜構建等多個研究領域。但由於它的重複性和穩定性較差，將RAPD標記轉 化為SCAR標記後，其特異性和穩定性大幅度提高，可以更方便快捷地應用於異源染色體的 檢測。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測小麥遺傳背景下殺配子染色體2C的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另 一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物為含有殺配子染色體2C的小麥屬植物，所述含有殺配子染色體2C的小 麥屬植物具體為「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二 體附加系雜交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本發明另一個目的是提供一種檢測植物殺配子染色體2C的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和PCR緩衝液組 成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另 一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試 劑中的濃度為0. 06υ/μ 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. ISmM ；所述植物為含有殺配子染色體2C的小麥屬植物。所述含有殺配子染色體2C的小麥屬植物為「中國春」-長穗偃麥草7Ε 二體附加系 與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2 代。PCR緩衝液購自寶生物工程(大連)有限公司，產品目錄號R10T1。所述的試劑盒在檢測小麥遺傳背景下殺配子染色體2C中的應用；所述的PCR試劑 在檢測小麥殺配子染色體2C中的應用；以上應用均是本發明保護的範圍。本發明的第三個目的是提供一種輔助檢測待測植物中是否含有殺配子染色體2C 的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述試劑盒中的引物對或所述的PCR試劑 對待測植物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴增產物，若所述PCR擴增產 物中含有大小為586bp，則所述待測植物中候選含有殺配子染色體2C，若所述PCR擴增產物 中不含有大小為586bp的片段，則所述待測植物中候選不含有殺配子染色體2C。所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；
所述PCR擴增的退火溫度為53°C。所述PCR擴增產物的核苷酸序列為序列表序列2自5』末端第405-990位核苷酸。所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發明的實驗證明，本發明開發的SCAR分子標記為快速、準確地鑑定小麥遺傳背 景下的外源山羊草屬殺配子染色體2C奠定基礎。該SCAR標記的開發對於鑑定普通小麥中 導入的殺配子染色體2C是極其有價值的，它為跟蹤鑑定普通小麥-殺配子染色體2C的後 代提供了十分方便快捷的途徑，也為雜種後代染色體構型的分析奠定了良好的基礎。


圖1為RAPD引物在普通小麥「中國春」、殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草 三種材料中的擴增結果圖2為SCAR標記在柱穗山羊草、「中國春」_殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體 長穗偃麥草、「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系中的擴增結果圖3為SCAR標記在「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國春」-殺配子 染色體2C 二體附加系雜種後代F」F2中的擴增結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。供試材料為柱穗山羊草(Endo TR. Gc chromosomes and their induction ofchromosome mutations in wheat. Jpn J Genet, 1990,65 :135-152.,公眾可從哈爾濱 師範大學獲得。)、「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系(2n = 44AABBDD+2C II, Endo TR. Allocation of a Gc chromosome of Aegilops cylindrica to wheathomoeologous group 2. Genes Genet Syst，1996，71 :243_246，公眾可從哈爾濱師範大學獲得。)和「中 國春」-長穗偃麥草 7E 二體附加系(2n = 44AABBDD+7E II，DvorakJ，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatumchromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol，1974，16 :399_417，公眾可從哈爾濱師範大學 獲得。)；普通小麥「中國春」(Miller TE, Hutchinson J, Chapman V Investigation of a preferentially transmitted Aegilops sharonesischromosome in wheat. Theor Appl Genet, 1982,61 :27-33.，公眾可從哈爾濱師範大學獲得)；「中國春」-長穗偃麥草7E 二體 附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的FpF2代。實施例1、山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR標記的獲得1、山羊草屬殺配子染色體2C特異RAPD標記0PF03標記的篩選與克隆利用40條RAPD引物，對普通小麥「中國春」、普通小麥「中國春」-殺配子染色體 2C 二體附加系、柱穗山羊草等材料進行擴增篩選，分離和克隆2C基因組特異擴增片段。其中，PCR擴增的20 μ 1體系Template DNA50ngIOxPCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl22. 5 μ 1
dNTP Mix (2. 5mM)
Random Primer(10 μ Μ)
1. 5μ 1 1 μ 1r Taq polymerase (5U/μ 1) 0. 25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1IOx PCR buffer購自寶生物工程(大連)有限公司，產品目錄號RlOTl。PCR程序94°C預變性 3min，94°C變性 15s，36°C復性 30s，72°C延伸 45s，46 個循環 結束後72°C延伸lOmin。4°C保存。PCR擴增產物經1. 2%的瓊脂糖膠電泳進行檢測，BIORAD紫外儀掃描，拍照。PCR擴增結果如圖1所示，其中，M.為DL2000Marker ；a.為普通小麥「中國 春」(AABBDD)，b.為「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系Qn = 44AABBDD+2C II) ；c.為柱穗山羊草；箭頭所示為殺配子染色體2C特異擴增帶，從圖中看出，引物 0PF035，-CCTGATCACC-3，(序列1)在「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊 草中擴增出一條HOObp左右的片段，此產物在普通小麥「中國春」中沒有出現，表明這個片 段是殺配子染色體2C所特有的。回收從普通小麥「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系中擴增得到的特異片段， 送去測序。經測序結果可知，該PCR產物具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表的序列 2由1496個核苷酸組成，將PCR產物命名為0PF031496。在GeneBank中將其進行Blast同源性搜索，結果發現它與大麥的1個cDNA克隆 序列(genbank號為AK252862. 1)同源性達92%。也可人工合成序列2。2、山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR標記的建立根據序列表序列2中的序列，利用I^rimer Premier 5. 0軟體，設計了一對SCAR引 物2C-F5865，TCTGTCGGGAAACTAATT 3，(序列 3)2C-R5865，AAGATAGCAACAGGGGAG 3，(序列 4)反應體系為20 μ 1，將RAPD擴增條件調整為正反向引物各0.5 μ 1，53°C退火，35個 循環外，其他同RAPD分析。PCR擴增的20 μ 1體系PCR擴增體系Template DNA50ngIOxPCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl2 (終濃度為 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,終濃度為 0. 18mM)1· 5 μ 12C-F586 上遊引物(10 μ Μ,終濃度為 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 12C-R586 下遊引物(10 μ Μ,終濃度為 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 1r Taq polymerase (5U/ μ 1，終濃度為 0. 06U/ μ 1) 0. 25 μ 1_ Distilled sterile waterup to 20 μ 1
分別以「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草、「中國春」、二倍體長 穗偃麥草(Knott D R. The inheritance of rust resistance. VI. The transferof stem rust resistance from Agropyron elongatum to common wheat. CanadianJournal of Plant Science, 1961,41 :108-123.，公眾可從哈爾濱師範大學獲得)、「中國春」-長穗偃麥 草7E 二體附加系的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結果如圖2所示，其中，1.為柱穗山羊草；2.為「中國春」-殺配子染色體2C 二體 附加系；3.為「中國春」;4.為Marker :DL2000 ；5.為二倍體長穗偃麥草；6.為「中國春」-長 穗偃麥草7E 二體附加系。從圖中看出，在「中國春」」-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗 山羊草材料中均得到586bp的片段，而在「中國春」、二倍體長穗偃麥草、「中國春」-長穗偃 麥草7E 二體附加系中沒有此片段。測序兩個586bp的片段，結果為該片段均為具有序列表 序列2自5』末端第405-990位核苷酸，表明該片段為殺配子染色體2C所特有。實施例2、山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR標記的應用用SCAR引物2C-F586、2C-R5a;對「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國 春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交後代F1和F1自交得到的F2代進行了鑑定。以普通 小麥「中國春」為對照。結果如圖3所示，1.為普通小麥「中國春」;2-12.為「中國春」-長穗偃麥草7E 二體 附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代；13.為DL2000Marker ； 14 25.為F1代自交獲得的F2代。從圖中看出，在&代材料中均擴增出了 586bp的產物，符合理論預期，經過測序為 該片段具有序列表序列2自5』末端第405-990位核苷酸，為殺配子染色體2C所特有,F1代 均表現為陽性結果。而在115株F2代材料中擴增結果出現分離現象，其中有65株F2材料中有擴增出 產物，說明在這些材料中存在2C染色體，佔整個F2代材料的56. 52%，其餘50株材料中沒 有擴增產物，說明這些材料中沒有2C染色體，佔整個F2代材料的43. 48% (殺配子染色體 2C是一種可以誘導染色體產生畸變的特殊染色體，它可以使不含有它的配子產生致死或半 致死的效應，半致死的效應就包括如染色體的易位、缺失等染色體畸變，達到要創製易位系 或缺失系的目的，這是一種誘導染色體產生畸變的一種方式，但2C產生的這些畸變行為完 全是隨機的。在F2代中，理論上存在2C染色體的機率為75%，但在實際的雜交後代中經檢 驗，實際情況往往低於理論值，因為2C染色體的殺配子作用，可能會使一些後代產生致死 效應，所以，一般情況下，實際值要低於理論值，實驗結果是在實際情況範圍內的。)；進一步 證明了此SCAR標記可以用來檢測小麥背景下的殺配子染色體2C，為小麥背景中殺配子染 色體2C的快速跟蹤檢測提供了新途徑。
權利要求
1.一種檢測植物殺配子染色體2C的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條 引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述植物為含有殺配子染色體2C的小麥屬植物，所述含有殺配子染色體2C的小麥屬 植物具體為「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附 加系雜交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一種檢測植物殺配子染色體2C的PCR試劑，由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合 酶和PCR緩衝液組成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條 引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根據權利要求3所述的PCR試劑，其特徵在於所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中 的濃度為0. 06U/y 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM ；所述植物為含有殺配子染色體2C的小麥屬植物。
5.根據權利要求3或4所述的PCR試劑，其特徵在於所述含有殺配子染色體2C的小麥屬植物為「中國春」-長穗偃麥草7Ε二體附加系與「中 國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
6.權利要求1或2所述試劑盒或權利要求3-5中任一所述的PCR試劑在檢測小麥殺配 子染色體2C中的應用。
7.一種輔助檢測待測植物中是否含有殺配子染色體2C的方法，包括如下步驟用權利 要求1或2所述試劑盒中的引物對或權利要求3或4中所述的PCR試劑對待測植物進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴增產物，若所述PCR擴增產物中含有大小為 586bp，則所述待測植物中候選含有殺配子染色體2C，若所述PCR擴增產物中不含有大小為 586bp的片段，則所述待測植物中候選不含有殺配子染色體2C。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為53°C。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增產物的核苷酸序列為序列表序列2自5』末端第405-990位核苷酸。
10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特徵在於所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發明公開了一種山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR標記。本發明提供了一種檢測植物殺配子染色體2C的試劑盒，所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。殺配子染色體2C是誘導易位系的一種有效方式，通過它可以將許多作物的優良性狀導入小麥，以改良小麥的品質。通過本發明的實驗證明，該SCAR標記的開發對於鑑定普通小麥中導入的殺配子染色體2C是極其有價值的，大量雜交後代的篩選和鑑定工作非常繁雜，殺配子染色體2C分子標記的開發為跟蹤鑑定普通小麥-殺配子染色體2C的後代提供了十分方便快捷的途徑，也為雜種後代染色體構型的分析奠定了良好的基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102146444SQ201110002658
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者叢雯雯, 徐國輝, 束永俊, 郭東林, 郭長虹 申請人:哈爾濱師範大學