一種測定血漿中5』-甲氧基-3』,4』-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法

2024-01-25 06:24:15

一種測定血漿中5』-甲氧基-3』, 4』-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定血漿中5』-甲氧基-3』,4』-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法，採用液質聯用系統測定，先取待測樣品，加入一定量的有機溶媒進行萃取，預處理後，經色譜柱分離，用質譜檢測器檢測，本發明方法快速、準確、靈敏度高、操作簡便，適合於測定血漿中5』-甲氧基-3』,4』-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺的濃度。
【專利說明】—種測定血漿中5』 -甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於藥物分析【技術領域】，涉及體內藥物的分析測定方法，具體涉及測定血漿中5』 -甲氧基_3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法。

【背景技術】
[0002]大葉筠(Piper Laetispicum C.DC.)為胡椒科胡椒屬植物，主要產於海南、廣東、廣西、雲南等地，民間用於活血、消腫、止痛，主治跌打損傷、瘀血腫痛。近期研究發現大葉筠具有較強的抗抑鬱作用，其活性和一系列醯胺類化合物有關。其中5』-甲氧基_3』，4』_亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺(C15H19N04) (K6)為其中含量最高的生物鹼。
[0003]目前關於人體服用大葉筠有效部位提取物後血漿中K6的測定方法沒有文獻報導。本發明建立了大葉筠有效部位提取物中主要有效成分K6在人體內的測定方法，通過該方法對K6在人體內的藥物代謝情況進行探索性研究，以期服務於新藥開發。


【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種測定血漿中5』 -甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法。
[0005]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下:
[0006]一種測定血漿中5』 -甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺(K6)濃度的方法，血漿樣品經預處理後經液質聯用系統檢測其濃度，具體方法包括如下步驟:
[0007](I)血漿樣品預處理:取血漿樣品，加入內標替硝唑溶液，加入乙酸乙酯萃取，吸取上層有機相，40 V下減壓濃縮揮幹，加入80v/v %甲醇水溶液溶解，離心後取上清液；
[0008](2)將步驟(I)預處理後的血漿樣品進行液相色譜分離:色譜柱為Agilent ZOBAXSB C18，4.6X150mm，5ym ;流動相:體積比為80:20的甲醇與0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液；流速:400mL.mirT1 ;柱溫:35°C ;進樣量:5 μ L ;洗脫方式為等度洗脫；
[0009](3)質譜測定:條件為:離子源:電噴霧離子化電離源ESI ;離子檢測方式:多反應監測(MRM);離子極性:正離子；離子源電壓IS:5000V ;離子源溫度TEM:400°C ；碰撞氣CAD:10L.mirT1 ;氣簾氣 CUR:20L.mirT1 ;離子源 Gasl:60L.mirT1 ;離子源 Gas2:70L.mirT1 ；檢測對象的離子選擇通道:5』 -甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺，[M+H]+，m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內標替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ；
[0010](4)計算:採用內標法，以5』 -甲氧基_3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺和內標替硝唑的峰面積比值代入標準曲線方程計算5』 -甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度。
[0011]步驟(I)中，於10.0mL玻璃試管中精密加入血漿樣品0.5mL，精密加入內標105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L，旋渦10s，加入4.0mL乙酸乙酯，旋渦振蕩3min，3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機相4mL, 40°C下減壓濃縮揮幹,加入10 μ L80v/v%甲醇水溶液復溶，旋潤lmin, 12000r.mirT1離心5min,吸取上清液。
[0012]其中，所述的血漿為口服大葉筠有效部位提取物後的血漿。本發明對大葉筠有效部位提取物如何製備沒有具體限定，現有的製備方法都可以採用。本發明方法重點是保護口服大葉筠有效部位提取物後，血漿內K6的檢測方法，從而為研究K6的體內代謝奠定基礎。
[0013]其中，所述血漿為人或動物的血漿。
[0014]有益效果:本發明方法與現有技術相比，具有如下優勢:
[0015](I)預處理方法簡便:有機溶媒液液萃取法，適用於常規測定。
[0016](2)專屬性強:採用ZOBAX SB C18色譜柱作為固定相，甲醇和水(0.2mmol -T1醋酸胺)的混合液作為流動相，等度洗脫，K6保留時間為5.3min左右，內標替硝唑保留時間為3.7min左右，6.5分鐘完成測定，內源性物質不幹擾二者的測定。
[0017](3)靈敏度高:血漿最低定量限為0.1006ng.mL—1。
[0018](4)本發明方法快速、準確、靈敏度高、操作簡便，為K6的臨床血藥物濃度測定提供依據，服務於新藥研究開發及臨床應用。本方法的血漿標準曲線線性範圍為0.1006?25.75ng.ml/1,日內和日間精密度RSD均小於10%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為質譜圖。
[0020]其中，A為人空白血漿的質譜圖。B為甲醇加入標準品的質譜圖。C人空白血漿加入標準品後的質譜圖。D為人空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg)3h後血漿樣品的質譜圖。
[0021]注:圖中離子選擇通道I為K6，[M+H]+，m/z278.1/205.1 ;保留時間為5.3min左右；離子選擇通道2為內標替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0，保留時間為3.7min左右。

【具體實施方式】
[0022]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0023]實施例1:人血漿中K6濃度的測定。
[0024]一、實驗材料與儀器
[0025]K6對照品:由蘇州頤華生物醫藥技術有限公司提供，批號:20131121 ;替硝唑對照品:由中國藥品生物製品檢定所提供，批號:100336-200402 ;試驗用水:超純水；甲醇:色譜純(Merck Company)。
[0026]API4000LC/MS/MS聯用儀(美國應用生物系統公司)，色譜工作站=Analystl.4.2 ；梅特勒MT-5電子天平(瑞士梅特勒公司)；LEGEND MICR017R冷凍高速離心機(美國Thermo公司)；80-2離心機(江蘇金壇市榮華儀器製造有限公司)Millipore Drict_Q5超純水機(法國 Millipore 公司)。離心濃縮儀:Labconco CentriVap Console (美國 Labconco 公司)
[0027]二、液質條件
[0028]1.液相色譜條件
[0029]色譜柱:AgilentZOBAX SB C18 (4.6 X 150mm, 5 μ m);流動相:甲醇一水(即0.2mmol/L 醋酸胺水溶液)(80:20，v/v);流速:400 μ L.mirT1 ;柱溫:35°C。
[0030]2.質譜條件
[0031]離子源:離子源:電噴霧離子化電離源ESI ;離子檢測方式:多反應監測(MRM);離子極性:正離子；離子源電壓is:5000V ;離子源溫度TEM:400°C;碰撞氣CAD:10L.mirT1 ;氣簾氣CUR:20L.min- 1 ;離子源Gasl:60L.min 1 ;離子源Gas2:70L.min-1、檢測對象的離子選擇通道:K6，[M+H]+, m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內標替硝唑，[M+H]+,m/z248.1/128.0，DP100, EP10, CE30, CXP8。
[0032]三、實驗過程:
[0033]1.Κ6標準溶液的配製:
[0034]精密稱取Κ6對照品10.30mg，置於1mL容量瓶中，加入甲醇溶解並定容至刻度，搖勻，即得1030 μ g -mL-1K6儲備液，再以甲醇依次稀釋，配成濃度分別為5.029，10.06，20.12，40.23,80.47，160.9,321.9,643.8，1288ng.mL_1 的 K6 標準溶液。
[0035]2.人血漿樣品的處理:
[0036]6名男性空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg)，用250mL溫開水送服；於給藥後3h採集外周靜脈血4ml,注入肝素管內，避光,離心(3000r *min_1, 1min),分取血漿0.5mL於10.0mL玻璃試管中，精密加入內標替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L，旋渦10s，加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機相4mL,40°C下減壓濃縮揮幹，加入100 μ L80%甲醇溶液復溶，旋渦lmin，12000r.mirT1離心5min，吸取上清液5 μ L進樣(見圖1中D)，計算K6和內標峰面積的比值fl，代入標準曲線計算濃度。
[0037]3.專屬性:
[0038]取沒有給予過大葉筠有效部位提取物的人空白血漿0.5mL於10.0mL玻璃試管中，加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機相4mL,40°C下減壓濃縮揮幹，加入100 μ L80%甲醇溶液復溶，旋渦lmin，12000r.mirT1離心5min，吸取上清液5μ L進樣(見圖1中Α)。
[0039]取1.0mL塑料離心管精密加入Κ6標準溶液(160.9ng.mL—1) 10 μ L，加入內標替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L, 80 % 甲醇 70 μ L,旋潤 lmin,於 12000r.mirT1 離心 5min,吸取上清液5 μ L進樣(見圖1中B)。
[0040]取沒有給予過大葉筠有效部位提取物的人空白血漿0.5mL於10.0mL玻璃試管中，精密加入K6標準溶液(103.0ng.mL—1) 10 μ L，內標替硝唑溶液(105.6ng.mL—1) 20 μ L，旋渦10s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋潤振蕩3min,3000r *min-l離心1min,吸取上層有機相4mL,40°C下減壓濃縮揮幹，加入100 μ L80%甲醇溶液復溶，旋渦lmin，12000r.mirT1離心5min，吸取上清液5 μ L進樣(見圖1中C)。
[0041]結果顯示，在本實驗所採用的LC-MS-MS條件下，血漿樣品無雜峰對檢測組分造成幹擾，Κ6保留時間在5.3min左右，內標替硝唑保留時間在3.7min左右。K6和內標互不幹擾，峰形良好，基線平穩。
[0042] 4.線性試驗
[0043]人血漿標準曲線:取10.0mL玻璃試管數支，分別加入沒有給予過大葉筠有效部位提取物的空白血漿0.5mL,再分別精密加入不同濃度的K6標準液10 μ L，旋渦1s混勻，配成含 Κ6 的濃度分別為 0.1006，0.2012,0.4023,0.8047、1.609,3.219,6.438、12.88、25.75ng ?ιn-1的含藥血漿，按「血漿樣品處理」項下操作。計算Κ6峰面積As和內標峰面積Ai的比值f (f = As/Ai)，以峰面積比值f對血藥濃度C作回歸計算。以平均比值f對血藥濃度C作回歸計算，得回歸方程:f = 0.137XC+0.00898 (r = 0.9990，權重係數w = 1/C*C)，K6血漿濃度在0.1006~25.75ng -ml-1範圍內線性關係良好。最低定量限為0.1006ng.mL'
[0044]5.準確度和精密度
[0045]按照人血漿標準曲線方法配製含K6濃度為0.2060,2.060,20.60ng.mL—1的低、中、高的血漿樣品，按「人血漿樣品的處理」處理方法分別處理。連續做3天，每天每個濃度各做5份樣品，計算K6峰面積As和內標峰面積Ai的比值f，代入當天的血漿標準曲線中求得K6實測濃度，由實測濃度計算日內、日間精密度和相對標準偏差(RSD)，實測濃度與加入濃度的比值即為準確度。結果顯示，日內和日間精密度RSD均小於10%，準確度符合要求。
[0046]6.測定結果
[0047]上述給予過大葉筠有效部位提取物的6名男性血漿中K6含量分別為4.969、
5.2636、9.008、5.006、1.295、4.254ng.mL、
[0048]實施例2:人血漿中K6濃度的測定
[0049]參照實施例1，6名女性空腹服用大葉筠有效部位提取物(含K620.8mg)，用250mL溫開水送服；於給藥後3h 採集外周靜脈血4mL，注入肝素管內，避光，離心(3000r.mirT1，1min)製備血漿。含藥血漿樣品處理及測定條件相同，結果給予過大葉筠有效部位提取物的 6 名女性血漿中 K6 含量分別為 9.323、12.54、12.55、13.09,5.011,7.569ng.mL'
【權利要求】
1.一種測定血漿中5』-甲氧基_3』，4』-亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法，其特徵在於，血漿樣品經預處理後經液質聯用系統檢測其濃度，具體方法包括如下步驟: (1)血漿樣品預處理:取血漿樣品，加入內標替硝唑溶液，加入乙酸乙酯萃取，吸取上層有機相，40°C下減壓濃縮揮幹，加入80v/v%甲醇水溶液溶解，離心後取上清液； (2)將步驟(I)預處理後的血漿樣品進行液相色譜分離:色譜柱為AgilentZOBAX SBα8，4.6Χ150πιπι，5μπι;流動相:體積比為80:20的甲醇與0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液；流速:400mL.miiT1 ;柱溫:35°C ;進樣量:5 μ L ;洗脫方式為等度洗脫； (3)質譜測定:條件為:離子源:電噴霧離子化電離源ESI;離子檢測方式:多反應監測；離子極性:正離子；離子源電壓IS:5000V ;離子源溫度TEM:400 0C ;碰撞氣CAD:1L.mirf1 ;氣簾氣 CUR:20L.mirf1 ;離子源 Gasl:60L.mirf1 ;離子源 Gas2:70L.mirf1 ;檢測對象的離子選擇通道:5』 -甲氧基_3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺，[M+H]+，m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;內標替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ； (4)計算:採用內標法，以5』-甲氧基_3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺和內標替硝唑的峰面積比值代入標準曲線方程計算5』 -甲氧基_3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度。
2.根據權利要求1所述的測定血漿中5』-甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法，其特徵在於，步驟(I)中，於10.0mL玻璃試管中精密加入血漿樣品0.5mL,精密加入內標105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L，旋渦1s,加入4.0mL乙酸乙酯，旋潤振蕩3min,3000r.mirT1離心1min,吸取上層有機相4mL, 4(TC下減壓濃縮揮幹,加入100 μ L80v/v%甲醇水溶液復溶，旋渦lmin，12000r.mirT1離心5min，吸取上清液。
3.根據權利要求1所述的測定血漿中5』-甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法，其特徵在於，所述的血漿為口服大葉筠有效部位提取物後的血漿。
4.根據權利要求1所述的測定血漿中5』-甲氧基-3』，4』 -亞甲二氧苯基桂皮酸異丁基醯胺濃度的方法，其特徵在於，所述血漿為人或動物的血漿。
【文檔編號】G01N30/88GK104076116SQ201410303081
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】張軍, 儲繼紅, 李長印, 居文政, 吳婷, 許美娟, 劉史佳 申請人:江蘇省中醫院