具有高產10-dab特性的紅豆杉細胞株及其應用的製作方法

2024-01-28 20:38:15 2

具有高產10-dab特性的紅豆杉細胞株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（ Taxuswallichianavar.mairei ） ，命名為：南方紅豆杉植物細胞系N12#，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNo.10001。本發明更進一步公開了10-DAB（10-DeacetylbaccatinⅢ，CASNO:32981-86-5）高產細胞系的篩選和建立，本發明從紅豆杉外植體中誘導篩選出一株高產10-DAB的細胞系，實驗結果證明：該細胞系高產次生代謝產物10-DAB等紫杉烷類化合物，可用於紫杉醇和多西紫杉醇的原料藥前體的生產。CGMCC No1000120141119
【專利說明】具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株及其應用 【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物細胞培養【技術領域】，具體涉及一種具有高產10-DAB特性的紅豆 杉細胞株（/1SjTo1S Far. ?airei)及其應用。 【背景技術】
[0002] 10-去乙醯巴卡亭III (lCKdeacetyl baccatin III，簡寫為ICHMB )是從紅豆杉短 枝葉中分離、提取得到的一種紫杉烷二萜類化合物，不但自身有抗癌活性，而且是生物合成 與化學半合成紫杉醇和多烯紫杉醇的重要前體化合物，在解決臨床治療和科學研究用紫杉 醇和多烯紫杉醇藥源問題中起著不可替代的作用。國內外學者對紅豆杉細胞懸浮培養生產 紫杉醇進行了大量的基礎性研究工作，但離工業化生產還有很大的距離。有關紅豆杉細胞 培養生產10-DAB的研究報導很少。本發明通過紅豆杉細胞培養生產10-DAB，再經過化學半 合成生產紫杉醇和多烯紫杉醇，是一條在不破壞紅豆杉野生植物資源基礎上能實現資源再 生利用的有效途徑。
[0003] 10-DAB 即 10-脫乙醜基巴卡丁 III (IO-Deacetylbaccatin III，CAS NO: 32981-86-5)，可以從紅豆杉中提取，其最主要的作用是作為多烯紫杉醇的合成前體。多烯 紫杉醇同紫杉醇一樣是抗癌藥物，但由於紫杉醇的水溶性差，阻礙了活性的發揮，所以溶解 性更好的多烯紫杉醇成為了紫杉醇的替代品。相較於紫杉醇，多烯紫杉醇具有如下特點： 1、 水溶性更優，是紫杉醇的數十倍； 2、 活性更高，其活性是相同劑量的紫杉醇的數倍； 3、 所需治療的總費用遠遠小於紫杉醇 但是目前多烯紫杉醇無法通過天然植物提取，只能通過生產10-DAB後利用化學物理 合成方法進行生產。因此開發10-DAB的大規模細胞培養生產具有良好的市場前景。
【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種高產10-DAB的紅豆杉細胞株。為了解決此問題，本發明 所採用的技術方案是 ： 一種具有高產IO-DAB特性的紅豆杉細胞株rar. ?airei)，命 名為：南方紅豆杉植物細胞系N12#，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號 CGMCC No. 10001。
[0005] 本發明進一步公開了具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. ffiairei)，保藏號CGMCC No. 10001在用於製備多烯紫杉醇合成前體藥物方面的應用。 特別是用於製備紫杉醇和多西紫杉醇原料藥前體的生產方面的應用。
[0006] 本發明更進一步公開了具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. ffiairei)，保藏號CGMCC No. 10001的篩選方法，其特徵在於按如下的步 驟進行： (1)外植體誘導愈傷細胞。
[0007] (2)愈傷組織穩定繼代生長 (3)固體愈傷細胞小細胞團法選種和啟動液體懸浮培養自然選種。
[0008] 本發明還公開了採用10-DAB特性的紅豆杉細胞株，生產10-去乙醯巴卡亭III的方 法，其特徵在於 ： (1)固體愈傷細胞自然生產。
[0009] (2)液體懸浮培養自然生產。
[0010] (3)液體懸浮培養組合調控的方法獲得高產。
[0011] 具體是將14代懸浮細胞接種按照稱重法接種鮮細胞至PN調控培養基，培養基用 IOOml三角瓶裝量20ml，接種量6g/瓶，分兩步法培養，周期28天，暗培養，100轉/分，採用 25°C培養。在細胞培養的第4天添加甲基茉莉酸100 μ M，第10天添加硝酸銀10 μ M，第28 天收穫細胞和培養液。結果=IO-DAB產量達150mg/L，產物還有紫杉醇50mg/l和微量巴卡 亭III〖1L 本發明還公開了具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. 通過特異性擴增18S的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進行比對，序列一致，其特 徵在於從基因角度證明該10-DAB高產細胞系屬於南方紅豆杉。
[0012] 本發明更加詳細的技術內容如下： (1)本發明提供的具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株π 入命名為：南方紅豆杉植物細胞系N12#，所述的細胞系是由北京市朝陽區北辰西路 1號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，命名南方紅豆杉植物細胞系N12#，保 藏日期2014年11月19日，保藏號CGMCC No. 10001，分類學名稱，曾用名Timz1S ?airei， Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K，最氣分類學^iTaxus wallichiana var. mairei〇
[0013] (2) 10-DAB 特性的紅豆杉細胞株Far. ?airei)的培養特徵 及生理生化指標： 1)本細胞株生長緩慢穩定，生長量2倍/14天，不易染菌，適應生長溫度25°C，暗培養， 生長最適PH值5. 8,糖濃度20g/L。
[0014] 2)本細胞株固體細胞偏幹，棕色，培養基底部無分泌物； 3)本細胞株懸浮細胞，細胞顆粒飽滿，大小均勻，像小米粒，上清培養液乳白色，渾濁。
[0015] (3) 10-DAB 特性的紅豆杉細胞株（Taxus wallichiana var. mairei)的 18S DNA ITS基因序列見圖10 18S DNA ITS序列的blast比較圖。
[0016] (4)10_DAB特性的紅豆杉細胞株raBicAiafla rar. ?airei)的篩選方法： 首先進行外植體誘導，將固體愈傷組織多次繼代，直至生長穩定，採用自然選種和組合調控 兩種方法進行選種。
[0017] 固體自然選種，選擇5代生長穩定，細胞狀態顏色均勻的細胞團作為選種的出發 細胞株，用小細胞團的方法來將一個2g左右的大細胞團通過稱重法分成幾個小的0. 5g的 小細胞團，培養一個周期後，取每個細胞團的一半檢測一半繼續繼代培養。目的是通過小細 胞團，將不同特性的細胞分開，達到選種的目的。
[0018] 液體懸浮培養自然選種，選擇5代生長穩定，細胞狀態均已一致的的固體愈傷細 胞進行各種激素培養基的液體懸浮，採用稱重法接種，多次繼代培養，每次繼代檢測細胞培 養上清液和細胞樣。目的是通過激素的變化刺激細胞株，達到選種的目的。
[0019] 液體懸浮培養組合調控方法選種，仍然採用液體懸浮的方法將細胞進行懸浮培養 放大，再去組合調控，通過添加前體、調控劑等，刺激細胞，達到選種目的。
[0020] 本發明公開的10-DAB特性的紅豆杉細胞株rar. ?airei」所 具有的有益效果在於： (1)本文通過紅豆杉細胞培養生產10-DAB，再經過化學半合成生產紫杉醇和多烯紫杉 醇，是一條在不破壞紅豆杉野生植物資源基礎上能實現資源再生利用的有效途徑。
[0021] (2)產量高，成本低。本細胞株具有高產10-DAB的特性，產量高達120mg/L，據報 道,新鮮紅豆杉外植體葉片中10-DAB含量3mg/g (乾重)，本發明中IL的產量需要40g乾重 的紅豆杉葉片，即需要大約400g的新鮮葉片。本細胞株生成IL產物的成本遠遠小於種植 紅豆杉的土地，人工等費用。解決了紅豆杉資源的頻繁砍伐和種植。
[0022] (3)提取分離純化簡單，收率高。本細胞株生成10-DAB，細胞培養結束後，下遊提 取分離純化簡單，收率高達80%以上。再次保護了紅豆杉自然資源，並且為合成紫杉醇和多 西紫杉醇提供了原料。
[0023] 【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為樣品檢測圖譜；愈傷細胞懸浮培養14天後，培養基上清液中的10-DAB的UPLC 檢測圖譜； 圖2為樣品+STD圖譜；圖1中W422樣品加10-DAB標準品後的UPLC檢測圖譜。
[0024] 圖3為外植體圖；自然界生長的紅豆杉的嫩莖； 圖4為誘導成功愈傷細胞的外植體圖；外植體嫩莖經過誘導後，含有愈傷細胞的外植 體狀態； 圖5為14代的愈傷細胞圖；外植體誘導的愈傷組織細胞，經過14代穩定繼代後的細 胞； 圖6為15代懸浮細胞圖；細胞在液體培養基生長15代的懸浮狀態； 圖7為400倍放大鏡檢細胞圖片；懸浮細胞在顯微鏡下物鏡40倍放大，目鏡10倍觀察 的細胞； 圖8為純化樣品色譜圖；經過調控的28天懸浮細胞和上清液，去除部分雜質後的 10-DAB 的 UPLC 圖譜； 圖9為純化樣品中10-DAB質譜圖；其中保留時間為0. 545min色譜峰的545. 3 ([M+H]+) 及591. 3 ([M+2Na+H]+)可以判斷該峰對應的化合物為10-DAB ; 圖10 18S DNA ITS序列及blast比對圖；其中特異性擴增片段都分布在南方紅豆杉屬 中，序列覆蓋範圍（Query coverage)均達到99%，最大相似性（Max identity)均在99% 以上。
[0025] 【具體實施方式】： 【具體實施方式】： 下面結合實施例說明本發明，這裡所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人 員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明 的範圍內，本發明的範圍和實質由權利要求來限定。下面通過實例來進一步闡明10-DAB特 性的紅豆杉細胞株的製備方法。本發明所用到的試劑除特別指出外均有市售。
[0026] 實施例I 產10-DAB高產細胞株保藏號CGMCC No. 10001的誘導 (1)由南方紅豆杉外植體誘導細胞株的愈傷組織保藏號CGMCC No. 10001 將外植體進行清洗、75%酒精消毒、0. 1%氯化汞消毒，接種、培養。
[0027] 1、外植體消毒 1. 1清洗 將外植體放入清水盆中，加少量洗潔精，用手輕輕搓洗外植體表面，然後用乾淨的自來 水衝洗3遍,用純化水衝洗3遍,最後用超純水衝洗3遍。洗乾淨後放置在乾淨的濾紙上， 將葉片和嫩莖分開，葉片放在有乾淨濾紙的平皿內，吸取多餘的水分，並蓋上蓋子。嫩莖用 剪刀剪成小段，同樣放在有乾淨濾紙的平皿內蓋好蓋子等待消毒備用。
[0028] 1. 2 消毒 將洗乾淨的葉片和嫩莖，倒入燒杯內，先用75%酒精消毒30s，將酒精倒掉，用無菌水清 洗2遍，每遍l-2min。再用氯化萊溶液消毒15min，再用無菌水清洗3遍，每遍l-2min。消 毒完畢後，放入無菌平皿內，接種備用。
[0029] 2、接種 2. 1葉片的接種 用鑷子夾取葉片，用剪刀將葉片中間剪若干小口。將剪好的葉片接種至誘導培養基內， 每個平皿內接種5-6個葉片。
[0030] 2. 2嫩莖的接種 將消毒好的嫩莖段，用鑷子夾取，並用剪刀剪成適當長度的小段，接種至誘導培養基 內，每個平皿內接種5-6個莖段。
[0031] 3、 培養及誘導：將接種好葉片和莖段的平皿用封口膜包好，放置在25土rc培 養箱，暗培養，周期30天[2i。 (1)誘導結果誘導培養基及誘導率：將葉片和莖段接入B5優化、WPM、B5-PVP、WR、 B5-US五種培養基（詳見誘導培養基見表1) 13】。
【權利要求】
1. 一種具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. ffiairei)，命 名為：南方紅豆杉植物細胞系N12#，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號 CGMCC No. 10001。
2. 權利要求1所述具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. aairei入保藏號CGMCC No. 10001在用於製備多烯紫杉醇合成前體藥物方面的應用。
3. 權利要求2所述的應用，其中用於製備多烯紫杉醇合成前體藥物指的是用於製備紫 杉醇和多西紫杉醇原料藥前體的生產。
4. 權利要求1所述具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. 入保藏號CGMCC No. 10001的篩選方法，其特徵在於按如下的步驟進行： (1) 外植體誘導愈傷細胞； (2) 愈傷組織穩定繼代生長； (3) 固體愈傷細胞小細胞團法選種和啟動液體懸浮培養自然選種。
5. -種採用10-DAB特性的紅豆杉細胞株生產10-去乙醯巴卡亭III的方法，其特徵在 於： (1) 固體愈傷細胞自然生產； (2) 液體懸浮培養自然生產； (3) 液體懸浮培養組合調控的方法獲得高產。
6. 權利要求1所述具有高產10-DAB特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. 18S的部分ITS片段，此18S的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進行比對，序列一 致，其特徵在於從基因角度證明該10-DAB高產細胞系屬於南方紅豆杉。
【文檔編號】C12R1/91GK104403987SQ201410726274
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2015年1月6日 優先權日:2015年1月6日
【發明者】王麗, 朱瑞雪, 劉曉月, 王海燕, 張桂才, 張衛 申請人:天津艾賽博生物技術有限公司