一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR₃₈₄標記的製作方法

2024-01-20 17:46:15 2

專利名稱：一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異TRAP-SCAR384標記。
背景技術：
小麥是世界上重要的糧食作物之一。在中國它是僅次於水稻的第二大農作物，小麥生產對國民經濟發展有著十分重要的戰略意義。由於小麥栽培品種單一化，使其遺傳基礎日益狹窄，抗源匱乏，極大地限制了其產量和品質的進一步改良。小麥的近緣物種中存在著大量的遺傳變異，是小麥改良可以利用的有益基因資源，將這些有益基因導入小麥一直是遺傳學家和育種學家經久不衰的研究課題。創製易位系是把外源有益基因導入小麥的一種有效途徑。常用的創製易位系的方法有自發易位、輻射誘發、利用Wi基因、染色體錯分裂與著絲點再融合、組織培養以及利用殺配子染色體等。國內外的研究都已證明，利用殺配子染色體誘導產生易位的頻率要遠遠高於其它方法。山羊草屬植物中的一些殺配子染色體，當單體附加到不同基因型普通小麥中時，具有完全或不完全的殺配子作用，在不完全殺配子作用下，可高頻誘導各種類型的染色體結構變異，變異頻率可達10%以上，遠遠高於自發易位、輻射誘發、Wi基因等其他方法的誘導效率。這些殺配子染色體是經長期自然選擇保留下來的，有的與小麥有部分同源關係，在誘導染色體結構變異中有特殊的意義。殺配子染色體不僅可誘導普通小麥染色體結構變異，而且對附加或代換到普通小麥中的外源染色體也具有同樣的功能，這就為小麥的誘變育種開闢了一條新途徑。殺配子染色體起源於不同的基因組(C， S或M)，就同祖性來說，現已識別出三種類型的山羊草殺配子染色體同祖群2中的殺配子染色體 Ae. Iongissima (2)、Ae. sharonensis、Ae. cylindrica、Ae. speltoides (1) 和Ae. speltoides O)；同袓群3中的殺配子染色體Ae. triuncialis (1)和 Ae. triuncialis(2)；同袓群 4 中的殺配子染色體 Ae. Iongissima(I)、Ae. Iongissima (3)、 Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)0殺配子染色體效應的強度是多樣的，從致死到半致死，而且也受不同小麥的遺傳背景的影響，其作用特點、方式也各不相同。染色體2S1，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在「中國春」小麥中引起不帶這些染色體的配子完全不育，因此無法傳遞給下一代。3C染色體在「中國春」中發揮很強的殺配子效應，但在其它品種中卻產生溫和的、半致死效應，暗示在這些栽培品種中仍存在阻遏基因。染色體T2B-2SSP "，2C，3(fAT*4Mg，在中國春中誘導半致死效應的染色體斷裂，而且結構重排的染色體可以被保留和分離。染色體3C和3Csat都起源於離果山羊草，但是它們的殺配子效應強度在「中國春」中卻不相同；其中3C的效應是致死的，而3CSAT則是半致死的。殺配子染色體2C在普通小麥「中國春」等遺傳背景下可誘導半致死效應的染色體斷裂，使後代產生易位、缺失等染色體結構畸變。利用殺配子染色體2C在構建大麥染色體缺失圖譜，誘導小麥-偃麥草、小麥-冰草易位等方面取得了很好的成效。在殺配子染色體 2C的利用過程中，雜種後代中2C染色體的鑑定是非常重要的環節。有很多學者利用分帶的方法對後代進行鑑定，但該方法非常繁瑣，而且需要結合相關的細胞學技術。與之相比，利用DNA分子標記進行鑑定則是十分方便快捷的途徑。靶位區域擴增多態性(TRAP)是一種新型的基於PCR的分子標記，由美國農業部北方作物科學實驗室Hu與Vick於2003年提出，它藉助大規模測序技術產生的許多生物的大量序列信息，利用生物信息學工具和表達序列標籤(expressed sequence tag, EST)資料庫信息設計引物，對目標候選基因序列區進行擴增產生多態性分子標記，該標記技術已廣泛應用於動植物的研究中，主要在種質資源的鑑定評價、遺傳圖譜的構建、繪製基因組轉錄圖譜、重要的性狀標記、比較基因組學、親緣關係和遺傳多樣性等方面取得了進展。

發明內容
本發明的目的在於提供一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記。山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記為SCAR384，其序列為SEQ IDNo. 6 ；擴增 SCAR384 的引物為 2C_F384 和 2C_R384，分別具有 SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 5 的核苷酸序列。山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的獲取方法按以下步驟進行一、採用CTAB法從山羊草幼嫩葉片中提取基因組DNA作為模板，採用引物1和2 進行PCR擴增，獲得W55 ARBI1-883片段；二、W55 ARBI1-883片段純化後連接到pMD18_T載體，所得產物連接轉化大腸桿菌 JM109感受態細胞，然後塗布於含有氨苄抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆， 提取質粒進行酶切鑑定後測序，長度為88;3bp ；三、根據設計SCAR引物的要求利用軟體Primer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0軟體進行W55 ARBI1-883片段的特異SCAR引物設計，所得引物為2C_F384和2C_R384，擴增後獲得 384bp的特異片段，SCAR384，即為山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAp-SCAR384標記；其中步驟一中引物1的核苷酸序列為5，-GCTTCCCTACAACAAACC-3』，引物2的核苷酸序列為5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步驟三中引物2C-F384的核苷酸序列為5，-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3，，引物 2C-R384 的核苷酸序列為5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3，；步驟二中W55ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。本發明應用的分子標記是TRAP，具有簡單、穩定、效率高的特點，且PCR產物只用瓊脂糖電泳就可以檢測各品系間的多態性。本發明使用的PCR反應體系，不需要特殊的PCR反應儀器和特殊的反應試劑，與其它普通PCR反應要求一樣。本發明獲得山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記，為快速鑑定小麥遺傳背景下的殺配子染色體2C外源染色質或染色體奠定了良好的基礎，同時也為分子標記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。通過本發明的實驗證明，該TRAP-SCAR384標記的開發對於鑑定普通小麥中導入的殺配子染色體2C是極其有價值的，為大量雜交後代的篩選和鑑定工作提供了十分方便快捷的途徑。


圖1為具體實施方式
二中TRAP弓丨物在普通小麥「中國春」、「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草三種材料中的擴增結果的電泳圖，其中泳道1表示普通小麥「中國春」，泳道2表示殺配子染色體2C 二體附加系，泳道3表示柱穗山羊草，Marker DL2000 ；圖2為具體實施方式
二中SCAR384標記在柱穗山羊草、「中國春」_殺配子染色體2C 二體附加系、普通小麥「中國春」、二倍體長穗偃麥草中的擴增結果的電泳圖，其中泳道1表示「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道2表示柱穗山羊草，泳道3表示普通小麥 「中國春」，泳道4表示二倍體長穗偃麥草，Marker :DL2000 ；圖3為具體實施方式
二中SCAR384 標記在「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜種後代FpF2中的擴增結果的電泳圖，其中泳道1表示普通小麥-「中國春」，泳道2表示二倍體長穗偃麥草，泳道3 13表示「中國春」-長穗偃麥草7E 二體附加系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代材料，泳道14 M表示F1代自交獲得的F2代材料，Marker :DL2000。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記為 SCAR384，其序列為SEQ ID No. 6 ；擴增SCAR384的引物為2C_F384和2C_R384，分別具有SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
具體實施方式
二 本實施方式山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的獲取方法按以下步驟進行一、採用CTAB法從山羊草幼嫩葉片中提取基因組DNA作為模板，採用引物1和2 進行PCR擴增，獲得W55 ARBI1-883片段；二、W55 ARBI1-883片段純化後連接到pMD18_T載體，所得產物連接轉化大腸桿菌 JM109感受態細胞，然後塗布於含有氨苄抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆， 提取質粒進行酶切鑑定後測序，長度為88;3bp ；三、根據設計SCAR引物的要求利用軟體Primer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0軟體進行W55 ARBI1-883片段的特異SCAR引物設計，所得引物為2C_F384和2C_R384，擴增後獲得 384bp的特異片段，SCAR384，即為山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAp-SCAR384標記；其中步驟一中引物1的核苷酸序列為5』 -GCTTCCCTACAACAAACC-3』，引物2的核苷酸序列為5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步驟三中引物2C-F384的核苷酸序列為5，-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3，，引物 2C-R384 的核苷酸序列為5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3，；步驟二中W55 ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。本實施方式中步驟一中山羊草為柱穗山羊草，由日本國家生物資源計劃小麥中心 (http://www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp)提供。本實施方式中pMD18-T載體和大腸桿菌JM109感受態細胞均為購買得到本實施方式中涉及引物合成與基因合成的部分由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應試劑均為購買得到(寶生物工程 有限公司，大連，中國)；本實施方式在具體操作中涉及使用的試劑盒均按說明書操作(寶 生物工程有限公司，大連，中國)。本實施方式中W55 ARBI1-883片段在NCBI中進行Blast搜索，利用軟體！3rimer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0進行序列比對及分析，結果顯示，未找到與其具有同源性的序 列。本實施方式中所得引物為2C_F384和2C_R384，擴增後獲得384bp的特異片段，即為 山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAp-SCAR384標記，其PCR擴增產物片段大小為384bp，命名 為 SCAR384 ；山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR384分子標記驗證利用普通小麥「中國春」、「中國春」-殺配子染色體2C ニ體附加系、柱穗山羊草和 二倍體長穗偃麥草材料進行了 SCAR384標記驗證，在「中國春」-殺配子染色體2C ニ體附加 系、柱穗山羊草中擴增出了 384bp的片段，而在普通小麥「中國春」、二倍體長穗偃麥草中沒 有該產物，初歩證明此TRAP-SCAR384標記可以用於殺配子染色體2C的檢測；(其中圖1為 TRAP引物在普通小麥「中國春」、殺配子染色體2C ニ體附加系、柱穗山羊草三種材料中的擴 增結果；圖2為SCAR384標記在柱穗山羊草、「中國春」-殺配子染色體2C ニ體附加系、二倍 體長穗偃麥草中的擴增結果)。山羊草屬殺配子染色體2C特異SCAR384分子標記應用用該對SCAR384引物對「中國春」-殺配子染色體2C ニ體附加系與「中國春」-長穗 偃麥草7E ニ體附加系的雜種F1代、F2代進行了分析，結果在全部F1代以及部分F2代材料 中擴增出了目的片段，進ー步證明了此TRAP-SCAR384標記可以用來檢測小麥背景下的殺配 子染色體2C，為小麥背景中殺配子染色體2C的快速跟蹤檢測提供了新途徑；(其中圖3為 SCAR384標記在「中國春」-長穗偃麥草7E ニ體附加系與「中國春」-殺配子染色體2C ニ體 附加系雜種後代F1. F2中的擴增結果)。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
ニ不同的是步驟一中PCR擴增的反 應體系為20 y L反應體系，由下列成分組成
成分用量
山羊草幼嫩葉片中基因組DNA50 ng
0.3pmol 引物 1luL 5，-GCTTCCCTAC AAC AAACC-3 『
IOpmol 引物 2luL5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，
10 X擴增緩衝液2|iL
2.5mM dNTP Mix1.5|iL
5υ/μ DNA 聚合酶0.2|iL
ddH20餘量PCR 擴增條件為94°C預變性 2min，94°C變性 45s，35°C退火 45s，72°C延伸 lmin， 共5個循環，94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，共；35個循環，再72°C延伸7min， 4°C保溫。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中連接的體系如下
成分用量
0.2 pmol W55 ARBI1-883 片段2|iL
pMD18-T 載體l|iL
Solution I5 μι
ddH20餘量連接條件為16°C連接過夜。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟二中氨苄抗性的 LB固體培養基每IOOOmL由50 μ g的氨苄青黴素、IOg的胰蛋白腖、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg NaCl的和餘量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟三中設計SCAR引物的要求①引物長度為20 22bp ；②退火溫度為52 58°C;③GC含量為40 55%;④ 產物片段大小為400 800bp。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
權利要求
1.一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAIi384標記，其特徵在於，山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAp-SCAR384標記為SCAR384，其序列為SEQ ID No. 6。
2.根據權利要求1所述一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記，其特徵在於擴增SCAR384的引物為2C-F384和2C-R384，分別具有SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
3.獲取如權利要求1所述一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的方法，其特徵在於獲取山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的方法按以下步驟進行一、採用CTAB法從山羊草幼嫩葉片中提取基因組DNA作為模板，採用引物1和2進行 PCR擴增，獲得W55ARBI1-883片段；二、W55ARBI1-883片段純化後連接到pMD18_T載體，所得產物連接轉化大腸桿菌 JM109感受態細胞，然後塗布於含有氨苄抗性的LB固體培養基中進行培養，挑取陽性克隆， 提取質粒進行酶切鑑定後測序，長度為88;3bp ；三、根據設計SCAR引物的要求利用軟體PrimerPremier 5. 0和DNAMAN5. 0軟體進行 W55 ARBI1-883片段的特異SCAR引物設計，所得引物為2C_F384和2C_R384，擴增後獲得384bp 的特異片段，SCAR384，即為山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記；其中步驟一中引物1的核苷酸序列為5』 -GCTTCCCTACAACAAACC-3』，引物2的核苷酸序列為5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步驟三中引物2C-F384的核苷酸序列為5』-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3』，引物2C_R384的核苷酸序列為5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3』 ；步驟二中W55 ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.根據權利要求3所述的獲取山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的方法，其特徵在於步驟一中PCR擴增的反應體系為20 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量山羊草幼嫩葉片中基因組DNA50 ng0.3 pmol 引物 1Ιμ 5，-GCTTCCCTAC AAC AAACC-3 『IOpmol 引物 2Ιμ 5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3 『10 X擴增緩衝液2μL2.5 mM dNTP Mix1.5jiL5U~L DNA聚合酶0.2|_iLddH20餘量PCR擴增條件為94°C預變性anin，94°C變性45s，35°C退火45s，72°C延伸lmin，共5個循環，94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，共；35個循環，再72°C延伸7min，4°C保
5.根據權利要求3所述的獲取山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的方法，其特徵在於步驟二中連接的體系如下成分用量 .0.2 pmol W55 ARBI1-883 片段2|iLpMD18-T 載體l|iLSolution I5 μιddH20餘量連接條件為16°C連接過夜。
6.根據權利要求3所述的獲取山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記的方法，其特徵在於步驟二中氨苄抗性的LB固體培養基每IOOOmL由50 μ g的氨苄青黴素、IOg 的胰蛋白腖、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl和餘量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。
全文摘要
一種山羊草屬殺配子染色體2C特異TRAP-SCAR384標記。標記為SCAR384；擴增SCAR384的引物為2C-F384和2C-R384。方法從山羊草中提取基因組DNA作為模板，TRAP-PCR擴增後獲得W55 ARBI1-883片段；W55 ARBI1-883片段純化後連接到pMD18-T載體，連接產物轉化感受態細胞後挑取陽性克隆，提取質粒進行酶切鑑定後測序，長度為883bp；根據設計SCAR引物的要求設計引物為2C-F384和2C-R384，擴增後獲得384bp的特異片段，SCAR384。本發明的標記簡單、穩定、效率高，且PCR產物只用瓊脂糖電泳就可以檢測各品系間的多態性。
文檔編號C12N15/11GK102286478SQ20111022253
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者吳磊, 徐國輝, 束永俊, 蘇文悅, 郭長虹 申請人:哈爾濱師範大學