一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法
2024-01-26 03:16:15
專利名稱：一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種螢光探針，以及利用螢光探針檢測病毒的方法，特別涉及一種藻紅蛋白螢光探針，以及利用藻紅蛋白螢光探針快速檢測菸草花葉病毒的方法。
背景技術：
植物病毒檢測常用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結合的特異性與酶的高效催化性相結合的技術，具有靈敏度高，特異性強等特點，但操作步驟多，耗時長，且需要相對昂貴的酶標抗體和96孔酶標板。
螢光免疫分析是利用各種螢光物作為探針分子的一種標記免疫分析方法，目前在核酸、蛋白質、多肽、胺基酸、酶、激素、生長因子、細胞因子、細胞表面標誌物、腫瘤特異性抗原、受體、藥物、傳染源等各種微量生物活性物質的分析中得到廣泛應用。傳統的螢光探針包括螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、羅丹明(Rodam)等。螢光測定的檢測限值常受血清和其他生物樣品中本底螢光的制約，加之，傳統螢光探針非特異性吸附，嚴重影響檢測的敏感性，阻礙螢光免疫分析方法發展。藻紅蛋白是一種新型的螢光探針，已經在醫學診斷、細胞生物學和分子生物學等諸多領域中得到廣泛應用。
閆鳳英等2004年在中華醫藥雜誌第4卷第10期發表文為「螢光染料R-藻紅蛋白標記小鼠抗人CD系列單克隆抗體」，用R-藻紅蛋白(R-PE)標記小鼠抗人CD系列單克隆抗體的螢光試劑，應用於流式細胞儀分析，分析表明R-PE標記的抗體特異性保持完好，且螢光強度高，還可配伍成雙標試劑。1997年美國的Iannellli，D等在病毒學方法雜誌上發表文為「利用流式細胞儀同時檢測黃瓜花葉病毒(CMV)、菸草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)」，將PVY、CMV、TMV三種病毒侵染的植物組織汁液分別與大小不同的乳膠顆粒一起孵育，洗滌後依次在第一抗體和第二抗體中孵育，其中第二抗體分別用藻紅蛋白和螢光素這兩種可發不同螢光的染料進行標記。根據產生螢光的不同和捕捉到病毒的乳膠顆粒的大小來判斷病毒的種類，從而實現了對這三種病毒的同時檢測。
目前，藻紅蛋白螢光探針的試劑化和商品化程度不高，尚未開發出普及型診斷試劑，對植物病毒的檢測研究更是鮮有報導。
發明內容
本發明的目的是利用藻紅蛋白的優良螢光特性，開發藻紅蛋白螢光探針，並用於菸草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的檢測。
本發明是通過以下方法實現的一、材料所用的主要試劑藻紅蛋白為福建農林大學植物病毒研究所製備；交聯試劑SPDP、2-IT、以及終止劑NEM購自Peirce公司；介質Superdex200HR為Amersham公司的產品；牛血清白蛋白(BSA)為Sigma產品；硝酸纖維素膜0.45μ為Amersham公司產品；試驗中所使用的其他常規藥品和試劑均為一般的國產分析純或化學純試劑。
1、藻紅蛋白的製備在研碎機中充分磨碎叉節藻(Amphiroa ephdraea)或珊瑚藻(Corallinaofficinalis)，用0.01M PBS pH7.0緩衝液浸提過夜，三層紗布過濾後，4℃下10000rpm離心15min，取上清液；然後用飽和度30％-45％硫酸銨分級沉澱蛋白，得粗製藻紅蛋白紅色沉澱；紅色沉澱溶於0.01M PBS pH7.0緩衝液，然後上樣於Superdex G-15脫鹽柱，脫鹽；收集的脫鹽液即可上樣於預先已用0.15M NaCl+0.01M PBS pH7.0緩衝液平衡好的羥基磷灰石柱，繼續用緩衝液衝洗30min後，再用0.15M NaCl+0.01M～0.2M pH7.0PBS緩衝液作線性梯度洗脫；洗脫液收集、濃縮、離心。
2、TMV多克隆抗體的製備取4ml抗血清加8ml 0.06M pH4.0的醋酸緩衝液，用NaOH校正pH值至4.8，在振蕩條件下緩慢加入120μl正辛酸，在室溫中振蕩混合30min，在4℃中10000rpm離心15min，去沉澱，上清液裝入透析袋中，在0.01MpH7.4PBS緩衝液中，透析12h，然後緩慢加等體積飽和硫酸銨，在4℃靜置30min，12000rpm離心20min，取沉澱，透析後使用。
3、陽性、陰性樣品的製備陽性樣品為純化的菸草花葉病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml範圍；陰性樣品為封閉緩衝溶液。
4.封閉緩衝液和洗滌緩衝液的配製封閉緩衝溶液20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA洗滌緩衝溶液50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20二、藻紅蛋白螢光探針的製備
(1)交聯蛋白交聯的兩種蛋白分別為6mg/ml，1.25ml的藻紅蛋白與4mg/ml，0.75ml菸草花葉病毒(TMV)多克隆抗體，二者的摩爾比為1∶1～2∶1；(2)異功能試劑活化蛋白用異功能試劑SPDP活化藻紅蛋白，二者摩爾比為80∶1～200∶1，反應時間為15～60min；異功能試劑2-IT巰基化TMV多克隆抗體，二者摩爾比為160∶1～320∶1，反應時間為0.5～3h；(3)混合反應異功能試劑活化反應後，脫鹽去除未反應活化試劑；取等體積反應物混合反應，4℃，反應6h。
(4)中止反應加入終止液NEM 80mmol/L 100μl中止交聯反應，4℃反應1h，將反應物裝入透析夾中，透析濃縮。
(5)純化分離交聯混合物將交聯混合物上樣於Superdex200HR凝膠層析拄(1.6×60cm)，以0.15ml/min流速，用0.15M NaCL+100mmol/L pH7.0PBS緩衝液洗脫。
三、檢測方法檢測使用的材料由藻紅蛋白螢光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩衝溶液和洗滌緩衝溶液組成。
檢測方法如下(1)包被在硝酸纖維素膜上，滴加2-6μlTMV抗體，各點間相隔1-2cm的距離，置於4℃，吸附0.5-3h；(2)封閉將硝酸纖維素膜直接浸入20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA封閉緩衝液內，37℃溫育0.5-3h；(3)洗滌A配製50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20的洗滌緩衝液，並用洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置乾燥；(4)點樣滴加陽、陰性樣品和待測樣品，每孔2-6μl；(5)洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置10-30min，用所述的洗滌緩衝液清洗膜片至少三次，靜置乾燥；(6)螢光標記示蹤加入藻紅蛋白螢光探針2-6μl，在37℃溫育0.5-3h；(7)洗滌C用所述的洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用乾淨的吸水紙去除表面殘餘的液體；(8)檢測判定將硝酸纖維素膜平鋪在乾淨的玻璃片上，在倒置螢光顯微鏡下檢測觀察判定結果。
藻紅蛋白螢光探針免疫螢光檢測主要運用兩種抗體，藻紅蛋白標記抗體和硝酸纖維素膜包被的固相抗體。檢測時固相抗體通過抗原反應特異性捕獲待測抗原，形成免疫複合物，加入藻紅蛋白螢光探針，與免疫複合物充分反應後，經洗滌去除非特異性物質，即可檢測判定結果。
為檢驗藻紅蛋白螢光探針直接免疫螢光法(DFIA)的檢測效果，用該法檢測了55份TMV樣品，檢測結果與ELISA的檢測結果相比較(見附表1)。
附表1 藻紅蛋白直接免疫螢光法與ELISA檢測結果的比較
注「+」代表陽性；「+/-」代表假陽性；「-」代表陰性。
41份由ELISA檢測為陽性的樣品，直接免疫螢光檢測也都為陽性；8份由ELISA檢測為假陽性的樣品，直接免疫螢光檢測其中的6份為假陽性，另2份為陽性；6份由ELISA檢測為陰性的樣品，直接免疫螢光檢測其中的5份為陰性，另1份為假陽性；從上述檢測的結果來看，藻紅蛋白直接免疫螢光檢測檢測具有較好的特異性，與ELISA檢測結果相比較，陽性的檢出率為100％、假陽性的檢出率為75％、陰性檢出率為83.3％、總體檢出率為94.55％，說明NC膜為固相載體的藻紅蛋白直接免疫螢光法與ELISA具有高的符合度。
利用藻紅蛋白螢光探針直接免疫螢光檢測菸草花葉病毒，具有選擇性強、試樣量少和方法簡便等優點，與目前植物病毒常用的檢測方法ELISA相對比，直接免疫螢光檢測法以硝酸纖維素膜為載體，膜片狀載體操作簡單、方便、步驟少，檢測所用的時間短，同時不需要比較昂貴的酶標抗體，相對經濟。此外，藻紅蛋白來自天然海藻，作為螢光探針安全無害，克服傳統化學合成的螢光素類螢光探針的合成所帶來的危害，蛋白本身螢光強度高，長期保存無明顯衰減的螢光特性，這都預示的藻紅蛋白作為螢光探針在檢測上應用具有巨大潛力。
具體實施例方式
為了充分公開本發明的一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，現結合實施例加以說明。
實施例一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，包括以下步驟1.包被在硝酸纖維素膜上滴加3μl TMV抗體，各點間相隔1cm，置4℃，吸附2h。
2.封閉將硝酸纖維素膜直接浸入50mmol/L pH7.5PBS+2％BSA封閉液內，37℃，溫育1h。
3.洗滌A配製100mmol/L pH7.5PBS+0.1％Tween20的洗滌緩衝液，並用洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置乾燥。
4.點樣滴加陽、陰性和待測樣品，各點3μl。、5.洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置15min，用所述的洗滌緩衝液清洗膜片至少三次，靜置乾燥。
6.螢光示蹤加入藻紅蛋白螢光探針3μl，在37℃溫育1h。
7.洗滌C用所述的洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用乾淨的吸水紙去除殘餘的液體。
8.檢測判定在倒置螢光顯微鏡下檢測儀器上觀察判定結果。
螢光免疫檢測儀器與判定標準以Leica倒置式螢光顯微鏡為檢測儀器，用肉眼觀察判定時，螢光信號的強度按以下標準判斷「-」表示無螢光；「-+」表示螢光較弱；「+」表示螢光清晰可見；「++」表示螢光明顯可見，強度大「+++～++++」表示螢光非常明亮；「-」定為陰性，「-+」定為假陽性，「+」及「+」以上的結果，均定為陽性。
待測樣品按以上標準，定性判斷分析樣品檢測結果的陰、陽性。
根據上述方法，配置所用的相應試劑和材料，也可以組裝成檢測菸草花葉病毒的試劑盒，方便使用。
權利要求
1.一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒(Tobacco mosaicvirus，TMV)的方法，其特徵在於使用的材料由藻紅蛋白螢光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩衝液和洗滌緩衝液組成；檢測方法如下(1)包被在硝酸纖維素膜上，滴加2-6μlTMV抗體，各點間相隔1-2cm的距離，置於4℃，吸附0.5-3h；(2)封閉將硝酸纖維素膜直接浸入20-100mmol/L pH7.5PBS+0.5-3％BSA封閉緩衝液內，37℃溫育0.5-3h；(3)洗滌A配製50-200mmol/L pH7.5PBS+0.05-0.3％Tween20的洗滌緩衝液，並用洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，靜置乾燥；(4)點樣滴加陽、陰性樣品和待測樣品，每孔2-6μl；(5)洗滌B待樣品液完全滲入硝酸纖維素膜，室溫靜置10-30min，用所述的洗滌緩衝液清洗膜片至少三次，靜置乾燥；(6)螢光標記示蹤加入藻紅蛋白螢光探針2-6μl，在37℃溫育0.5-3h；(7)洗滌C用所述的洗滌緩衝液清洗硝酸纖維素膜至少三次，取出膜片用乾淨的吸水紙去除表面殘餘的液體；(8)檢測判定將硝酸纖維素膜平鋪在乾淨的玻璃片上，在倒置螢光顯微鏡下檢測觀察判定結果。
2.根據權利要求1所述的一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，其特徵在於藻紅蛋白螢光探針的製備方法如下(1)交聯蛋白交聯的兩種蛋白分別為6mg/ml，1.25ml的藻紅蛋白與4mg/ml，0.75ml菸草花葉病毒(TMV)多克隆抗體，二者的摩爾比為1∶1～2∶1；(2)異功能試劑活化蛋白用異功能試劑SPDP活化藻紅蛋白，二者摩爾比為80∶1～200∶1，反應時間為15～60min；異功能試劑2-IT巰基化TMV多克隆抗體，二者摩爾比為160∶1～320∶1，反應時間為0.5～3h；(3)混合反應異功能試劑活化反應後，脫鹽去除未反應活化試劑；取等體積反應物混合反應，4℃，反應6h；(4)中止反應加入終止液NEM 80mmol/L 100μl中止交聯反應，4℃反應1h，將反應物裝入透析夾中，透析濃縮；(5)純化分離交聯混合物將交聯混合物上樣於Superdex200HR凝膠層析拄(1.6×60cm)，以0.15ml/min流速，用0.15M NaCL+100mmol/L pH7.0PBS緩衝液洗脫。
3.根據權利要求1或2所述的一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，其特徵在於藻紅蛋白的製備方法是在研碎機中充分磨碎海藻，用0.01M PBS pH7.0緩衝液浸提過夜，三層紗布過濾後，4℃下10000rpm離心15min，取上清液；然後用飽和度30％-45％硫酸銨分級沉澱蛋白，得粗製藻紅蛋白紅色沉澱；紅色沉澱溶於0.01M PBS pH7.0緩衝液，然後上樣於Superdex G-15脫鹽柱，脫鹽；收集的脫鹽液即可上樣於預先已用0.15MNaCl+0.01M PBS pH7.0緩衝液平衡好的羥基磷灰石柱，繼續用緩衝液衝洗30min後，再用0.15M NaCl+0.01M～0.2M pH7.0PBS緩衝液作線性梯度洗脫；洗脫液收集、濃縮、離心。
4.根據權利要求1所述的一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，其特徵在於所述的封閉，是將硝酸纖維素膜直接浸入50mmol/LpH7.5PBS+2％BSA封閉液內，37℃，溫育1h。
5.根據權利要求1所述的一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒的方法，其特徵在於所述的洗滌，是用100mmol/L pH7.5PBS+0.1％Tween20的洗滌緩衝液。
全文摘要
一種利用藻紅蛋白螢光探針檢測菸草花葉病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)的方法，使用的材料由藻紅蛋白螢光探針、硝酸纖維素膜、TMV多克隆抗體、陽性陰性對照品、封閉緩衝液和洗滌緩衝液組成。主要運用藻紅蛋白標記抗體和硝酸纖維素膜包被的固相抗體兩種抗體。檢測時固相抗體通過抗原反應捕獲待測抗原，形成免疫複合物，加入藻紅蛋白螢光探針，與免疫複合物充分反應，洗滌後在倒置螢光顯微鏡下檢測判定結果。藻紅蛋白直接免疫螢光法具有特異性強、試劑用量少、方法簡單、相對經濟等優點。
文檔編號G01N33/544GK1715924SQ200510044139
公開日2006年1月4日 申請日期2005年7月25日 優先權日2005年7月25日
發明者吳祖建, 陳良華, 王盛, 林奇英, 謝聯輝 申請人:福建農林大學