一種淡水小龍蝦swd蛋白酶抑制劑的製備方法
2024-01-24 21:03:15
一種淡水小龍蝦swd蛋白酶抑制劑的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，屬於基因工程【技術領域】。本發明將淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑基因進行大腸桿菌原核表達，通過蛋白酶抑制劑活性檢測試驗，SWD蛋白酶抑制劑可以抑制細菌生長繁殖過程產生的蛋白酶的活性，而且具有廣譜蛋白酶活性抑制劑作用，其在食品行業的抗菌處理、醫藥行業的抗菌藥物開發等方面具有較大的應用價值。
【專利說明】—種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]在動物進化過程中，隨著外界環境不斷改變造成的各種挑戰，生物體自身的免疫系統在接受各種外界免疫刺激的同時也在不斷進化，到目前為止，依據動物體所處進化地位的高低，已經形成了兩大類鮮明的免疫系統，一類是較為低等的先天免疫系統，另一類是後天形成的獲得性免疫系統。先天免疫系統主要存在於無脊椎動物體內，然而，獲得性免疫系統主要存在於高等的脊椎動物體內。對於不具有脊椎的甲殼類動物來說，先天免疫系統是它們防禦細菌、真菌、病毒侵染的唯一防線，尤其是先天免疫系統中的細胞免疫和體液免疫兩種方式擔負著所有的免疫防禦功能。[0003]先天免疫系統中的體液免疫方式存在著多種免疫效應分子，其中，抗菌肽分子是一類非常重要的能夠針對細菌和真菌的入侵發揮免疫效應的分子，而且，抗菌肽分子也是甲殼類無脊椎動物與免疫反應相關的多種信號通路的最終發揮清除作用的功能分子。目前，發現的抗菌肽分子種類繁多，其中有一類分子的結構比較典型，在其胺基酸序列中存在著一個乳清酸性蛋白結構域，簡稱WAP結構域，這個結構域的特點就是存在著由8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵。根據分子中存在的WAP結構域的個數，我們人為地將其分為具有單個WAP結構域的抗菌肽分子或者稱為SWD抗菌肽分子、具有雙WAP結構域的抗菌肽分子或者稱為DWD抗菌肽分子。
[0004]多數抗菌肽分子不僅可以在甲殼類動物體內發揮清除細菌、真菌的作用，也可以在體外行使抗菌功能以及蛋白酶活性抑制劑作用，因此，其在食品行業的抗菌方面具有非常廣闊的應用前景。此外，與目前我國醫療行業廣泛使用的抗生素不同，源於甲殼類動物的抗菌肽分子發揮抗菌作用的同時，不會引起耐藥性問題，因為抗菌肽分子發揮作用的過程是直接作用於細菌、真菌細胞壁的某一部位的胺基酸序列，從而引起細菌、真菌細胞壁某一部位的水解產生漏洞因而引起細菌、真菌細胞的內溶物外洩，使其死亡而被清除，所以，這類抗菌肽分子在醫藥行業也存在較大的應用前景。
[0005]淡水小龍蝦在我國養殖規模非常大，是一類經濟價值較高的水產養殖動物，在科研研究方面也是一個十分典型的甲殼類模式生物。淡水小龍蝦的具有單個WAP結構域的抗菌肽分子在動物體內先天免疫系統中是一類重要的免疫效應分子，而且，其抗菌功能與蛋白酶活性抑制劑作用在體外也可以發揮。尤其，SWD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用在體外可以抑制細菌繁殖過程中產生的蛋白酶的活性，從而將細菌分泌蛋白酶水解環境中的有機物從而獲得可吸收的營養物質的途徑徹底切斷，將細菌活活餓死，而且這種蛋白酶活性抑制劑作用不存在專一性，SffD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用具有廣泛的抑制效果，凡是細菌繁殖過程中產生的蛋白酶的活性都可以被徹底抑制，因而，具有光譜抑制作用。所以，淡水小龍蝦SWD抗菌肽分子在食品抗菌、醫療抗生素方面具有良好的應用空間。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，該方法製備的SWD蛋白酶抑制劑能夠抑制細菌分泌的蛋白酶的活性。
[0007]技術解決方案:
[0008]本發明的具體方法如下:
[0009]I)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的cDNA的克隆與表達片段擴增:取體重約為20g-30g的冷凍保存的淡水小龍蝦3隻，在實驗室超淨工作檯的無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg,利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA ExtractorCTrizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，之後，利用上海生工生物工程有限公司生產的一步法RT-PCR擴增試劑盒(M-MuLV)進行cDNA的反轉錄合成，並以此cDNA樣品作為模板，以表達引物 SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3'與 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為擴增 SWD 蛋白酶抑制劑表達片段的前後引物進行PCR擴增反應，反應條件優選為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0010]2)原核表達載體的構建與轉化克隆菌株DH5 a:將步驟(1)的PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，目的條帶所在的膠條回收之後利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產品)進行片段回收，之後利用EcoR I和Xho I核酸內切酶進行雙酶切處理，之後，將經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體(TaKaRa公司產品)在16°C條件下連接10h_12h，連接酶為T4DNA連接酶(TaKaRa公司產品)，之後，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態細胞(TaKaRa公司產品)，轉化過程利用「熱激法」進行轉化，將LB固體培養基平板在37°C培養12h-14h，抗性為卡那黴素抗性，獲得轉化後LB固體培養基平板；
[0011]3)陽性重組子的篩選與質粒提取:挑取步驟(3)的LB固體培養基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達引物SWD-F:5/` -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為菌落PCR篩選陽性重組子的PCR反應引物，進行菌落PCR反應，程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養基進行搖瓶培養，添加的卡那黴素的最終質量體積濃度為IOOii g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為12h_14h，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質粒小量提取試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產品)進行質粒提取，獲得陽性重組質粒；
[0012]4)轉化表達菌株BL21 (DE3)與陽性表達菌株的篩選:將步驟(3)的陽性重組質粒利用「熱激法」轉化大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株感受態細胞(TaKaRa公司產品)，轉化過程利用「熱激法」進行轉化，將LB固體培養基平板在37°C培養12h-14h，抗性為卡那黴素抗性，之後，利用表達引物SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SffD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為菌落 PCR 篩選陽性表達菌株的PCR反應引物，挑取固體LB培養基表面的白色菌落作為模板，進行菌落PCR反應，程序為:941預變性51^11，941:變性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性表達菌株利用液體LB培養基3mL_5mL進行搖瓶震蕩培養，添加的卡那黴素的最終質量體積濃度為IOOii g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為12h_14h，獲得表達菌株培養液；
[0013]5) SWD蛋白酶抑制劑分子的誘導表達:將步驟(4)中的表達菌株培養液在無菌條件下吸取lmL，轉接在新鮮的IOOmL液體LB培養基中，添加卡那黴素的濃度為100 u g/mL，培養溫度為37 °C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為3h_4h，之後加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，IPTG的最終物質的量濃度為0.5mmol/L,其他條件不變的情況下誘導表達4h-5h之後,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體，菌體沉澱利用IOmL的IXPBS 緩衝液重新懸起之後，冰浴上進行超聲波破碎，破碎方法要求為:功率200w,破碎2s,間歇3s,全程60min,破碎後的液體經過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集上清液，獲得菌體破碎後上清液；
[0014]6) SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)的菌體破碎後上清液5mL利用His-tag鎳柱(上海生工生物工程有限公司產品)進行親和純化，純化結果利用質量體積比為15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，根據電泳結果合併目的重組蛋白質所在位置對應的I X elute洗脫液，得到目的重組蛋白質I X elute洗脫合併液；
[0015]7) SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)中目的重組蛋白質I X elute洗脫合併液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司產品)對I XPBS緩衝液透析24h，12h期間更換一次I XPBS緩衝液，之後將透析後的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進行蛋白酶活性抑制劑檢測試驗，方法優先:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌，我們選擇一種革蘭氏陽性細菌一枯草芽孢桿菌和一種革蘭氏陰性細菌一綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養基上劃線37°C過夜培養，然後用經過滅菌的牙籤挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養基上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的直徑為Smm-1Omm的濾紙小圓片，然後，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IXPBS緩衝液、過濾除菌的與SWD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同的BSA蛋白溶液，28°C條件下培養10h-12h，觀察透明圈出現的情況。
[0016]本發明的優點:利用本發明製備的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑具有良好的蛋白酶抑制劑活性，可以廣泛抑制細菌生長繁殖過程中分泌到細胞外的蛋白酶的活性，從而切斷細菌的營養物質的來源，達到抑制細菌生長的作用，其在食品抗菌方面具有較大的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]附圖1為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的誘導表達與親和純化的蛋白電泳結果圖；
[0018]附圖2為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的枯草芽孢桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結果圖；
[0019]附圖3為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的綠膿桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結果圖。【具體實施方式】[0020]實施例1:淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的重組表達與親和純化以及酶活抑制劑活性檢測
[0021]圖1中，I為誘導前大腸桿菌總蛋白，2為誘導後大腸桿菌總蛋白，3為純化後的重組淡水小龍蝦SWD蛋白，4為標準蛋白質分子量。
[0022]圖2中，I為濾紙片上不加任何物質的對照，2為加15 ii LlXPBS的對照，3為加15uL BSA蛋白透析液對照，4為加15 ii L重組SWD蛋白透析液。
[0023]圖3中，I為濾紙片上不加任何物質的對照，2為加15 ii LlXPBS的對照，3為加15uL BSA蛋白透析液對照，4為加15 ii L重組SWD蛋白透析液。
[0024]方法步驟如下:
[0025]I)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑cDNA的克隆:取體重約為20g_30g的冷凍保存的淡水小龍蝦3隻，在實驗室超淨工作檯的無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，方法可以參照說明書進行，之後，利用上海生工生物工程有限公司生產的一步法RT-PCR擴增試劑盒(M-MuLV)進行cDNA的反轉錄合成，方法可以參照說明書進行，並以此cDNA樣品作為模板，以表達引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgcaca cac tat gct~3'與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為擴增SWD表達片段的前後引物進行PCR擴增反應，反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循環35圈，後延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0026]2)原核表達載體的構建與轉化克隆菌株DH5 a:將步驟(1)的PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠 電泳處理，目的條帶所在的膠條切膠回收之後，利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產品)進行片段回收，並且利用EcoRI和Xho I核酸內切酶進行雙酶切處理之後，與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體(TaKaRa公司產品)在16°C條件下連接10h_12h，連接酶為T4DNA連接酶(TaKaRa公司產品)，之後，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態細胞(TaKaRa公司產品)，轉化過程利用「熱激法」進行轉化，將LB固體培養基在37°C培養12h-14h，抗性為卡那黴素抗性，獲得LB固體培養基平板；
[0027]3)陽性重組子的篩選與質粒提取:挑去步驟(2)中的LB固體培養基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tatgct-31 與 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作為菌落 PCR篩選陽性重組子的PCR反應引物，進行菌落PCR反應，程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養基進行搖瓶震蕩培養，添加的卡那黴素的最終質量體積濃度為100 ii g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為12h_14h，之後，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質粒小量提取試劑盒進行質粒提取，獲得陽性重組質粒；
[0028]4)轉化表達菌株BL21 (DE3)與陽性表達菌株的篩選:將步驟(3)中的陽性重組質粒利用「熱激法」轉化大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株感受態細胞，將LB固體培養基在37°C過夜12h_14h培養，抗性為卡那黴素抗性，利用表達引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttccag cgc aca cac tat gct~3'與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgcac-3/作為菌落PCR篩選陽性表達菌株的PCR反應引物，挑去固體LB培養基表面的白色菌落作為模板，進行菌落PCR反應，程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性表達菌株利用液體LB培養基3mL-5mL進行搖瓶震蕩培養，添加的卡那黴素的最終質量體積濃度為100 u g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為12h_14h，得到表達菌株培養液；
[0029]5)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的誘導表達:將步驟(4)中的表達菌株培養液在無菌條件下吸取lmL，轉接在新鮮的IOOmL液體LB培養基中，添加卡那黴素的最終質量體積濃度為IOOii g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為3h_4h，之後加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，IPTG的最終物質的量濃度為0.5mmol/L,其他條件不變的情況下誘導表達4h_5h之後,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體，收集到的菌體沉澱用無菌的移液器槍頭蘸取一小部分，用無菌水40 y L懸起，加入20 y L蛋白質樣品處理液之後在沸水域中煮沸5min-10min,冷卻後作為質量體積比為15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳的樣品使用，聚丙烯醯胺凝膠電泳選擇120v電壓進行1.5h-2h，並且，將剩餘的菌體沉澱保存在4°C冰箱中；
[0030]6)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)剩餘的保存在4°C冰箱中的菌體沉澱利用IOmL的IXPBS緩衝液重新懸起之後，冰浴上進行超聲波破碎，超聲波破碎的具體方法為:功率200w，破碎2s，間歇3s，全程60min，破碎後的液體經過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集上清液，取上清液5mL利用His-tag鎳柱(上海生工生物工程有限公司產品)進行親和純化，具體方法為:先用IXPBS緩衝液IOmL反覆緩慢衝洗柱子3次-5次，再用試劑盒中的I Xwash溶液5mL洗脫柱子，再用試劑盒中的I Xbinding溶液3mL洗脫柱子，接著將5mL超聲波破碎後上清液反覆上樣3次-5次，目的是為了重組SWD蛋白能夠充分結合在柱子上，之後用試劑盒中的IXbinding溶液IOmL洗脫柱子，再用試劑盒中的I X wash溶液6mL洗脫柱子,最後用試劑盒中的I X elute溶液3mL洗脫柱子，並且此時收集洗脫液，目的重組SWD蛋白就在此I X elute洗脫溶液中，純化結果利用質量體積比為15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，最終根據電泳結果合併目的重組蛋白質所在位置對應的IXelute洗脫液，得到目的重組蛋白質IXelute洗脫合併液；
[0031]7)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:取步驟(6)中的3mL目的重組SWD蛋白質的I X elute洗脫合併液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司產品)對IXPBS緩衝液透析24h，透析溫度為4°C，並且，12h期間更換一次IXPBS緩衝液，之後將透析後的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進行蛋白酶抑制劑活性的檢測試驗，方法為:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌，一種為革蘭氏陽性細菌一枯草芽孢桿菌，一種為革蘭氏陰性細菌一綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養基上劃線37°C過夜培養，然後用經過滅菌的牙籤挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的直徑為Smm-1Omm的濾紙小圓片，然後，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IX`PBS緩衝液、與SWD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同的過濾除菌的BSA蛋白溶液，28°C條件下培養10h-12h，觀察透明圈出現的情況。[0032]結果顯示，重組淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子能夠充分抑制枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌分泌的蛋白酶的活性，在試驗中滴加重組淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液 的位置都沒有出現因為蛋白質水解而產生的透明圈。
【權利要求】
1.一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，其特徵在於:方法步驟如下: 1)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的cDNA的克隆與表達片段擴增:取體重約為20g-30g的淡水小龍蝦，在無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg，進行總RNA的提取，之後，進行cDNA的反轉錄合成，並以此cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，獲得PCR反應產物； 2)原核表達載體的構建與轉化克隆菌株DH5a:將步驟(1)的PCR反應產物進行質量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，目的條帶所在的膠條切膠回收之後利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒進行片段回收，利用EcoR I和Xho I核酸內切酶進行雙酶切處理，之後，將經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的pET-28a載體在16°C條件下連接10h_12h，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態細胞，轉化過程利用「熱激法」進行，獲得LB固體培養基平板； 3)陽性重組子的篩選與質粒提取:挑去步驟(2)中的LB固體培養基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達引物 SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作為菌落PCR篩選陽性重組子的PCR反應引物，進行菌落PCR反應，程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養基進行搖瓶震蕩培養10h-12h，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質粒小量提取試劑盒進行質粒提取，獲得陽性重組質粒； 4)轉化表達菌株BL21(DE3)與陽性表達菌株的篩選:將步驟(3)中的陽性重組質粒利用「熱激法」轉化大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌株感受態細胞，並且，利用表達引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cctgac ctt agt tea tgc ac_3'作為菌落PCR篩選陽性表達菌株的PCR反應引物,挑去固體LB培養基表面的白色菌落作`為模板，進行菌落PCR反應，程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，後延伸5min，根據PCR結果，將篩選得到的陽性表達菌株利用液體LB培養基3mL-5mL進行搖瓶震蕩培養，得到表達菌株培養液； 5)SffD蛋白酶抑制劑分子的誘導表達:將步驟(4)中搖瓶培養的表達菌株培養液在無菌條件下吸取lmL，轉接在新鮮的IOOmL液體LB培養基中，添加卡那黴素最終的質量體積濃度為100 ii g/mL，培養溫度為37°C，搖床轉速為180rpm-200rpm，培養時間為3h_4h，之後加入IPTG進行誘導表達，IPTG的最終物質的量濃度為0.1mmoI/L-1.0mmoI/L,其他條件不變的情況下誘導表達4h-5h之後,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體,菌體沉澱利用IOmL的IXPBS緩衝液重新懸起之後，冰浴上進行超聲波破碎，破碎後的液體經過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集獲得上清液； 6)SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)中的上清液5mL利用His-tag鎳柱進行親和純化，純化結果利用質量體積比為15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，最終根據電泳結果合併目的重組蛋白質所在位置對應的IXelute洗脫液，得到目的SWD重組蛋白質I X elute洗脫合併液； 7)SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質I X elute洗脫合併液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩衝液透析24h，12h期間更換一次I XPBS緩衝液，之後將透析後的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進行蛋白酶抑制劑活性的檢測試驗。
2.根據權利要求1所述的一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，其特徵在於，淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑表達片段擴增方法，以表達引物SWD-F:5' -tac tea gaattc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt teatgc ac-3/作為擴增SWD表達片段的前後引物進行PCR擴增反應，反應條件為:94°C預變性3min，94°C變性 30s，53。。退火 45s，72。。延伸 30s，循環 35 圈，後延伸 5min。
3.根據權利要求1所述的一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的製備方法，其特徵在於:淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細菌，分別選擇革蘭氏陽性細菌——枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性細菌——綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養基上劃線37°C過夜培養，然後用經過滅菌的牙籤挑去細菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養基上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經過滅菌的直徑為8mm-10mm的濾紙小圓片，然後，預留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I X PBS緩衝液、過濾除菌的與SWD重組蛋白透析液的蛋白質濃度相同的BSA蛋白溶液，28 °C條件下過夜培養10h-12h，觀察透明`圈出現的情況。
【文檔編號】C07K1/22GK103667330SQ201310403117
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】杜志強, 王金星, 趙小凡, 張雪峰, 王建英 申請人:內蒙古科技大學